专利名称：通过体内基因递送治疗心血管疾病的技术和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过体内基因疗法治疗心血管疾病的方法和组合物。更具体地，本发明涉及通过体内递送血管生成转基因以治疗心脏疾病和/或治疗外周血管疾病的技术和多核苷酸结构。
背景技术：
美国心脏协会(1995年统计增刊)报道，在美国约有6千万成年人患心血管疾病。心血管疾病造成美国每年近一百万的死亡，这占所有死亡的40％以上。在美国，每年有约350,000例新的心绞痛病例，它是冠状动脉病的一种常见病情，其特征在于短暂的心肌缺血导致胸部疼痛。类似地，每年有约400,000名患者被诊断患有充血性心力衰竭“CHF”(心脏疾病的另一表现)，在美国它是造成住院的最常见的非选择性原因。1996年，估计有725,000名患有外周血管疾病的患者，其中超过100,000名需要截肢。
心肌缺血是心脏功能障碍的一个方面，它发生在心脏肌肉(心肌)没有接受到充足血液供应并由此失去了必需水平的氧和养料的时候。心肌缺血可以导致各种心脏疾病，包括例如绞痛、心脏病发作和/或充血性心力衰竭。心肌缺血最为常见的原因是动脉粥样硬化(又称冠状动脉疾病或“CAD”)，它导致向心肌供血的冠状动脉、血管堵塞。目前心肌缺血的疗法包括药物疗法、冠状动脉旁路手术、和使用球囊血管成形术等技术经皮再形成血管。标准的药物治疗是以如下策略为基础的，该策略涉及增加向心肌的血液供应或降低心肌对氧和养料的需求量。例如，可以通过例如钙通道阻断剂或硝酸甘油等药剂来增加向心肌的血液供应。这些药剂被认为可以通过造成血管壁平滑肌的松弛增加患病动脉的直径。可以通过降低心脏血液动力学载量的药剂如动脉血管扩张剂、或通过降低心脏对给定血液动力学载量的收缩反应的那些药剂如β-肾上腺素受体拮抗剂，降低心肌对氧和养料的需求量。缺血性心脏疾病的手术治疗一般是基于使用策略性放置的旁路移植物(通常是隐静脉或胸廓内动脉移植物)作为患病动脉区段的旁路。经皮血管再生成一般是基于使用导管降低患病冠状动脉的狭窄程度。所有这些策略均被用于减少缺血事件的发生次数或根除缺血事件的发生，但所有的策略都有不同的限制性，其中一些将在以下进行讨论。
许多心脏疾病患者，包括许多因严重心肌缺血导致心脏病发作的患者，被诊断为有充血性心力衰竭。充血性心力衰竭的定义是导致不足以满足代谢需要的心脏排出量的异常心脏功能(Braunwald，E.(编)，《心脏病》(Heart Disease)，W.B.Saunders，Philadelphia，第426页，1988)。在美国估计有5百万人患有充血性心力衰竭。一旦CHF的症状达到中等程度的严重性后，预后比大多数癌症更坏，因为预期这样的患者中仅有一半可存活2年以上(Braunwalk，E.(编)，《心脏病》，W.B.Saunders，Philadelphia，第471-485页，1988)。药物治疗最初可以减轻CHF的症状(例如水肿、不耐运动和气喘)，在某些情况下可延长生命。然而，甚至使用药物治疗，该疾病的预后仍是可怕的，而且CHF的发生率在一直增加(见如Baughman，K.，Cardiology Clinics 1327-34，1995)。CHF的症状包括气喘、疲劳、乏力、腿浮肿和不耐运动。体检时，心力衰竭患者倾向出现心率和呼吸速率升高、湿啰音(肺中有液体的迹象)、水肿、颈静脉扩张、而且一般心脏增大。CHF的最常见原因是动脉粥样硬化，正如以上讨论的，这导致向心肌供血的冠状动脉阻塞。因此，充血性心力衰竭最通常是与冠状动脉疾病相关，就范围或突然性而言这种疾病如此严重以致它会导致发生慢性或急性心力衰竭。在这些患者中，一或多条冠状动脉的大范围和/或突发性闭塞妨碍充足的血流量入心肌，导致严重缺血和(在一些情况下)心肌梗死或心肌死亡。随之发生的心肌坏死倾向于在进行性慢性心力衰竭或急性低排出状态(两者均与高死亡率相关)后出现。
患有充血性心力衰竭的大多数患者倾向于出现收缩性差的增大心脏，此病被称作“扩张型心肌病”(或DCM，如本文所用)。DCM是一种典型地通过发现扩张的收缩不足的左和/或右心室而诊断出来的心脏疾病。再有，在大多数情况下，与扩张的心脏有关的充血性心力衰竭是冠状动脉疾病的结果，该疾病通常十分严重以致会造成一或多次的心肌梗死。然而，在相当少数的情况下，DCM可以在无冠状动脉疾病(例如动脉粥样硬化)特征的情况下发生。在扩张型心肌症与CAD无关的许多病例中，DCM的原因是已知的或是可疑的。例子包括家族性心肌病(例如与进行性肌营养不良、强直性肌营养不良、Freidrich氏共济失调、和遗传性扩张型心肌病有关的那些)、导致心肌炎的感染(例如各种病毒、细菌和其它寄生虫感染)、非感染性炎症(例如由自身免疫病、分娩前后心肌病、超敏反应或移植排斥引起的那些)、引起心肌炎的代谢紊乱(包括营养、内分泌和电解质异常)、以及暴露于引起心肌炎的毒性药剂(包括醇、以及某些化疗药物和儿茶酚胺)、然而，在大多数非CAD的DCM病例中，疾病的原因不明，因此该病被称作“原发性扩张型心肌病”(或“IDCM”)。尽管根本原因上存在潜在的差异，患有严重CHF的大多数患者都有增大的薄壁心脏(即，DCM)，而且大多数那些患者表现出心肌缺血(尽管他们中的一些可能并没有明显的动脉粥样硬化)。而且，DCM患者会出现心绞痛，即使他们可能并没有严重的冠状动脉疾病。
CHF的发生提出了几个主要的治疗关注点，包括进行性的心肌损伤、与扩张的心脏有关的血液动力学低效、系统性栓塞的威胁、和室性心律失常的危险。由于闭塞性冠状动脉疾病不是主要问题，传统的血管再生成不是治疗非CAD的DCM的选择。甚至对于DCM的原因已知或可疑的那些患者，该损伤典型地也是不易逆转的。例如，对于阿霉素诱导的心脏毒性，该心肌症一般是不可逆转的并导致60％以上的患病患者死亡。对于一些DCM患者，原因本身就是未知的。因此，对于DCM没有普遍适用的疗法。传统上医师集中在减轻DCM患者的症状(例如通过使用利尿剂缓解体液潴留、和/或使用血管紧张肽转化酶抑制剂降低心肌对氧和养料的需求量)。因此，大约50％表现DCM的患者会在诊断后的两年内死亡，通常死于室性心律失常相关的突发性心脏停搏。“心室重构”是心脏疾病的一个方面，该疾病通常在心肌梗死后发生并通常导致心室功能的进一步降低。在许多情况下，心肌梗死愈合后，愈合的梗塞和正常组织间的毗连区中的持续缺血和其它因素导致其余的心脏组织扩张和/或重构。这种扩张或重构尽管一开始是适应性的，但常常导致心室功能的进一步受损。在大约50％患有此类梗塞的患者中有整个心脏的扩大，并且重构通常在心肌梗死后几个月内发生，尽管它也可以早在梗塞后的1-2周发生。左心室功能差是心肌梗死后不良后果的最佳单一指征。因此，心肌梗死后预防心室重构将是有益的。一种尝试预防心室重构的方法是使用血管紧张肽转化酶(“ACE”)抑制剂治疗患有心肌梗死的患者(见例如McDonald，K.M.，Trans.Assoc.Am.Physicians 103229-235，1990；Cohn，J.Clin.Cardiol.18(Suppl.IV)IV-4-IV-12，1995)。然而，这些药剂仅在一定程度上对预防破坏性心室重构有效，因此需要新的疗法。
目前的CHF疗法包括药物疗法、冠状血管再生成法和心脏移植。CHF的药物疗法涉及增强心脏的收缩力(通过使用肌力作用物如洋地黄和β-肾上腺素受体激动剂)、降低肺和其它部位的体液积聚(通过使用利尿剂)、和减少心脏的工作(通过使用降低系统性血管阻力的药剂如血管紧张肽转化酶抑制剂)。还测试了β-肾上腺素受体拮抗剂。尽管这些药剂可以改善症状，并可能延长生命，但在大多数情况下预后仍是晦暗的。
由相关的冠状动脉疾病造成的一些心力衰竭患者可以得益于(至少暂时地)血管再生成法例如冠状动脉旁路手术和血管成形术。在心肌未死亡但可能由于血流量不足而出现功能障碍时，这些方法具有潜在的益处。如果正常的冠脉血流量得到恢复，则之前功能不良的心肌可以更正常的收缩，并且心脏功能可以得以改善。然而，如果患者的微血管床不足(例如可以在较为严重的CHF患者中发现的那样)，则血管再生成将极少使心脏功能恢复到正常或近正常水平，即使有时可以观察到轻微的改善。此外，血管成形术后失败的旁路移植和再狭窄的发生率也给这些方法治疗的患者造成了危险。心脏移植可能是没有其它混杂疾病并相对年青的CHF患者的适当选择，但仅有少数这样的患者，而且仅在花费了极大的费用后，才能有此选择。总之，可以看出CHF具有极差的预后并且对目前疗法的反应性差。
进一步并发CHF相关生理疾病是易发生在心脏功能不良患者身上的各种天然适应反应。尽管这些天然反应最初可以改善心脏的功能，但它们常常导致其它问题，这些问题会使疾病恶化、混杂治疗、并对生存造成不良影响。在CHF患者中常观察到三种这样的适应性反应(i)由钠再吸收的改变而诱导的体液潴留，这扩大了血清体积并在初期提高了心脏的排出量；(ii)心脏增大(由扩大和肥大造成的)，这可以增加每搏量而同时维持相对正常的壁张力；和(iii)增加作用于心脏的肾上腺素能神经末梢的去甲肾上腺素释放，通过与心脏的β-肾上腺素能受体相互作用，这往往可以增加心率和收缩力，籍此增加心脏排出量。然而，所有这三种天然适应均因各种原因往往最终失败。尤其是，体液潴留易于导致水肿并在肺中潴留体液损害呼吸。心脏增大可以导致破坏性左心室重构，及随后的严重扩张和壁张力增加，由此使CHF恶化。最后，心脏长期暴露于去甲肾上腺素易于造成心脏对肾上腺素刺激不产生反应，而且与不良的预后相关。
和心脏疾病一样，外周血管疾病，常常是由于流向组织(例如骨骼肌)的血液受限而造成的，这些组织(与心脏疾病一样)会发生缺血，尤其是在代谢需要量增加(如运动)时发生缺血。因此，外周血管中的动脉粥样硬化可以引起患病血管所供应的组织中缺血。此问题被称作外周动脉闭塞性疾病(PAOD)，该疾病最常见的是影响患者的下肢。和其它形式的心血管疾病一样，该疾病或它的至少某些症状可以通过使用药物如阿斯匹林或其它降低血液粘度的药物、或通过手术干预如动脉移植、手术去除脂肪斑沉积物、或通过血管内治疗如血管成形术来进行治疗。尽管症状可以得以改善，但典型地这些疗法的效率不足，原因和以上提及的那些原因相似。
近来，对心血管疾病治疗的研究转向了与血管发生有关的疗法。血管发生一般是指血管的发生和分化。已知典型被称作“血管生成蛋白”的许多蛋白质可以促进血管发生。这些血管生成蛋白包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员、血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族成员、血小板衍生生长因子(PDGF)家族成员、胰岛素样生长因子(IGF)家族成员、和其它(参见以下和本领域中的更为详细描述)。例如，FGF和VEGF家族成员被认为是生长和发育过程中血管发生的调节物。近来在成年动物中检测了它们促进血管发生的作用(讨论如下)。FGF和VEGF家族的血管生成活性已得到检测。例如，已显示，位于胶原覆盖的基质中的酸性FGF(“aFGF”)蛋白，当被置于成年大鼠的腹腔中时，导致产生良好血管化并正常灌注的结构(Thompson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，867928-7932，1989)。据报道，成年犬冠脉堵塞时向该冠状动脉内注射碱性FGF(“bFGF”)蛋白导致心肌功能障碍减少、较少的心肌梗死、和处于危险的该床中血管供应的增加(Yanagisawa-Miwa等，Science，2571401-1403，1992)。使用bFGF蛋白在心肌缺血动物模型中也报道了相似的结果(Harada等，J.Clin.Invest.94623-630，1994；Unger等，Am.J.Physiol.，266H1588-H1595，1994)。用VEGF蛋白质处理狗，显示出侧支血流量增加(Banai等，Circulation，892183-2189，1994)。
然而，与潜在使用这些蛋白质输注来促进心脏血管发生有关的困难包括需要足够长的时间来实现适当的定位、和确保蛋白质在心肌细胞内具有并保持摄取和促进血管发生作用所需的适当形式和浓度。最初很高(例如在输注大丸剂后)但随后快速降低(随着身体对其进行清除)的蛋白质浓度可能既有毒又没有效果。另一个困难是需要重复输注或注射该蛋白质。
一些出版物提出了基因转移在治疗或预防疾病(包括某些心脏疾病)中的用途。见，例如，French，“基因转移和心血管疾病”，Herz18222-229，1993；Williams，“基因治疗缺血性心脏病的前景”，American Journal of Medical Sciences 306129-136，1993；Schneider和French，“腺病毒的到来心血管疾病的基因治疗”，Circulation 881937-1942，1993；和Mazur等，“冠状动脉再狭窄和基因治疗”，Molecular and Cellular Pharmacology，21104-111，1994。此外，一些研究组提出使用质粒、逆转录病毒、腺病毒和其它载体向心肌作体外基因转移(参见如Barr等，增刊II，Circulation，84(4)摘要1673，1991；Barr等，Gene Ther.，151-58，1994；French等，Circulation，90(5)2402-2413，1994；French等，Circulation，90(5)2414-2424，1994；French等，Circulation，901517摘要2785，1994；Leiden等，WO94/11506(1994年5月26日)；Guzman等，Circ.Res.，73(6)1202-1207，1993；Kass-Eisler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9011498-11502，1993；Muhlhauser等，Hum.Gene Ther.，61457-1465，1995；Muhlauser等，Circ.Res.，77(6)1077-1086，1995；和Rowland等，Am.Thorac.Surg.，60(3)721-728，1995。
然而，一般这些报道提供的仅是潜在疗法的建议或希望。提供动物数据的那些报道中，大多数没有使用与实际体内条件适当相关的疾病模型。而且，已尝试过的体内方法通常有一或多个以下缺陷不足的转导效率和转基因表达；对所用载体的明显免疫应答，包括炎症和组织坏死；而且重要的是，相对无法使转导和转基因表达靶向目的器官(例如靶向心脏的基因转移也导致转基因被递送到测试动物的非心脏部位如肝、肾、肺、脑和睾丸)。例如，转基因在快速分离细胞群中的插入将导致转基因表达持续时间的相当大程度降低。这些细胞的例子包括构成所有血管内层的内皮细胞、和分散在整个心脏的成纤维细胞。使转基因定向以便仅有期望细胞接受和表达转基因并且以便该转基因不会出现系统性地分布，这点也是至关重要的考虑因素。如果这不能够实现的话，则将导致转基因的系统性表达和由此随之而来的问题。例如，文献报道，在腺病毒介导的肝内基因转移后出现炎性浸润(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，914407，1994)。此外，文献报道，通过针头插入心肌壁进行直接的心肌内注射后心脏中出现炎性浸润(French等，Circulation，90(5)2414-2424，1994)。
近来，Hammond等在1998年3月12日公布的PCT公开文本WO98/10085中报道了治疗与β-肾上腺素信号转导有关的某些形式充血性心力衰竭的方法。该方法包括向患有与β-肾上腺素信号转导降低有关的心脏病的患者心脏递送编码β-肾上腺素信号转导途径因子的基因。
发明概述本发明涉及治疗心血管疾病的方法和组合物，包括通过将包含编码血管生成蛋白或肽的转基因的载体导入患病组织中从而将该转基因递送至所述组织，其中该转基因得以表达并且疾病症状得到改善。例如，可以通过将含有转基因的载体导入患者的至少一条冠状动脉中，增加心脏的收缩功能和/或血流量，其中该转基因被递送至心肌并在其中表达。本发明还提供用于外周血管疾病如外周动脉闭塞性疾病(PAOD)的方法。正如本文所描述和举例说明的，由此这些方法可以用于治疗心脏疾病、外周血管疾病和类似病症。
本发明提供用于增加患者缺血组织中的血流量的方法，包括将血管生成蛋白或肽递送至所述组织的缺血区域，方式是将包含该转基因的载体导入该组织，籍此该转基因在该组织中表达而组织中的血流量增加。一方面，将包含编码血管生成蛋白或肽的转基因的载体导入缺血的骨骼肌中，在其中该血管生成蛋白或肽被表达并导致该组织中的血流量增加和缺血情况的减少。在另一实施方案中，将该载体导入为缺血组织提供血液的血管中(例如向供应心肌的冠状动脉中、或向外周动脉如供应骨骼肌的股动脉中导入)。本发明所用载体可以是质粒，优选是病毒载体，例如复制缺陷型腺病毒。以下描述和举例说明了本发明的各方面和治疗用途。
一方面，本发明提供增强患者心脏收缩功能的方法，包括通过将包含编码血管生成蛋白或肽的转基因的载体导入心肌，而将该转基因递送至患者的心肌中(优选地通过递送至一或多条冠状动脉中)，其中该转基因被递送至心肌并得以表达，而心脏的收缩功能得以增强。例如，可以通过冠状动脉内注射，将该转基因导入向心肌供血的一或多条冠状动脉或隐静脉或胸廓内动脉移植物中。转基因优选编码至少一个血管生成蛋白或肽。用于本发明的载体可以是质粒或优选是病毒载体，包括例如复制缺陷型腺病毒。通过向一或两条冠状动脉或移植物的内腔中(优选向左和右冠状动脉或移植物中)深度(至少约1cm)注射优选按光密度测量确定的107-1013个病毒颗粒量(更优选109-1011个病毒颗粒)的病毒载体原液(优选含有相对少或没有野生型病毒)，可以用血管生成蛋白或肽编码基因向心脏局部转染期望数量的细胞，尤其是心肌细胞，籍此使基因转移治疗效力最大化并使心脏外部位的非期望血管生成和病毒蛋白引起炎症反应的可能性最小化。如果使用心肌细胞特异性启动子，则可以进一步将表达限制在心肌细胞中以便进一步降低在非心脏组织如视网膜中生成血管的潜在有害影响。
本发明还提供可以用于该治疗技术中的试剂盒和组合物。
附图简述
图1显示了在充血性心力衰竭的猪模型中起搏过程中壁增厚(wallthickening)的百分数。随着心力衰竭的发展，在起搏前(第0天)和每隔7天相继在心室间隔和外侧壁评价壁增厚的百分数(见实施例1)。符号代表平均值；误差线指示一个标准差(1SD)。双向ANOVA(重复测量)显示，起搏的持续时间(P＜0.001)和区域(P＝0.001)影响壁增厚的百分数。而且，壁增厚的改变方式在两个区域间是不同的(P＜0.0001)。通过Tukey方法测试这两个区域在每个时间点壁增厚的百分数的平均值上的差异；这些分析的P值显示在误差线下。
图2A和2B显示了在充血性心力衰竭的猪模型中起搏过程中心内膜下的血流量，描述于实施例1。
对于图2A，在沿着x轴所列的条件下相继地在室间隔和外侧壁评价心内膜下(endo)的血流量。天是指获得测量值的持续起搏日期(0，起搏开始；14，第14天；21-28，第21-28天)。PACE是指使用激活的(+)或还是静止的(0)起搏器获得血流量测定值。起搏器频率是225bpm。(数量值见本文表3)。符号代表平均值；误差线代表1SD。双向ANOVA(重复测量)显示，起搏持续时间(P＝0.0001)和区域(P＝0.017)影响心内膜下的血流量。而且，心内膜下血流量的改变方式在这两个区域间是不同的(P＜0.006)。通过Tukey方法测试这两个区域在每个时间点心内膜下血流量的平均值上的差异；这些分析的P值显示在误差线下。
对于图2B，在沿着x轴所列的条件下相继地在室间隔和外侧壁评价每次搏动心内膜下的血流量。符号和条件同图2A。(数值见本文表4)。双向ANOVA(重复测量)显示，起搏的持续时间(P＝0.0001)和区域(P＝0.0198)影响了每次搏动的心内膜下血流量。
图3A显示随着心力衰竭的发展，在起搏前(第0天)和每隔7天在室间隔和外侧壁相继评价的纵向收缩末期壁压(见实施例1)。双向ANOVA(重复测量)显示，起搏的持续时间(P＜0.0001)影响了收缩壁压。然而，两个区域的收缩壁压方式相似。测量是用未激活的起搏器进行的。
图3B显示了在充血性心力衰竭的猪模型中起搏过程中的冠状血管阻力，见实施例1。在沿x轴的所列条件下相继地在室间隔和外侧壁中评价冠状血管阻力的指数。符合和条件与图2相同。双向ANOVA(重复测量)显示，起搏的持续时间(P＝0.0001)和区域(P＜0.013)影响了冠状血管阻力指数。而且，冠状血管阻力的改变方式在两个区域间是不同的(P＝0.0012)。通过Tukey分析测试这两个区域在每个时间点冠状血管阻力的平均值上的差异。该分析显示起搏开始后外侧壁中的冠状血管阻力比间隔中的高(P值显示在误差线下)。
图4显示用于基因转移的示例性复制缺陷重组腺病毒的构建示意图，描述于以下实施例中。
图5是显示编码转基因的腺病毒的拯救重组构建示意图。
图6A和6B显示了测试动物的区域收缩功能，描述于实施例5中。图6A显示了基因转移后2周测试动物的结果，而图6B显示了基因转移后12周的结果。
图7A、7B和7C显示了相应于心肌对比超声心动图的图。白色区域代表对比增强(更多的血流量)而暗区代表血流量减少。图7A说明在正常猪中的急性LCx闭塞。图7B说明在用LacZ基因转移后14天IVS和LCx床间对比增强的差异，表明在心房起搏(200bpm)期间两个区域的血流量不同。图7C中，FGF-5基因转移后14天，对比的增强在IVS和LCx床中似乎相同，说明心房起搏期间这两个区域有相似血流量。这些结果描述在实施例5中。
图8显示峰值对比比率(peak contrast ratio)(血流量的相关值)，其表示为缺血区域(LCx床)的峰值视频强度(peak videointensity)除以室间隔(IVS)的峰值视频强度的比值，峰视频强度的测量方式是在用lacZ(对照基因)和用FGF-5作基因转移之前和之后14±1天，以及在FGF-5基因转移后12周，在5只动物中，于心房起搏(200bpm)期间使用基于计算机的图像分析程序从视频图象进行测量(描述于实施例5)。流向缺血床的血液在使用对照基因作基因转移后保持正常的50％，但在使用FGF-5作基因转移后增加超过正常的2倍(p＝0.0018)，此效果持续至少12周。
图9显示用FGF-5和用lacZ作基因转移(描述于实施例5)后，通过显微镜分析测定的缺血和不缺血区域中的血管数量。与接受LacZ基因的动物相比，在接受FGF-5基因转移的动物的缺血和不缺血区域中每根纤维周围的毛细血管数量增加(p＜0.038)。
图10A、10B和10C是凝胶图，说明根据本发明在向心肌基因转移血管生成转基因后DNA、mRNA和蛋白质的表达(描述于实施例5)。图10D是PCR扩增后的凝胶图，说明在处理动物的视网膜、肝或骨骼肌中没有任何可检测到的基因转移(描述于实施例5)。
图11比较了使用不同血管生成基因结构，FGF-4、FGF-5和FGF-2LI+/-sp(即，FGF-2LI加或减分泌信号肽)，进行体内基因转移获得的壁增厚，见实施例6和7。
图12显示FGF-4基因转移后缺血区域的功能改善与提高的区域灌注有关。
图13比较了注射FGF-4、FGF-5和FGF-2LI+/-sp(＝FGF-2LI加或减分泌信号肽)所导致的灌注(血流量)，见实施例6和7。
图14比较了用FGF-2LI加(FGF-2LI+sp)或减分泌信号肽(FGF-2LI-sp)作基因转移导致的壁增厚，见实施例7。
优选实施方案详述定义“心脏疾病”是指急性和/或慢性心脏功能障碍。心脏疾病常与心脏收缩功能的降低有关，并可能与可见的心肌血流量减少(例如冠状动脉病的结果)有关。心脏疾病的表现包括心肌缺血，这可以导致心绞痛、心脏病发作和/或充血性心力衰竭。
“心肌缺血”是心脏肌肉不能接受到充足水平的氧和养料的一种疾病，该疾病的典型原因是向心肌的供血不足(例如作为冠状动脉疾病的结果)。
“心力衰竭”在临床上定义为心脏不能向躯体提供充足血流量以满足代谢需要的疾病。症状包括气喘、疲劳、乏力、腿浮肿和不耐运动。体检时，心力患者往往出现心率和呼吸速率升高、湿啰音(指示肺中有液体)、水肿、颈静脉怒张、而且一般有心脏增大。严重心力衰竭患者有高死亡率；典型地50％的患者在出现该病后的两年内死亡。在一些情况下，心力衰竭与严重的冠状动脉疾病(“CAD”)有关，CAD典型地导致心肌梗死和进行性慢性心力衰竭或急性低排出量状态，参见本文和本领域的描述。在其它情况下，心力衰竭与没有相关严重冠状动脉疾病的扩张型心肌病有关。
“外周血管疾病”是指急性或慢性外周(即非心脏)血管和/或其供应的组织的功能障碍。和心脏疾病一样，外周血管疾病典型地是由于血管组织提供给组织的血流量不足导致的，血液的缺乏可导致例如缺血、或在严重情况下组织细胞的死亡。外周血管疾病方面包括，但不限于，外周动脉阻塞病(PAOD)和外周肌肉缺血。外周血管疾病的症状常常表现在患者的四肢，特别是腿。
正如本文所用，术语“具有疗效”和“成功治疗”基本上具有相同意义。尤其是，如果心脏疾病患者在根据本发明方法接受血管生成因子转基因后表现出可见的和/或可测量到的一或多种心脏疾病症状降低或消失，则该患者的疾病得到成功“治疗”。患者也可以感受到这些病征或症状的减轻。因此，成功治疗心脏疾病病情的指标包括患者表现出或感受到任何一种如下症状的减轻心绞痛、疲劳、乏力、气喘、腿浮肿、湿啰音、心率或呼吸速率、水肿或颈静脉怒张。患者还可以表现出更大的运动耐受性、具有较小的心脏、心室和心脏的功能得到改善，而且一般与心脏疾病相关的需要住院的次数减少。心血管功能的改善可以足以满足患者的代谢需要，并且患者在轻微用力或休息时可以不表现出症状。这些病征和症状的许多可以容易地通过肉眼观察到和/或通过医师熟悉的常规程序测量到。改善的心血管功能的指标包括经治疗的组织中血流量增加和/或收缩功能增加。正如下述，可以通过铊成像(描述于Braunwald，心脏疾病(Heart Disease)，第4版，第276-311页(Saunders，Philadelphia，1992))或通过超声心动描记术(描述于实施例1和5及Sahn，DJ等，Circulation581072-1083，1978)测量患者的血流量。使用这些方法可以比较血管生成基因转移前和后的血流量。改善的心脏功能与减轻的病征和症状相关，见上述。除了超声心动描述术外，还可以通过本领域已知的核(非侵入性的)技术测量射血分数(LV)。同样，根据本发明可以测量经治疗的外周组织中的血流量和收缩功能。
“血管生成蛋白或肽”是指能够促进血管生成或血管生成活性(即血管发生)的任何蛋白质或肽。
“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或它们的类似物)聚合形式。该术语是指分子的一级结构，因此包括双链和单链DNA、以及双链和单链RNA。它还包括修饰的多核苷酸如甲基化的和/或带帽的多核苷酸。
应用于多核苷酸的“重组”是指该多核苷酸是克隆、限制和/或连接步骤、及其它导致产生不同于天然存在多核苷酸的结构的方法的各种组合的产物。
“基因”或“转基因”是指包含编码多肽的序列的多核苷酸或多核苷酸的部分。对于大多数情况，会期望基因还包含与该编码序列可操作连接的启动子，以便有效地启动转录。正如本领域熟知的，还可以包括增强子、阻遏子和其它调节序列以便调节基因的活性。(参见例如以下引用的文献)。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换用于指任何长度的氨基酸聚合物。这些术语还包括通过包括糖基化、乙酰化和磷酸化在内的反应经翻译后修饰的蛋白质。
“异源”成分是指该成分被导入一个与其天然所定位的实体不同的实体中或是在其中产生。例如，来源于一种生物、但通过遗传工程技术而被导入至一种不同生物中的多核苷酸，是异源多核苷酸，如果表达的话它可以编码异源多肽。类似地，从其天然编码序列中取出的、与一个不同的编码序列可操作连接的启动子或增强子是异源启动子或增强子。
“启动子”在本文中用于指控制与其可操作连接的基因或编码序列转录的多核苷酸序列。来自多种不同来源的大量启动子，包括组成型、诱导型和阻遏型启动子，是本领域熟知的(并且在数据库如GenBank中作了标识)，并且可以作为克隆的多核苷酸序列或其部分(从例如ATCC等保藏单位以及其它商业或个人来源)获得。
“增强子”在本文中用于指增强与其可操作连接的基因或编码序列转录的多核苷酸序列。来自多种不同来源的大量增强子是本领域熟知的(并且在数据库如GenBank中作了标识)，并且可以作为克隆的多核苷酸序列或其部分(从例如ATCC等保藏单位以及其它商业或个人来源)获得。大量包含启动子序列的多核苷酸(例如常用的CMV启动子)也包括增强子序列。
“可操作连接”是指两个或多个成分并置，其中所述这些成分处于相互关联的状态，这使得它们可以按预期的方式发挥功能。如果启动子控制基因或编码序列的转录，则该启动子可操作地与该基因或编码序列相连。尽管可操作相连的启动子一般被置于编码序列的上游，但不必与之邻近。如果一个增强子增强了编码序列的转录，则该增强子与该编码序列可操作地相连。可操作连接的增强子可以定位在编码序列的上游、其中或下游。如果一个聚腺苷酸化序列被定位在编码序列的下游末端以致转录通过编码序列进入此聚腺苷酸化序列，则该聚腺苷酸化序列与该编码序列可操作地相连。
“复制子”是指包含复制起点的多核苷酸，复制起点将允许该多核苷酸在适当的宿主细胞中复制。例子包括其中可以整合有异源核酸的靶细胞染色体(例如核和线粒体染色体)、以及染色体外复制子(例如复制质粒和附加体)。
术语“基因递送”、“基因转移”等在本文中是指将外源多核苷酸(有时称“转基因”)导入宿主细胞，而不论用于进行导入的方法是什么。这些方法包括各种熟知技术例如载体介导的基因转移(通过例如病毒感染/转染、或各种其它基于蛋白质或基于脂的基因递送复合物)以及利于递送“裸”多核苷酸的技术(例如电穿孔、“基因枪”递送和各种其它用于导入多核苷酸的技术)。导入的多核苷酸在宿主细胞中可以是稳定的或是暂时维持在其中。适合的维持典型地需要所导入的多核苷酸含有和宿主细胞相容的复制起点或整合在宿主细胞的复制子如细胞外复制子(例如质粒)或核或线粒体染色体中。正如本领域已知的以及本文中描述的那样，已知有许多载体能够介导将基因转移至哺乳动物细胞中。
本文所用术语“体内”基因递送、基因转移、基因治疗等是指将包含外源多核苷酸的载体直接导入生物体内如人或非人哺乳动物体内，籍此该外源多核苷酸被体内导入该生物的细胞中。
“载体(vector)”(有时称基因递送或基因转移“载体(vehicle)”)是指包含待体外或体内递送至宿主细胞中的多核苷酸的高分子或分子复合物。待递送的多核苷酸可以包含基因治疗的目的编码序列。
术语“脉管系统”或“脉管”是指遍布哺乳动物躯体携带血液(以及淋巴液)的管道系统。
“血管”是指哺乳动物脉管系统的任何管道，包括动脉、小动脉、毛细血管、小静脉、静脉、窦、和血管滋养管。在本发明用于治疗心脏疾病的优选方面，将包含血管生成转基因的载体直接导入向心肌供应血液的脉管管道中。这些脉管管道包括冠状动脉以及隐静脉或胸廓内动脉移植物等管道。
“动脉”是指血液流出心脏的管道。冠状动脉供应心脏本身的组织，而其它动脉供应身体的剩余器官。动脉的一般结构是由多层动脉壁所环绕的内腔组成的。
“个体”或“患者”是指哺乳动物，优选大的哺乳动物、最优选人。
“治疗(treatment)”或“治疗(therapy)”在本文中用于指给个体患者施用能够在个体上引起预防性、治疗性或其它有益效果的药剂。
“基因治疗”在本文中用于指给个体患者施用包含治疗性基因或多个基因的载体。
“治疗性多核苷酸”或“治疗性基因”是指当转移至个体内后，能够在个体中引起预防性、治疗性或其它有益作用的核苷酸序列。文献除非另行指出，否则本发明的实施将使用分子生物学等的常规技术，它们属于本领域的技术范围。文献中对这些技术作了解释。参见例如分子克隆实验室手册(Molecular CloningA LaboratoryManual)，(J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)；当前分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)(F.Ausubel等编，1987和更新的)；基本分子生物学(Essential Molecular Biology)(T.Brown编，IRL Press 1991)；Gene Expression Technology(Goeddel编，Academic Press 1991)；Methods for Cloning and Analysis ofEukaryotic Genes(A.Bothwell等编，Bartlett Publ.1990)；GeneTransfer and Expression(M.Kriegler，Stockton Press 1990)；Recombinant DNA Methodology(R.Wu等编，Academic Press 1989)；PCRA Practical Approach(M.McPherson等，IRL Press at OxfordUniversity Press 1991)；Cell Culture for Biochemists(R.Adams编，Elsevier Science Publishers 1990)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.Miller & M.Calos编，1987)；MammalianCell Biotechnology(M.Butler编，1991)；Animal Cell Culture(J.Pollard等编，Humana Press 1990)；Culture of Animal Cells，第2版(R.Freshney等编，Alan R.Liss 1987)；Flow Cytometry andSorting(M.Melamed等编，Wiley-Liss 1990)；Methods inEnzymology系列(Academic Press，Inc.)；Techniques inImmunocytochemisty，(G.Bullock & P.Petrusz编，Academic Press1982，1983，1985，1989)；Handbook of Experimental Immunology(D.Weir & C.Blackwell编)；Cellular and Molecular Immunology(A.Abbas等，W.B.Saunders Co.1991，1994)；Current Protocolsin Immunology(J.Coligan等编，1991)；Annual Review ofImmunology系列；Advances in Immunology系列；OligonucleotideSynthesis(M.Gait编1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney编，IRL Press 1987)；Arteriosclerosis系列，Thrombosis andVascular Biology(Lippincott，Williams & Wilkins Publishersfor the American Heart Association)；Circulation系列(Lippincott，Williams & Wilkins Publishers for the AmericanHeart Association)；和Circulation Research系列(Lippincott，Williams & Wilkins publishers for the American HeartAssociation)。
描述可以用于本发明方法的递送和手术后勤的其它文献包括下列Topol，EJ(编)，The Textbook of Interventional Cardiology，第2版(W.B.Sauders Co.1994)；Rutherford，RB，Vasular Surgery，第3版(W.B.Saunders Co，1989)；The Cecil Textbook of Medicine，第19版(W.B.1992)；和Sabiston，D.，The Textbook of Surgery，第14版(W.B.1991)。其它描述血管中存在的细胞类型和可以用于本发明方法中的那些脉管系统的细胞类型的文献包括W.Bloom & D.Fawcett，A Textbook of Histology(V.B.Saunders Co.1975)。
多种出版物提出了基因转移在预防疾病包括心脏疾病中的用途。见例如Methods in Virology，Vol.7；Gene Transfer and ExpressionProtols，Murray，E.(编)，Weiss，Clifton，N.J.1991；Mazur等，Molecular and Cellular Biology，21104-111，1994；French，Herz18222-229，1993；Wiliams，Journal of Medical Sciences306129-136，1993；和Schneider，Circulation 881937-1942，1993。
以上部分引用的文献特此并入本文作为参考，只要这些文献给出了用于实施本发明的技术。并入作为参考本申请中引用的所有文献，包括专利、专利申请和其它出版物，均特此并入作为参考。各种优选实施方案的详述以下总结了本发明的各优选方面，这些方面在随后的详述和附图中作了进一步的描述和举例说明。
本发明涉及治疗心血管疾病，包括心肌缺血、心力衰竭和外周血管疾病，的方法。
在本发明方法中，为了治疗心脏疾病，使含有编码血管生成蛋白或肽的基因的载体结构靶向患者的心脏，籍此使此外源血管生成蛋白在心肌中表达，由此通过改善血流量和/或改善心脏收缩功能缓解心脏功能障碍。改善的心脏功能最终将导致心脏疾病或心力衰竭的一或多种症状减轻或消失并使生命延长超过预期的死亡期。
类似地，在根据本发明治疗外周血管疾病中，将包含编码至少一种血管生成蛋白或肽的转基因的载体结构靶向患病组织，如缺血的骨骼肌，由此合成的外源血管生成蛋白将通过增加流向组织患病(如缺血)区域的血流量和/或，在肌肉中，通过提高患病肌肉的收缩功能，缓解和/或治愈外周血管疾病。
因此，在一个优选方面，本发明提供了治疗心肌缺血患者的心脏疾病的方法，该方法包括通过冠状动脉内注射，优选通过直接将载体注入一或两条冠状动脉(或移植物)中，将插有转基因的载体递送至患者的心肌，由此该转基因得到表达而血流量和/或收缩功能得到改善。例如，使用包含编码血管生成蛋白或肽如FGF-5、FGF-4、aFGF、bFGF和/或VEGF的转基因的载体，将该载体递送至心脏，在心脏这些蛋白质或肽在心肌中以治疗上有意义的水平持续一段时间连续产生，从而可以促进心肌患病区域中的血管生成。正如下述，也可以将其它转基因，例如编码β-肾上腺素能信号转导蛋白(beta-adrenergic signalingproteins)或其它心脏或肌肉增强蛋白的那些转基因，和血管生成转基因一起使用。本发明所用载体包括质粒或优选病毒载体，例如复制缺陷腺病毒或腺相关病毒(AAV)。通过向一或两条冠状动脉(或移植物)的内腔中，优选向左和右冠状动脉(或移植物)的内腔中，深入注射病毒载体原液，例如含有相对很少或没有野生型病毒的病毒载体原液，注射量优选为按光密度法所确定的约107-1013个病毒颗粒量(更优选约109-1011个病毒颗粒)，可以用血管生成蛋白或肽编码基因局部转染患病心肌中期望数量的细胞，由此使基因转移的疗效最大化，并使心脏外部位非期望的血管生成和针对病毒蛋白的炎症反应的可能性最小化。
在另一优选方面，本发明还可以用于治疗患有充血性心力衰竭的患者，方法是向所述患者的心脏递送插有转基因的载体，该载体包含编码血管生成蛋白或肽的转基因，籍此该转基因在心肌中表达，导致心脏的血流量和功能提高。在充血性心力衰竭患者中一些表现出扩张性心肌病，而一些表现出有典型与严重或闭塞性冠状动脉病有关的严重心肌梗死。优选地，将载体导入向心脏心肌供血的血管中，以便将载体递送至心肌中。优选地，将载体导入冠状动脉、隐静脉移植物或胸廓内动脉移植物(internal mammary artery graft)的内腔中；最优选地，将载体导入左和右冠状动脉的内腔。冠状动脉内注射优选以相对深地(例如优选进入血管内腔至少约1cm)单次注入所选择动脉的每一条中的方式来进行。
本发明技术对于预防或缓解患有(或可能患有)心肌梗死的患者的破坏性心室重构也是有用的。同样，向患者心脏递送包含编码血管生成蛋白质或肽的转基因(优选与用于该基因表达的启动子可操作连接)的载体，籍此该转基因在所述心脏中表达而破坏性心室重构得到缓解。编码血管生成蛋白和肽的转基因本发明中，可以使用能够增加血流量和/或收缩功能的一或多个编码血管生成蛋白或肽因子的转基因。通过本文和本领域的所述方法可测量到表现出血管生成活性的任何蛋白质或肽，均可以潜在地用于本发明中。这些血管生成蛋白中的许多是本领域已知的，而且新的形式可通过常规方式鉴定。适合的血管生成蛋白或肽的例子是成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)家族的成员，和其它。FGF家族成员包括，但不限于，aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-4(又称“hst/KS3”)、FGF-5、FGF-6。已显示在体外或体内VEGF可由心肌细胞响应缺血而表达；它是生理条件下以及病理状态的适应性反应过程中血管生成的调节物(Banai等，Circulation 892183-2189，1994)。VEGF家族包括，但不限于，VEGF-A亚家族(例如VEGF-121、VEGF-145、VEGF-165、VEGF-189和VEGF-206)、及VEGF-B亚家族(例如VEGF-167和VEGF-186)、和VEGF-C亚家族。PDGF包括例如PDGF A和PDGF B，IGF包括例如IGF-1。其它血管生成蛋白或多肽是本领域已知的，而新的血管生成蛋白或多肽可以通过常规方式鉴定。编码这些和其它蛋白质的基因的核苷酸序列、和相应的氨基酸序列同样是本领域已知的(参见例如GENBANK序列数据库)。
血管生成蛋白和肽包括血管生成蛋白或肽的肽前体、和“衍生物”及“功能性等同物”，肽前体在翻译后加工为活性肽。血管生成蛋白或多肽的衍生物是具有相似氨基酸序列并一定程度上保留相关血管生成蛋白或肽的一或多种活性的肽。正如本领域技术人员熟知的，有用的衍生物一般在血管生成活性的相关蛋白区或域中具有相当大的序列相似性(氨基酸水平上)。类似地，本领域技术人员将容易明了，“功能性等同物”是指蛋白质或多肽所具有的活性可以替代特定血管生成蛋白或肽的一或多种活性。优选的功能等同物保留了特定血管生成蛋白或肽的全部活性；然而，该功能性等同物所具有的活性可以在定量测量时比野生型肽或蛋白的更强或弱。
对于FGF家族的详情，参见例如Burgess，Ann.N.Y.Acad.Sci.63889-97，1991；Burgess等，Annu.Rev.Biochem.58575-606，1989；Muhlhauser等，Hum.Gene Ther.61457-1465，1995；Zhan等，Mol.Cell Biol.，83487，1988；Seddon等，Ann.N.Y.Acad.Sci.638；98-108，1991。对于人hst/KS3(即FGF-4)，参见Taira等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842980-2984，1987。对于人VEGF-A蛋白，参见例如Tischer等，J.Biol.Chem.20611947-11954，1991，及其中的参考文献；和Neufeld等，WO98/10071(1998年3月12日)。已知血管生成蛋白的其它变体同样已有描述；例如VEGF蛋白变体和VEGF相关蛋白，参见例如Baird等，WO99/40197，(1999年8月12日)；和Bohlen等，WO 98/49300(1998年11月5日)。血管生成蛋白的组合和编码这些组合的基因递送载体描述于Gao等，2000年6月30日提交的题为“二元重组基因治疗组合物和应用方法”的USSN 09/607,766，特此完整地并入作为参考。本领域技术人员也将明了，血管生成蛋白可以通过增强其它血管生成蛋白的表达、稳定性或功能性来促进血管生成。这样的血管生成蛋白或肽的例子包括，例如响应低氧诱导的调节因子(例如低氧诱导因子如Hif-1、Hif-2等；参见如Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(9)4304-8，1993；Forsythe等，Mol.Cell Biol.16(9)4604-13，1996；Semenza等，Kidney Int.，51(2)553-5，1997；和O’Rourke等，Oncol.Res.，9(6-7)327-32，1997)；以及其它调节因子例如心血管疾病相关生理状态如炎症诱导的那些(如诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、和它的组成型对应物(cNOS)；参见例如Yoshizumi等，Cir.Res.73(1)205-9，1993；Chartrain等，J.Biol.Chem.269(9)6765-72，1994；Papapetropoulos等，Am.J.Pathol.1505(5)1835-44，1997；和Palmer等，Am.J.Physiol.274(2 Pt1)L212-9，1998)。这些血管生成蛋白的其它例子包括某些胰岛素样生长因子(如IGF-1)和血管形成素(angiopoietins)(Angs)(据报道它可以促进和/或刺激其它血管生成蛋白如VEGF的表达和/或活性)(参见如Goad等，Endocrinology，137(6)2262-68(1996)；Warren等，J.Bio.Chem.，271(46)29483-88(1996)；Punglia等，Diabetes，46(10)1619-26(1997)；和Asahara等，Circ.Res.，83(3)233-40(1998)和Bermont等，Int.J.Cancer 85117-123，2000)。类似地，据报道可以体内诱导血管形成(参见如Grant等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 901937-1941，1993)的肝细胞生长因子(又称Scatter因子)也已被报道可以增加VEGF的表达(见例如Wojta等，Lab Invest.79427-438，1999)。其它血管生成多肽的例子包括充当内源性血管生成基因启动子的天然和合成的调节肽(血管生成多肽调节物)。天然的血管生成多肽调节物可以来源于内源性血管生成基因的诱导物。正如上述，Hif是此类血管生成基因的一个示例性例子，据报道它可以通过诱导其它血管生成基因的表达促进血管生成。合成的血管生成多肽调节物可以例如通过制备特异结合内源性血管生成基因编码区上游序列并可以用于诱导这些内源性基因表达的多锌指结合蛋白来设计。对许多基因的研究已使人们发现了设计这些锌指DNA结合蛋白的“规律”(参见如Rhodes和Klug，Scientific American，1993年2月，第56-65页；Choo和Klug，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(23)11163-7，1994；Rebar和Pabo，Science，263(5147)671-3，1994；Choo等，J.Mol.Biol.273(3)525-32，1997；Pomerantz等，Science 26793-96，1995；和Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，945525-5530，1997)。正如本领域技术人员将明了的，许多其它编码能够直接或间接促进血管生成的蛋白质或肽的基因可以通过常规方式鉴定，而且新基因可以基于与已知血管生成蛋白或肽编码基因的相似性，或基于发现的这些基因编码促进血管生成的蛋白或肽的能力来鉴定。这些基因和所编码的多肽的序列信息可以容易地从序列数据库如GenBank或EMBL获得。编码这些蛋白质的多核苷酸也可以从基因文库通过例如本领域常规的PCR或杂交技术获得。
优选地，编码血管生成蛋白的转基因与指导该基因在哺乳动物细胞如心脏或骨骼肌细胞中转录和表达的启动子可操作地连接。一个目前优选的启动子是CMV启动子。在其它优选实施方案中，正如以下进一步讨论的，启动子是组织特异性启动子，如心脏特异性启动子(如心肌细胞特异性启动子)。优选地，编码血管生成因子的基因还与聚腺苷酸化信号可操作地连接。
基因转移方法的成功要求基因产物从转染的细胞中合成并分泌。因此，优选的血管生成蛋白或肽包括天然分泌的或经修饰后允许进行分泌的那些，例如可操作地与信号肽连接的那些。从此观点看，编码分泌性血管生成蛋白如FGF-4、FGF-5或FGF-6的基因是优选的，因为这些蛋白质含有功能性分泌信号序列并可以容易地自细胞中分泌出来。如果不是大多数也是许多人VEGF蛋白质(包括但不限于VEGF-121和VEGF-165)也可以容易地分泌并在分泌后扩散。因此，当表达后，这些血管生成蛋白可以容易地达到心间质并诱导血管生成。在血管生成过程中生成的血管包括毛细血管(它们是直径约8微米的内径最小的血管)、和直径至少约10微米的较大内径血管。血管生成活性可以使用本领域已知的方法或本文所述的方法通过测量血流量、所处理组织的功能增强或血管的存在来确定。例如，可以通过目测观察或通过对组织部位作显微镜分析(见实施例5)定量动物中的毛细血管数量或密度。
对于缺少天然分泌信号序列的其它血管生成蛋白如aFGF(FGF-1)和bFGF(FGF-2)，可以使用本领域技术人员熟悉的标准重组DNA方法学重组制备具有分泌信号序列的融合蛋白。据认为，天然情况下aFGF和bFGF在一定程度上是分泌的；然而，可以通过将其它分泌信号序列包含在内以增强该蛋白质的分泌。分泌信号序列典型地被置于期望蛋白质的N端，但也可以放置在适于允许该血管生成因子分泌的任何位置。例如，含有适合信号序列的多核苷酸可以和所选血管生成蛋白基因的第一个密码子的5’端融合。适合的分泌信号序列包括FGF-4、FGF-5、FGF-6基因的信号序列或不同分泌蛋白如IL-1β的信号序列。以下的实施例7举例说明了对血管生产蛋白的一类修饰以使之包含来自另一蛋白的信号序列，该修饰是通过用指导分泌型第二种蛋白分泌的残基置换血管生成蛋白中的残基。可以使用来源于正常从心肌分泌的蛋白质的信号序列。血管生成基因还可以提供能够改善如心脏细胞功能的其它功能。例如，FGF可以提供心脏增强和/或“缺血保护剂作用”，这些作用可以独立于其促进血管生成的能力。因此，可以使用血管生成基因通过本质上附加于促进血管生成作用之上或取代此作用的机制，增强心脏的功能。作为另一个例子，可以促进血管生成的IGF也可以增强肌肉细胞的功能(见如Musaro等，Nature 400581-585，1999)；并表现出抗细胞凋亡作用(见如Lee等，Endocrinology 1404831-4840，1999)。根据本发明的方法，也可以使用其它增强肌肉功能的蛋白质。
正如上述，本发明可以使用编码一或多个血管生成蛋白或肽的基因。因此，可以根据本文所述方法使用一或多个载体递送编码血管生成蛋白或肽的组合的基因。本文和本领域中描述的血管生成基因家族包含许多这样基因的例子。优选地，当使用此类组合时，这些基因可以来源于不同的血管生成因子家族(例如从来自FGF、VEGF、PDGF和IGF的两个或多个不同成员中选出的组合)。举一个简单的例子，对于这样的组合，可以使用包含FGF基因和VEGF基因的载体。例如，我们已使用FGF基因(FGF-4片段140)(见如Basilico等在1995年10月17日颁布的美国专利5,459,250中描述的FGF-4基因和其变体，以及相关案例)和VEGF基因变体(VEGF-145突变蛋白2)(见如Neufeld等在1998年3月12日公开的WO 98/10071中描述的VEGF-145基因和其变体，及相关案例)的组合。这些组合可以表现出额外的和/或协同的效果。基于这些说明，本领域技术人员将明了许多其它组合。根据本发明，包含血管生成基因或血管生成基因组合的载体还可以包括一或多个能够用于进一步增强组织血流量和/或收缩功能的其它基因。例如，在心脏中，可以联合使用编码β-ASP的基因(见Hammond等，1998年3月12日公开的共同待决申请WO 98/10085)和一或多个编码血管生成蛋白或肽的基因。类似地，可以将其它心脏或肌肉细胞增强蛋白并入本发明的组合物和方法中。
可以用于本发明的基因组合可以在单个的载体中(例如作为不同的基因，每个基因均处于一个启动子的控制下，或作为单一的转录或翻译融合基因)提供。还可以以载体组合(可以来源于相同或不同载体，例如腺病毒载体的组合、或腺病毒载体和AVV载体的组合)的形式提供基因组合；它们可以被同时或连续地导入患者中。对于腺病毒(Ad)和腺相关病毒(AAV)，Ad(其正常是AAV的辅助病毒)的存在可以增强AAV介导基因转移的能力。因此，根据本发明，可以将Ad载体在AAV载体导入的同时或之前导入。除了转染效率外，载体的选择也受到转基因表达的期望期限的影响。例如，由于许多血管生成基因无需长期表达即可以实现长期作用(例如通过起始或促进导致组织脉管化增加的血管生成过程)，因此可以使用腺病毒(或正常不整合入宿主DNA的其它载体)导入血管生成基因，腺病毒可以在携带期望进行长期表达的转基因(例如β-ASP转基因)的AAV载体导入之前使用或组合使用。基于本发明的教导和举例说明，转基因和/或载体的其它组合对于本领域技术人员是明了。
为了治疗人类，尽管也可以使用其它哺乳动物来源的表现出交叉物种活性(即在人体中具有血管生成活性)的血管生成蛋白，但优选编码人来源的血管生成蛋白基因。用于体内基因递送的载体一般地，目的基因被体内转移至心脏或外周脉管系统中，并指导所编码蛋白的产生。优选地，这种产生是组成型的(尽管也可以使用诱导表达系统)。
用于本发明的载体包括病毒载体、基于脂的载体(如脂质体)和其它能够将DNA体内递送至非分裂细胞中的载体。目前优选的是病毒载体，尤其是复制缺陷型病毒载体，包括例如复制缺陷型腺病毒载体和腺相关病毒载体。为了易于在本发明中产生和使用，目前最优选复制缺陷型腺病毒载体。腺病毒有效感染非分裂细胞，由于心肌细胞的非复制性本质，由此腺病毒对于在心肌中表达重组基因是有用的。
适于体内基因治疗的多种其它载体可以容易地用于递送本发明所用的血管生成蛋白转基因。这些其它载体包括其它病毒载体(如AAV)、非基于病毒蛋白的递送平台、以及基于脂的载体(如脂质体、微团、含脂乳剂和本领域已描述过的其它载体)。关于AAV载体，其是本领域已知的，它们优选在人体中是复制缺陷的，例如去除了rep和cap基因(因此该序列必须，典型地在包装细胞系中，反式提供以便实现AAV载体的复制和包装)，而且插入的转基因(包括例如与其可操作连接的启动子)的侧翼优选是AAV的末端反向重复(ITR)。
重组病毒载体包含一或多个异源基因或序列。因为许多病毒载体表现出与包装有关的大小限制，而且因为对于体内递送一般优选复制缺陷型病毒载体，所以典型地通过置换病毒基因组的一或多个部分的方式导入异源基因或序列。作为缺失的结果，这些病毒可以成为复制缺陷的，由此在病毒的复制和衣壳化的过程中就要求反式提供缺失的(多个)功能(通过使用例如带有复制和/或衣壳化所必需的基因的辅助病毒或包装细胞系)(见例如参考文献和下列举例说明)。正如上述，其中插入转基因以代替病毒的rep和/或cap基因的修饰AAV载体同样是本领域熟知的。类似地，在病毒颗粒外部携带待递送的多核苷酸的修饰病毒载体也已有描述(见如Curiel，DT等，PNAS 888850-8854，1991)。描述这些和其它基因递送载体的文献是本领域已知的，本文引用了其中的许多。
正如以上和引用文献中描述的，载体还可以包括进一步调节基因递送和/或基因表达或在其它方面向所靶向细胞提供有益性质的其它成分或功能。这些其它成分包括，例如，影响结合或靶向细胞的成分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的成分)；影响细胞摄取载体的成分；影响摄取后载体和其核酸在细胞内的加工和/或定位的成分(例如介导细胞内加工和/或核定位的药剂)；和影响该多核苷酸表达的成分。这些成分还可以包括标记，例如可检测和/或可选择标记，这些标记可以用于检测或选择摄取了载体并且表达载体所递送核酸的细胞。这些成分可以作为载体的天然特征(例如使用含有介导结合和摄取的成分或功能的某些病毒载体)提供，或可以对载体进行修饰以提供这些功能。可检测标记基因使得带有该基因的细胞可以被特异地检测到(例如与未带有该标记基因的细胞区分开)。可检测标记基因的一个例子是编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因，该基因允许带有lacZ基因的载体所转导的细胞可以通过染色的方式得到检测，见下述。选择标记可以是正的、负的或双功能的。正选择标记允许选出带有该标记的细胞，而负选择标记允许选择除去带有该标记的细胞。多种此类标记基因已有描述，包括双功能性(即正/负)标记(见如Lupton，S.，1992年5月29日公开的WO 92/08796；和Lupton，S.，1994年12月8日公布的WO 94/28143)。这些标记基因可以提供一种在基因治疗内容中可能有利的额外控制措施。大量的这样载体是本领域已知的，并且一般是可获得的(见如以上引用的各种文献)。
描述能够用于本发明方法的腺病毒载体和其它病毒载体的参考文献包括以下Horwitz，M.S.，腺病毒科和其复制，Fields，B.等(编)Virology，第2卷，Raven Press New York，第1679-1721页，1990)；Graham，F.等，第109128页，《Methods in Molecualr Biology》，第7卷基因转移和表达实验方案，Murray，E.(编)，Humana Press，Clifton，N.J.(1991)；Miller，N等，FASEB Journal 9190-199，1995；Schreier，H.，Pharmaceutica Acta Helvetiae 68145-159，1994；Schneider和French，Circulation 881937-1942，1993；Curiel D.T.等，Human Gene Therapy 3147-154，1992；Graham，F.L.，等，WO 95/00655(1995年1月5日)；Falck-Pedersen，E.S.，WO95/16772(1995年6月22日)；Denefle，P.等，WO 95/23867(1995年9月8日)；Haddada，H.等，WO 94/26914(1994年11月24日)；Perricaudet，M.等，WO 95/02697(1995年1月26日)；Zhang，W.等，WO 95/25071(1995年10月12日)。多种腺病毒质粒也是可以从商业途径获得的，包括例如Microbix Biosystems of Toronto，Ontario(见例如Microbix Product Information SheetPlasmidsfor Adenovirus Vector Construction，1996)。多种其它的腺病毒载体和它们的制备和纯化方法可以通过常规方式确定。
描述可以用于本发明方法的AAV载体的其它文献包括以下Carter，B.，Handbook of Parvoviruses，第1卷，第169-228，1990；Berns，Virology，第1743-1764页(Raven Press 1990)；Carter，B.，Curr.Opin.Biotechnol.，3533-539，1992；Muzyczka，N.，CurrentTopics in Microbiology and Immunology，15892-129，1992；Flotte，T.R.等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7349-356，1992；Chatterjee等，Ann，NY Acad.Sci.，77079-90页，1995；Flotte，T.R.等，WO 95/13365(1995年5月18日)；Trempe，J.P.等，WO95/13392(1995年5月18日)；Kotin，R.，Human Gene Therapy，5793-801，1994；Kotin等，WO 98/11244(1998年3月19日)；Kotin等，WO 99/61601(1999年12月2日)；Flotte，T.R.等，Gene Therapy2357-362，1995；Allen，J.M.，WO 96/17947(1996年6月13日)；和Du等，Gene Therapy 3254261，1996。多种其它AAV载体和它们的制备和纯化方法均可以通过常规方式确定。
正如以上和科学文献中描述的，许多逆转录病毒来源的系统也已被开发用于体内基因递送。例如，可以修饰逆转病毒的慢病毒属(例如，人免疫缺陷性病毒、猫免疫缺陷病毒等)以便它们能够转导典型非分裂的细胞(见如Poeschla等，PNAS 9611395-11399，1996；Naldini等，PNAS 9611382-11388，1996；Naldini等，Sciene 272263-267，1996；Srinivasakumar等，J.Virol.715841-5848，1997；Zufferey等，Nat.Biotechnol.15871-875，1997；Kim等，J.Virol.72811-816，1998；Miyoshi等，J.Virol.728150-8157，1998；也参见Buchschacher等，Blood 152499-2504，2000；也见The Salk Institute，WO 97/12622(1997年4月10日))。尽管在此方面基于HIV的慢病毒载体系统已受到某种程度的关注，但近来开发了潜在优于基于HIV的系统的其它慢病毒系统，例如基于猫免疫缺陷病毒的慢病毒载体系统(见如Poeschla等，Nat.Med.4354-357，1998；Johnston等，J.Virol.732491-2498，1999；和Johnston等，J.Virol.7349991-5000，1999；也见Romano等的综述，StemCells 1819-39，2000和其中所回顾的文献)。
除了病毒载体外，可以用作基因递送手段的非病毒载体同样也是已知的，并持续得到发展。例如，基于非病毒蛋白的递送平台，如包含DNA结合蛋白和能够介导基因递送的载体或部分的大分子复合物，以及基于脂的载体(例如脂质体、微团、含脂乳剂和其它)在本领域中已有描述。描述可以用于本发明方法的非病毒载体的文献包括以下Ledley，FD，Human Gene Therapy 61129-1144，1995；Miller，N.等，FASEB Journal 9；190-199，1995；Chonn，A.等，Curr.Opin.inBiotech.6698-708，1995；Schofield，JP等，British Med.Bull.51；56-71，1995；Brigham，K.L.等，J.Liposome Res.33149，1993；Brigham，K.L.，WO 91/06309(1991年5月16日)；Felgner，P.L.等，WO 91/17424(1991年11月14日)；Solodin等，Biochemistry3413537-13544，1995；WO 93/19768(1993年10月14日)；Debs等，WO 93/125673；Felgner，P.L.等，美国专利5,264,618(1993年11月23日)；Epand，R.M.等，美国专利5,283,185(1994年2月1日)；Gao等，WO 9622765(1996年8月1日)；Gebeyebu等，美国专利5,334,761(1994年8月2日)；Felgner，P.L.等，美国专利5,459,127(1995年10月17日)；Overell，R.W.等，WO 95/28494(1995年10月26日)；Jessee，WO 95/02698(1995年1月26日)；Haces和Ciccarone，WO 95/17373(1995年6月29日)；Lin等，WO 96/01840(1996年1月25日)。许多其它脂介导的体内基因递送载体和载体递送辅因子已有描述(见例如，Kollen等，Hum.Gene Ther.10615-22，1999；Roy等，Nat.Med.5387-391；Fajac等，Hum.Gene Ther.10395-406，1999；Ochiya等，Nat.Med.5；707-710，1999)。此外，将病毒和非病毒介导的基因递送系统的成分组合起来的系统的开发也已有描述并且可以在本文中使用(见例如Philip等，Mol.Cell.Biol.142411-2418，1994；也见Di Nicola等，Hum.Gene Ther.101875-1884，1999)。各种其它的非病毒基因递送载体和它们的制备和纯化方法可以通过常规方式确定。
如上述，使用载体如病毒载体的基因递送效率可以通过将载体递送至用血管活性剂预先灌注和/或共灌注的血管如动脉或组织中得到增强，所述血管活性剂如组胺或组胺激动剂、或血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白，本文对此进行了描述，而且1999年8月19日公开的共同待决PCT申请WO 99/40945中还对此作了说明。可以用于增强基因递送效率的血管活性剂的另一例子是一氧化氮供体如硝普钠。最优选的是，将血管活性剂和载体一起和/或在载体导入前几分钟内灌注入血管或组织中。血管活性剂在本文中用于指诱导血管渗透性增加和/或增强大分子如基因递送载体从血管转移如跨过毛细血管内皮细胞的天然或合成物质。通过提高血管对大分子的通透性或以其它方式促进大分子转移至动脉灌注的毛细血管床中，血管活性剂可以增强这些载体向所靶向位点的递送，由此增强转基因在靶组织中的整个表达。我们已使用组胺作为活性剂，并且发现该物质相当大地增强了载体向输注部位如心肌的递送。可以使用的组胺衍生物和激动剂，如与组胺H受体相互作用的那些，包括例如2-甲基组胺、2-吡啶基乙基胺、β组氨酸、和2-噻唑基乙基胺。这些和其它组胺激动剂描述于例如Garrison JC.，Goodman和Gilman氏治疗的药理学基础(Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics)(第8版Gilman AG，Rall TW，Nies AS，Taylor P编)Pergamon Press，1990，第575-582页和其它药理学论文中。除了可以用作血管活性剂的组胺和组胺激动剂外，血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF激动剂(见本文和引用文献)也可以诱导血管的通透性增加并因此能够在本文所述组合物和方法的范围内用作血管活性剂以增强基因递送。与使用组胺一样的，VEGF优选在输注载体前几分钟内被输注入供应靶位点的血管中。也可以使用一氧化氮供体如硝普钠(SNP)作为血管活性剂。优选地，在输注载体组合物的时间前几分钟开始并持续至该时间，将一氧化氮供体预先灌注入靶组织中(或供应靶组织的血管中)。还可以在载体组合物的输注过程中持续施用。在人体内不依赖于辅助病毒的复制缺陷型腺病毒载体例子一般，目的基因被体内转移至心脏或外周脉管系统中，并指导所编码蛋白的产生。有几种不同的基因转移方法是可行的。目前优选基于人腺病毒5(Ad5)的不依赖辅助病毒的复制缺陷型系统。使用单次冠状动脉内注射此基于Ad5的重组系统，我们展示了心肌细胞的体内显著转染(Giordano和Hammond，Clin.Res.42123A，1994)。非复制性重组腺病毒载体在冠状动脉内皮细胞和心脏细胞的转染中尤其有用，从而在冠状动脉内注射后导致高效转染。腺病毒载体还可以例如，通过动脉内或直接注射，用于转染外周脉管系统所供应的组织。
正如本文所阐述的，可以使用不依赖辅助者的复制缺陷型人腺病毒5系统，通过单次冠状动脉内注射有效地体内转染大部分心肌细胞。我们还显示，可以使用该递送技术有效地使载体靶向大哺乳动物心脏的心肌。使载体靶向特定细胞或组织类型的其它手段描述于下和本领域中。
在以下描述的各种举例说明中，所用的重组腺病毒载体以人腺病毒5为基础(描述于McGrory WJ等，Virology 163614-617，1988)，它们从腺病毒基因组中缺失了必需的早期基因(通常是E1A/E1B)，因此除非生长在反式提供此缺失基因产物的许可细胞系中否则不能复制。目的转基因可以取代此缺失的腺病毒基因组序列在此复制缺陷腺病毒感染的组织/细胞中克隆和表达。一般地，基于腺病毒的基因转移不导致在靶细胞基因组中的稳定整合。然而，腺病毒载体可以以高滴度增殖并转染非复制性细胞；而且，尽管该转基因不能被传递给子代细胞，但这对于向非活跃分裂的成年心肌进行的基因转移而言是适合的。逆转录病毒载体提供稳定的基因转移，而且目前通过逆转录病毒的假型包装可以获得高的滴度(Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908033-8037，1993)，但目前的逆转录病毒载体一般不能有效地转导非复制细胞(例如心肌细胞)。此外，如果短期的基因转移就足够了，则没有理由承担转基因在宿主DNA中整合的潜在危险。
实际上，我们已阐明，在有限的持续时间内表达血管生成蛋白即足以相当大地改善缺血组织的血流量和功能(见实施例5)。因此，短暂基因转移在治疗学上足以治疗这类心血管疾病。在FGF-5基因转移至心肌后14天内，向缺血床的血流量增加两倍，且该效果持续至少12周(实施例5和图8)。血流量的增加和心脏中毛细血管数量的增加有关(见实施例5)。基因转移后两周内壁增厚程度也增加，并持续至少12周。因此，为了产生疗效，血管生成因子基因并不必在感染细胞中存在几周以上。一旦血管已经出现，为了维持新的脉管结构和血流量的增加，可以不必要求外源性血管生成蛋白作持续表达。
与非分裂细胞如心肌细胞有关的一个优点是病毒载体不容易被宿主细胞的分裂所“稀释清除”。然而，如果必需或期望进一步增加转基因在心脏中的表达持续时间时，则还可以使用E1和E4均缺失的各种第二代腺病毒载体，它们可以和环磷酰胺的施用一起使用(参见如Dai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921401-1405，1995)。
人293细胞(保藏号ATCC CRL 1537；Rockville，MD)是转化了腺病毒E1A/E1B的人胚胎肾细胞，该细胞是制备该复制缺陷型载体的典型有用许可细胞系。然而，也可以使用允许复制缺陷型腺病毒载体在其中增殖的其它细胞系，如HeLa细胞。重组腺病毒载体的构建本发明使用的腺病毒载体可以通过Graham在Virology 163614-617，1988中描述的拯救重组技术来构建。简单地说，将目的转基因克隆在穿梭载体中，该载体含有启动子、多接头和其中缺失了E1A/E1B基因的部分侧翼腺病毒序列。可以将以下两个质粒作为穿梭载体的例子，质粒pAC1(Virology 163；614-617，1988)(或类似物)编码去除了病毒复制必需的早期蛋白E1A和E1B编码序列的人腺病毒5基因组的左末端部分(Virology 163；614-617，1988)，而质粒ACCMVPLPA(Gomez-Foix等，J.Biol.Chem.26725129-25134，1992)含有多接头、CMV启动子、和SV40聚腺苷酸化信号、以及位于侧翼的缺失了E1A/E1B基因的部分腺病毒序列。使用质粒pAC1或ACCMCPLA可以有利于该克隆程序。然而，将穿梭载体和含有完整人腺病毒5基因组但因长度过长而不能被衣壳化的质粒共转染293细胞。可以通过磷酸钙沉淀或脂转染(Zhang等，Biotechniques 15868-872，1993)实施共转染。质粒JM171编码完整的人腺病毒5基因组及载体pBR322中包括氨苄青霉素抗性基因在内的部分(4.3kb)。尽管JM17编码产生成熟病毒颗粒所必需的全部腺病毒蛋白质，但该质粒过长以致无法发生衣壳化(40kb对野生型的36kb)。在共转染细胞的一个小的子集中，含有转基因的穿梭载体如质粒pAC1和具有完整腺病毒5基因组的质粒如质粒pJM17之间的拯救重组提供了重组基因组，该重组基因组缺少E1A/E1B序列、并含有目的转基因但在重组的过程中继发丢失了额外序列如pBR322序列，因此足够小以致可以被衣壳化(见图1)。关于上述方法，我们已报道了成功的结果(Giordano等，Cirulation881-139，1993，和Giordano和Hammond，Clin.Res.42123A，1994)。使用X-gal处理，编码CMV驱动的β-半乳糖苷酶的腺病毒HCMVSP1lacZ(Clin Res 42123A，1994)可以用于评价基因转移效率。定向的载体结构将血管生成转基因的表达限制在心脏或心脏内的特定细胞类型(如心肌细胞)中或限制在其它靶组织(如外周脉管系统中的那些)中，可以提供某些优点，这些将在以下讨论。
例如，本发明考虑到不仅可以通过将转基因递送至冠状动脉或其它组织特异性管道中，而且可以通过使用具有倾向于使基因递送和/或基因表达靶向特定宿主细胞或宿主细胞类型(如心脏或其它肌细胞)的特性的定向载体结构，来实现对定向的使用。因此，该定向载体结构将包括定向的递送载体和/或定向载体，见以下和公开技术中的更为详细描述。限制性递送和/或表达作为一种使基因治疗的潜在效果进一步集中的手段可能是有益的。进一步限制性递送/表达的潜在用途在大部分上取决于所用的载体类型和导入该载体的方法和位置。正如本文所述，已经观察到通过冠状动脉内注射向心肌递送病毒载体可以实质上提供高度定向的基因递送(见以下实施例)。此外，使用一般不导致转基因在宿主细胞复制子中整合的载体(例如腺病毒和许多其它载体)，由于心肌细胞一般不复制，因此可以预期该细胞将表现出相对长的转基因表达。相反，快速分裂细胞如内皮细胞中的表达将由于细胞的分裂和更新而易于降低。然而，按本文所述，也可以使用限制递送和/或表达的其它手段，联合或代替此举例说明的递送方法。
定向递送载体包括例如具有介导优先结合特定宿主细胞或宿主细胞类型和/或优先向这些细胞作基因递送的表面成分(如配体-受体对的成员，其另一半存在于待靶向的宿主细胞上)或其它特性的载体(如病毒、非基于病毒蛋白的载体和基于脂的载体)。正如本领域已知的，许多既是病毒又是非病毒来源的载体具有利于此优先结合的固有性质和/或已经过修饰可实现优先靶向(见例如Douglas等，Nat.Biotech.14；1574-1578，1996；kasahara，N.等，Science 2661373-1376，1994；Miller，N.等，FASEB Journal 9190-199，1995；Chonn，A.等，Curr.Opin.in Biotech.6698-708，1995；Schofield，JP等，British Med.Bull.5156-71，1995；Schreier，H.，Pharmaceutica Acta Helvetiae 68145-159，1994；Ledley，F.D.，Hum.Gene Ther.61129-1144，1995；Conary，J.T.等，WO 95/34647(1995年12月2 1日)；Overell，R.W.等，WO 95/28494(1995年10月26日)；和Truong，V.L.等，WO 96/00295(1996年1月4日))。
定向载体包括其递送导致转基因表达被相对限制在特定宿主细胞或宿主细胞类型中的载体(例如病毒、非基于病毒蛋白的载体、和基于脂的载体)。例如，根据本发明待递送的血管生成转基因可以和异源的组织特异性启动子可操作连接籍此将表达限制在特定组织的细胞中。
例如，可以将来源于编码心肌细胞特异性肌球蛋白轻链(MLC)或肌球蛋白重链(MHC)启动子的基因的组织特异性转录控制序列和转基因如FGF基因在载体如上述腺病毒载体中融合。该转基因的表达由此可以相对被限制在心肌细胞中。使用lacZ已经确定了由心肌细胞特异性MLC和MHC启动子所提供的基因表达效率和特异性程度(使用重组腺病毒系统如本文作为例子的那些)；并已经报道了心脏特异性表达(见例如Lee等，J.Biol.Chem.26715875-15885，1992)。
由于MLC启动子可以包含少至约250bp，因此它易于满足甚至大小受限的递送载体如本文所例举的腺病毒5包装系统。肌球蛋白重链启动子已知是一个强转录启动子，它提供了另一替代的心脏特异性启动子，其包含少于约300bp的碱基。尽管其它启动子如肌钙蛋白C启动子不能提供组织特异性，但它们小而高效。定向的基因表达本发明的未预料到的发现是重组腺病毒可以极为有效地被摄入它所遇到的第一脉管床中。实际上，在实施例4的动物模型中，冠状动脉内注射后，心脏摄取病毒的效率是98％，即98％的病毒在病毒首次通过心肌脉管床的过程中即被除去。而且，注射过程中采自动物的血清在稀释200倍前不能生成病毒斑(Graham，Virology，163；614-617，1988)，这提示存在抑制病毒增殖的血清因子(或结合蛋白)。这两个因素(病毒的有效首次通过附着和血清结合蛋白的存在可能性)可以一起作用以将基因表达限制在病毒遇到的第一个脉管床中。
为了进一步评价冠状动脉内基因转移后基因转移被限制在心脏中的程度，使用聚合酶链式反应(PCR)观察基因转移后两周两只处理动物中是否有病毒DNA在心脏外存在的迹象(以下实施例4)。动物表现出在心脏中而非视网膜、骨骼肌或肝中有病毒存在。PCR极为灵敏以致可以检测到每5,000,000细胞中的单个DNA序列。因此，这些数据证明，基因转移后两周在心脏外组织中没有病毒存在。使用其它血管生成蛋白和衍生物(见下述)进一步证实了这些结果。这些发现极为重要，因为它们证实了转基因定向心脏的概念(即转基因在心脏但不在其它部位提供表达)。此定位的转基因递送和表达提供了安全这个优点，而且增强了本发明在治疗患者中的用途。腺病毒载体的增殖和纯化重组病毒载体如腺病毒载体可以根据标准方法作噬斑纯化。例如，可以在人293细胞(反式提供E1A和E1B功能)中增殖此所获重组腺病毒载体至约1010-1012个病毒颗粒/ml优选范围的滴度。多种可以用于本发明的病毒载体的增殖和纯化技术已有描述。本文例举了腺病毒载体，但也可以使用其它病毒载体如AAV。对于腺病毒，可以感染80％汇合度的细胞并在48小时后进行收获。将感染细胞进行3个冻融循环后，离心沉淀细胞碎片并通过CsCl梯度超离心(优选双CsCl梯度超离心)纯化病毒。体内注射前，将病毒原液脱盐(例如通过Sepharose柱如Sephadex G25作凝胶过滤)。如果期望的话，还可以将此脱盐病毒原液通过0.3微米滤膜过滤。我们典型地通过双CsCl超离心，及随后在磷酸缓冲盐水(PBS)平衡的Sephadex G25上层析，浓缩和纯化病毒原液。所获病毒原液典型地具有至少约1010-1012个病毒颗粒/ml的最终病毒滴度。
优选地，该重组腺病毒是高度纯化的并基本上不含有野生型(潜在复制性)病毒。由于这些原因，例如，可以通过使用适当的引物借助PCR鉴定成功的重组病毒并进行两轮噬斑纯化和双CsCl梯度超离心来实施增殖和纯化，以便排出污染和野生型病毒。递送带有血管生成转基因的载体正如本领域熟知的，用于递送带有血管生成转基因的载体的方法和组合物取决于所用的具体载体。然而，典型地，载体可以是含有药物可接受载体/稀释剂如磷酸缓冲盐水的注射制剂形式。以下描述了其它药物载体、制剂和剂量。
对于心脏疾病(特别是对于否则不会定向递送的载体结构和/或限制在心肌或其它靶组织中的表达)，目前优选的体内递送手段是将载体注射至直接供应心肌或组织的血管或其它管道中，优选向一或两条冠状动脉或其它组织特异性动脉中注射(或向外周组织注射大丸剂(bolus))。例如，对于向心肌的递送，该注射优选通过基本上(典型地至少约1cm)导入一或两条冠状动脉或一或多条隐静脉或胸廓内动脉移植物或其它向心肌供血的管道的内腔中的导管来实现。优选地，在左右两条冠状动脉中进行注射，以便提供向整个心脏区域的普通分布(例如LAD、LCx和Right)。通过注射根据本文的腺病毒载体制剂，任选地联合增强基因递送的本文所述血管活性剂，可以为治疗心血管疾病，例如临床心肌缺血、或外周血管疾病，实施有效的腺病毒介导的血管生成基因转移，而不产生任何不希望的效果。
按对于转基因的表达和提供疗效而言有效的量递送载体。对于病毒载体(例如腺病毒)，注射制剂中的终病毒滴度优选为允许实现有效基因转移的约107-1013个病毒颗粒。腺病毒载体原液优选不含野生型病毒，可以将该原液深度注射至一或两条冠状动脉(或移植物)的内腔中，优选注射至左右冠状动脉(或移植物)中，并优选按光密度测定所确定的约109-1011个病毒颗粒的量进行注射。优选地，通过单次注射至每条导管中(例如每条冠状动脉中)来递送载体。
为了进一步提高基因治疗载体的局部递送，并为了增强基因递送的效率，根据本发明，可以在导入血管生成基因治疗载体的同时、或优选之前几分钟内，向待治疗的组织中输注血管活性剂，优选组胺或组胺激动剂或血管内皮生长因子(VEGF)蛋白或一氧化氮供体(例如硝普钠)。
通过利用冠状动脉导管将载体组合物直接注入冠状动脉的内腔中，可以使基因相当有效地定向并使注射过程中重组载体向近侧主动脉的损失达到最小。这种注射使得可以使用血管生成蛋白或肽编码基因局部感染期望数量的细胞，尤其是患病心肌中的心肌细胞，籍此使基因转移的疗效达到最大，并使心脏外部位的非期望血管生成最小化。对于向外周脉管供应的患病组织的递送，可以将载体导入供应该组织的一或多条动脉中，或以大丸剂注射剂的形式注射入组织中。
特异靶向心肌的载体结构，如掺有心肌特异性结合或摄取成分的载体，和/或掺有处于心肌特异性转录调节序列(如心肌细胞特异性启动子)控制下的血管生成蛋白转基因的载体，可以用于替代或优选地联合此直接注射技术作为进一步使表达限制在心肌(例如心室肌细胞)中的手段。对于可以引起免疫应答的载体，尽管也可以使用限制心脏外递送或另外降低免疫反应可能性的其它技术，但优选按上述方式直接将载体注射至供应心肌的血管中。同样，可以使用靶向外周脉管系统所供应的组织的载体，例如靶向骨骼肌的载体，或特异在骨骼肌中表达的启动子。
正如以下详细描述的，我们证明，使用本发明的技术体内递送含有血管生成转基因的病毒载体，冠状动脉内注射后任何时候，在肝细胞中没有发生转基因表达而且也没有在尿液中发现病毒RNA。此外，以此方式冠状动脉内递送转基因后两周，通过PCR没有在眼、肝或骨骼肌中检测到心脏外基因表达的迹象。
正如本领域已知的，可以使用多种导管和递送途径来实现冠状动脉内递送(见如以上引用的文献，包括Topol，EJ(编)，The Textbookof Interventional Cardiology，第2版(W.B.Saunders Co.1994)；Rutherford，RB，Vascular Surgery，第3版(W.B.Saunders Co.1989)；Wyngaarden JB等(编)，The Cecil Textbook of Medicine，第19版(W.B.Saunders Co.1992)；和Sabiston，D，The Textbook ofSurgery，第14版(W.B.Saunders Co.1991))。直接冠状动脉内(或移植管内)注射可以使用标准的基于经皮导管的方法在X射线透视的指导下进行。例如，任何一种冠状动脉导管、或Stack灌注导管，均可以用于本发明。例如，适用于本发明的各种一般目的用导管，以及修饰的导管，可从商家如Advanced Cardiovascular Systems(ACS)、Target Therapeutics、Boston Scientific and Cordis获得。而且，当使用直接注入冠状动脉内方式向心肌作递送(这在目前是最优选的)时，正如本领域已知的，可以使用许多方法将导管导入冠状动脉内。例如，可以将导管方便地导入股动脉中并倒退穿过髂动脉和腹主动脉然而进入冠状动脉。或者，可以首先将导管导入肱动脉或颈动脉并倒退穿行达到冠状动脉。还可以通过逆向灌注(例如从置于冠状窦的导管)，到达心肌的毛细血管床。作为利于逆向灌注的手段，该导管还可以使用一个近侧球囊以防止或降低顺行流动。对于向外周脉管系统供应的组织进行的递送，可以将导管导入供应该组织的动脉中(如对于腿而言，股动脉中)或可以将导管以例如大丸剂注射剂或输注的形式导入患病组织。
可以将包含血管生成基因的载体和导管或其它体内递送装置(例如能够将一般于缓冲溶液中的药物组合物导入血管或肌肉中的其它装置)的各种组合并入根据本发明应用的试剂盒中。这些试剂盒还可以含有一或多种血管活性剂以增强基因递送，并还可以包括描述它们根据本文所述任何方法的用途的说明书。动物模型成功研究心血管基因治疗的重要先决条件是(1)构建可适用于临床心血管疾病的动物模型，该动物模型可以提供关于血流量和/或收缩功能增强的机制的有用数据，和(2)准确评价基因转移的效果。从此观点看，较早的技术没有令人满意的。因此，我们利用了满足这些先决条件的猪模型。对于研究人心脏疾病而言，由于猪和人在生理上的相关性，它是一种尤其适合的模型。猪心与人心在以下方式上极为相似。猪具有与人冠状动脉循环极为相似的天然冠状动脉循环，包括相对缺少天然的冠状侧支血管。其次，猪心的大小，按总体重的百分数计算，与人心的大小是相似的。此外，猪是一种大动物模型，由此使得可以对各种参数如有效载体剂量、毒性等作更准确的外推。相反，动物如狗和鼠科成员的心脏有大量的内源性侧支血管。此外，相对总体重而言，狗心的尺寸是人心尺寸的两倍。
实施例5中本文所述的动物模型是心肌缺血的示例。(由于，心肌缺血也可以导致充血性心力衰竭和/或与之同时发生，因此此具体模型也与此情况有关。)使用此模型，我们证明，载体介导的血管生成蛋白编码基因的递送缓解了心肌缺血并增加了缺血区域的血流量。侧支血管的发生同样得到增加。例如，使用几种不同的血管生成蛋白，包括天然形式蛋白和突变蛋白(以下实施例中作了详细描述)，我们已成功证明这些基因转移技术。
在此模拟临床冠状动脉疾病的模型中，在冠状动脉左旋支(LCx)周围放置ameroid缩窄器(ameroid constrictor)导致逐渐完全的封闭(放置7天内)，而且梗死最小(左心室1％，LCx床的4±1％)(Roth等，Circulation，821778，1990；Roth等，Am.J.Physiol.2351-11279，1987；White等，Cir.Res.711490，1992；Hammond，等，Cardiol.，23475，1994；和Hammond等，J.Clin.Invest.922644，1993)。在之前由闭塞动脉灌注的区域(称缺血区域)心肌功能和血流量在休息时是正常的，但由于有限的内源性侧支血管发生，血流量储备不足以在心肌氧需求增加时防止缺血。因此，LCx床会偶尔发生缺血，这类似于临床心绞痛。侧支血管发育和血流量功能的关系在ameroid放置的21天内是稳定的，并持续4个月保持稳定(Roth等，Circulation，821778，1990；Roth等，Am.J.Physiol.，235H1279，1987；White等，Circ.Res.711490，1992)。通过遥测术已经显示，动物在全天时间内在危险床中有周期性的缺血功能不良，这与喂食期间的突发心率增加、人为造成的中断等有关。因此，该模型有具有稳定但不充足的侧支血管的床，而且有周期性缺血。该模型的另一独特优点是邻近异常灌注的机能不良区域(LCx床)有正常灌注和发挥功能的区域(LAD床)，由此每只动物体内都提供了一个对照床。
心肌对比超声心动图被用于估计区域的心肌灌注。对比材料由半乳糖的微聚集物组成，并增强图像的回波发生性(白色)。微聚集物按和血流量成比例的方式分布进入冠状动脉和心肌壁中(Skyba等，Circulation，901513-1521，1994)。已经显示，对比的峰值强度与通过微球体测量的心肌血流量紧密相关(Skyba等，Circulation，901513-1521，1994)。为了证明本发明使用的超声心动图准确地鉴定出LCx床、以及心肌对比超声心动描记术可以用于评价心肌血流量，在邻近ameroid的最近侧LCx周围放置液压套闭合器(hydraulic cuffoccluder)。
在本研究的某些方面，当处死动物后，对心脏进行灌注固定(戊二醛、生理压力、原位)以便通过显微镜定量毛细血管的生长。使用PCR在接受基因转移的动物的心肌中检测血管生成蛋白DNA和mRNA。正如下述，基因转移后两周，转导了lacZ的动物的心肌样品在组织学检查时显示出相当多的β-半乳糖苷酶活性。最后，使用针对血管生成蛋白的多克隆抗体，证实血管生成蛋白在接受基因转移的动物的细胞和心肌中表达。
关于对血流量改善的证明，有多种技术是本领域技术人员已知的。例如，可以通过Roth，DM.等，Am.J.Physiol.253H1279-H1288，1987或Roth，DM等，Circulation 821778-1789，1990所描述的放射性微球技术，确定心肌的血流量。还可以例如通过铊成像定量心肌血流量，该技术涉及用放射性核素铊按Braunwald在Heart Disease，第4版，第276-311页(Saunder，Philadelphia，1992)所描述的方法灌注心脏。心脏细胞具有很强的铊摄取性。铊的摄取与血流量成正相关。因此，降低的摄取量指示了血流量降低，如在有灌注缺陷的缺血病情下所发生的血流量降低。在一个有意识的个体中，血管生成活性可以容易地通过对比超声心动描记术评价，例如实施例1和5以及Sahn，DJ等，Circulation.58；1072-1083，1978中所描述的。通过例如借助经胸廓的超声心动描记术测量壁的增厚，可以确定改善的心肌功能。
治疗研究的策略包括转基因递送的时间选择、施用转基因的方式和途径、及血管生成基因的选择。在心肌缺血的ameroid模型中，在形成稳定但不足的侧支血管后实施基因转移。施用该ameroid模型的先前研究已经涉及到在ameroid闭合期间、缺血和侧支血管发生之前递送血管生成肽。然而，由于几个原因我们没有使用该方法。首先，这些研究不适于极近似地复制临床心肌缺血治疗中存在的病情，其中在正在发生的心肌缺血情况下将进行基因转移；先前的研究类似于在预期将发生缺血时提供肽，因而相关性较弱。其次，基于细胞培养物的早期研究，推测缺血刺激联合血管生成肽将是刺激血管生成的最佳环境。最佳地，这可以通过在心脏疾病已经存在时进行转基因递送来实现。与这些决定相关的是对实现转基因递送的方法的选择。要求技术应当适用于随后对冠心病患者的治疗的这一约束使得几种方法不可行(将肽连续地注入冠状动脉中、直接将质粒注射至心脏、用含有该肽的树脂包被心脏以提供长期缓释)。最后，猪模型提供了一种在基因递送前和后跟踪区域血流量和功能的良好手段。接受带有报道基因的相同载体(例如，重组腺病毒)的对照动物的使用为了这些研究提供了对照。猪具有与人冠状动脉循环极为类似的天然冠状动脉循环系统，包括相对缺乏天然冠状侧支血管。猪模型还为在基因递送前和后跟踪区域血流量和功能提供了一种良好的手段。接受带有报道基因的相同重组腺病毒结构的对照动物的使用为这些研究提供了对照。基于前述和以前所公布的研究，本领域技术人员将明了，在猪得到的下述结果预期将可以预测人体中的结果。
关于外周血管疾病，可以使用，例如外周缺血的后肢结扎模型，检测使用本发明的基因治疗载体向外周脉管系统作的血管生成基因递送。见例如R.L.Terjung和同事(见例如Yang等，Circ.Res.79(1)62-9，1996)描述的股动脉结扎模型。与向缺血心肌递送血管生成基因一样，根据本发明向外周脉管系统和/或相关肌肉递送血管生成基因可以用于克服外周血管疾病的影响。
本文实施例1中描述了另一动物模型，该模型诱导诸如临床充血性心力衰竭中所观察到的扩张型心肌病。在该模型中，在3-4周的时间内连续快速的心室起搏诱导了心力衰竭，此心力衰竭表现出与临床心力衰竭的许多特征具有相似性，包括与心力衰竭中观察到区域功能异常(包括与严重冠状动脉疾病和与非CAD DCM如IDCM相关的那些)相类似的左心室扩张及心肌收缩功能受损。其它充血性心力衰竭动物模型包括通过冠脉内递送微球诱导慢性心室功能障碍(见如Lavine等，J.Am Coll.Cardiol.181794-1803(1991)；Blaustein等，Am.J.Cardio.Path.532-48(1994)；Sabbah等，Am.J.Physiol.260H1379-H1384(1991))。作为心室功能障碍的另一例子，在大鼠模型中堵塞左冠状动脉可以诱导心肌梗死，然后可以在随后的数天或书周内对动物进行研究和治疗(见例如Pfeffer等，Circ.Res.44503-512，1979；Pfeffer等，Am.J.Physiol 260H1460-1414，1991)。
因此，可以使用这些模型确定递送的编码血管生成肽或蛋白的载体结构是否对缓解与这些病症有关的心肌功能障碍有效。这些模型对于提供一些参数尤其有用，通过这些参数可以评价体内基因疗法在治疗充血性心力衰竭和心室重构中的有效性。治疗性用途本发明载体(如复制缺陷型腺病毒)允许实现高效的体内基因转移而没有显著的坏死或炎症。基于这些结果(其中一些详细描述在以下实施例中)，可以看到实现了足以改变体内功能的体内基因递送程度。血管生成蛋白单独地或联合另一肌肉增强蛋白或肽进行的基因递送将改善被治疗肌肉中的血流量并增强其肌肉功能。而且，如果期望的话，正如本文所述，可以与这些方法和组合物联合使用血管活性剂，以便进一步增强向靶位点的基因递送。由于血管活性剂(例如组胺、组胺激动剂、一氧化氮供体、或VEGF蛋白)可以用于增加一定基因载体剂量的基因转移效率，因此可以将该药剂包含在内使用以限制需要施用的载体量以便达到指定的治疗效果。
一方面，可以使用本发明的载体和方法治疗扩张型心肌病(DCM)，一种典型通过发现扩张性收缩不足的左/或右心室进行诊断的心力衰竭。正如上述，DCM可以在缺少其它典型形式的心脏疾病如冠状动脉堵塞或心肌梗死历史的情况下发生。DCM与心室功能不良和心力衰竭的症状有关。在这些患者中，心室的扩张和壁的变薄导致高的左心室壁张力。许多患者甚至在轻微用力或休息时也表现出症状，因此其特征在于分别表现出严重的，即“III型”或“IV型”，心力衰竭(见例如NYHA心力衰竭分类)。正如上述，许多冠状动脉病患者可以发展表现出扩张型心肌病，这常常是由一或多次心脏病发作(心肌梗死)导致的。
本发明的再一应用是防止、或至少减少破坏性左心室重构(破坏性重构缩写为a.k.a.)，这是指心肌梗死后心室扩张，这种心室扩张可以发展成严重心力衰竭。即使心室重构已经开始，仍期望促进血流量的增加，因为这仍可以有效地抵消心室功能障碍。类似地，可以促进血管生成，因为微血管床的发展也可以有效地抵消心室功能障碍。而且，这些血管生成蛋白或肽还可以具有其它的增强作用。在遭受心肌梗死的患者中，如果患者无心室扩张以及如果没有出现心力衰竭症状，则可以预防破坏性心室重构。如果有任何可观察到的或可测量到的已有心力衰竭症状的减轻，则破坏性心室重构得到缓解。例如，患者可以表现出较少的气喘和改善的运动耐受性。心脏功能改善和症状减轻的评价方法基本上类似于用于DCM的上述方法。由改善的侧支血流量和心室功能和/或其它机制导致的对破坏性心室重构的预防或缓解预期可以在使用本文所述方法给患者体内转移血管生成基因后数周内实现。
一个实施例中，本发明体内转移编码血管生成蛋白的转基因的方法被用于证明基因转移表达血管生成蛋白或肽的重组腺病毒可以有效地在相当大程度上减少心肌缺血。在另一实施例中，本发明体内转移编码血管生成蛋白的转基因的方法被用于治疗与充血性心力衰竭有关的病症。
正如以下数据所显示的，外源提供的血管生成转基因的表达导致心脏(或其它靶组织)中的血流量和/或功能增加。血流量和/或功能的这种增加可以减少影响靶组织的心血管疾病的一或多个症状。
正如本文所述，根据本发明的方法可以使用许多不同的载体来体内递送血管生成蛋白转基因。例如，本文例举的复制缺陷型重组腺病毒实现了高效的体内基因转移而且在基因表达区域中没有致细胞病变效应或炎症。
在可能与CAD有关的心绞痛的治疗中，可以在任何时候进行编码血管生成蛋白的转基因的基因转移，但优选在严重心绞痛发作后相对不久进行。在大多数充血性心力衰竭的治疗中，可以例如在诊断可能发生心力衰竭或已发生了心力衰竭后，进行编码血管生成蛋白的转基因的基因转移。为了治疗心室重构，可以在患者遭受梗死后的任何时间，优选在梗死后30天内、甚至更优选在7-20天内，进行基因转移。
正如上述，还可以使用β-肾上腺素能信号转导蛋白(β-ASP)(包括β-肾上腺素能受体(β-AR)、G蛋白受体激酶抑制剂(GRK抑制剂)和腺苷酸环化酶(AC))增强心脏功能，见1997年9月5日提交的美国专利申请系列号08/924,757(基于1997年6月16日提交的美国60/048,933和1996年9月5日提交的美国08/708,661)以及1997年9月5日提交的PCT/US97/15610、和1998年1月16日提交的美国连续案例系列号09/008,097和1999年12月27日提交的美国连续案例系列号09/472,667中的详细描述和举例说明，所有这些均并入本文作为参考。
本发明的组合物或产品可以方便地以适于给患者施用至血流内(例如通过动脉内注射或作为大丸剂输注组织如骨骼肌)的制剂形式提供。最好可以由医师确定适合的施用方案。适合的药物可接受载体和它们的配方描述在标准配方论文中，如E.W.Martin的Remington’sPharmaceuticals Sciences。也见Wang，Y.J.和Hanson，M.A.，“蛋白质和肽的母体配方稳定性和稳定剂”，Journals of ParentalSciences and Technology，Technicai Report No.10，Supp.422S(1988)。本发明载体应当优选在中性pH如约pH6.5至约pH8.5，更优选约pH7至8的溶液中配制，该溶液含有使溶液达到约等渗的赋形剂(如4.5％甘露糖或0.9％氯化钠)、并使用本领域已知的一般认为安全的缓冲液如磷酸钠对pH进行缓冲，它还含有可接受的防腐剂如0.1％至0.75％的间甲苯酚、更优选0.15％至0.4％的间甲苯酚。可以使用氯化钠或其它可药用药剂如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、多元醇(如甘露糖醇和山梨糖醇)、或其它无机或有机溶质，实现期望的等渗性。对于含钠离子的缓冲液，尤其优选氯化钠。如果期望的话，还可以制备上述组合物溶液以增加搁置寿命和稳定性。本发明的治疗上有用的组合物可以按一般接受的程序将成分混合来制备。例如，可以将所选择的组合物混合以产生浓缩的混合物，然后可以通过加入水将该混合物调节至终浓度和粘度，和/或加入缓冲液以控制pH或加入其它溶质以控制渗涨度。
对于由医师使用，本发明组合物将以含有一定量本发明载体的剂量形式提供，所述载体量在一或多个剂量中可以有效地提供治疗效果。正如本领域人员意识到的，治疗剂的有效量可以随许多因素，包括患者的年龄和体重、患者的身体情况、及待获得的血管生成和/或其它效果的水平、及其它因素，而改变。
本发明病毒载体的有效剂量典型的在约107-1013个病毒颗粒、优选约109-1011个病毒颗粒范围内。正如提及的，待施用的确切剂量由主治临床医师确定，但优选在5ml或更少的生理缓冲溶液(如磷酸缓冲盐)内、更优选在1-3ml内。
优选的施用方式是使用适合的导管或其它体内递送装置向一或多个局部位置(例如在心脏疾病情况下，一或两条冠状动脉)中注射。
我们提供以下实施例以进一步帮助本领域的普通技术人员。这些实施例旨在举例说明，因此不应被认为是对本发明的限制。在本申请中描述了许多示例性修饰和变动，而其它的修饰和变动对于本领域技术人员是明了的。这些变动被认为处于本文所描述和要求保护的本发明的范围内。
实施例实施例1充血性心力衰竭和相关心肌缺血的猪模型1-A.动物和手术程序9头重40±6kg约克夏猪(Sus scrofa)用氯胺酮(50mg/kg IM)和硫酸阿托品(0.1mg/kg IM)及随后的异戊巴比妥钠(100mg/kg IV)麻醉。气管插管后，通过压力循环呼吸器在整个过程中递送氟烷。左胸廓切开术时，将导管放入主动脉、肺动脉和左心房中。将Konigsberg微型流体压力计放入左心室顶湍，将心外膜单极导联放在房室沟下1.0cm左心室外侧壁内。将动力发生器(Spectrax 5985；Medtronic，Inc.)插入腹内皮下袋(subcutaneous pocket)中。4头动物在主要的肺动脉周围安装了流量探测器(flow probe)(Transonic，Inc.)。松散地接近心包膜并关闭胸部。胸廓切开术后7-10天，测量血液动力学、左心室功能、和心肌血流量的基线值。然后开始心室起搏(220±9bpm(每分钟搏动数)，持续26±4天)。刺激幅度为2.5V，脉冲持续时间0.5ms。使用另9头猪(40±7kg)作为对照；5头接受胸廓切开术并安装仪器但不进行起搏，最初的胸廓切开术后30±7天将它们处死。关于左和右心室质量的数据在接受或未接受胸廓切开术的对照动物中是相似的，因此，将它们的数据汇集在一起作为一个单一的对照组。1-B.血液动力学研究在心脏起搏器停止至少1小时、动物处于基态时，从有意识的未给予镇静剂的动物获取血液动力学数据。每隔7天从每只动物获取所有数据。从左心房、肺动脉、和主动脉获得压力值。从高忠实性的左心室压力得到左心室的dP/dt。记录肺动脉血流量。获取主动脉和肺的血液样品以计算动静脉的氧含量差异。1-C.超声心动描记术研究超声心动描记术是一种测量区域心肌血流量的方法，它涉及将对比材料注入个体或动物中。在注入左心房后，对比材料(半乳糖微聚体)增强图像的回声产生(“白色”)。微聚体按与血流量成比例的方式分布到冠状动脉和心肌壁中(Skyba等，Circulation，901513-1521，1994)。对比增强的峰值强度与通过微球测量的心肌血流量相关(Skyba等，Circulation，901513-1521，1994)。
使用Hewlett Packard Sonos 1500成像系统获得二维M型图像。从右胸骨旁接近乳头肌中部水平获得图像，并记录在VHS带上。根据美国超声心动描记术协会的标准进行测量(Sahn，DJ，等，Circulation.581072-1083，1978)。由于猪室间隔(IVS)的中线取向和使用右胸骨旁视野，通过IVS和解剖学上的外侧壁产生短轴M型测量。所有的参数，包括舒张末期体积(EDD)、收缩末期体积(ESD)、和壁厚度，均在至少5次随机的呼气末期搏动时测量并进行平均。QRS波群开始时获得舒张末期体积。在IVS达到最大外侧位的瞬间或在T波末获取收缩末期体积。使用缩短分数(fractional shortening)，FS＝[(EDD-ESD)/EDD]×100，评价左心室收缩功能。壁增厚的百分数(％WTh)按以下计算％WTh＝[(ESWTh-EDWTh)/EDWTh]×100。为了证明超声心动描记术的测量具有可重复性，在开始起搏程序前在连续的2天对动物进行成像。来自不同测定的数据具有高度可重复性(缩短分数，R2＝.94，P＝.006；外侧壁增厚，R2＝.90，P＝.005)。所有这些测量值均是在心脏起搏器停止后获取的。1-D.心肌血流量通过放射性微球技术按以前详细描述的方法(Roth，DM，等，Am.J.Physiol.253H1279-H1288，1987；Roth，DM.等，Circulation 821778-1789，1990)，测定心肌血流量。将来自左心室外侧壁和IVS的透壁样品分成心内膜、中壁和心外膜三部分，并测定所有这三个部分的血流量和透壁流量。从获得超声心动描记术测量值的区域采取透壁部分，以便血流量和功能测量值在每个床中均相对应。向对照状态(非起搏的)中、在心室起搏开始时(225bpm)、然后在225bpm的心室起搏期内每隔7天注入微球；并在起搏器停止第14(n＝4)和21至28天(n＝3)也注射微球。通过心肌血流量除以心率(在微球注射过程中记录的)，计算每搏心肌血流量(Indolfi，C.等，Circulation 80933-993，1989)。在微球注射过程中记录平均左心房和平均右心房压力，以便可以计算出冠状血管阻力；冠状血管阻力指数等于平均动脉压力减去平均左心房压力除以透壁冠状血流量。1-E.心脏收缩壁压圆周心脏收缩壁压是无法测量的，因为我们不能获得一个适合的视野以估计左心室的长轴。因此，我们使用方程式纵向收缩末期壁压(达因)＝(0.334×P×D)÷[h(I-h/D)]，计算了纵向收缩末期壁压(Riechek，N.，等，Circulation 6599-108，1982)，其中P是左心室收缩末期压力(单位达因)、D是左心室收缩末期直径(单位cm)、h是收缩末期壁厚。在起搏开始前和随后每隔一周(起搏器关闭)计算外侧壁和IVS两者的纵向收缩末期壁压。1-F.末期手术在连续起搏26±2天后，麻醉动物并插入管子，然后实施中线胸骨切开术。将仍在跳动的心脏浸没在盐水(4℃)中，用盐水(4℃)快速灌注冠状动脉，称重右心室和左心室(包括IVS)，并将采自各区的透壁样品快速地冷冻在液氮中并保存在-70℃的温度下。1-G.腺苷酸在四只心力衰竭动物(起搏的第28天)和4只对照动物中，在IVS和外侧壁的透壁样品中测量ATP和ADP。心力衰竭动物的样品是在起搏器关闭(60分钟)后处死动物的那天获取的。从所有动物采取样品的方式一致。在Waters高效液相层析中按前述(Pilz，R.B.等，J.Biol.Chem.259；2927-2935，1984)测量ATP和ADP。1-H.统计学分析数据表示为平均值±标准差(SD)。将在对照状态(起搏前)和起搏期间每隔一周获得的具体测量值通过重复测量ANOVA进行比较(Crunch 4，Crunch Software Corp.)。在一些比较(如，外侧壁对IVS)中，使用双向ANOVA。使用本领域描述的“Tukey方法”进行Post hoc比较。9只动物存活了起搏的21天；其中的6只存活了起搏的28天。来自存活28天的动物的数据在统计学上与来自存活仅21天的动物的数据没有区别。因此，在以下4个时间点上对9只动物进行ANOVA对照(起搏前)、7天、14天、和21-28天。当P＜.05(双侧)排除无效假设。
结果1-I.血液动力学研究快速的心室起搏导致血液动力学的改变，这在起搏的7至14天后是显著的。在第7天，动物增加了平均左心房和肺动脉压力。这些压力随着起搏的更多周的过去日益异常(表1)。到第14至21天时，循环充血(circulatory congestion)的症状(呼吸急促、腹水和心动过速)明显。肺动脉流量(心脏排出量)到起搏第21天时降低(对照，3.3±0.1L/min；21天，1.9±0.4L/min；P＜.05)。
表1.血液动力学和左心室功能n对照7d 14d 21-28dpHR(bpm) 9122±16 136±15149±13b157±15c，g.0004MAP(mmHg)9103±8 99±6 98±7 102±14 .52PA(mmHg) 724±7 37±4b42±9c48±8c，g，i.0001LA(mmHg) 813±3 25±5c30±7c36±6c，e.0001AVO2D(ml/dl)73.6±1.13.5±0.9 5.2±1.56.2±1.5b，h.0005EDD(cm) 93.9±0.44.4±0.5 4.9±0.6c5.8±0.6c，f，i.0001FS(％) 939±3 26±5c18±6c，e13±4c，i.0001LV dP/dt(mmHg/s) 42849±272408±46 1847±381c，d1072±123c，e，i.00018 0
使用方差分析(重复测量值)确定起搏的持续时间是否影响特定变量；ANOVA的p值列在右栏中。通过Tukey方法进行Post hoc检验ap＜0.05；bp＜0.01；cp＜0.001(对于相同变量而言，相对于对照)；dp＜0.05；ep＜0.01；fp，0.001(相对于前一周)；gp＜0.05；hp＜0.01；ip＜0.001(相对于第7天的值)；post-hoc检验通过Tukey方法进行。心脏起搏器停止时进行测量，测量值表示为平均值±SD。7d起搏的第7天；14d起搏的第14天；21-28d起搏的第21-28天。1-J.左心室的整体功能在起搏器停止后通过超声心动描记术和血液动力学变量评价左心室的功能。缩短分数(fractional shortening)在起搏期间进行性地下降(P＝.0001；表1)，在第21-28天达到其最低值(对照，39±3％；21-28天13±4％；P＜.0002)。在起搏期间左心室舒张期末体积进行性地增加(P＜.0001；表1)，在第21天至28天达到最大(对照，3.9±0.4cm；21至28天，5.8±0.6cm；p＝.0002)。在整个研究过程中左心室峰值正dP/dt也下降(P＝.0001；表1)。峰值dP/dt的进行性降低伴随着左心室舒张末期压力的增加，这说明左心室的收缩性降低，因为前负荷的增加一般会提高左心室的峰值dP/dt。(Mahler，F.等，Am.J.Cardiol.35626-634，1975)。1-K.左心室的区域功能在心脏起搏器停止时，通过测量左心室外侧壁和IVS的壁增厚百分数，评价左心室的区域功能。自外侧壁的心室起搏导致外侧壁与IVS相比功能有显著降低(P＝.001；图1和表2)。这种差异随着外侧壁功能的降低，在第7天是显著的并在21至28天时增加。IVS显示出在研究过程中壁增厚有不显著的降低。在研究过程中，舒张末期壁厚度表现出进行性的变薄，且比外侧壁更严重(表2)。
表2.连续的左心室壁增厚对照 7d 14d 21-28d p(ANOVA)IVS EDTh(cm) .8±.1.7±.1 .7±.1.6±.1 时间.0001LAT EDTh(cm) .8±.1.7±.1 .6±.1.5±.1 区域.039p(IVS vs.LAT) ns nsnsns inter.027IVS WTh(％) 33±4 33±5 28±3 28±6 时间.0001LAT WTh(％) 35±5 25±4 19±8 14±6 区域.001p(IVS vs.LAT) ns .02 .007 .0001 inter.0001使用双向方差分析(重复的测量值)确定舒张末期的壁厚度(EDTh)或壁增厚(WTh)的百分数是否受起搏的持续时间(时间)、或区域(外侧壁，LAT；或室间隔，IVS)的影响、或者EDTh或WTh％的改变是否在这两个区域间(inter)不同。通过Tukey分析使用post-hoc在每个时间点上检测EDTh和WTh％的平均值在这两个区域间的差异。值表示为平均值±SD。7d起搏的第7天；14d起搏的第14天；21-28d起搏的第21-28天。n＝9。1-L.左心室的区域血流量当起搏开始后，IVS中比外侧壁中每分钟的心内膜下血流量增加更多(图2和表3)。这种起搏过程中区域血流量差异在研究的持续时间内保持，而且血流量的改变方式在这两个区域间是不同的(P＝0.006)。无论在心内膜(P＝.006)、中壁(P＝.002)、心外膜(P＝.016)、或透壁(P＝.003)部分进行测量，起搏过程中两个区域间每分钟的血流量改变方式是一致的(表3)。相反，在起搏器停止后，无论是在对照状态、第14天、或第21-28天进行测量，心内膜下血流量均未表现出区域差异(图2和表3)。
表3.连续的心肌血流量第0天第14天 第21-28天OFF ON OFFONOFF ON P(ANOVA)IVS ENDO1.41±.2 1.96±.38 1.68±.22 2.35±.4 1.88±.1 2.67±.3 时间.0001(ml/min/g) 6 6 8 9LAT 1.40±.3 1.11±.14 1.50±.35 1.65±.2 1.73±.0 2.05±.1 区域.017ENDO3 5 5 6(ml/min/g)p(IVS vs. Ns.001 ns .002 ns.006 inter.006LAT)IVS MID 1.56±.2 2.11±.33 1.84±.29 2.48±.3 2.04±.0 2.98±.4 时间(ml/min/g) 0 1 9 6 .0001LAT MID 1.66±.2 1.53±.17 1.50±.43 1.77±.2 1.76±.3 2.12±.0 区域.019(ml/min/g) 8 9 9 6p(IVS vs. Ns.01ns nsns.001 inter.002LAT)IVS EPI 1.13±.2 1.50±.24 1.54±.38 1.91±.4 1.79±.1 2.53±.3 时间(ml/min/g) 7 8 4 8 .0001LAT EPI 1.37±.2 1.48±.31 1.24±.24 1.55±.2 1.50±.0 1.92.0 区域.17(ml/min/g) 2 5 4 8p(IVS vs. Nsns ns ns.049 ns interLAT) .0016IVS 1.36±.2 1.85±.27 1.69±.30 2.24±.4 1.90±.0 2.73±.4 时间TRANS 1 6 9 0 .0001(ml/min/g)LAT 1.47±.2 1.38±.22 1.41±.33 1.65±.2 1.66±.0 2.03±.0 区域.019TRANS 7 5 2 7(ml/min/g)p(IVS vs. Ns.001 ns nsns.001 inter.003LAT)IVS 1.30±.3 1.32±.23 1.13±.20 1.27±.2 1.05±.2 1.06±.1 时间.058ENDO/ 6 0 0EPILAT 1.01±.0 0.77±.10 1.21±.06 1.07±.1 1.15±.0 1.07±1区域.054ENDO/ 7 1 2 0EPIp(IVS vs. Ns.0002 ns nsnsns interLAT) .0008
使用双向方差分析(重复测量值)确定心内膜下(ENDO)或透壁(TRANS)的血流量是否受到起搏时间(时间)或区域(外侧壁，LAT；或室间隔，IVS)的影响、或者血流量的改变方式是否在这两个区域(inter)不同。通过Tukey分析使用post-hoc在每个时间点上检测血流量改变方式在这两个区域间的差异。值表示为平均值±SD。ON在心室起搏(225bpm)期间注射的微球。OFF起搏器停止。0天＝对照；14天起搏的第14天；21-28天起搏的第21-28天。
心内膜与心外膜的血流量比例随着心力衰竭的发展没有显著改变(P＝.058)。然而，随着起搏的开始，心内膜与心外膜的比在外侧壁中比在IVS中低得多(IVS，1.32±0.23；外侧壁，0.77±0.10；P＝.0002；表3)。两个区域的比在剩下的整个研究过程中＞1.0。
在起搏开始前每搏心内膜血流量(图2和表4)在两个区域中是相似的(IVS，0.013±0.003mL·min-1·g-1·搏-1；外侧壁，0.012±0.004mL·min-1·g-1·搏-1；P＝NS)。在心室起搏(225bpm)起始时，在外侧壁而非IVS中每搏心内膜血流量有区域不足(IVS，0.009±0.002mL·min-1·g-1·搏-1；外侧壁，0.005±0.001mL·min-1·g-1·搏-1；P＝.001)。在第14天和第21-28天，起搏期间每搏心内膜血流量在外侧壁中比在IVS中少(图2和表4)。这些数据说明，外侧壁中心肌灌注不足在起搏开始时即开始，并维持这种相对的缺血。然而，随着起搏器的关闭在两个区域中每搏心内膜血流量保持正常(图2和表4)。
两个区域中的血流量在起搏的最后一周内倾向于增加(图2和表3)。这种方式与冠状血管阻力指数的进行性降低是相关的(图3)，这提示随着心力衰竭的进展，冠状血管结构和功能的改变可能伴有左心室重构。在起搏初期，冠状血管阻力指数在外侧壁中比IVS中显著要高，冠状血管阻力的这种改变方式在这两个区域间是不同的(P＝.0012)(图3)。这些发现可以说明改变的电活化对心肌灌注的影响。
表4.每搏心内膜血流量模型每搏心内膜血流量(ml/min/g/搏)猪ameroid缺血(HR 200bpm；n＝6)非缺血床 0.012±0.004缺血床 0.006±0.002p＜0.001*猪LV起搏诱导的CHF(HR 225bpm；n＝5)起搏器开 起搏器关第0天 IVS 0.009±0.002 0.013±0.003(HR122bpm)外侧壁 0.005±0.001 0.012±0.004p＝0.001 ns第14天IVS 0.010±0.003 0.011±0.002(HR 149bpm)外侧壁 0.007±0.001 0.010±0.003p＝0.008 ns第21-28天 IVS 0.012±0.002 0.013±0.003(HR 157bpm)外侧壁 0.009±0.001 0.012±0.002p＜0.024 ns我们的实验室先前已公布了ameroid缺血模型的数据(Hammond，H.K.和McKirnan，M.D.，J.Am.Coll.Cardiol.，23；475-82，1994)。值表示为平均值±1SD。这些数据显示，与正常灌注的心肌区域相比，ameroid模型的侧支依赖性(缺血区域)和左心室起搏诱导的心力衰竭模型的外侧壁在每搏心内膜血流量上有相似的不足。1-M.左心室的收缩末期壁压力就起搏期间而言，估计的纵向收缩末期壁压力有显著增加(P＜.0001)，但壁压的改变方式对于外侧壁和IVS而言是相似的(P＝33)，而且post hoc检验未能显示在任何特定的时间点上收缩壁压有任何的区域差异(图3)。收缩末期壁压的增加在外侧壁中(对照，168±40×103达因；28天，412±143×103达因；P＝.0001)和在IVS(对照，159±35×103达因；28天，480±225×103达因；P＝.0001)几乎是3倍。1-N.尸检尸检时，患有心力衰竭的动物有腹水(平均量，1809mL；范围，300-3500mL)和扩张性薄壁心脏，所有四个心室均表现出整体的扩大。心室重量与体重的比提示仅左心室肥大，这证实了使用该模型从前面的研究中获得的数据。(Roth，D.A.等，J.Clin.Invest.91；939-949，1993)。与重量匹配的对照动物相比，没有与心力衰竭相关的左心室质量改变(对照，112±10g；心力衰竭，114±17g)；左心室重量与体重的比在两个组中是相似的(对照，2.8±0.3g/kg；心力衰竭，2.9±0.3g/kg)。相反，心力衰竭与右心室重量的增加(对照，38±3g；心力衰竭，52±11g；P＝.003)和右心室重量与体重的比的增加(对照，0.09±0.1g/kg；心力衰竭，1.3±0.3g/kg；P＜.003)相关。起搏的动物在研究过程中增重4kg，此量部分是由腹水积聚引起的。如果使用起始体重计算左心室重量和体重的比，则此比值并不显著高于从重量匹配的对照动物中获得的比值。这些数据证实，在研究过程中左心室的质量没有实质上的增加。1-O.腺苷酸对照动物表现出正常的ATP/ADP比值，这与在常规活检收集并随后立即浸没在液氮中的猪心中报道(White，F.C.和Boss，G.J.Cardiovasc.Pathol.3225-236，1990)的相似，这说明所用取样技术是适当的。在取自IVS的样品中(对照，14.8±1.1；心力衰竭，2.4±0.3；P＜.0001，n＝4，两组)和取自外侧壁的样品中(对照，14.3±4.0；心力衰竭，2.4±0.9；P＝.0012，n＝4，两组)，患有心力衰竭的动物表现出明显的ATP/ADP比值下降。这证实心肌的氧供应和需求之间存在不平衡。1-P.心肌血流量在起搏诱导的心力衰竭中，心肌血流量的区域差异(快速心室起搏的直接结果)可能在区域和整体的功能障碍的发病机理方面起作用。在起搏期间，我们发现左心室外侧壁(邻近刺激位点)和IVS之间每分钟心肌血流量有差异。起搏一开始外侧壁中立即出现血流量降低，并持续21至28天。左心室外侧壁比IVS在起搏期间接受较少的血流量，在起搏的21至28天时期内它表现出进行性的壁增厚降低(起搏器关闭)。相反，IVS在起搏过程中接受到更多的血流量，在起搏的21至28天它维持相对正常的壁增厚。
由于每分心肌血流量不易于允许对相对的心肌缺血进行评价，因此我们也将冠状血流量表示为每搏心内膜血流量。该分析的生理学基础在于前面的实验显示了每分区域心内膜血流量(不是透壁血流量的外壁)在进行性冠状动脉狭窄病情中是主要决定区域心肌收缩的因素(Gallagher，K.P.等，Am.J.Physiol.16H727-H738，1984)，而且心率的增加会使此血流量-功能关系向下移动，即以任何水平的心内膜下血流量都产生较低的区域功能。(Delbaas，T.等，J.Physiol.477481-496，1990)。然而，为了修正心率的影响，如果按区域功能对每搏心内膜血流量进行该血流量-功能关系的作图，则在不同的心率下只有一个单一的关系，这说明在冠状血流量降低时每搏心内膜血流量主要地确定壁功能的水平。(Indolfi，C.等，Circulation80933-993，1989；Ross，J.，Cir culation 831076-1083，1991)。随着起搏的开始，外侧壁与IVS相比，每搏心内膜血流量有＞50％的降低(P＜.001；表4)。
我们在有意识的猪中所作的先前研究中已证明，心内膜血流量的50％降低导致区域功能的50％降低并与每搏心内膜下血流量相关，这与本研究中在外侧壁中观察到的相似(表4)。在整个研究过程中起搏期间外侧壁中血流量都保持降低。这些数据提供了心室起搏开始后外侧壁中心肌缺血的证据。相反，IVS的功能和每搏心内膜血流量保持相对正常。在起搏器关闭时，在整个研究过程中两个区域的每搏心内膜血流量都保持正常，而外侧壁中持续有区域性功能障碍，这与该区域中心肌顿抑的发生是一致的。因此，我们推测外侧壁的持续缺血在起搏期间和之后对整体功能有显著影响。实施例2制备示例性基因递送结构2-A.制备示例性腺病毒结构使用不依赖辅助病毒的复制缺陷型人腺病毒5系统作为起始的基因递送载体。我们使用编码β-半乳糖苷酶和FGF-5的基因作为载体结构的起始示例。使用全长cDNA，我们构建了编码β-半乳糖苷酶或FGF-5的重组腺病毒。用于制备重组腺病毒的系统对转基因插入片段提出了一个强制的约5kb的包装限制。各与CMV启动子及SV40聚腺苷酸化序列可操作地相连的β-gal和FGF-5小于4kb，恰好处于包装限制范围内。
从质粒pLTR122E中以1.1kb ECOR1片段的形式释放出人FGF-5的全长cDNA(Zhan等，Mol.Cell Biol.83487，1988)，所述片段包括该基因的981bp开放式阅读框，将它克隆至穿梭质粒ACCMVpLpA的多接头中。FGF-5的核苷酸和氨基酸序列公开在Zhan等，Mol.CellBiol.83487，1988的图1中。pACCMVpLpA描述于Gomez-Foix等J.Biol.Chem.，26725129-25134，1992。pACCMVpLpA含有腺病毒血清型5的基因组的5’末端(图距单位0-17)，其中的E1区域被替代为人巨细胞病毒增强子-启动子(CMV启动子)及随后的来自pUC19(本领域熟知的质粒)的多克隆位点(多接头)和随后的SV40聚腺苷酸化信号。编码lacZ的对照腺病毒是基于从图距1-9.8中缺失掉E1A/E1B。编码FGF-5的腺病毒(Ad.FGF-5)是基于从图距1.3-9.3中缺失掉E1A/E1B中。这两个载体均去除了完整的E1A编码序列和大部分E1B编码序列。两个载体均具有以相对于腺病毒序列而言的反向克隆的转基因插入片段。因此，在不大可能发生的连读转录事件中，腺病毒转录本将是反义的而且不表达病毒蛋白。
将含有FGF-5基因的质粒与质粒JM17(pJM17)共转染(使用磷酸钙沉淀)293细胞，质粒JM17含有完整人腺病毒5基因组和一个额外的4.3kb插入片段，这就使得pJM17过大以不能被包装入成熟的腺病毒毒粒中。然后用营养琼脂糖覆盖这些细胞。通过293细胞中的同源拯救重组，产生含有血管生成基因的感染性病毒颗粒，并在10-12天后以单个噬斑的形式进行分离。(也可以通过利用脂转染进行的共转染和通过显微镜直接寻找致细胞病变效应，鉴定成功的重组病毒，见Zhang等，Biotechniques 15(5)868-872，1993)。所获腺病毒载体含有转基因但没有E1A/E1B序列，因此是复制缺陷的。带有FGF-5基因的腺病毒载体在本文中又称作Ad.FGF-5。
尽管这些重组腺病毒在哺乳动物细胞中无复制性，但它们可以在已转化有E1A/E1B而反式提供这些必需基因产物的293细胞中繁殖。从单个噬斑得到的重组病毒在293细胞中增殖并通过限制性分析表征病毒DNA。
然后使用标准程序，对成功的重组病毒进行两轮的噬斑纯化。病毒原液在293细胞中增殖达到每毫升1010-1012范围(按光密度法测定的)的滴度。感染80％汇合度的人293细胞，并在36-48小时收获培养物上清液。在对含有病毒的上清液进行多个冻融循环后，通过标准离心沉淀细胞碎片，并进一步通过两个氯化铯(CsCl)密度梯度离心(不连续1.33/1.45 CsCl梯度；CsCl制备在5ml Tris，1mM EDTA(pH7.8)中；90,000×g(2hr)，105,000×g(18hr))。体内注射前，通过Sepharose柱(例如PBS平衡的G25 Sephadex)进行凝胶过滤，使病毒原液脱盐。最终的病毒浓度为每毫升(ml)约1011个病毒颗粒(按光密度法测定的)。病毒原液可以方便地于-70℃保存在培养基的细胞中。为了进行注射，优选将纯化的病毒重新悬浮在盐水中。该腺病毒载体制品是高度纯化的并基本上不含有野生型(潜在地复制性)病毒(即，优选每百万含有少于约一个(1)能复制的腺病毒(RCA)颗粒，更优选每109少于1个、最优选每1012少于1个)。因此，心脏中的腺病毒感染和炎症浸润得到最小化。
以下提供了腺病毒载体结构的另一示例，而且，与本文提供的其它教导相结合，可以使用适于本发明的其它腺病毒结构，包括基于修饰的腺病毒载体的结构。2-B.其它的示例性载体和转基因结构正如以上描述的，可以使用各种病毒和非病毒载体来递送根据本发明的基因。作为另一载体的举例说明性例子，我们根据以上描述的本发明方法制备了用于体内递送的腺相关病毒(AAV)载体。作为可以用于本发明中的另一血管生成基因的举例说明例子，我们按上述方法制备了在腺病毒(Ad)和AAV载体结构中含有上述IGF基因的结构。
此示例性结构含有处于异源启动子(为了举例说明的目的使用CMV启动子)控制下的IGF-1基因，并被命名为rAd/IGF或rAAV/IGF。除了这些外，还构建了含有标记基因如增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的结构。还可以构建rAd/IGF或rAAV/IGF以使之包括标记基因(如EGFP)。含有EGFP的结构可从商业途径获得(例如，从Clontech，Palo Alto，California获得)。
为了制备rAd/IGF，将IGF-1基因(可获自ATCC)亚克隆在腺病毒穿梭载体如pAdshuttle-CMV、pAd5CI、和/或pAdtrack-CMV中。所获IGF-1穿梭质粒与辅助病毒pJM17在细菌或293细胞(取决于所用的穿梭载体)中经历重组过程。通过RT-PCR和/或western印迹验证所获rAd/IGF病毒能表达IGF-1蛋白。
例如，我们使用穿梭载体和pJM17辅助质粒在293细胞中，基本上按以上描述和举例说明的用于制备包含FGF-5血管生成基因的腺病毒载体的方法，制备了示例性rAd/IGF结构。使用类似技术我们制备了包含EGFP的腺病毒载体作为对照。
我们基本上按照本领域描述的方法，使用用于制备重组AAV载体的技术，制备了示例性rAAV/IGF结构；见如以上引用的涉及AAV制备的文献。尽管按照本领域所述，可以使用各种不同的技术制备AAV载体，但我们使用了一种基本的双转染程序，基本上按Samulski等，J.Virol.633822-3828，1989所述的方法进行。简单地说，为了制备rAAV/IGF，将IGF-1基因亚克隆至rAAV质粒DNA中(以便IGF基因侧翼为AAV的反向末端重复或ITR)，然后将此rAAV质粒和AAV的辅助质粒(反式提供AAV rep和cap基因)共转染293细胞。随后通过用辅助腺病毒(我们使用了称作dl312的E1缺陷腺病毒)感染，起始产生AAV。一般，根据标准技术(见例如Samulski等，同上)，加热处理病毒裂解物以使腺病毒失活，并用DNA酶和链霉蛋白酶处理。
可以使用多种技术纯化rAAV载体。为了此举例说明的目的，我们使用了标准的氯化铯(CsCl)超离心程序(使用两次CsCl纯化)以最初将rAAV颗粒与污染物分离开，方法基本上与本领域所述相同。透析后，我们进一步通过HPLC纯化该物质。在此实施例中，我们使用肝素包被的亲和层析柱(POROS HE，可从PE Biosystems，Foster City，Californian获得)，并用盐(1-2M NaCl)洗脱。在本实施例中，大多数AAV在约0.7M NaCl时被洗脱下来。在对PBS(pH7.4)透析后，56摄氏度热处理该载体60分钟以破坏残余的腺病毒。与腺病毒相似，所获载体原液一般进行DNA酶抗性颗粒(DRP)的滴定；并测试其是否无致细胞病变效应。
通过western印迹分析验证rAd/IGF和rAAV/IGF中的IGF-1表达。使用在培养的MCF-7细胞上进行的增殖实验，进一步测试它们是否产生功能性IGF-1蛋白。简单地说，用rAd/IGF或rAAV/IGF在第1天转导HEK(人胚胎肾癌)293细胞，并将之培养在无血清培养基中。48小时孵育后，收获此无血清培养基并将之置于已培养在无血清培养基中的MCF-7细胞上。使用标准增殖测试方法(例如MTT测试)，基本上按Mosmann所述(见如Mosmann，J.Immunol.Meth.1655-63，1983)，在接着的72小时内监测MCF-7细胞的增殖。携带增强的绿色荧光蛋白基因的腺病毒或AAV载体，即rAd/EGFP或rAAV/EGFP，被用作阴性对照，而重组人IGF-1蛋白质用作阳性对照。从该MTT测试获得的结果指示，rAd/IGF和rAAV/IGF载体结构能够将IGF-1转基因递送至人靶细胞(HEK293细胞)中，然后该被打靶的细胞的培养基能够以类似纯化的IGF-1蛋白的方式诱导该MCF-7细胞增殖。使用阴性对照(即rAd/EGFP或rAAV/EGFP)转染的细胞的培养基，没有观察到显著的增殖。通过直接转染MCF-7细胞我们还测试了这些载体结构，并且证明IGF结构(在AAV和腺病毒中)可以用于直接诱导转染细胞增殖，其方式以向细胞施用IGF-1蛋白质等同(以约3mg/ml的浓度)。
可以使用肌细胞进行其它测试以验证IGF载体结构的功能，可以在其中观察到IGF对肌细胞的大小和/或功能的影响。例如，可以通过各种分析检测IGF对原代新生心肌细胞(NCM)或成熟心肌细胞的影响。例如，可以通过腺病毒或AAV载体递送IGF-1以在NCM中诱导肥大和细胞DNA合成。以适当的感染复数(MOI)，典型在约100-1000的范围内，转导NCM后，用结晶紫或中性红染色心肌细胞。在显微镜下对这些细胞摄像，并可以自动测量(例如使用Image Plus软件)单个细胞的大小，包括面积、长度和宽度。IGF-1对细胞DNA合成的影响可以通过3H-胸苷的细胞掺入量来量化，籍此通过TCA沉淀细胞DNA后3H的计数来监测细胞DNA的合成。
按本文所述和举例说明，可以通过冠状动脉内递送向心脏递送包含血管生成转基因的载体。作为候选载体的最初测试，在递送至大动物模型如猪中前，我们还使用了大鼠模型，在该大鼠模型中我们使用间接的冠状脉管内递送的方式将载体递送至心肌。在该模型中，通过在束紧肺动脉和远端主动脉后将包含载体的溶液(例如磷酸缓冲盐(PBS)或HEPES缓冲盐水)导入左心室的室内(即通过导入室内腔中而不是心室壁中)，进行递送。因此，由于另一途径的暂时封闭，来自此心室的室内的血流量带着待递送的物质进入冠状动脉中。我们使用交叉钳夹术以束紧肺动脉和主动脉(见例如Hajjar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955251-5256，1998)。我们还使用血管活性剂(见上述及以上提及的相应共同待决申请)进行预处理，以便增强通过冠脉递送进行的基因转移。我们典型地使用组胺或硝普钠(SNP)作为血管活性剂。这些药剂的使用范围可以是约1-75毫克/ml。典型地，我们使用约25mg/ml组胺在载体递送前进行灌注。对于SNP，我们典型地使用约50mg/ml的该血管活性剂在转导载体前几分钟起直到载体完全注射后进行灌注。使用这些程序，我们已证明通过冠脉内递送腺病毒和AAV载体可以向心肌作高水平的基因递送。使用上述rAAV/EGFP，例如按一剂约1×10e11 DNA酶抗性颗粒的剂量递送，我们可以获得约30％细胞水平的左心室转导(在多聚甲醛中固定LV切片并用低温恒温器切成8-10微米切片后通过荧光显微镜测量，然后使用ImageProPlus软件定量绿色区域的百分数)。心肌内的基因表达在心外膜中最大，但甚至在心内膜中也观察到显著表达。此外，我们还证明在按所述向心肌递送AAV载体后有相对长活性的基因表达(即使在注射后30天至180天内表达水平有降低，这种降低也是微小的)。而且，组织学和病理学分析揭示在心脏中几乎没有或没有炎症反应而且在肝或肺中没有检测到基因表达。实施例3大鼠心肌细胞中的基因转移3-A.Ad.β-gal基因转移和表达通过用含有胶原酶的灌注液根据标准方法进行Langendorf灌注，制备成年大鼠心肌细胞。将杆状细胞培养在层粘连蛋白包被的平板上，在第24小时用上述实施例2中获得编码β-半乳糖苷酶的腺病毒进行感染，感染复数为1∶1。再36小时后，用多聚甲醛固定细胞并与X-gal孵育。一致地，在用重组腺病毒感染后成年肌细胞中70％-90％的表达β-半乳糖苷酶转基因。在1-2∶1的感染复数时没有观察到细胞毒性。3-B.rAAV/IGF-1基因转移和表达为了在大鼠新生心肌细胞中评价IGF-1表达的效应，在10cm细胞培养皿上接种2×10e6个细胞并用rAAV/IGF-1或rAAV/EGFP的1×10e10 DNA酶抗性颗粒感染。在无血清极限培养基中37℃正常氧水平下培养细胞。向培养物中加入重组IGF-1蛋白(50ng/ml)或脱氢肾上腺素(50μM)作为阳性对照。处理后48小时以观察方式评价细胞。基于形态学外观，与未处理的细胞相比，用rAAV-IGF-1处理的细胞表现出显著的肥肿(与使用脱氢肾上腺素获得的相当)。与rAAV/IGF-1相比，外源加入的IGF-1蛋白质似乎仅诱导轻微的肥肿。为了对肥肿水平进行定量，使用立体学程序(stereological program)，Image Pro Plus5(Media Cybernetics，Carlsbad，California)。简单地说，ImagePro Plus 5程序允许跟踪单个细胞并获取测量值。程序中绘出细胞轮廓，并计算每个细胞的面积数。每种条件下计数大约50-100个细胞，并在统计学程序Prizm中绘图。我们发现，脱氢肾上腺素处理的细胞和rAAV/IGF-1感染的细胞相对于未处理的细胞表现出显著的的肥肿。
处理检测肥肿外，我们使用针对IGF-1蛋白的ELISA分析法确定了在rAAV/IGF-1表达后培养基中IGF-1的分泌水平。简单来说，发现蛋白质水平在rAAV/IGF-1感染的培养物的培养基(第48小时收集的)中为约0.1-1.0ng/ml的水平，比(未用rAAV/IGF-1处理的或感染的)对照群体中的IGF-1水平有显著增加。实施例4向猪心肌中进行体内基因转移4-A.Ad.β-gal基因转移和表达基于实施例2的程序，在许可性293细胞中增殖实施例2中获得的编码β-半乳糖苷酶的腺病毒载体，然后通过CsCl梯度超离心纯化，最终的病毒滴度是1.5×1010个病毒颗粒。对麻醉的通气的40kg猪作胸廓切开术。将26号蝶形针头插入冠状动脉左前降支(LAD)中部，并注入2ml体积的载体(1.5×1010个病毒颗粒)磷酸缓冲盐水。缝合胸部并使动物得以恢复。在注射后第4天，处死动物。用戊二醛固定心脏、然后切片并与X-gal孵育16.5个小时。包埋和切片后，组织用伊红复染。
显微镜分析组织切片(冠状脉内注射含有lacZ的腺病毒后96小时LAD床的透壁切片)揭示在LAD冠脉床中观察到显著数量的基因转移，许多组织切片说明相当大部分细胞的β-半乳糖苷酶染色为阳性。在远离LAD冠脉床的心肌区域没有表现出X-gal染色而充当阴性对照，而在肌细胞和内皮细胞中观察到弥散性基因表达。心肌的相当大部分表现出β-半乳糖苷酶活性(蓝染色)，在随后的研究中使用封闭的胸部冠脉内注射，基因转移后14天也出现相似活性(n＝8)。在基因表达区域没有炎症或坏死迹象。4-B.rAAV/EGFP基因转移和表达按实施例2所述制备、增殖和纯化编码EGFP的腺相关病毒载体。对4头农场猪(每头约30kg)进行麻醉、通气并在颈中线切下。分离颈动脉，并插入5 French导入鞘。在左旋支动脉(LCx)中放入一个5French多功能血管导管，导管尖放入冠状动脉内腔中约1cm。首先用PBS冲洗用于基因注射的注射器，然后将基因溶液吸入注射器中。在给予病毒前冠脉内向LCX输注3分钟的组胺(25μg/min)，之后输注2.36×1013个rAAV/EGFP病毒颗粒(n＝3)或4.72×1013个rAAV/EGFP病毒颗粒(n＝1)。每头猪注入总共1.5ml体积的基因溶液，注入速率是1ml/30秒。然后除去血管导管和导入鞘并缝合颈部切开。使动物从麻醉状态恢复，并放在笼中直到研究结束。
基因注射的第6-8周，处死猪并收集组织。切出心脏并放置在冰冷的盐水中。冷灌注冠状动脉，然后收集组织并将其快速冷冻在液氮中。同样尽可能快速地收集其它组织并在液氮中快速冷冻。组织切片的荧光显微镜和RT-PCR分析均显示使用这种在胸部缝合的猪中直接的冠脉内注射递送方法通过rAAV载体已成功地递送和表达了EGFP。尤其是，正如以下显示的，来自RT-PCR的结果证实，与冠状动脉左前降支(LAD)床相比，该基因已被递送至接受注射的动脉所供应的床(即LCX床)中并在其中表达
实施例5介导血管生成的基因治疗的猪模型(使用FGF-5转基因)在心肌缺陷和心力衰竭的猪模型中，通过动脉电刺激(起搏)给动物施压。对压力诱导的心肌功能障碍和血流量不足的程度进行定量，然后通过冠脉内注射表达FGF-5的示例性重组腺病毒进行基因转移。在出现稳定但受限的内源性血管生成、而且存在与患者的心绞痛相类似的可诱导性缺血后，进行基因转移。动物在休息时不缺血但在活动或心房起搏的过程中出现缺血。对照动物接受表达lacZ(β-gal)的重组腺病毒以排出腺病毒本身(不依赖于FGF-5的)刺激新血管形成的可能性。这也控制了与基因转移无关的可能的持续侧支血管形成。在基因转移后两周，再次测量压力诱导的心脏功能障碍和区域血流量。
接受lacZ的猪在基因转移前和两周后在缺血区域表现出相似程度的起搏诱导的功能障碍。相反，接受FGF-5基因后两周，动物表现出壁厚度增加和在起搏期间缺血区域中的血流量提高。这些结果说明，血管生成转基因(FGF-5)的基因转移通过新形成的血管增加区域血流量而有效地改善了区域性心肌收缩功能障碍。方法动物和模型使用重47±9kg的约克夏饲养猪(Sus srofa，n＝27)。两头猪冠脉内注射了表达lacZ的重组腺病毒(2.0ml盐水中1011个病毒颗粒)，并在注射后3或5天处死。剩余的25只动物在左心房、肺动脉和主动脉中放置了导管，这些导管为测量区域血流量和检测压力提供了一种手段。将导线缝合在左心房上以允许作ECG记录和心房起搏。ameroid材料是吸湿性并缓慢膨胀，放置10天后逐渐导致动脉的完全堵塞，由于侧支血管的形成有最小的梗死(＜1％的左心室)。在由闭塞动脉先前灌注的区域(缺血区域)中心肌功能和血流量在休息时是正常的，但当心肌氧需求量增加时血流量不足以防止缺血。在放置ameroid材料的21天内侧支血管发育完成，并保持至少4个月不变(Roth等，Am.J.Physiol.253H1279-H1288，1987)。而且，在ameroid的邻近但远端的动脉周围放置了液压套。这些程序详细描述在其它地方(Hammond等，J.Am.Coll.Cardiol.23475-482，1994和Hammond等，J.Clin.Invest.922644-2652，1993)。两只动物在放置ameroid后5和7天死亡。放置ameroid后38(±2)天，当有限的侧支循环形成并稳定后，对动物进行研究以确定起搏诱导的区域功能和血流量，然后通过冠脉内注射向动物递送表达lacZ(n＝7，对照动物)或FGF-5(N＝16，治疗组)的重组腺病毒。然后，14±1天后，重复研究以确定起搏诱导的区域功能和血流量。之后，处死AdlacZ(n＝7)和AdFGF-5(n＝11)动物，并收集组织。在基因转移后12周研究5只AdFGF-5动物，然后将其处死。重组腺病毒和转基因递送按以上实施例2所述制备不依赖辅毒的复制缺陷型腺病毒5系统。
为了冠脉内递送此转基因，麻醉动物，并将一个5F动脉鞘放置在颈动脉中。通过此鞘在冠状动脉内插入一个5F多功能(A2)冠脉导管。通过向左主冠状动脉相反注射，证实所有的动物中均出现ameroid的堵塞。然后将导管顶端深入插在动脉内腔中，以便在注射过程中仅有最小量的物质流失到近侧的主动脉中。通过在左和右冠状动脉中缓慢注射2.0ml，递送含有2×1011个重组腺病毒颗粒的4毫升溶液。分析(1)区域收缩功能和灌注。使用Hewlett Packard超声成像系统(Hewlett-Packard Sonos 1000)，在乳头肌水平位置上，从右胸骨旁途径获得双维M型图像。研究为了使身体运动最小而悬挂在舒服的吊带中的有意识动物。在VHS带上记录处于基态的动物的图像，并在左心房起搏(心率＝每分钟200次搏动)期间再次记录。这些研究在基因转移前1天进行，并在14±1天后重复。基因转移FGF-5后12周对5头动物作再次检测，以确定这种改善功能的作用是否持久。在两个组中心率-压力乘积和左心房压力在基因转移前和后是相似的，这说明相似的心肌氧需求量和负荷情况。使用标准化的标准(Sahn等，Circulation 581072-1083，1978)进行超声心动描记术测量。为了说明超声心动描记术测量的可重复性，在连续的两天对动物成像(n＝5)。来自不同测定的数据是高度可重复的(外侧壁增厚r2＝0.90；P＝0.005)。通过经胸廓的超声心动描记术和声音测微法(sonomicrometry)在该模型中测量到的功能降低百分数是相似的(Hammond等，J.Am.Coll.Cardiol.23475-82，1994和Hammond等，J.Clin.Invest.922644-2652，1993)，这证明了超声心动描记术在评价缺血性功能障碍上的准确性。分析是在不知道治疗组的情况下进行的。
对比材料(Levovist；半乳糖微聚体)在左心房注射后增强图像的超声产生量(白色)。此微聚体按与血流量成比例的方式分布在冠状动脉和心肌壁内。对比增强的峰值强度与通过微球测量的心肌血流量相关(Skyba等，Circulation 581072-1083，1978)。放置ameroid后38天(±2)天，即正好在ameroid堵塞后但在基因转移前，在心房起搏(200bpm)期间进行对比超声心动描记术研究。在基因转移后14±1天重复研究，并在用FGF-5进行基因转移后12周在5只动物中再次重复。使用基于计算机的视频分析程序(Color Vue II，NovaMicrosonics，Indianapolis，Indiana)从视频图像测量峰值对比强度，这样就提供了一个客观的视频强度测量值。数据表示为缺血区域的峰值视频强度(LCx床)除以室间隔(IVS，通过未堵塞的冠状动脉左前降支接受正常血流量)中峰值视频强度的比值。在我们实验室，心房起搏期间通过对比超声心动描记术测量到的区域血流量差异与通过在此同一模型中使用微球所测量到的差异相似，这说明超声心动描记术在评价区域心肌血流量上是准确的。对比研究是在不知道动物接受何种基因的情况下分析的。(ii)评价血管生成将导管插入头臂动脉中并结扎其它大血管。在静脉内注射肝素(10,000IU)、罂粟碱(60mg)、及随后的氯化钾(为了诱导舒张的心脏停搏)后，横向夹住主动脉并灌注冠状脉管系统。以120mmHg压灌注戊二醛溶液(6.25％，0.1M二甲胂酸缓冲液)；取出心脏；使用色彩标记的染料顺行注射通过左前降支、左旋支和右冠状动脉，鉴定这些床；并检测ameroid以证实堵塞。取自正常灌注和缺血的区域的样品(心内膜和心外膜三部分)通过塑胶包埋并预备用于显微镜分析毛细血管数量。按以前所述方法(Mathieu-Costello，Microvasc.Res.3398-117，1987和Poole & Mathieu-Costello，Am.J.Physiol.259H204-H210，1990)，从每个子样品(每个区域的心内膜和心外膜)取4个1μm厚的横向切片。在每个子样品的所有8个视野(通过系统性采样随机选取的)中，使用图像分析仪(Videometric 150，AmericanInnovision)，以1400倍测量每根纤维周围的毛细血管数量和纤维截面积。测量了总共325±18根纤维周围的毛细管数量。通过每个子样品打点计数15±1个视野，估计毛细管密度(每个纤维截面积的数量)。每根纤维周围的毛细血管数量、纤维截面积和毛细血管密度的相对标准误分别是1.4、4.1和4.2％。毛细血管与纤维的比按毛细血管密度与纤维截面积的乘积来计算。在任一组的心肌样品中纤维截面积没有显著差异。将溴脱氧尿苷(50mg/kg)注入活动物的腹膜间隔中对照动物(无ameroid)；两只具有ameroid堵塞物的动物，在两周前接受lacZ基因转移；和两只具有ameroid堵塞物的动物，在两周前接受FGF-5基因转移。BRDU注射后36小时，处死动物并使用以前描述的方法(Kajstura等，Cir.Res.74383-400，1994)预备组织用于分析。使用十二指肠切片作为阳性对照。(iii)DNA、mRNA和蛋白质表达在基因转移后，对左心室匀浆物进行研究以证实转基因的存在和表达。使用针对CMV启动子的有义引物(GCAGAGCTCGTTTAGTGA AC；SEQID NO.1)和针对内部FGF-5序列的反义引物(GAAAATGGGTAGAGATATGCT；SEQ ID NO.2)，聚合酶链式反应(PCR)扩增预期的500bp片段。使用针对FGF-5序列起始部分的有义引物(ATGAGCTTGTCCTTCCTCCTC，SEQ IDNO.3)和针对内部FGF-5序列的反义引物(即SEQ ID NO.2)，RT-PCR扩增期望的400bp片段。使用指向腺病毒DNA E2区的引物以检测组织中的野生型或重组病毒DNA(引物TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG；SEQ IDNO.4和CATCTGAACTCAAAGCGTGG；SEQ ID NO.5)。从重组病毒扩增期望的900bp片段。这些研究是在200mg来自心肌和其它组织的组织样品上进行的。PCR的检测灵敏度是每5百万个细胞1个病毒序列。指向FGF-5的多克隆抗体(Kitaoka等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.353189-3198，1994)被用于蛋白质的免疫印迹中，所述蛋白质来源于基因转移FGF-5或lacZ后48小时的培养大鼠心脏成纤维细胞的培养基。FGF-5基因转移后在条件培养基中发现了FGF-5蛋白，但lacZ基因转移后则无。PCR和Western印迹的方法详细描述在其它地方(Hammond等，J.Clin.Invest.922644-2652，1993；Roth等，J.Clin.Invest.91939-949，1993；和Tsai等，Am.J.Physiol.267H2079-H2085，1994)。为了检测此转基因的体外促有丝分裂活性，用编码FGF-5的腺病毒或用编码lacZ的腺病毒感染成年大鼠心脏成纤维细胞，或不进行感染。将这些细胞培养物的培养基和NIH 3T3小鼠成纤维细胞一起孵育，并测量氚化胸苷的掺入量(Tsai等，Endocrinology，1363831-3838，1995)。(iv)冠脉内递送期间的腺病毒释放在三只动物中在冠脉内注射重组病毒期间，连续地抽取肺动脉血液。每个样品的血清用于标准噬斑试验。在亚汇合的H293细胞中加入未稀释的血清(0.5ml)；10天后，没有噬斑形成。然而，用DMEM(2％FBS)将0.5ml血清稀释200至8000倍后，到第9天形成了病毒噬斑。单一血管床(心肌的)将冠状动脉和肺动脉分开。如果注入冠状动脉后在该床中没有病毒附着，则肺动脉中的病毒浓度应当反映了在注射的时间内系统静脉血液对冠状窦血液的稀释。我们实验室的测量值说明，冠脉血流量是肺动脉血流量的5％。使用此稀释系数(20倍)，冠脉注射持续时间、和注射的腺病毒量，在假设没有腺病毒逃逸或附着的情况下，我们计算了递送至肺动脉的腺病毒量。该估计值与所测量到的值比较，并将此差值用作被心肌脉管床所清除的病毒量的估计值。(v)评价炎症反应使用苏木精/伊红和Masson氏三色染色法，检测炎性细胞浸润、细胞坏死和纤维化。小鼠的腹水、猪的抗CD4和抗CD8单克隆抗体(1.0mg/ml；VMRD，Inc.Pullman，Washington)被用于检测脾(阳性对照)和心脏的冰冻切片(6μm)中T淋巴细胞上的CD4和CD8标记。这些研究是在6只动物心脏的透壁样品上进行，所述动物在处死前50天接受了ameroid堵塞物两只未接受基因转移，两只2周前接受了FGF-5基因转移，而两只在2周前接受了lacZ基因转移。在不知道处理组的情况下进行分析。(vi)统计学分析数据表示为平均值±1s.e.m。在用FGF-5和lacZ作基因转移前和后进行测量，并使用双向方差分析(Crunch4，Crunch软件公司，Oakland，California)。比较测量值。从血管生成研究得到的数据也进行了双向方差分析。当P＜0.05时排除无效假设。使用FGF-5转基因获得的结果使用三种测量评价FGF-5的基因转移是否对治疗心肌缺血有效区域收缩功能和灌注(在基因转移之前和之后评价)及毛细血管数量。所有的测量均在不知道动物接受何种基因(FGF-5对lacZ)的情况下进行的。
区域收缩功能和血流量。在放置ameroid后38天，动物在心房电刺激(起搏)期间表现出壁增厚受损。接受lacZ的猪在基因转移之前和之后两周在缺血区域中表现出相似程度的起搏诱导的功能障碍。相反，FGF-5基因转移后两周，在起搏期间缺血区域的壁增厚增加2.7倍(P＜0.0001；图6)。在正常灌注的区域(室间隔)壁加厚在起搏期间是正常的并且不受基因转移的影响(％壁增厚lacZ基因转移前53±8％、基因转移后51±6％；FGF-5基因转移前59±4％、基因转移后59±6％)。
与缺血区域功能的改善相关的是改善的区域血流量。lacZ基因转移后两周，在起搏期间缺血区域中有持续的血流量不足(图8)。然而，接受FGF-5基因转移的动物在两周后两个区域中表现出均一的对比增强，这说明缺血区域的血流量得到改善(P＝0.0001)。为了确定此缺血床中改善的功能和灌注是否长期维持，在FGF-5基因转移后12周再次检测5只动物。每只动物均表现出持久的功能改善(P＝0.005；图6)和灌注(P＝0.001；图8)。
血管生成。未感染的ameroid阻塞动物(未进行基因转移)与接受编码lacZ的腺病毒的动物具有一致的生理反应，这说明lacZ并没有对天然的血管生成产生不良影响。为了评价血管生成，使用显微镜分析灌注固定的心脏，以定量心肌毛细血管数量(图9)。接受FGF-5基因转移的动物在缺血的心内膜和非缺血的区域中与接受lacZ基因转移的动物的相同心脏区域比较，每根心肌纤维周围的毛细血管数量更多(P＝0.038)。因此，区域功能和灌注的改善与FGF-5基因转移后两周的毛细血管生成是相关的。FGF-5基因转移后每根纤维周围增加的毛细血管数量倾向于在壁的心外膜部分中增加。毛细管现象的其它测量值如每个纤维截面积中的毛细血管数量和每纤维数的毛细血管数，在心内膜或心外膜中不改变。
DNA、mRNA和蛋白质表达。确立了FGF-5基因转移对功能、灌注和每根纤维周围的毛细血管数量的有利影响后，必需证明转基因在心脏中的存在和表达。使用聚合酶链式反应(PCR)和逆转录酶偶联的PCR(RT-PCR)在接受FGF-5基因转移的动物的心肌中检测转基因FGF-5 DNA和mRNA。
基因转移后，检测左心室样品以证实转基因的掺入和表达。简单地说，冠脉内基因递送lacZ后3天，用X-gal处理心肌，然后用伊红X120复染。使用标准组织学技术检测，揭示心肌细胞的大部分表现出β-半乳糖苷酶活性(蓝染色)。在基因转移后14±1天在所有接受lacZ基因转移的动物中也观察到活性。较高的放大倍数显示中含有β-半乳糖苷酶活性的细胞中的横纹，这证实了基因在心肌细胞中的表达。使用针对CMV启动子的有义引物和针对FGF-5内部序列的反义引物进行PCR分析以证实在接受FGF-5基因转移的三只动物的缺血(LCx)和非缺血(LAD)区中存在编码FGF-5的重组腺病毒DNA。该结果显示在图10A中，证实存在期望的500bp片段。然后在基因转移后14天检测FGF-5mRNA的表达。正如如10B中显示的，RT-PCR扩增的400bp片段存在于两只动物的两个区域中，而对照动物没有表现出信号。在蛋白质免疫印迹中使用针对FGF-5的多克隆抗体，所述蛋白来自基因转移FGF-5或lacZ后48小时培养的大鼠心脏成纤维细胞的培养基。正如图10C显示的，在FGF-5(F)基因转移后发现了FGF-5蛋白，但在lacZ基因转移(β)后则没有，这说明FGF-5基因转移后有蛋白表达和细胞外分泌。最后，使用指向腺病毒DNA(E2区)的一套引物进行PCR，以确定在两只14天前接受了冠脉内注射腺病毒的动物的视网膜、肝或骨骼肌中是否存在腺病毒DNA。正如图10D显示的，期望的900bp扩增片段仅在含有重组腺病毒(作为阳性对照)的对照泳道(+)中被发现，而在来源于处理动物的视网膜(r)、肝(l)或骨骼肌(m)的泳道中均没有。
我们证实在缺血和非缺血区域中均有成功的基因转移。免疫印迹显示接受FGF-5基因转移的动物的心肌中存在FGF-5蛋白。在使用培养的成纤维细胞进行的其它试验中，我们证实FGF-5基因转移赋予了这些细胞合成和向细胞外分泌FGF-5的能力。来自表达FGF-5的重组腺病毒感染的培养细胞的培养基显示出促有丝分裂反应(相对于对照14倍的增加；P＝0.005)。最后，基因转移后两周，来自lacZ感染的动物的心肌样品(而非肝样品)在组织学检查中表现出β-半乳糖苷酶活性。这些研究证实了成功的体内基因转移和表达，并证明了该转基因产物的生物学活性。
冠脉内注射重组病毒两周后，尽管心肌中存在病毒DNA，但使用PCR我们未能在肝、视网膜或骨骼肌中检测到病毒DNA。而且，在冠脉注射后2-24小时，尿液中没有检测到病毒DNA。这些试验说明，冠脉内递送腺病毒载体使病毒的系统性动脉分布最小化，达到低于PCR方法检测限度的水平。该技术在具有较小冠状动脉尺寸的动物如兔中可能难于实施。
为了评价心肌对腺病毒的摄取效率，我们通过在冠脉内注射期间采取肺动脉血液，测量了心脏释放的腺病毒量。令人惊奇地，第一次通过时心脏清除了98.7％的病毒。冠脉内递送病毒期间从肺动脉获得的未稀释血清不能在适当的条件下形成病毒噬斑。因此，本发明有效地提供了心脏特异性基因递送系统。
炎症反应的评价。显微镜观察接受重组腺病毒的动物的心脏透壁切片，没有显示出炎性细胞浸润、细胞坏死或纤维化增加。作为腺病毒诱导的致细胞病毒效应的另一评价，我们进行了免疫组织学研究以检测CD4和CD8抗原，这些抗原将指示细胞毒性T细胞的存在。这些研究显示在未感染动物(n＝2)和接受重组腺病毒的动物(n＝4)的心脏透壁切片上罕有阳性细胞。而且肝脏也没有炎症反应。实施例6使用FGF-4转基因的基因介导血管生成本实验实施例说明使用不同的编码血管生成蛋白的基因FGF-4实现了成功的基因治疗。FGF-4基因治疗的方案基本上同以上实施例5中所述的用于FGF-5的方法。
从由卡波西肉瘤DNA转化NIH3T3细胞的mRNA构建的cDNA文库中分离人FGF-4基因。FGF-4 cDNA长约1.2kb，编码在N端包括一个30个氨基酸的信号肽的206个氨基酸多肽(Dell Bovi等，Cell50729-737，1987；Bellosta等，J.Cell Biol.121705-713，1993)。我们将基本上全长的1.2kb EcoRI片段形式的FGF-4 cDNA亚克隆在腺病毒载体pACCMVpLpASR(简写为pACSR)的EcoR I位点中。5’起始位点在第243个碱基对处而3’末端在863碱基对处。编码FGF-4的重组腺病毒载体(本文中又称作Ad.FGF-4)是按实施例2中所述制备FGF-5腺病毒的方法进行的。
通过Western印迹分析，使用抗FGF-4抗体进行检测，证实FGF-4在心脏组织中表达(并在其它组织包括肝、骨骼肌和眼中不表达)。我们还测试了FGF-4对体外内皮细胞增殖的促有丝分裂影响。
放置ameroid后45天，对动物进行研究以确定压力诱导的区域功能和血流量，然后通过冠脉内注射向动物递送表达FGF-4的重组腺病毒(n＝6只动物)。13天后，重复该研究以压力诱导的区域功能和血流量。之后，处死动物并收集组织。转基因递送与FGF-5相同，在内源性血管生成停止、且存在类似于患者心绞痛的诱导型心肌缺血后，进行基因转移。为了冠脉递送转基因，麻醉动物，并在颈动脉中放置一个5F的动脉鞘。通过该鞘将一个5F的多功能冠脉导管插入冠状动脉中。通过向左主冠状动脉中反向注射，证实在所有动物中均有ameroid闭塞。然后将导管顶端放入动脉内腔内1cm，以便在注射期间向近侧主动脉中流失最少的物质。通过向左冠状动脉中缓慢注射3.0ml并向右冠状动脉中注射2.0ml，递送含有1.5×1012个表达FGF-4的重组腺病毒病毒颗粒的5ml溶液。使用FGF-4转基因的结果区域功能和灌注在放置ameroid后45天，动物在心房起搏期间表现出壁加厚受损。相反，在FGF-4基因递送后两周，起搏期间在缺血区中壁加厚增加2.7倍(p＜0.0001；图11和12)。正常灌注区域(室间隔)中的壁加厚在起搏期间是正常的并不受基因转移的影响。FGF-4基因转移后功能上的改善与使用FGF-5或FGF-2LI+信号肽(“sp”)后获得的改善在统计上没有不同(图11)。缺血区域中功能的改善与改善的区域灌注是相关的(图12)。正如图12所示，在FGF-4基因转移前，起搏期间缺血区域中的血流量不足。用FGF-4进行基因转移后两周，在两个区域中观察到均一的对比增强，指示缺血区域的血流量得到改善(p＝0.0001)。使用FGF-4的结果在统计上与使用FGF-5和FGF-2LI+sp所获得的结果没有不同(图13)。FGF-2LI+sp在实施例7中描述并指含有信号序列的FGF-2。
转基因表达使用编码该转基因的序列所特异的引物，通过PCR和RT-PCR证实FGF-4仅在心脏中表达。在心脏中发现FGF-4 DNA和mRNA，但在眼、肝和骨骼肌中没有此发现。这些数据证实了使用Ad.FGF-5(n＝2)和Ad.FGF-2LI+sp(n＝1)所得到的数据。因此在接受含有不同编码血管生成蛋白的基因的腺病毒载体的所有4只动物中证实了转基因仅在心脏中表达。
缺少心肌炎症反应我们检测了接受Ad.FGF-4的三只连续动物的透壁心肌活检组织。在基因转移后2周处死动物。与未接受腺病毒的对照ameroid动物相比，在这些切片中没有炎性细胞浸润、坏死或纤维化增加的迹象。在LAD和LCx床中这均是事实。由病理学家观察这些切片，并给出盲样评价，并判断所有切片中没有存在心肌炎的迹象。实施例7使用FGF-2突变蛋白的基因介导血管生成该实验实施例说明使用第三编码血管生成蛋白的基因FGF-2实现了成功的基因治疗。本实验还说明可以如何修饰血管生成蛋白以增加分泌和潜在地提高血管生成基因治疗在增强心脏内血流量和心肌功能方面的效力。用于人FGF-2基因治疗的方案实际上与上述用于FGF-5和FGF-4的一致。
尽管一些蛋白可以分泌，但酸性FGF(aFGF，FGF-1)和碱性FGF(FGF-2)缺少天然的分泌信号序列。对于酸性FGF，还描述了另一不涉及高尔基体的分泌途径。制备两个FGF-2结构(FGF-2LI+sp和FGF-2LI-sp)，一个具有编码用于经典蛋白分泌途径的信号肽的序列(FGF-2LI+sp)，一个不具有编码信号肽的序列(FGF-2LI-sp)，以测试具有额外信号肽的FGF-2比不具有额外信号肽的相同蛋白质具有更大的改善效力。
正如以下显示的，FGF-2具有一个5个残基的环结构，该结构从氨基酸第118位延伸至第122位残基。通过盒式定向诱变使用白介素-1β的相应5残基环替代该环结构，产生FGF-2LI环置换突变体。简单地说，将编码人Glu3，5FGF-2的基因(Seddon等，Ann.N.Y.Acad.Sci.63898-108，1991)克隆在T7表达载体pET-3a(M13)(pET-3a的衍生物)(Rosenberg等，Gene 56125-135，1987)的Ndel和BamH1限制性位点之间。将单一限制性内切核酸酶位点，BstB1和Spl1以一定方式导入该基因中，以便在位于编码FGF-2的区段Ser117-Trp123的密码子侧翼的位置处在编码的氨基酸中不引起改变(即沉默突变)。
FGF-1、FGF-2和IL-1β中β9-β10环的结构比对1。
110 115 120 125 130FGF-1 ENHYNTYISKKHAEKHWFVGLKKNG (SEQ ID NO.6)110 115 120 125 130FGF-2 SNNYNTYRSRKY..TSWYVALKRTG (SEQ ID NO.7)110 115 120 125IL-1βNNKLEFESAQF..PNWYISTSQAE (SEQ ID NO.8)
1用于FGF-1和FGF-2的编号是从编码155残基形式的cDNA序列推导出的氨基酸残基第1位起始的(正如Seddon等，Ann.N.Y.Acad.Sci.63898-108，1991中所述的)，而对于IL-1β则是从成熟的153个残基多肽的第一位残基开始的(id.)。
基本上按如下方式，用来自结构类似物IL-1β(15-119)的相应环的人序列Ala-Gln-Phe-Pro-Asn替代FGF-2的Arg118-Lys119-Tyr120-Thr121-Ser122残基用BstB1和SplI消化质粒DNA，pET-3a(M13)，并使用琼脂糖凝胶电泳分离所获较大DNA片段。使用T4DNA连接酶将该DNA片段与以下两个合成寡核苷酸退火后获得的双链DNA连接5’-CGAACGATTGGAATCTAATA ACTACAATAC GTACCGGTCT GCGCAGTTTC CTAACTGGTATGTGGCACTTAAGC-3’(SEQ ID NO.9)和5’-GTACGCTTAA GTGCCACATACCAGTTAGGA AACTGCGCAG ACCGGTACGT ATTGTAGTTA TTAGATTCCAATCGTT-3’(SEQ ID NO.10)，它们含有与BstB1和SplI消化产生的末端相容的末端。使用此连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)(DH5α株)细胞。基于在新引入的Alf2限制性位点(以上带下划线的)切割的敏感性，选择出期望的突变质粒(FGF-2LI)。
通过使用基于聚合酶链式反应(PCR)的方法，构建具有和不具有信号肽的FGF-2LI。为了在FGF-2LI的5’加上FGF-4的信号肽序列而且为了确保该信号肽可以从FGF-2LI蛋白上被切割下来，我们使用了Forough R.等用于获得分泌性FGF-1的基因盒。使用与FGF-4信号肽的5’部分匹配的引物(pF1B5’-CGGGATCCGC CCATGGCGGG GCCCGGGACGGC-3’(SEQ ID NO.11)和针对FGF-1的5’部分的第二引物(pF2R5’-CGGAATTCTG TGAAGGTGGT GATTTCCC-3’)(SEQ ID NO.12)，通过PCR合成在FGF-1头10个氨基酸之前的FGF-4信号肽序列5’末端含有BamHI位点并在3’末端含有EcoRI位点的DNA片段。使用分别与FGF-2LI的5’端和3’端序列匹配的另一对引物(pF3R5’-CGGAATTCATGGCTGAAGGG GAAATCACC-3’(SEQ ID NO.13)和pF4HA5’-GCTCTAGATTAGGCGTAGTC TGGGACGTCG TATGGGTAGC TCTTAGCAGA CATTGGAAGA AAAAG-3’(SEQ ID NO.14))，我们获得第二DNA片段，该片段在FGF-2LI的5’末端具有一个EcoRI位点，在FGF-2LI的3’末端具有一个流感血凝集素(HA)标记加上一个XhaI位点。然后通过三分子连接将这两个片段亚克隆至pcDNA3载体的BamHI和XbaI位点中。以相似方式亚克隆与pSPFGF-2LI/cDNA3相似但不具有信号肽的质粒pFGF-2LI/cDNA3。然后测序此两个质粒以验证插入片段的正确性。然后通过用BamHI和XbaI消化从pcDNA3中释放出此两个FGF-2LI片段，并亚克隆至用于制备重组病毒的穿梭载体pACCMVpLpASR(+)(简写为pACSR)中。基本上按实施例2所述制备重组病毒和可注射载体。按实施例5所述进行基因转移(8只动物用于FGF-2LI sp+，6只动物用于FGF-2LI sp-，lacZ载体充当对照，所有均使用1011至1012个病毒颗粒)。使用FGF-2突变蛋白的结果用FGF-2LI+sp进行基因转移后两周，与基因转移前相比，200bpm的起搏压力期间峰值对比比率(LCx/LV)显著得到改善。图13显示了使用表达lacZ、FGF-5、FGF-2LI+sp、FGF-2LI-sp和FGF-4的重组腺病毒作冠脉内基因转移进行比较得到的结果。图13中右侧的黑条显示了使用此方法的正常血流量比例。FGF-2LI+sp对这些动物中的峰值对比血流量比率进行标化。
冠脉内递送表达FGF-2LI+sp的重组腺病毒后两周，壁增厚的百分数也得到改善。图11显示了使用表达lacZ、FGF-5、FGF-2LI+sp、FGF-2LI-sp和FGF-4的重组腺病毒作冠脉内基因转移进行比较得到的结果。图11中右侧的黑条显示了起搏诱导压力前的正常壁增厚百分数。FGF-2LI+sp使区域功能提高的程度在统计学上与FGF-5没有不同。尽管在使用FGF-2LI-sp进行基因转移后注意到有一些改善，但使用含有信号肽的转基因得到的改善更佳(图13)。
权利要求
1.增强患者心脏收缩功能的方法，其包括通过将包含编码血管生成蛋白或肽的转基因的载体导入至少一条冠状动脉中从而将该转基因递送至患者的心肌，其中该转基因被递送至心肌中并得到表达，而心脏的收缩功能增强。
2.权利要求1的方法，其中该载体从引导至一或多条冠状动脉腔内的导管导入。
3.权利要求2的方法，其中从所述导管的顶端注射该载体。
4.权利要求1的方法，其中载体的导入包括将载体注射至向所述心肌供血的至少两条冠状动脉的内腔中。
5.权利要求4的方法，其中将该载体导入至少一条右冠状动脉和至少一条左冠状动脉中。
6.权利要求3的方法，其中通过从引导至所述动脉腔内至少1cm的导管注射而将载体导入。
7.权利要求6的方法，其中该载体被导入至少一条右冠状动脉和至少一条左冠状动脉中。
8.权利要求1的方法，其中还将载体导入向该心肌供血的隐静脉移植物和/或胸廓内动脉移植物中。
9.权利要求1的方法，其中从放入接受来自心肌的血液的管道内的导管通过逆行灌注导入该载体。
10.权利要求1的方法，其中所述载体是病毒载体。
11.权利要求10的方法，其中所述载体是复制缺陷型病毒载体。
12.权利要求10的方法，其中所述载体是腺病毒载体。
13.权利要求12的方法，其中所述载体是复制缺陷型腺病毒载体。
14.权利要求12的方法，其中体内递送约107至1013个腺病毒载体颗粒。
15.权利要求14的方法，其中体内递送约109至1012个腺病毒载体颗粒。
16.权利要求1的方法，其中所述转基因由包含在载体中的CMV启动子驱动表达。
17.权利要求1的方法，其中所述转基因由包含在载体中的组织特异性启动子驱动表达。
18.权利要求17的方法，其中所述转基因由包含在载体中的心肌细胞特异性启动子驱动表达。
19.权利要求18的方法，其中所述心肌细胞特异性启动子选自心肌细胞特异性肌球蛋白轻链启动子和心肌细胞特异性肌球蛋白重链启动子。
20.权利要求1的方法，其中所述血管生成蛋白或肽选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子。
21.权利要求1的方法，其中所述血管生成蛋白或肽是成纤维细胞生长因子。
22.权利要求21的方法，其中所述血管生成蛋白或肽是选自aFGF、bFGF、FGF-4、FGF-5和FGF-6的成纤维细胞生长因子。
23.权利要求1的方法，其中所述血管生成蛋白是血管内皮细胞生长因子。
24.权利要求23的方法，其中所述血管内皮细胞生长因子选自VEGF-A、VEGF-B和VEGF-C。
25.权利要求1的方法，其中所述血管生成蛋白或肽是胰岛素样生长因子。
26.权利要求25的方法，其中所述血管生成蛋白或肽是胰岛素样生长因子1。
27.权利要求1的方法，其中所述血管生成蛋白或肽包含信号肽。
28.权利要求1的方法，其中所述血管生成蛋白或肽是血管生成多肽调节物。
29.权利要求1的方法，其中所述载体还包含编码血管生成蛋白或肽的第二转基因。
30.权利要求1的方法，其中所述载体包含编码至少两个血管生成蛋白或肽的一个转基因或多个转基因。
31.权利要求30的方法，其中所述血管生成蛋白或肽均独立地选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子。
32.权利要求30的方法，其中所述血管生成蛋白或肽均独立地选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、低氧诱导因子和血管生成多肽调节物。
33.权利要求30的方法，其中所述血管生成蛋白或肽中的第一个选自由成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、低氧诱导因子和血管生成多肽调节物组成的组，而且所述血管生成蛋白或肽中的第二个选自所述组的另一成员。
34.权利要求30的方法，其中所述血管生成蛋白或肽的第一个是成纤维细胞生长因子而且所述血管生成蛋白或肽的第二个是血管内皮细胞生长因子。
35.权利要求30的方法，其中所述血管生成蛋白或肽的第一个是成纤维细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子，而所述血管生成蛋白或肽的第二个是胰岛素样生长因子。
36.权利要求30的方法，其中所述载体包含编码成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子的一个转基因或多个转基因。
37.权利要求1的方法，其中所述载体还包含编码心脏增强蛋白或肽的转基因。
38.权利要求37的方法，其中所述心脏增强蛋白或肽是β-肾上腺素能信号转导蛋白或肽(β-ASP)。
39.权利要求37的方法，其中所述心脏增强蛋白或肽诱导肌细胞的生长或功能，籍此增强心脏的收缩功能。
40.权利要求1的方法，其中所述血管生成蛋白或肽刺激心脏中的侧支血管发育，籍此增加心脏中的血流量。
41.权利要求1的方法，其中使用所述载体进行的转基因递送主要定位在心脏。
42.权利要求1的方法，其中所述载体主要转染心脏细胞。
43.权利要求1的方法，其中所述转基因的表达主要发生在该心肌内。
44.权利要求43的方法，其中所述转基因的表达主要发生在心脏的肌细胞中。
45.权利要求1的方法，其中心脏的壁增厚百分数增加。
46.权利要求1-45之任一项的方法，其中向至少一条冠状动脉中导入载体的步骤在用血管活性剂输注该动脉的同时或之后进行。
47.权利要求46的方法，其中在注射所述载体前至少约2分钟向该动脉内输注所述血管活性剂。
48.权利要求46的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂或血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白。
49.权利要求48的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂。
50.权利要求49的方法，其中该血管活性剂是浓度为约1-75微克/毫升的组胺。
51.权利要求50的方法，其中该血管活性剂是浓度约25微克/毫升的组胺，其在注射所述载体前以约1ml/min的速率被输注至该动脉中，持续约3分钟。
52.权利要求1的方法，其中所述患者患有心血管疾病。
53.权利要求52的方法，其中所述患者患有动脉粥样硬化。
54.权利要求52的方法，其中所述患者患有心肌缺血。
55.根据权利要求1-45或52-54之任一项的方法，其中所述患者是人。
56.权利要求55的方法，其中心脏内血流量增加。
57.增加患者缺血组织中的血流量的方法，其包括通过将包含编码血管生成蛋白或肽的转基因的载体导入所述组织中而将该转基因递送至所述组织的缺血区域，籍此该转基因在该组织中表达，而且该组织中的血流量得以增加。
58.权利要求57的方法，其中从放入向组织递送血液的管道中的导管，通过顺行灌注将该载体导入组织中。
59.权利要求57的方法，其中从放入接受来自组织的血液的管道中的导管，通过逆行灌注将该载体导入组织中。
60.权利要求57的方法，其中该缺血组织包含肌细胞，而且该缺血组织中血流量的增加导致收缩功能的增强。
61.权利要求60的方法，其中该肌细胞是心脏肌细胞。
62.权利要求62的方法，其中该血管选自冠状动脉和股动脉。
63.权利要求57的方法，其中通过向骨骼肌中注射包含该载体的溶液来导入该载体，其中该血管生成蛋白或肽导致组织中的血流量增加和缺血的减少。
64.权利要求63的方法，其中所述溶液包含至少约1ml。
65.权利要求57的方法，其中该患者患有心血管疾病。
66.权利要求65的方法，其中该患者患有外周血管疾病。
67.权利要求57的方法，其中从引导至一或多条冠状动脉的内腔中的导管将该载体导入。
68.权利要求57的方法，其中载体的导入包括将该载体注射至向心肌供血的至少两条冠状动脉的内腔中。
69.权利要求68的方法，其中将该载体导入至少一条右冠状动脉和至少一条左冠状动脉中。
70.权利要求68的方法，其中从引导至所述动脉内腔中至少约1cm的导管通过注射导入该载体。
71.权利要求70的方法，其中将该载体导入至少一条右冠状动脉和至少一条左冠状动脉中。
72.权利要求66的方法，其中也将该载体导入向心肌供血的隐静脉移植物和/或胸廓内动脉移植物中。
73.权利要求57的方法，其中从放入接受来自心肌的血液的管道中的导管，通过逆行灌注导入该载体。
74.权利要求57的方法，其中所述载体是病毒载体。
75.权利要求74的方法，其中所述载体是复制缺陷型病毒载体。
76.权利要求74的方法，其中所述载体是腺病毒载体。
77.权利要求76的方法，其中所述载体是复制缺陷型腺病毒载体。
78.权利要求76的方法，其中体内递送约107至约1013个腺病毒载体颗粒。
79.权利要求78的方法，其中体内递送约109至约1012个腺病毒载体颗粒。
80.权利要求57的方法，其中所述转基因由包含在载体中的CMV启动子驱动表达。
81.权利要求57的方法，其中所述转基因由包含在载体中的组织特异性启动子驱动表达。
82.权利要求81的方法，其中所述转基因由包含在载体中的心肌细胞特异性启动子驱动表达。
83.权利要求82的方法，其中所述心肌细胞特异性启动子选自心肌细胞特异性肌球蛋白轻链启动子和心肌细胞特异性肌球蛋白重链启动子。
84.权利要求57的方法，其中所述血管生成蛋白或肽选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子。
85.权利要求57的方法，其中所述血管生成蛋白或肽是成纤维细胞生长因子。
86.权利要求85的方法，其中所述血管生成蛋白或肽是选自aFGF、bFGF、FGF-4、FGF-5和FGF-6的成纤维细胞生长因子。
87.权利要求57的方法，其中所述血管生成蛋白是血管内皮细胞生长因子。
88.权利要求87的方法，其中所述血管内皮细胞生长因子选自VEGF-A、VEGF-B和VEGF-C。
89.权利要求57的方法，其中所述血管生成蛋白或肽是胰岛素样生长因子。
90.权利要求89的方法，其中所述血管生成蛋白或肽是胰岛素样生长因子1。
91.权利要求57的方法，其中所述血管生成蛋白或肽包含信号肽。
92.权利要求57的方法，其中所述血管生成蛋白或肽是血管生成多肽调节物。
93.权利要求57的方法，其中所述载体还包含编码血管生成蛋白或肽的第二转基因。
94.权利要求57的方法，其中所述载体包含编码至少两个血管生成蛋白或肽的一个转基因或多个转基因。
95.权利要求94的方法，其中所述血管生成蛋白或肽均独立地选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子。
96.权利要求95的方法，其中所述血管生成蛋白或肽均独立地选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、低氧诱导因子和血管生成多肽调节物。
97.权利要求94的方法，其中所述血管生成蛋白或肽中的第一个选自由成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、低氧诱导因子和血管生成多肽调节物组成的组，而且所述血管生成蛋白或肽中的第二个选自所述组的另一成员。
98.权利要求94的方法，其中所述血管生成蛋白或肽的第一个是成纤维细胞生长因子，而所述血管生成蛋白或肽的第二个是血管内皮细胞生长因子。
99.权利要求94的方法，其中所述血管生成蛋白或肽的第一个是成纤维细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子，而所述血管生成蛋白或肽的第二个是胰岛素样生长因子。
100.权利要求94的方法，其中所述载体包含编码成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子的一个转基因或多个转基因。
101.权利要求57的方法，其中所述载体还包含编码心脏增强蛋白或肽的转基因。
102.权利要求101的方法，其中所述心脏增强蛋白或肽是β-肾上腺素能信号转导蛋白或肽(β-ASP)。
103.权利要求101的方法，其中所述心脏增强蛋白或肽诱导肌细胞的生长或功能，籍此增强心脏的收缩功能。
104.权利要求57的方法，其中所述血管生成蛋白或肽刺激心脏中的侧支血管发育，籍此增加心脏中的血流量。
105.权利要求57的方法，其中使用所述载体进行的转基因递送，主要定位在心脏。
106.权利要求57的方法，其中所述载体主要转染心脏细胞。
107.权利要求57的方法，其中所述转基因的表达主要发生在心肌内。
108.权利要求107的方法，其中所述转基因的表达主要发生在心脏的肌细胞中。
109.权利要求57的方法，其中心脏的壁增厚百分数增加。
110.权利要求52-54或57-109之任一项的方法，其中向至少一个冠状动脉中导入载体的步骤在用血管活性剂输注该动脉的同时或之后进行。
111.权利要求110的方法，其中在注射所述载体前至少约2分钟向该动脉内输注所述血管活性剂。
112.权利要求110的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂或血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白。
113.权利要求112的方法，其中血管活性剂是组胺或组胺激动剂。
114.权利要求113的方法，其中该血管活性剂是浓度为约1-75微克/毫升的组胺。
115.权利要求114的方法，其中该血管活性剂是浓度约25微克/毫升的组胺，其在注射所述载体前以约1ml/min的速率被输注至该动脉中，持续约3分钟。
116.权利要求57的方法，其中所述患者患有心血管疾病。
117.权利要求116的方法，其中所述患者患有动脉粥样硬化。
118.权利要求116的方法，其中所述患者患有心肌缺血。
119.根据权利要求57-109或116-118之任一项的方法，其中所述患者是人。
120.权利要求119的方法，其中心脏中的收缩功能增加。
121.基因治疗组合物，其包含含有编码血管生成蛋白或肽的转基因的载体。
122.权利要求121的组合物，其中所述载体是病毒载体。
123.权利要求122的组合物，其中所述载体是复制缺陷型病毒载体。
124.权利要求122的组合物，其中所述载体是腺病毒载体。
125.权利要求124的组合物，其中所述载体是复制缺陷型腺病毒载体。
126.权利要求124的组合物，其包含约107至约1013个腺病毒载体颗粒。
127.权利要求126的组合物，其包含约109至约1012个腺病毒载体颗粒。
128.权利要求121的组合物，其中所述转基因由包含在载体中的CMV启动子驱动表达。
129.权利要求121的组合物，其中所述转基因由包含在载体中的组织特异性启动子驱动表达。
130.权利要求129的组合物，其中所述转基因由包含在载体中的心肌细胞特异性启动子驱动表达。
131.权利要求130的组合物，其中所述心肌细胞特异性启动子选自心肌细胞特异性肌球蛋白轻链启动子和心肌细胞特异性肌球蛋白重链启动子。
132.权利要求121的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子。
133.权利要求121的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽是成纤维细胞生长因子。
134.权利要求133的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽是选自aFGF、bFGF、FGF-4、FGF-5和FGF-6的成纤维细胞生长因子。
135.权利要求121的组合物，其中所述血管生成蛋白是血管内皮细胞生长因子。
136.权利要求135的组合物，其中所述血管内皮细胞生长因子选自VEGF-A、VEGF-B和VEGF-C。
137.权利要求121的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽是胰岛素样生长因子。
138.权利要求137的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽是胰岛素样生长因子1。
139.权利要求121的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽包含信号肽。
140.权利要求121的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽是血管生成多肽调节物。
141.权利要求121的组合物，其中所述载体还包含编码血管生成蛋白或肽的第二转基因。
142.权利要求121的组合物，其中所述载体包含编码至少两个血管生成蛋白或肽的一个转基因或多个转基因。
143.权利要求142的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽均独立地选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子。
144.权利要求142的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽均独立地选自成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、低氧诱导因子和血管生成多肽调节物。
145.权利要求142的组合物，其中所述血管生成蛋白或多肽中的第一个选自由成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、低氧诱导因子和血管生成多肽调节物组成的组，而且所述血管生成蛋白或多肽中的第二个选自所述组的另一成员。
146.权利要求142的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽的第一个是成纤维细胞生长因子，而所述血管生成蛋白或肽的第二个是血管内皮细胞生长因子。
147.权利要求142的组合物，其中所述血管生成蛋白或肽的第一个是成纤维细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子，而所述血管生成蛋白或肽的第二个是胰岛素样生长因子。
148.权利要求142的组合物，其中所述载体包含编码成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子的一个转基因或多个转基因。
149.权利要求121的组合物，其中所述载体还包含编码心脏增强蛋白或肽的转基因。
150.权利要求149的组合物，其中所述心脏增强蛋白或肽是β-肾上腺素能信号转导蛋白或肽(β-ASP)。
151.权利要求121的组合物，还包含药物赋形剂。
152.包含根据权利要求121至151的基因治疗组合物的试剂盒。
153.权利要求152的试剂盒，还包含将该组合物导入体内血管或组织中的装置。
154.权利要求153的试剂盒，其中该装置是导管。
155.权利要求152的试剂盒，还包含血管活性剂。
156.权利要求155的试剂盒，其中血管活性剂是组胺。
全文摘要
本发明提供治疗心血管疾病(包括心脏疾病和外周血管疾病)患者的方法。本发明的优选方法涉及体内向心肌或外周缺血组织递送编码血管生成蛋白或肽的基因，所用方式是将含有该基因的载体导入供应心脏的血管中或外周缺血组织中。
文档编号A61K45/00GK1433325SQ00816481
公开日2003年7月30日 申请日期2000年11月3日 优先权日1999年11月5日
发明者H·K·哈蒙德, F·J·乔达诺, W·H·迪尔曼 申请人:加利福尼亚大学董事会