基于来源于人及动物病原体基因组构建体的dna疫苗的制作方法

专利名称：：基于来源于人及动物病原体基因组构建体的dna疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明主要涉及疫苗组合物及其使用方法。更特别地，本发明涉及通过施用一个或多个大的基因组DNA片段，在受试者体内引发免疫应答。
背景技术：
：诱发细胞介导的免疫应答的疫苗正在作为与寄生虫、自身免疫失调、过敏性疾病和癌症斗争的重要策略出现。传统的接种疫苗策略通常包括施用“活的”或“死的”疫苗。Ertl等(1996)J.Immunol.1563579-3582.所谓的活疫苗包括减毒微生物和基于活载体的重组分子。死的疫苗包括那些基于不再有传染力(killed)的完整的病原体，和亚单位疫苗，如可溶的病原体亚单位或蛋白质亚单位。活疫苗通常成功地在已免疫的受试者体内提供一个有效的免疫应答；然而，这样的疫苗在免疫损害的(immunocompromised)或怀孕的受试者中可能是危险的，可能恢复为致病的生物体，或可能被其它的病原体污染。Hassett等(1996)TrendsinMicrobiol.8:307-312。死的疫苗避免了与活疫苗关联的安全问题；然而这样的疫苗经常未能在被免疫的受试者中提供一个适当的和/或有效的免疫应答。更最近，使用针和注射器，肌肉内注射(Wolff等(1990)Science24714651468)或真皮内注射(Raz等(1994)PNASUSA919519-9523)直接质粒DNA已经被描述。另外一个被称为发射(ballistic)的或颗粒介导的DNA递送的方法使用一个不需要颗粒的递送设备直接将DNA包被的精微金珠施用于表皮层的细胞之内(杨等(1990)PNASUSA879568-9572)。因此，许多的递送技术能用来递送免疫用的核酸，包括颗粒介导的技术，其递送核酸包被的微颗粒进入目的组织之内。(参见，例如，1999年2月2日发布的共同拥有的美国专利5,865,796号)已经表明，在表皮内递送了纳克量的DNA之后，颗粒介导的核酸免疫技术能引发体液和杀伤性T淋巴细胞免疫应答。Pertmer等(1995)Vaccine131427-1430。这些颗粒介导的递送技术已同其它类型核酸接种比较，并且发现是明显的优越者。Fynan等(1995)Int.J.Immunopharmacology1779-83，Fynan等(1993)Proc.Natl.AcadSci.USA9011478-11482，和Raz等(1994)Proc.Natl.AcadSci.USA919519-9523。已经描述了一种新的穿越皮肤的(transdermal)药物递送系统，该系统需要使用无针的注射器来递送包含受控制剂量的固体药物的颗粒进入并且通过完整的皮肤。特别地，Bellhouse等人的美国专利号为5,630,796的普遍拥有的专利描述一个颗粒递送设备(例如，一个无针头的注射器)，该设备能递送在超声波的气流中产生的药物颗粒。颗粒递送设备是用于穿越皮肤的递送粉状药物化合物和组合物的，是用来递送遗传物质进入活的细胞(例如，基因疗法)之内和递送生物药物至皮肤、肌肉、血液或淋巴的。这种设备也能连同外科手术一起使用，用来递送药物和生物制剂至器官表面，实体肿瘤和/或外科手术的腔洞(例如，在肿瘤切除术之后的肿瘤床或腔洞)。那些以一种相当结实的微粒子形式合适地制备来的药物制剂，可被安全地而且容易地使用这样的设备递送。一个特别的颗粒递送设备通常包含一伸长管状的喷嘴，其上有一个可破裂的隔膜最初封闭经过喷嘴的通路而且坚固地放置在紧邻喷嘴的上游末端。被递送的治疗用制剂颗粒紧邻可破裂的隔膜放置而且使用一种供给能量的方式被递送，这种方式在隔膜的上游一边施加了一个足够强的气压，从而使隔膜爆裂而产生超声波气体流(包含治疗用制剂颗粒)通过喷嘴并从其下游末端递送。颗粒就能如此以1马赫至8马赫之间的递送速度从无针头的注射器被递送，而这样的速率在可破裂的隔膜爆裂之时是很容易获得的。另外的一个颗粒递送设备配置通常包括上面所描述的相同元素，只是除了没有产生在超声波气流中的药物颗粒，而是在喷嘴的下游末端提供有一个双稳态横膈膜，它能在静态的“倒转(inverted)”位置(这一状态下，横膈膜下游的表面呈现一个中央凹陷处，其中包含有药物颗粒)和活跃的“翻转(everted)”位置(这一状态下，横膈膜下游的表面由于施加在横膈膜上游表面的超声冲击波，而变得外表面是凸起的)。以这种方式，包含在横膈膜中央凹陷里的药物颗粒以一个高的初始速度从该设备逐出，以将其穿越皮肤的(transdermal)递送到目标皮肤或粘膜的表面。使用上述设备配置的穿越皮肤的(transdermal)递送通常用近似大小范围常在0.1和250μm之间的颗粒进行。大于约250μm的颗粒也能从这样的设备递送，只是具有上限，在这一点颗粒的大小会造成对皮肤细胞的不幸伤害。被递送的颗粒将会穿透的实际距离依赖于颗粒的大小(例如，假定一粗略球形的颗粒形状的标称颗粒直径)，颗粒的密度，颗粒冲击皮肤表面的初始速度以及皮肤的密度和动粘度。用于无针头颗粒注射的靶颗粒密度通常在约0.1和25g/cm3之间，而注射速度通常在约150和3,000米/秒之间。DNA疫苗所能达到的有效保护水平与传统的蛋白质亚单位疫苗和不再有传染力的或减毒的病毒疫苗所引发的相似；但是传统上弱于在从自然感染恢复的康复期动物中所观察到的水平。Manickan等(1997)CriticalReviewImmunol.17139-154。疱疹感染是极其普遍的并且是由两种病毒引发的，即单纯疱疹病毒类型1(HSV-1)和单纯疱疹病毒类型2(HSV-2)。HSV-1通常在孩童时期获得并且是口部感染的占优势的原因。HSV-2感染通常与性传播的生殖感染关联。然而，多达25％的生殖疱疹是由HSV-1引起的。自然感染似乎在两种HSV株系之间给予交叉保护，即，感染一个株系的个体(如HSV-1)即使暴露在另一株系(也就是，HSV-2)，也只有低的感染率。Mertz等(1992)An.Intern.Med.116197-202。解释这些观察情况的理由还没有完全被阐明。虽然通过用不再有传染力的或改良的病毒接种，在小鼠和/或豚鼠体内能达到对单纯疱疹病毒(HSV)感染接近完全的保护作用，在康复期动物体内的保护程度成了改进疫苗性能的目标。HSV是一种具有一个约150-160kbp基因组的双链DNA病毒。HSV-1和HSV-2的基因组是共线性的并且在整个基因组上具有大于50％的同源性。对于某些基因，它们的氨基酸一致性在这两种病毒类型之间达到80到90％。由于这一相似性结果，许多HSV特异的抗体对这两种病毒类型是交叉反应的。病毒基因组包裹在一个具有膜的二十面体核壳体中。膜(或包膜)包括至少10种病毒编码的糖蛋白，最丰富的是gB，gC，gD和gE。病毒糖蛋白参与病毒附着在细胞受体及病毒和宿主细胞膜之间的融合这样的过程，其允许病毒进入细胞之内。糖蛋白位于病毒粒子的表面。结果，它们成了中和抗体和抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)的目标。在一个病毒类型内部，糖蛋白基因的株系-株系的序列可变性是有限的(1到2％)。病毒的基因组也编码超过70种其它的蛋白质，包括病毒粒子蛋白质，例如VP16和VP22，它们与病毒粒子被膜相关联，位于衣壳和胞膜之间。此外，一群大约五个ICPs也由病毒编码。(参见，例如，WO/9516779关于包含ICP4的疫苗)。这些早期蛋白在病毒复制周期的早期合成，与仅在病毒生命周期的晚期合成的胞膜糖蛋白相反。为综观HSV的分子结构和构造，可参见，如Roizman和Sears(1996)“Herpessimplexvirusesandtheirreplication”inFieldsVirology，3rded.，Fieldsetal.eds.，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，PA。一个发展HSV疫苗的方法就是使用被证明具有保护作用和治疗作用的分离糖蛋白。参见，如，Burke等，病毒学(virology)(1991)181793-797；Burke等，Rev.Infect.Dis.(1991)13(Suppl11)S906-S911；Straus等，Lancet(1994)3431460-1463；Ho等，J.Virol.(1989)632951-2958；Stanberry等，J.Infect.Dis.(1988)157156-163；和Stanberry等，(1987)J.Infect.Dis.155914-920；Stanberry，L.R.“SubunitViralVaccinesprophylacticandtherapeuticuse.”InAurelianL(ed.)Herpesviruses，theImmuneSystemsandAids.Kluwer，Boston，pp.309-341。然而，临床实验未能证明由gB和gD糖蛋白所组成的亚单位疫苗接种人体能产生重要的保护性免疫力。确定编码免疫原性抗原表位的序列的一个方法包括表达文库的使用，即已知的表达文库免疫作用(ELI)。国际公布WO96/31613报告了引入来自cDNA或片段化基因组DNA的克隆表达文库到受试者体内诱发一个能被定量的免疫应答以便选择包含有免疫原性抗原表位序列的文库。选择池然后被确定并且进行进一步的定性。使用的基因组片段相对小，长度约在10和100碱基对之间。而且，在ELI方法中，基因组片段被拼接到含有一个外源(例如，异源的)启动子载体上。ELI的基因组克隆的序列仍未经确认，因此，在发展一个特异的疫苗之前，必须广泛纯化和定性任何抗原性的序列。尽管这些报道，仍需要那些引发免疫应答的方法，这些免疫应答更近地模拟动物对抗原的自然反应。本发明提供了对这一问题和其它问题的解决办法。发明概述本发明提供在受试者体内引发免疫应答的方法和组合物。一方面，本发明提供引起脊椎动物受试者免疫应答的方法，包含有施用携带有从一个或多个病原体获得或来源的基因组DNA片段的构建体。一旦基因组DNA片段施用给受试者，存在于基因组DNA片段的编码抗原的编码序列就会表达，其表达量足以引发免疫应答。基因组片段在大小方面优选比5千碱基(kb)大的片段。在某些方法中，构建体是携带有大小大约在5kb和25kb之间的基因组DNA片段的一个质粒。在其它的方法中，构建体是携带有大小大约在25kb和大约在50kb之间的基因组DNA片段的一个粘粒。在某些方法中，包含在基因组DNA片段的编码序列(如，抗原编码序列)的表达不是被异源的启动子驱动的。病原体可以是，如一种或多种类型的细菌或一种或多种类型的病毒(如，单纯疱疹病毒或“HSV”)。构建体(如质粒或粘粒)可以，如通过穿越皮肤的(transdermal)用药的方式来施用。因此，本发明也提供遗传构建体在药物生产中的用途，该遗传构建体携带有来源于病原体的至少5kb大小的基因组DNA片段，该药物通过施用所述构建体给脊椎动物受试者，引发免疫应答，藉此包含在所述基因组DNA片段中的序列编码的抗原得以表达，其表达量足以引发免疫应答。另一方面，本发明提供一个在脊椎动物受试者中引发免疫应答的方法。该方法包括这些步骤(a)提供一个与携带来源于一个或多个病原体的基因组DNA片段的构建体包被在一起的核心载体，其中基因组DNA片段包含有一个抗原编码序列；和(b)使用颗粒介导的穿越皮肤的递送技术，将包被的核心载体施用给受试者，藉此存在于基因组DNA片段的一个编码序列编码的抗原在受试者中得以表达，其表达量足以引发免疫应答。基因组DNA片段在大小方面大约大于5千碱基对。在某些方法中，构建体是一个质粒并且携带大小从约5到约25千碱基对的基因组DNA片段。在其它的方法中，构建体是一个粘粒并且携带大小从约25到大约50千碱基对的基因组DNA片段。在某些方法中，包含在构建体(例如，质粒或粘粒)的基因组DNA片段里面的编码序列的表达不是被异源的启动子驱动的。对于本文描述的任何质粒或粘粒构建体，核心载体，典型地，有约0.5至大约5μm的平均直径和足以准许穿越皮肤的递送进入受试者之内的密度。核心载体可能由金属，如金，组成。病原体可能是，例如，一种或多种类型的细菌，一种或多种类型的病毒，或可能来自两种或多种不同的病原体。还有进一步的方法包括重复步骤(b)以提供最佳的和增强的施用措施。因此，本发明也提供遗传构建体在药物生产中的用途，该遗传构建体携带有编码来源于一个或多个病原体的抗原的大小至少5kb的基因组DNA片段，该药物用于在脊椎动物受试者中引发免疫应答，其中该遗传构建体包被在核心载体上，经由穿越皮肤的颗粒介导的递送技术施用给受试者，并且，进一步，其中由存在于基因组片段的一个编码序列编码的抗原得以在受试者中表达，其表达量足以引发免疫应答。在本发明的另外一个方面，提供一个确定编码抗原性多肽序列的方法。该方法需要有这些步骤(a)施用携带有从一个或多个病原体的基因组DNA片段获得或来源的构建体，其中基因组DNA片段包含有或猜想有一个编码抗原性多肽的序列并且，当被递送至受试者后，抗原性多肽能以足以引发免疫应答的表达量从编码序列表达；和(b)确定构建体上的编码抗原性多肽的序列。在一个方法中，步骤(b)包含施用一个或多个步骤(a)中的构建体的片段和确定哪个片段编码抗原性多肽。在另外的一个方法中，步骤(b)包含对构建体进行测序。本发明进一步提供遗传构建体在组合物生产中的用途，该遗传构建体携带有来源于一个或多个病原体的大小至少5kb的基因组DNA片段，通过给受试者施用所述构建体以确定编码抗原性多肽的序列，其中基因组DNA片段包含一个所述抗原性多肽的编码序列并且，在递送之后，抗原性多肽能以足以引发免疫应答的表达量得以表达；并且确定构建体上编码抗原性多肽的序列。在相关方面，本发明提供包含有携带获得或来源于一个或多个病原体的基因组DNA片段的一个或多个构建体的疫苗组合物，如包含有一个或多个携带来自单纯疱疹病毒2(HSV-2)的基因组DNA片段的构建体(如克隆#68)的疫苗组合物。在某些实施方案中，构建体是一个携带有大小范围从大约5kb到25kb之间的基因组DNA片段的质粒。在其它的实施方案中，构建体是一个携带有大小范围从大约25kb到大约50kb之间的基因组DNA片段的粘粒。在本文所描述的任何方法或组合物中，基因组片段能够包含有病毒，如HSV-2病毒的立即早期区域(immediateearlyregions)(例如，ICP27，ICP0，ICP4，ICP22等)。例如，范围大约从HSV-2基因组核苷酸114589位到134980位区域，或HSV-2基因组的核苷酸范围从110931位到139697位的一个EcoRI酶切片段。HSV-2基因组的序列可以从发表的来源得到，如以登记号NC_001798存储在GenBank的序列。在某些实施方案中，包含在构建体(例如，质粒或粘粒)的基因组DNA片段里面的编码序列的表达不是被异源的启动子驱动的。疫苗组合物也可以包含有一种或多种佐剂。看了本公开后，本发明的这些和其它的实施方案将会很容易地被本领域普通技能人员想起。图2描述在用HSV-2粘粒免疫的小鼠中血清抗体水平。图3描述用HSV-2gD质粒或HSV-2粘粒免疫的动物体中抗原特异性的脾细胞增殖。实施本发明的方式在详细地描述本发明之前，应当了解本发明并不限于特定的抗原或抗原编码核苷酸序列。也应当了解本公开的方法的不同应用可以因本领域特殊的需要而修改。也应当了解本文用的术语仅仅是为了描述本发明的特定实施方案，而不是有意限制。本文引用的所有的出版物，专利和专利申请，无论上文或下文，特此全部引用作为参考。必须注意到，正如本说明书和附加的权利要求所用的，单数形式的“a”，“an”和“the”包括复数的对象，除非其内容在其它方面清楚地明示。因此，如，涉及“一个抗原”包括两个或多个这样的物质的混合物，涉及”一个颗粒”包括涉及两个或多个这样的颗粒混合物，涉及”一个受体细胞”包括两个或多个这样的细胞，及类似的情况。定义除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语与本发明所涉及领域的普通人员普遍理解的意思相同。下列各项术语已有如下所指明的定义。术语“疫苗组合物”意指包含有抗原(例如，编码抗原的多聚核苷酸)的任何药物组合物，组合物能用来在一个受试者中预防或治疗疾病或身体不适。因此，该术语既包含亚单位疫苗，也就是说，疫苗组合物含有从完整的生物体分离并且离散的(discrete)抗原，这种抗原自然状态下是与该生物体相关联的，也有含有完整的不再有传染力的或减毒的或失活的细菌，病毒，寄生虫或其它微生物的组合物。术语“穿越皮肤的(transdermal)”递送意指进入皮肤内的(例如，进入真皮或表皮层之内)，穿越皮肤的(例如，”经由皮肤的”)和穿越粘膜的(transmucosal)施用，也就是，藉由药剂进入或通过皮肤或粘膜组织之内递送。参见，例如，TransdermalDrugDeliveryDevelopmentalIssuesandResearchInitiatives，Hadgraft和Guy(eds.)，MarcelDekker，Inc.，(1989)；ControlledDrugDelivery.FundamentalsandApplications，RobinsonandLee(eds.)，MarcelDekkerInc.，(1987)；andTransdermalDeliveryofDrugs，Vols.1-3，Kydonieus和Berner(eds.)，CRCPress，(1987)。因此，该术语包含如美国专利号5,630,796所描述的从一个颗粒递送设备(例如，无针头的注射器)递送和如美国专利号5,865,796所描述的颗粒介导的递送。至于“核心载体”意谓一个载体颗粒，其上包被有核酸(例如，DNA)以便给与一个规定的颗粒大小和足够高的密度以获得进入细胞膜必需的动力，这样，DNA就能通过使用颗粒介导的递送技术被递送，正如美国专利5,100,792所描述的那些。核心载体典型地包括这些材料如钨、金、铂、亚铁盐、聚苯乙烯和橡胶。参见，例如，ParticleBombardmentTechnologyforGeneTransfer.(1994)Yang，N.ed.，OxfordUniversityPress，NewYork，NY10-11页。至于“颗粒递送设备”或“无针头的注射器”，意指一个穿越皮肤递送微粒子组合物的器械，它没有用于刺穿皮肤的传统针头。本发明使用的颗粒递送设备在本文件从头到尾都被讨论。至于“抗原”意指一个包含一个或多个抗原表位的分子，所述抗原表位将会刺激宿主的免疫系统产生细胞抗原特异的免疫应答，或体液抗体应答。因此，抗原包括蛋白质、多肽、抗原性的蛋白质片段、寡糖、多糖等等。此外，抗原可能来自任何已知病毒、细菌、寄生虫、植物、原生动物或真菌类，而且可能是完整的生物体。该术语也包括肿瘤抗原。同样地，表达抗原的寡核苷酸或多聚核苷酸，例如DNA免疫应用中，也被包含在抗原的定义中。合成抗原也被包括在内，如多聚抗原表位、侧翼抗原表位和其它的重组或合成来源的抗原(Bergmann等(1993)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol)232777-2781；Bergmann等(1996)免疫学杂志(J.Immunol)1573242-3249；Suhrbier，A.(1997)免疫学和细胞生物学(Immunol.andCellBiol)75402-408；Gardner等(1998)第12届世界AIDS研讨会(12thWorldAIDSConference)，日内瓦，瑞士，6月28日-7月3日，1998)。“合适的免疫应答”意指本发明的方法能在一个被免疫的受试者中引起针对单一抗原或抗原的以B和/或T淋巴细胞的产生为特征的免疫应答。术语“肽”被用在它最宽泛的意义上是指两个或多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或其它的肽模拟物的化合物。亚单位可以由肽键或其它的键如酯、醚键等连接起来。本文使用的术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和L或D型两种光学异构体和氨基酸类似物及肽模拟物。如果该肽链很短，三个或更多个氨基酸肽一般被称为寡聚肽。如果肽链长，肽就被典型地称为多肽或蛋白质。术语“病原体”被用在一个广泛的意义上，是指引发免疫应答的任何分子的来源。因此，病原体包括，但不限于，毒性的或减毒的病毒、细菌、真菌、原生动物类、寄生虫、癌细胞等等。典型地，免疫应答是由这些病原体产生的一个或多个肽引起的。如同下面所详细描述的，来自这些和其它的病原体的编码抗原性肽的基因组DNA被用来产生对自然感染反应模拟的免疫应答。考虑到本文的教导，包括使用得自超过一个病原体的基因组DNA的方法也将会是明显的。术语“核酸分子”和“多聚核苷酸”可互换使用，是指任何长度核苷酸的多聚体形式，核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多聚核苷酸可以有任何一种的三维的结构，并且可以执行任何的已知或未知的功能。多聚核苷酸的非限制的例子包括基因，基因片段，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多聚核苷酸，分枝的多聚核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离DNA，任何序列的分离RNA，核酸探针和引物。多聚核苷酸典型地是由四个核苷酸碱基组成的一个特异的序列腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(当多聚核苷酸是RNA的时候，尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶(T))。因此，术语多聚核苷酸序列是多聚核苷酸分子的线性表现形式。这一线性表现形式可以被输入到具有中央处理器单元的计算机中的数据库中并且用作诸如功能基因组学和同源检索的生物信息学应用。“载体”或“构建体(construct)”是能够转移基因序列到靶细胞的元件(例如，病毒载体，非病毒载体，微粒子载体和脂质体)。“质粒”载体是一个能在宿主细胞中自我复制的染色体外的遗传元件。“粘粒”载体是一个使用λ噬菌体cos序列的特殊类型的质体载体。术语“cos末端”“cos位点”是指λDNA的单链12个碱基的互补延伸。粘粒能携带大的插入物，如大小可达50kb左右，而典型的质粒携带大小大约在10kb之下的片段。由于它们的携带大片段的能力，粘粒用于基因组文库的构建。典型地，“载体，”“构建体，”“表达载体”和“基因转移载体，”意指能够指导所关心的基因表达和能转移基因序列到靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体，还有病毒载体。“基因组文库”是共同代表一个生物体的完整基因组的重组核酸分子的集合。“编码序列”或“编码”所选多肽的序列是一个核酸分子，当其放置在适当的调控序列(或“控制元件”)控制下的时候，在体内被转录(在DNA的情况下)并且翻译(在RNA的情况下)成多肽。编码序列的界线是由5′(氨基)末端的一个起始密码子和3′(羧基)末端的一个翻译终止密码子确定的。编码序列可包括，但不限于，来自病毒的cDNA，原核生物或真核生物的mRNA，来自病毒的基因组DNA序列或原核生物的DNA，甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3′一端。编码序列的转录和翻译通常被“控制元件”调控，包括，但不限于，转录启动子，转录增强子元件，Shine-Delagarno序列(S-D序列)，转录终止信号，多聚腺苷酸序列(位于翻译终止密码子的3′一端)，优化翻译起始的序列(位于编码序列的5′一端)，和翻译终止序列。“启动子”是一段指导编码多肽的多聚核苷酸转录的核苷酸序列。启动子能包括可诱导的启动子(可操作地连接到启动子的多聚核苷酸序列的表达由分析物、辅助因子、调节蛋白等诱导)，可抑制的启动子(可操作地连接到启动子的多聚核苷酸序列的表达由分析物、辅助因子、调节蛋白等抑制)，和组成型的启动子。术语“启动子”或“控制元件”意指包括全长的启动子区域和这些区域的功能(例如，控制转录或翻译)节段。“分离的多聚核苷酸”分子是从自然界发现该分子的完整的生物体分离和离散的核酸分子；或一个核酸分子，全部或部分地缺乏天然状态下与之正常关联的序列；或一个序列，如同它在自然界存在一样，但具有随其关联的异源序列(在下文定义)。一个序列如果它与来源分子、它的cDNA及其互补物的一个区域有相同或相当程度相同的碱基对序列，或表现出如下文所述的序列一致性，就是“来源于或获得自”一个分子。“可操作地连接”是指元件的排列，其中所述的元件被装配以便行使其通常的功能。因此，一个给定的可操作地连接到一个编码序列(例如，编码所关心的抗原)的启动子，当存在适合的酶的时候，是能够影响编码序列的表达的。启动子或其它的控制元件不需要邻近编码序列，只要它们发挥指导其表达的功能。如，插入性非翻译但仍然转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间并且启动子序列仍能被认为是“可操作地连接”到编码序列的。本文使用的描述一个核酸分子的“重组的”意指一个基因组的、cDNA的、半合成的或合成来源的多聚核苷酸，合成来源是根据其来源或操作而言的(1)不与同它在自然状态下一起关联的全部或部分多聚核苷酸关联；和/或(2)连接到不同于它在自然状态下连接的多聚核苷酸。术语“重组的”涉及蛋白质或多聚核苷酸时意指通过重组多聚核苷酸的表达而产生的多肽。确定核酸和氨基酸的“序列一致性”的技术也是本领域公知的。典型地，这样的技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列，以及将这些序列和另一核苷酸或氨基酸序列进行比较。通常，“一致性(identity)”是指两个多聚核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的各自的对应。两个或多个序列(多聚核苷酸或氨基酸)能够藉由确定它们的“百分比一致性”来比较。两个序列的百分比一致性，无论核酸或氨基酸序列，是一个由两个比对(aligned)的序列之间的精确匹配个数除以较短序列的长度，再乘以100后得来的数字。核酸序列的近似比对是由Smith和Waterman的局部同源算法(localhomologyalgorithm)提供的，AdvancesinAppliedMathematics2482-489(1981)。此算法通过使用由Davhoff开发的划线矩阵，AtlasofProteinSequencesandStructureM.O.Dayhoffed.，5suppl.3353-358，NationalBiomedicalResearchFoundation，华盛顿，D.C.，USA，且被Gribskov标准化(1986)Nucl.AcidsRes.14(6)6745-6763，可被应用于氨基酸序列。这一算法的一个示范性的运行是确定由GeneticsComputerGroup(Madison，WI)在“BestFit”这一应用软件中提供的序列百分比一致性的确定。这个方法的默认参数在威斯康辛序列分析软件包(WisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManual)的程序手册第8版(1995)(可以从GeneticsComputerGroup，Madison，WI得到)中有描述。本发明上下文中确定百分比一致性的方法优选使用爱丁堡大学的MPSRCH软件包，由JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok开发，并由IntelliGenetics，Inc.(MountainView，CA)分发。从这一软件包套件，可以进行Smith-Waterman算法，使用默认参数用于得分表(scoringtable)(如，gapopenpenaltyof12，gapextensionpenaltyofone，andagapofsix)。从这一数据产生的“匹配”值反映“序列一致性”。用于计算序列之间的百分比一致性或类似性的其它合适的程序通常是本领域熟知的，如另外的一个比对程序是BLAST，按默认的参数使用。如，BLASTN和BLASTP可使用如下的默认参数geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+Swissprotein+Spupdate+PIR。这些程序的细节能在下列各项英特网地址找到http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。可选择的，同源性可以由多聚核苷酸杂交来确定，杂交的条件是在同源区域之间形成稳定的双链体形式，随后用单链特异的核酸酶消化并进行被消化片段的大小确定。如同使用上面的方法确定的那样，两个DNA或两个多肽序列，当它们的序列在一个分子整个的定义长度下，呈现至少约80％-85％，优选至少约90％，和最优选至少约95％-98％序列一致性的时候，就说它们是彼此“大体上同源”。如本文使用的，大体上同源也是指序列与指定的DNA或多肽序列表现完全的一致性。大体上同源的DNA序列能由在如特定的系统所定义的严格条件下进行的Southern杂交实验来确定。例如，严格的杂交条件可以包括50％甲酰胺、5×Denhardt氏溶液、5×SSC、0.1％SDS和100μg/ml变性的鲑精DNA，而且洗涤条件可以包括37℃，2×SSC，0.1％SDS，随后68℃1×SSC，0.1％SDS。定义适当的杂交条件在本领域的技能之内。参见，例如，Sambrook等，supra；DNACloning，supra；NucleicAcidHybridization，supra。本文使用的术语“佐剂”是指任何增强药物，抗原，多聚核苷酸，载体等物质的作用的材料。想要指出的是，虽然没有总是明确地陈述，同野生型或纯化的肽佐剂(例如，重组产生的或其突变蛋白质)有相似生物学活性的分子和编码这些分子的核酸有意地被使用在本发明的精神和范围之内。如本文所使用的，术语“治疗”包括下述任何之一感染或再感染的预防；症状的减轻或消除；以及病原体的减少或完成消除。治疗可以预防性地(在感染之前)或治疗性地(在感染之后)起作用。至于“脊椎动物受试者”意指脊索动物亚门，特别是哺乳动物，包括，而不限制于，人和其它的灵长类的任何成员。该术语不指明一个特别的年龄。因此，成年的和新生的个体都被有意包含在内。发明概观在详细地描述本发明之前，应当理解本发明并不限于特定的公式化表述或方法参数，因为这些当然可以变化。也应当理解本文所用的术语仅是为了描述本发明的特定实施方案，而不是有意限制。本发明提供在受试者中引发免疫应答的新方法。简要地，产生携带有代表一个或多个病原体(例如，细胞，组织，病毒等)的基因组的大的多聚核苷酸(例如，DNA)片段的载体文库。这些载体，依赖于基因组片段的大小，典型地是质粒或粘粒的形式。文库可以包含重叠或非重叠的插入物。一个或多个所选择的基因组文库的克隆以一个有效引发免疫应答的量施用到受试者体内。这样，很多的抗原(和它们的相应抗原表位)能在一个单一免疫步骤中被施用到受试者中。此外，因为构建体携带的大的基因组片段(例如，粘粒或质粒)包含有它们的内源性的表达控制元件，进一步的分子操作(举例来说，异源启动子序列的插入以驱动来自存在于基因组片段的编码序列的表达)就不需要了。然而，异源控制可以存在于构建体，举例来说，当基因组序列来自原核生物例如细菌时。进一步地，因为内源性的控制元件(例如，顺式和/或反式作用调节元件)在宿主个体内驱动抗原的表达和因此，免疫原性基因的产物就能以类似天然感染产生的水平得以产生，由构建体引发的总免疫应答更接近地模拟因天然感染产生的反应。相反，在前述表达文库免疫中异源启动子的使用会导致病原体基因的非选择性表达。本发明也包括用来确定编码抗原性片段序列的一个有效的方法。特别地，具有一个已知遗传成分的构建体的用途，其允许确定编码抗原性多肽序列的方法。举例来说，在一个受试者中诱发免疫应答的一个粘粒或质粒克隆被鉴定出来。然后参与免疫应答中的精确序列就能用本领域公知的方法，例如，克隆的测序，或藉由粘粒或质粒插入物进一步地片段化并测试这些较小片段的免疫原性来确定。本发明的多聚核苷酸可以在体外或体内引入细胞之内，例如，通过传统的转染技术或藉由将多聚核苷酸包被在颗粒之上，然后使用颗粒介导的转染将包被的颗粒施用于细胞。可选择的，多聚核苷酸可以以一个微粒(例如，粉末)的形式提供，在国际公布号WO98/10750中会有更充分的讨论，引入本文作为参考。本发明的优点包括，但不限于，(i)扩展用于引发免疫应答的抗原的数字(number)；(ii)提供一个更接近地模拟天然感染的抗原(例如，抗原表位)的阵列(array)；(iii)达到抗原和它们的关联的野生型的调节元件共同递送到相同的细胞之内，以便达成多个抗原的协调表达；(iv)引发类似于天然感染所引发的免疫应答；(v)引发比天然感染的反应具有更好保护作用的免疫应答，例如，免除优势抗原的去除或抑制免疫应答的基因的去除；(vi)为后来的用在引发免疫应答质粒产物确定最有效的抗原组合；以及(vii)触发通常参与清除细胞内感染的抗原加工和呈递途径。抗原本文描述的方法在引发针对广泛多样的细胞、组织和人类或动物病原体的免疫应答中是有用的。这些病原体包含一种或多种抗原。粘粒或质粒文库基因组DNA的来源的非限制的例子包括病毒，细菌细胞，真菌细胞和其它的病原性生物体。合适的病毒抗原包括，但不限于，那些获得或来自病毒肝炎家族，包括甲型肝炎病毒(HAV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，δ肝炎病毒(HDV)，戊型肝炎病毒(HEV)和庚型肝炎病毒(HGV)。参见，例如，国际公布号WO89/04669；WO90/11089；和WO90/14436。HCV基因组编码数个病毒蛋白质，包括E1和E2。参见，例如，Houghton等。(1991)Hepatology14381-388。包含编码这些蛋白质序列的基因组片段及其抗原性片段将会用于本方法中。同样地，来自HDV的δ-抗原的编码序列是已知的(参见，例如，美国专利第5,378,814号)。以相似的方式，来自疱疹病毒族的广泛多样的蛋白质能作为抗原在本发明中使用，包括来自单纯疱疹病毒(HSV)类型1和2的蛋白质，例如HSV-1和HSV-2的糖蛋白gB，gD和gH；来自痘疱疹病毒(VZV)，Epstein-Barr病毒(EBV)和包括CMVgB和gH的巨细胞病毒(CMV)的抗原；和来自其它的人疱疹病毒如HHV6和HHV7的抗原。(参见，例如Chee等(1990)Cytomegaloviruses(J.K.McDougall，ed.，Springer-Verlag，pp.125-169；McGeoch等。(1988)J.Gen.Virol.691531-1574；美国专利第5,171,568号；Baer等(1984)Nature310207-211；和Davison等(1986)J.Gen.Virol.671759-1816)。人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原，例如多数爱滋病毒-1和爱滋病毒-2分离株的gp120分子，包括爱滋病毒的各种不同遗传的亚型成员，是已知而且报导过的(参见，例如，Myers等，LosAlamosDatabase，LosAlamosNationalLaboratory，LosAlamos，NewMexico(1992)；和Modrow等(1987)J.Virol.61570-578)61570-578)而且从这些分离株中的任何一个来源或获得的包含抗原的基因组片段将会用于本发明。此外，其它从多种不同的爱滋病毒分离株中任何一个来源或获得的免疫原性蛋白质将会用于本文，包括含有一个或多个不同包膜蛋白质如gp160和gp41，gag抗原如p24gag和p55gag的片段以及来自爱滋病毒pol，env，tat，vif，rev，nef，vpr，vpu和LTR区域的蛋白质。从其它病毒来源或获得的抗原也将会用于本文，例如没有限制地，来自小RNA病毒家族成员(例如脊髓灰质炎病毒，鼻病毒等)；杯状病毒；披膜病毒(例如，风疹病毒，登革热病毒等)；黄病毒；冠状病毒；呼肠孤病毒(例如，轮状病毒等)；Birnaviridae病毒；弹状病毒(例如，狂犬病病毒等)；正粘病毒(例如，流行性感冒病毒A、B和C型等)；线状病毒；副粘病毒(例如，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒等)；布尼亚病毒；沙粒病毒；逆转录病毒(例如，HTLV-I；HTLV-II；爱滋病毒-1(也以HTLV-III，LAV，ARV，hTLR等闻名))包括但不限于来自分离株HIVIIIb，HIVSF2，HIVLAV，HIVLAI，HIVMN的抗原)；爱滋病毒-1CM235，爱滋病毒-1US4；爱滋病毒-2，在其它的之中；猴免疫缺陷病毒(SIV)；人乳头瘤病毒，蜱传脑炎病毒等的抗原。参见，如病毒学，第三版(W.K.Jokliked.1988)；FundamentalVirology，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.1991)，得到这些和其它病毒的描述。在某些情况下，可以优选的是选择的病毒抗原获得或来源于这样一个病毒病原体，它典型地经由粘膜表面进入身体而且已知是造成或与人疾病相关联的，例如，但不限于，爱滋病毒(爱滋病)，流行性感冒病毒(Flu)，单纯疱疹病毒(生殖器感染，感冒疮，STDs)，轮状病毒(腹泻)，副流感病毒(呼吸道感染)，脊髓灰质炎病毒(脊髓灰质炎)，呼吸道合胞体病毒(呼吸感染)，麻疹和流行性腮腺炎病毒(麻疹，流行性腮腺炎)，风疹病毒(风疹)和鼻病毒(感冒)。包含细菌和寄生虫抗原的基因组片段能从已知的成为疾病病因的病原体获得或来源，这样的疾病包括，但不限于，白喉，百日咳，破伤风，结核，细菌性或真菌性肺炎，中耳炎，淋病，霍乱，伤寒，脑膜炎，单核细胞增多症，鼠疫，志贺氏菌病或沙门菌病，军团菌疾病，莱姆病，麻疯病，疟疾，钩虫病，盘尾丝虫病，血吸虫病，锥虫病(Trypamasomialsis)，Lesmaniasis，贾第虫病(Giardia)，阿米巴病，丝虫病，Borelia和旋毛虫病。进一步，抗原可能从非常规的病毒获得或者来源，如库鲁病，克罗伊茨费尔特-雅各布综合症(Creutzfeldt-Jakob病，CJD)，瘙痒病，可传染的水貂脑病和慢性消耗性疾病的病原体因子，或者从蛋白质感染颗粒如同疯牛病相关联的朊病毒获得或者来源。特异的病原体可以包括结核分枝杆菌，衣原体，奈瑟氏淋球菌，志贺氏菌，沙门氏菌，霍乱弧菌，Treponemapallidua，假单胞菌，百日咳博德特氏菌，布鲁氏菌，Franciscellatulorensis，幽门缠绕杆菌，Leptospriainterrogaus，嗜肺军团菌，鼠疫耶尔森氏菌，链球菌(类型A和B)，肺炎球菌，脑膜炎球菌，流感嗜血杆菌(类型b)，Toxoplasmagondic，Complylobacteriosis，粘膜炎莫拉氏菌，腹股沟肉芽肿，和放线菌病；真菌病原体包括念珠菌病和曲霉病；寄生虫病原体包括绦虫，吸虫，蛔虫，阿米巴病，梨形鞭毛虫病，隐孢子虫，血吸虫，卡氏肺孢子虫，毛滴虫病和旋毛虫病。因此，本发明也被用来提供对很多的兽医疾病，如口蹄疫，冠状病毒，多杀巴斯德菌，缠绕杆菌，寻常圆线虫，胸膜肺炎放线杆菌，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，肺炎杆菌，大肠杆菌，百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌和brochiseptica的合适的免疫应答。佐剂在一些实施方案中，本发明可以有效地与任何合适的佐剂或佐剂的组合一起使用。举例来说，合适的佐剂包括，但没有限制，从铝盐(明矾)形成的佐剂，如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝等；水包油和油包水乳剂形式的，如完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；从细菌细胞壁成分形成的佐剂，如包括脂多糖的佐剂(例如，脂质A或单磷脂酰脂质A(MPL)，Imoto等，(1985)Tet.Lett.261545-1548)，trehalosedimycolate(TDM)，和细胞壁骨架(CWS)；热休克蛋白质或其衍生物；来自腺苷酸二磷酸-核糖基化细菌毒素的佐剂，包括白喉毒素(DT)，百日咳毒素(PT)，霍乱毒素(CT)，大肠杆菌热不稳定的毒素(LT1和LT2)，假单胞菌内毒素A，假单胞菌外毒素S，仙人掌芽孢杆菌(B.cereus)胞外酶，sphaericus芽孢杆菌毒素，肉毒梭菌C2和C3毒素，limosum梭菌胞外酶，和来自产气荚膜梭菌、spiriforma梭菌、差异(difficile)梭菌金黄色葡萄球菌EDIN的毒素和腺苷酸二磷酸-核糖基化细菌毒素的突变体如CRM197，一个非毒性的白喉毒素突变体(参见，如Bixler等(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251175；和Constantino等(1992)Vaccine)；肥皂素佐剂如QuilA(U.S.Pat.No.5,057,540)，或从肥皂素产生的颗粒例如ISCOMs(免疫刺激复合物)；趋化因子和细胞因子如白介素(如，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12等)，干扰素(例如，γ干扰素)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，防御素1或2，RANTES，巨噬细胞炎症蛋白-α和巨噬细胞炎症蛋白-2等；胞壁酰肽如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酸甘油酰-sn-glycero-3-huydroxyphosphoryloxy)-乙胺(MTP-PE)等；来自CpG分子家族，CpG二核苷酸和包含CpG基本单元的合成寡核苷酸的佐剂(参见如Krieg等Nature(1995)374546，Medzhitov等(1997)Curr.Opin.Immunol.94-9，和Davis等J.Immunol.(1998)160870-876)，例如TCCATGACGTTCCTGATGCT(SEQIDNO1)和ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQIDNO2)和合成佐剂例如PCPP聚-二(苯氧基羧酸酯)膦腈(Poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene](Payne等Vaccines(1998)1692-98)。这样的佐剂通过商业途径从销售商处得到，这些销售商如AccurateChemicals；RibiImmunechemicals，Hamilton，MT；GIBCO；Sigma，St.Louis，MO。佐剂可以单独递送或两个或多个佐剂联合递送。关于这一点，联合的佐剂在促进免疫应答方面可以有叠加的或协同的效应。协同效应是指联合的两个或多个佐剂取得的结果比人们预想的比仅仅将每一个佐剂单独施用时取得的效果加起来大。基因组文库的制备基因组文库可以藉由本领域公知的任何方法产生。多种来源能用于基因组DNA。基因组DNA可以从商业途径得到，例如，从诸如AdvancedBiotechnologiesInc(ABI)和Clonetech，Inc.来源。另外的标准的来源当然是从生物体(例如，病毒，细菌，寄生虫，或其它的病原体)，细胞(例如，癌细胞)，或选择的组织分离的基因组DNA。可选择的，DNA可以用本领域已有的技术从RNA(例如，RNA病毒)制备。来自被选择的来源基因组DNA能用标准的步骤分离，典型地包括连续的酚和酚/氯仿抽提，然后用乙醇沉淀。在沉淀反应之后，来自一个所关心的生物体、细胞或组织的DNA，可以用限制性核酸内切酶处理，完全或部分地消化DNA以产生合适的片段。被选择的大小的DNA片段能被许多技术分离开来，包括琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或脉冲场凝胶电泳(Carle等，(1984)Nuc.AcidRes.125647-5664；Chu等，(1986)Science2341582；Smith等，(1987)MethodsinEnzymology151461)，以提供一个合适大小的起始材料用于克隆。本文使用的另外一个获得核酸序列的方法为通过重组的方式。因此，一个所需要的核苷酸序列能用标准的分子生物学程序从携带有相同的载体上切下来。位点特异的DNA切割能用合适的限制性酶(或酶)在本领域通常被了解和商业途径得到的限制性酶的制造者所叙述的详细说明的条件之下进行。如果需要，切割片段的大小分离可以使用标准的技术用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳进行。如果需要，使用标准的技术，在存在四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)的情况下，用大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow)处理，限制切割片段可以是平末端的。Klenow片段补平5’单链突出，但是即使在存在四种dNTPs的情况下，也消化突出的3′单链。如果需要，选择性的修复能藉由只供应一种或几种选择的dNTPs在突出部分性质要求的限制之内进行。在Klenow处理之后，混合物能用如酚/氯仿抽提出来并用乙醇沉淀。在适当的条件下用核酸酶S1或BAL-31处理就导致任何单链部分的水解。一旦基因组片段已制备或分离，这样的序列能被克隆进任何合适的载体构建体或复制子。很多克隆载体是那些本领域技术人员所知的，并且合适的克隆载体的选择是选择的一件要事。在一个优选的实施方案中，基因组片段被克隆进入粘粒产生粘粒文库。当使用粘粒克隆载体的时候，片段是大的，优选大小在大约20,000bp(20kb)和50,000个碱基对(50kb)之间(或在其间的任何整数)，优选在大约25kb和50kb之间，更优选在约30-35kb和50kb之间，和甚至更优选在大约35kb和大约50kb之间。合适的粘粒载体商业途径可得到，例如SuperCos1粘粒载体试剂盒(Stratagene，LaJollaCalifornia)。DNA的连接进粘粒是按制造商指示的进行的或者鉴于本说明书教导，可以使用本领域公知的方法以经验为主来确定。在另外的一个优选的实施方案中，基因组片段被克隆进入质粒产生质粒文库。当使用质粒克隆载体的时候，片段典型地是大小大约在5,000bp(5kb)和25,000个碱基对(25kb)之间(或在其间的任何整数)之间，优选在大约10kb和25kb之间，更优选在约10-15kb和25kb之间，和甚至更优选在大约15kb和20kb之间。合适的质粒载体商业途径可以得到。鉴于本说明书的教导，DNA连接进入质粒使用本领域熟知的方法进行。如同上文所描述的，本发明的一个优点是大的基因组片段包括内源性的转录和翻译调控元件。这些调节控制序列包括例如启动子(起始转录相关联的一个序列)，增强子(增强转录的顺式-作用序列)和其它的元件包括那些引起编码序列的表达被打开或关闭的元件，因响应化学的或物理的刺激，包括调控化合物的存在。因此，在一个优选的实施方案中，针对载体和/或插入的多聚核苷酸的分子变更(modification)的数目是最小的。也有可能的是，在载体构建体上选择的核苷酸序列可能置于异源的调控序列控制之下，如异源的启动子，举例来说，当基因组片段来自细菌或其它的原核生物细胞，而且需要在真核生物受试者表达时。编码所关心的特定蛋白质的序列变更可以令人所想的达到这一目的。例如，在某些情况下，变更序列以便它以合适的方向附加到控制序列是必需的，也即维持阅读框架。控制序列和其它的调控序列在插入载体之前可以连入编码序列。此外，编码序列能直接克隆进入一个已经包含控制序列和一个合适的限制酶位点的表达载体之内。多聚核苷酸的施用本文描述的基因组片段和辅助的物质可以被任何的合适方法施用。如下文描述，在一个优选的实施方案中，多聚核苷酸片段通过包被包含有该片段的合适构建体到核心载体颗粒之上的(例如，粘粒或质粒)，然后将包被的颗粒施用于受试者或细胞，而被施用。然而，基因组片段也可以使用病毒载体或使用非病毒系统被递送，例如裸露的核酸递送。病毒载体许多基于病毒的系统已用作基因递送。例如，逆转录病毒系统是已知的而且通常使用具有一个成为整体(integrated)的缺陷原病毒(“辅助者(helper)”)包装线，该缺陷原病毒表达病毒的所有基因，但是由于包装信号，即psi序列的缺失不能够包装自己的基因组。因此，细胞系产生空的病毒外壳。生产线可能来自包装线，除了辅助者之外，这些包装线包含一个含有以顺式方式存在，并为病毒的复制和包装所必需的序列的病毒载体，即被称为长末端重复(LTRs)的序列。所关心的基因组片段可以被插入载体之内并且被包装在由逆转录病毒的辅助者合成的病毒外壳中。然后重组的病毒可以被分离而且递送到一个受试者。(参见，例如，美国专利第5,219,740号)。代表性的逆转录病毒载体包括但不限于这样的载体，例如，美国专利第5,219,740号描述的LHL，N2，LNSAL，LSHL和LHL2载体，这些载体已全部引入本文作为参考，还有这些载体的衍生物，例如本文描述的变更后的N2载体。逆转录病毒载体可以使用本领域熟知的技术构建。参见，例如，美国专利第5,219,740号；Mann等，(1983)Cell33153-159。以腺病毒为基础的系统已被发展起来用作基因的递送并且适合递送本文描述的基因组片段。人的腺病毒是双链的DNA病毒，通过受体介导的内吞作用进入细胞。因为他们容易生长和操作，并且在体内和体外表现出宽阔的宿主范围，所以这些病毒特别适合遗传的传递。例如，腺病毒可以感染人的造血，淋巴和骨髓起源的细胞。此外，腺病毒感染静态和复制的靶细胞。不像逆转录病毒整合进入宿主基因组之内，腺病毒在染色体外存留，因此将和插入突变关联的危险减到最小。病毒容易以高的滴度产生并且是稳定的，以至于它可以被纯化和储存。甚至在有能力复制的形式，腺病毒仅仅引起低水平的发病率并且不与人的肿瘤相关联。因此，腺病毒载体利用这些优点被发展起来。对于腺病毒载体的描述和它们的用途，参见，例如，Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57267-274；Bett等，(1993)J.Virol.675911-5921；Mittereder等，(1994)HumanGeneTherapy5717-729；Seth等，(1994)J.Virol.68933-940；Barr等，(1994)GeneTherapy151-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques6616-629；Rich等，(1993)HumanGeneTherapy4461-476。腺相关病毒载体(AAV)也可以用来施用本文描述的某些比较小的基因组片段(例如，5kb)。AAV载体可以来自任何AAV血清类型，包括但没有限制，AAV-1，AAV-2，AAV-3，AAV-4，AAV-5，AAVX7等。AAV载体可以有一个或多个全部或部分删除的AAV野生型基因，优选rep和/或cap基因，但是仍保留一个或多个功能性的侧翼的反向末端重复(ITR)序列。一个功能性的ITR序列通常认为是AAV病毒粒子的拯救，复制和包装所必需的。因此，一个AAV载体至少包括那些以顺式方式存在为病毒的复制和包装所必需的序列(例如，功能性的ITR)。ITR不需要是野生型的核苷酸序列，而是可以通过例如插入，缺失或核苷酸的替代而改变的，只要序列提供功能性的拯救，复制和包装。AAV表达载体是使用公知的技术被构建的，以至少提供如在转录的方向上操纵性连接的成分，包括转录起始区域的控制元件，所关心的DNA和一个转录终止区域。控制元件被选择以使之在哺乳动物细胞中是有功能的。作为结果的构建体包含操纵性连接的成分，以功能性的AAVITR序列为界限(5′和3′)。合适的AAV构建体可以使用本领域熟知的技术制成。参见，例如，美国专利第5,173,414号和5,139,941号；国际公布号WO92/01070(1992年1月23日公开)和WO93/03769(1993年3月4日公开)；Lebkowski等，(1988)Molec.Gell.Biol.83988-3996；Vincent等，(1990)Vaccines90(ColdSpringHarborLaboratoryPress)；Carter，B.J.(1992)CurrentOpinioninBiotechnology3533-539；Muzyczka，N.(1992)CurrentTopicsinMicrobiol.andImmunol.15897-129；Kotin，R.M.(1994)HumanGeneTherapy5793-801；ShellingandSmith(1994)GeneTherapy1165-169；以及Zhou等(1994)J.Exp.Med.1791867-1875.传统药物的制备物(preparation)包含本发明基因组DNA片段的制备物的制剂(formulation)，有或没有佐剂组合物的添加，可以通过使用普通技能的技工已具有的标准的药物制剂化学和方法来实现。例如，包含一个或多个基因组片段(例如，存在于一个质粒或粘粒上)的组合物可以同一个或多个药学上可接受的赋形剂或载体组合以提供一个液态的制备物。辅助的物质，例如加湿或乳化剂，pH值缓冲液物质等等，可以存在于赋形剂或载体中。这些赋形剂，载体和辅助的物质通常是药学上的试剂，它们在接受该组合物的个体中不诱发免疫应答并且可以施用而没有不适当的毒性。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，液体例如水，盐水，聚乙二醇，透明质酸，甘油和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如无机酸盐，如盐酸盐，氢溴化物，磷酸盐，硫酸盐等；以及有机酸盐如醋酸盐，丙酸盐，丙二酸盐，苯甲酸盐和类似的盐。尽管不是必需的，有一点也是优选的，即制备物包含药学上可接受的赋形剂用作稳定剂，特别是用于肽、蛋白或其它相似的分子，如果它们将被包含在疫苗组合物中。也充当肽的稳定剂的合适携带者的例子包括但没有限制，药学级的葡萄糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，山梨糖醇，肌醇，葡聚糖等等。其它的合适携带者包括也没有限制，淀粉，纤维素，磷酸钠或磷酸钙，柠檬酸，酒石酸，甘氨酸，高分子量的聚乙二醇(PEGs)及其组合。透彻讨论药学上可接受的赋形剂，载体和辅助的物质的资料见于REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES(MackPub.Co.，N.J.1991)，已引入本文作为参考。某些核酸吸收和/或表达促进物(“转染促进试剂”)也可以被包含在组合物中，例如那些如布比卡因，心脏毒素和蔗糖之类的促进剂和转染促进载体如那些通常用来递送核酸分子的脂质体或脂类的制备物。广泛使用阴离子和中性脂质体并且用于递送核酸分子是熟知的(参见，例如LiposomesAPracticalApproach，(1990)RPCNewEd.，IRLPress)。阳离子脂类制备物用作核酸分子的递送也是熟知的载体。合适的脂类制备物包括DOTMA(N-[1-(2，3-dioleyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammoniumchloride)，可从商标名lipofectinTM得到，以及DOTAP(1，2-bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio)propane)，参见，例如，Felgner等，(1987)Proc.Natl.AcadSci.USA847413-7416；Malone等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA866077-6081；美国专利号5,283,185和5,527,928，和国际公布号WO90/11092，WO91/15501和WO95/26356。这些阳离子的脂类可以优选地同中性的脂类例如DOPE(dioleylphosphatidylethanolamine)联合使用，进一步，可以加入上述的脂类或脂质体制备物的转染促进组合物包括精胺衍生物(参见，例如，国际公布号WO93/18759)和膜渗透化合物如GALA，短杆菌肽S6和阳离子胆盐.(参见，例如，国际公布号WO93/19768)。此外，本发明的核酸分子可以装入胶囊，吸附到，或关联到，微粒子携带者。合适的微粒子携带者包括那些来自聚甲基甲基丙烯酸酯聚合物，和来自多聚(交酯类)和多聚(丙交酯-共乙交酯)的PLG微粒。参见，例如，Jeffery等，(1993)Pharm.Res.10362-368。也可以使用其它的微粒系统和聚合物，例如聚合物如聚赖氨酸，聚精氨酸，聚鸟苷酸，精胺，亚精胺以及这些分子的结合物。因此，制成的疫苗组合物将会典型地包括多聚核苷酸(例如，质粒或粘粒)，该多聚核苷酸包含至少一个来自被选择的病原体的基因组片段，其数量足以发起一次免疫应答。合适有效的数量可以很容易地由本领域技术人员确定。这些数量将会落入一个经过常规试验就可以确定的相对宽的范围内。例如，当使用少至1μgDNA时，就能获得免疫应答，而在其它的施用中，却用了可达2mg的DNA。通常预期的是包含基因组片段的多聚核苷酸的有效剂量将会落在大约10μg到1000μg的范围之内，然而在这一范围之上和这一范围之下的剂量也可以被发现是有效的。组合物因此可以包含从约0.1％到约99.9％的多聚核苷酸分子。传统药物制备物的施用上述药物制剂的施用可以在整个治疗过程中的一次剂量或连续或间歇用药时有效。递送液态组合物和包含微粒子组合物的液态悬浮液的最典型方式是经由传统的针头和注射器。此外，不同的液体喷射注射器是为本领域所知的并且可以用于施用本发明的组合物。决定施用最有效的方式和剂量的方法对本领域的技术人员是熟知的，并且会随着递送载体，治疗的组合物，靶细胞和正被治疗的受试者而改变。单一和多重(multiple)施用可以采用主治医师选择的剂量水平和方式完成。应该了解多聚核苷酸载体构建体可以携带超过一个基因组片段。此外，单独的载体(例如，粘粒或质粒)，每一个表达一个或多个来自任何病原体的抗原也可以如本文所描述的那样被递送到一个受试者中。而且，也意味着，由本发明的方法递送的多聚核苷酸可与其它合适的组合物和疗法联合。例如，为了在受试者中增加免疫应答，本文描述的组合物和方法可以进一步包括辅助的物质(例如，佐剂)，如药理学制剂，细胞因子或等等。辅助的物质可以以例如，蛋白质或其它的高分子施用，同时、先于或晚于本文描述的DNA疫苗(例如，粘粒或质粒)的施用。核酸分子组合物也可以使用为本领域熟练人员所知的方法直接施用于受试者或，可选择的，体外(exvivo)递送到来自受试者细胞。包被的颗粒在一个实施方案中，包含基因组片段(例如，质粒或粘粒)的构建体，和其它的辅助成分例如佐剂可由载体颗粒递送。施用这些核酸制剂的颗粒介导的递送方法是本领域所知的。因此，一旦制备和适当地纯化之后，上述质粒和粘粒构建体可以使用多种本领域公知的技术包被在载体颗粒(例如，核心载体)之上。载体颗粒选自在颗粒大小范围典型地用作从一个合适的颗粒递送设备进行细胞内递送之内的有一个合适密度的材料。最适宜的载体颗粒大小将会，当然，依赖靶细胞的直径。就本发明的目的而言，钨，金，铂和铱核心载体颗粒可以被使用。优选钨和金颗粒。平均大小在直径为0.5到2.0μm的钨颗粒是容易得到的。虽然这些颗粒在用作颗粒递送方法中有最佳的密度，而且允许高效包被DNA，但是钨可以对某些细胞类型具有潜在的毒性。因此，金颗粒或微晶金(例如，金粉A1570，可从EngelhardCorp.，EastNewark，NJ得到)也将会用于本方法中。金颗粒在大小方面(可从AlphaChemicals得到1-3μm的颗粒大小，或从Degussa，SouthPlainfield，NJ得到包括0.95μm的颗粒大小范围)提供一致性并且减少了毒性。许多方法是公知的并且已经就在金或钨粉颗粒之上包被或沉淀DNA或RNA作了描述。大多数这样的方法通常将一个预定数量的金或钨和质粒DNA，CaCl2和亚精胺结合在一起。产生的溶液在包被过程中被不断地涡动以确保反应混合物的一致。在核酸沉淀之后，包被的颗粒可以被转移到合适的膜上并且在使用之前干燥，包被在样品模块或样品盒表面或装入递送盒，用于合适的颗粒递送设备中。肽佐剂(例如，细胞因子和细菌毒素)，也可以包被在相同或类似的核心载体颗粒之上。例如，肽可以通过根据经验确定的比率简单地与载体颗粒混合而附着在载体颗粒上，它是通过硫酸铵沉淀或其它为本领域技术人员所熟悉的溶剂沉淀方法或通过化学偶联肽到载体颗粒而实现的。L-半胱氨酸残基偶联到金上以前已经有描述(Brown等，ChemicalSocietyReviews9271-311(1980))。其它的方法包括，例如溶解肽佐剂于无水乙醇、水或酒精/水混合物中，将溶液加入一定量的载体颗粒，然后在空气或氮气流之下边涡动边干燥混合物。此外，佐剂可以通过真空离心干燥在载体颗粒之上。一旦干燥，包被的颗粒可以重悬在一个合适的溶剂(例如，乙酸乙酯或丙酮)中，制成粉(例如，通过超声)以提供一个基本上一致的悬浮液。然后以佐剂包被的核心载体颗粒就能与携带有基因组片段的构建体的核心载体颗粒联合而且可在一个单一的颗粒注射步骤中施用，或单独地从基因组片段组合物施用。包被颗粒施用在它们形成之后，以本发明的核酸制备物包被的核心载体颗粒，单独或同例如，佐剂制剂联合，使用颗粒介导的递送技术被递送到一个受试者。适合颗粒介导的递送技术的不同的颗粒递送设备是本领域公知的，并且都适合在本发明的实践中使用。当前的设备设计使用一个爆发性的，电子或气体的释放以驱使包被的核心载体颗粒导向靶细胞。包被的颗粒自身可以以可释放的方式附着在一个可移动的载体层，或可移动地附着到一个表面，气体流沿着该表面通过，从该表面提升颗粒并加速它们朝向目标。在美国专利第5,204,253号中描述了气体释放设备的一个例子。在美国专利第4,945,050号中描述了一个爆发类型设备。在美国专利第5,120,657号中描述了一个电释放类型的颗粒加速仪器的一个例子。在美国专利第5,149,655号中描述了适合本文使用的另外一个电释放仪器。所有这些专利的公开全部引入本文作为参考。包被的颗粒被施用到受治疗的实验者中，以一种与剂量制剂相容的方式和一个将会有效引起所需免疫应答的数量。被递送的组合物的数量，至于核酸分子，通常是在从0.001到100.0μg的范围中，更典型的是每一剂量0.01到10.0μg的核酸分子，在肽或蛋白质分子情况是1μg到5mg，更典型肽的是1到50μg，依赖被治疗的受试者而不同。必需的精确数量将会依赖被免疫的个体的年龄及综合条件和被选择的特别的核苷酸序列或肽，以及其它因素而改变。在读了本说明书之后，本领域技术人员可以容易地确定合适有效的数量。因此，本文描述的基因组片段的一个有效量将会足以在一个免疫的受试者中引起合适的免疫应答，并且这个量将会落入一个经过常规试验就可确定的相对宽的范围。优选地，为了在被治疗的受试者中引发免疫应答(例如，T细胞激活)，包被的核心颗粒被递送到合适的受体细胞。微粒子组合物此外，本发明的基因组片段(例如携带有基因组片段的质粒或粘粒构建体)，还有一个或多个选择的佐剂，可以被制成如微粒子组合物。更特别地，制成含有所关心的基因组片段的颗粒可以通过使用标准药物制剂化学和方法而实现，这些全部的标准药物制成化学和方法能容易地为有相当技能的技工得到。例如，一个或多个载体构建体和/或佐剂可以联合一个或多个药学上可接受的赋形剂或载体以提供疫苗组合物。辅助物质，如加湿或乳化剂，pH值缓冲液物质等等，可以存在于赋形剂或载体中。这些赋形剂，载体和辅助物质通常是制药的试剂，它们本身不在接受组合物的个体中诱发免疫应答，可以施用而没有不适当的毒性。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，液体例如水，盐溶液，聚乙二醇，透明质酸，甘油和乙醇。其中也可以包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐如盐酸盐，氢溴化物，磷酸盐，硫酸盐类等；以及有机酸盐如醋酸盐，丙酸盐，丙二酸盐，苯甲酸盐等。虽然不是必需，但也是优选的是，核酸组合物将会包含一个药学上可接受的载体作为稳定剂，特别是对肽、蛋白质或其它相似的佐剂或辅助的物质。也可充当肽的稳定剂的合适载体的例子包括，没有限制，药物级的葡萄糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，山梨糖醇，肌醇，葡聚糖等。其它的合适载体包括，还是没有限制，淀粉，纤维素，磷酸钠或钙，柠檬酸，酒石酸，甘氨酸，高分子量聚乙二醇类(PEGs)及它们的组合。透彻讨论药学上可接受的赋形剂，载体，稳定剂和其它辅助物质的资料可在REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCES(MackPub.Co.，N.J.1991)得到。已引入本文作为参考。如同上面所详细说明的那样，被制成的组合物将会包括一定数量的所关心的基因组片段，足以引发免疫应答。本领域的技术人员可以容易地确定合适有效的数量。这样数量将会落入一相对宽的范围，通常在大约0.1μg到25mg或更多的所关心的核酸构建体的范围之内，而且经过常规试验即可以确定特别合适的数量。组合物可以包含从约0.1％到约99.9％的核酸分子。如果一个佐剂被包含在组合物中，或有方法被用来提供一个微粒子佐剂组合物，佐剂将会以一个如上文所述的合适数量存在。然后，组合物使用标准的技术以颗粒形式被制备出来，这些技术如藉由简单的蒸发(风干)，真空干燥，喷雾干燥，冷冻干燥(真空冷冻干燥)，喷雾-冷冻干燥，喷雾包被，沉淀，超临界流体颗粒形成等。如果需要，作为结果的颗粒可以使用在普遍拥有的国际公布号WO97/48485描述的技术而使密度增加，该国际公布已引入本文作为参考。颗粒可以在使用之前包装在单一单位剂量或多剂量的容器，该容器可以包含一个密封的包装盒，其中封入合适量的含有合适核酸构建体(例如，质粒或粘粒)和/或被选择的佐剂(例如，提供一个疫苗组合物)的颗粒。微粒子组合物可以以一种无菌制剂包装，而且密封的包装盒可以如此制成以保持制剂的无菌状态，直到按照本发明的方法使用为止。如果需要，包装盒可以适合在颗粒递送设备中直接使用。这些包装盒可以采用胶囊式，箔小袋式，香袋式，盒式等形式。本文描述了合适的颗粒递送设备(例如，无针头的注射器)。颗粒包装在内的包装盒可以进一步被贴上标签以识别组合物并且提供有关的剂量信息。此外，包装盒能以政府机构，例如食品和药物管理局，规定的简介的形式贴上标签，其中该简介表明包含在其中作为人类使用的抗原，佐剂(或疫苗组合物)的生产、使用或售卖在联邦法律之下，得到政府机构的批准。然后微粒子组合物(仅包含所关心的一种或多种基因组片段，或同被选择的佐剂组合在一起)能使用穿越皮肤的递送技术被施用。优选地，微粒子组合物经由粉状注射方法被递送，例如从一个无针头的注射器系统递送，如那些描述在普遍拥有的国际公布WO94/24263，WO96/04947，WO96/12513和WO96/20022，全部引入本文作为参考。从这样的无针头注射器系统的颗粒递送典型地是用通常有近似的大小从0.1到250μm范围的颗粒实施，优选约10-70μm范围。大于约250μm的颗粒也能从这些设备递送，其上限是这样的一个点，大小在这一点的颗粒会造成对皮肤细胞不适当的损害。被递送的颗粒将会穿透目标表面的实际距离依赖于颗粒的大小(例如，假定一粗略球形的颗粒形状的标称颗粒直径)，颗粒的密度，颗粒冲击皮肤表面的初始速度以及皮肤的密度和动粘度。关于这一点，用于无针头的注射的最佳颗粒密度范围通常在约0.1和25g/cm3之间，优选在约0.9和1.5g/cm3之间，以及注射速度范围通常在约100和3,000m/sec之间，或更大。藉由适当的气压，平均直径在10-70μm的颗粒能以一个接近推进气流的超音波速度被加速通过喷嘴。如果需要，这些无针头的注射器系统能以预装载(preloaded)的状态提供，即包含含有基因组片段和/或选择的佐剂的合适剂量的颗粒。装载的注射器可以包装在一个密封的包装盒中，依照上文所描述的，可以进一步被贴上标签。因此，本方法可以用来获得大小范围从约10到大约250μm的核酸颗粒，优选约10到大约150μm，和最优选约20到大约60μm；以及颗粒密度范围从约0.1到大约25g/cm3，和约0.5到大约3.0g/cm3的体积密度，或更大。同样地，选择的佐剂颗粒能获得大小范围从约0.1到大约250μm的，优选约0.1到大约150μm，和最优选约20到大约60μm；颗粒密度范围从约0.1到大约25g/cm3，和体积密度优选约0.5到大约3.0g/cm3，和最优选约0.8到大约1.5g/cm3。微粒子组合物的施用在形成之后，微粒子组合物(例如，粉末)藉由合适的穿越皮肤的递送技术被穿越皮肤地递送到脊椎动物受试者的组织中。适合施用所关心的物质的不同的颗粒递送设备是本领域公知的，并且将会用于本发明的实践中。一个特别优选的穿越皮肤的颗粒递送系统使用一个无针头的注射器来发射受控剂量的固体颗粒进入和穿过完整的皮肤和组织。参见，例如，Bellhouse等的美国专利5,630,796号，其描述了一个无针头的注射器(名也为“PowderJect(r)颗粒递送设备”)。其它的无针头的注射器配置是本领域公知的而且本文已描述。包含一个治疗上有效量的如本文描述的粉末状分子的组合物能经由上文所述的颗粒递送设备被递送到任何合适的目标组织。例如，组合物能被递送到肌肉，皮肤，脑，肺脏，肝脏，脾脏，骨髓，胸腺，心脏，淋巴，血液，骨骼软骨，胰，肾脏，胆囊，胃，肠，睾丸，卵巢，子宫，直肠，神经系统，眼睛，腺体和结缔组织。至于核酸分子，优选递送到，并且分子表达在，末端分化细胞；然而，该分子也能被递送到非分化，或部分分化了的细胞例如造血干细胞和皮肤纤维母细胞。粉末状的组合物被施用到将受治疗的实验者中，以与剂量制成相容方式和将会预防性地和/或治疗性有效性的数量。递送的组合物的数量，通常每一剂量在从0.5μg/kg到100μg/kg的核酸分子的范围内，依赖被治疗的受试者而不同。其它药物，例如生理学活性肽和蛋白质的剂量，通常从大约0.1μg到大约20mg范围，优选10μg到大约3mg。必需的精确数量将会依赖被治疗个体的年龄和普通条件，被治疗状况的严重性，递送的特定制备物，施用的位点，以及其它因素而改变。本领域的技术人员容易地确定适当的有效数量。因此，本微粒子组合物的“治疗性地有效数量”将会足以引起对疾病或病情症状的治疗或预防，并且将会落入一个经过常规试验就能确定的相对宽的范围内。以下是实现本发明的具体实施方案的实施例。提供这些实施例，只是为了说明的目的，并不是以任何方式有意限制本发明的范围。实施例1使用HSV-2粘粒的核酸免疫作用为了评价使用包含有HSV-2基因组DNA的DNA疫苗粘粒的核酸免疫作用的特异性和有效性，进行了下面的研究。A.粘粒的制备HSV-2粘粒HSV-2基因组DNA是藉由用HSV-2株系MS(ATCC#VR-54T)感染Vero细胞(ATCC#CCL-81)然后分离来自被感染的细胞基因组DNA而获得的。包含HSV-2基因组片段的粘粒通过，如上文所述，用限制性酶EcoRI(NewEnglandBiolabs)消化HSV-2基因组DNA而产生。如图1所示，HSV基因组已被作图并且包含至少10个EcoR1位点，已用箭头标明在图中。按照制造商的说明，使用来自Stratagene的SuperCos1CosmidVectorKit将被消化的DNA连接到粘粒上。阳性粘粒首先通过纯化的粘粒DNA的EcoRI消化产生的片段大小来鉴定。消化的DNA上样到1％琼脂糖凝胶(15小时脉冲场电解，运行时间在6V/cm，以120°角，14℃在0.5×TBE缓冲液中进行)。进一步的鉴定是基于用其它的限制性酶产生的限制性图谱。这一初步的分析被用来确定相对于图1所示的HSV-2基因组的片段位置。例如，粘粒#68包含一个从第7个扩展到第10个所示的EcoRI位点的HSV-2基因组片段，而克隆#74包含一个从第1个扩展到第4个描述的EcoR1位点的HSV-2片段。B.包被微粒的制备使用由Eisenbraun等，(1993)DNACellBiol.12791-797描述的技术，粘粒DNA被包被在1-3μm金颗粒(DegussaCorp.，SouthPlainfield，NJ)之上。简而言之，藉由把13.26毫克的1-3微米金粉(Degussa)和一个适当量的粘粒DNA(每毫克金粉2μg)加入到一个含有500μl0.05M亚精胺(Sigma)的1.5毫升离心管中，粘粒DNA就被粘附到金颗粒。粘粒DNA和金通过在涡动过程中逐滴地加入500μl10％CaCl2(Fujisawa)而共沉淀，之后，沉淀物容许沉降数分钟。金/DNA沉淀物通过在微量离心机中离心15秒而浓缩，在无水乙醇(Spectrum)中洗三次并且重悬在适量的乙醇(每毫升乙醇8.84毫克金粉)和每毫升乙醇0.05毫克聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Spectrum)中。悬浮液然后被转移到一个小玻璃瓶中，盖上瓶盖，浸入超声水浴中2-5秒以溶解团块。乙醇溶液然后被注射Tefzel管(McMaster-Carr)中，用离心力使金/DNA粘附到管的一边。剩余的乙醇然后通过使用小的、受控制的氮气流被逐出。然后将管用氮气流干燥一小时，并被切割成半英寸的筒(cartridge)。筒在一个含有干燥剂的紧紧加盖的玻璃闪烁小瓶中4℃存储直到使用。如McCabe的美国专利5,584,807号所描述的，DNA包被的金颗粒然后被装入Tefzel管，而且该管被切割成1.27cm长以在颗粒递送设备中用作筒。氦-脉冲PowderJectXR颗粒递送设备以前已经被描述(参见，美国专利5,584,807号)而且从PowderJectVaccines，Madison，WI可以获得。在接种疫苗方面，每个1.27cm筒名义上包含了以1μgDNA包被的0.5毫克金颗粒。C.免疫通过包被粘粒(大约1μg粘粒/mg金，每一次射击递送0.5mg金)的金珠单发射击，使用颗粒介导的递送，免疫Balb/c小鼠。在初次免疫4星期之后动物被加强免疫。在加强免疫同时(4星期)及两星期之后(6星期)收集血清。小鼠血清抗体水平在6星期时使用ELISA检测。简而言之，HSV-2抗原以10μg/mg的浓度制备在PBS中。100微升的HSV-2抗原制备剂加入到96孔板(Costar)每个孔中，浓度约为每孔1μg蛋白质。该板在4℃孵育过夜，然后用PBS/0.05％Tween20溶液洗3次。该板在室温下用PBS/Tween5％干奶粉封闭1小时。以1∶100稀释在PBS/Tween中的兔抗HSV-2(对照)抗体或小鼠血清(未知的)加入到合适的孔中。该板用PBS/0.05％Tween20洗3次。制备以1∶8000稀释在PBS/Tween中的生物素偶联的羊抗兔抗体并且取100μl加入到每个孔中。该板用PBS/0.05％Tween20洗3次。制备以1∶8000稀释的链亲合素-HRP，取100μl加入每个孔中，在室温下孵育1小时。该板用PBS/0.05％Tween20洗6次。TMB仅仅在使用之前制备，取100μl加入到每个孔中并且在室温孵育15。通过添加100μl1NH2SO4终止反应，光密度值由一个自动化的读板仪在450nm处读出。来自1∶160稀释的值就个体动物(每组4个)进行平均，减去对照组(接种空载体的动物)的光密度。特别的粘粒的结果如图2所示。条棒上面的数字是不同粘粒克隆的名字。D.细胞介导的免疫应答进行脾细胞增殖试验以进一步评定HSV-2基因组来源的粘粒诱发细胞介导的免疫(CMI)应答的能力。这个试验测量体外培养的脾脏来源的淋巴细胞的增殖能力，也就是，生长和分裂，因此导致在数目上的增加，以作为对HSV-2抗原的反应。藉由一个较高级的刺激指标评分，增殖的数量越大，针对抗原的免疫应答就越强。用包含有表达HSV-2gD-抗原，用PCR从HSV-2基因组DNA扩增来，并克隆进pTarget载体(Promega)的基因的质粒或用HSV-2基因组来源的粘粒(如上文所述，称为第68号)免疫BALB/c小鼠。PowderJectXR颗粒递送设备用来通过递送质粒/粘粒DNA包被的金颗粒进入表皮层之内接种小鼠。小鼠进行一次初期和两次加强(每次给予4个星期间隔)免疫。每次免疫包括递送每0.5毫克金1μgDNA的单一注射。这些小鼠也有用蛋白质抽提物(100μg在PBS中)被注射在它们的耳廓中的，在第三次加强免疫之后的1-2个星期，来评定它们发起一个延迟类型的超敏感反应的能力。这些动物的右左耳分别用来自被HSV-2感染的和未感染的培养VERO细胞(ATCC#CCL-81)的蛋白质抽提物注射。在蛋白质注射三个星期之后，来自每一免疫组(在图例框中标明为“gD质粒和粘粒#68”)的两只小鼠，连同两只未免疫的幼稚小鼠被杀死。来自这些动物的脾细胞被分离而且在体外用纯的gD蛋白(0.1μg/孔)，或被HSV-2感染的VERO细胞蛋白抽提物(25或10μg/孔)，或不加抗原进行培养。在培养3天之后，抗原诱导的不同脾细胞群体的增殖反应通过被吸收进分裂细胞之内的放射性标记的胸腺嘧啶核苷(用闪烁扫描计数器每分钟计数测量)进行定量。刺激指数(Stimulationindices)藉由吸收进抗原刺激脾细胞的放射性总量，也就是每分钟计数(cpm)，除以它们相对应的非抗原刺激的脾细胞的cpm值而计算出来。在图3中，抗原刺激的非免疫的幼稚脾细胞的刺激指数从来自免疫的小鼠脾细胞的值中被减去了，以便给出一个gD-抗原表达质粒引发的抗原特异的细胞介导的免疫水平的真实的表现，这是同HSV-2基因组来源的粘粒引发的相比较而言。这些结果清楚地证明HSV-2基因组来源的粘粒#68能够在小鼠中引发抗HSV-2抗原的强的CMI应答。与来自用粘粒#68免疫的小鼠脾细胞获得的应答相比较，来自gD质粒免疫的小鼠脾细胞的针对gD蛋白的CMI应答稍微高一些。相反，与来自用单一gD-抗原表达质粒免疫的小鼠的脾细胞获得的应答相比较，来自用粘粒#68免疫的小鼠脾细胞产生的针对HSV-2感染的含有一个多阵列的HSV-2抗原的VERO细胞的蛋白质抽提物的CMI应答明显要高。因此，这些数据证明了用一个基于粘粒的DNA-疫苗产生一个比较强的CMI应答的实用性。同样地，进行了用上述HSV-2基因组来源的粘粒在豚鼠动物模型系统中的实验。粘粒在这些动物中也引发了强的CMI应答。在随后的在免疫的豚鼠中进行的挑战性研究中，没有观察到保护性的免疫；然而，这些结果被视为是非决定性的。实施例2使用HSV-2质粒的核酸免疫A.质粒构建藉由用HSV-2株系MS(ATCC#VR-54T)感染VERO细胞(ATCC#CCL-81)并且分离来自纯化的病毒颗粒的基因组DNA而获得HSV-2基因组DNA。使用基因组DNA进行PCR来扩增用于克隆进入质体载体的片段。引物gB2，具有下面的序列CGCGTCTAGAAACGTTCGCGACCACGGGTGAC(SEQIDNO3)和引物gB3，具有下面的序列CGCGTCTAGATGATGGGGTCCCGCTAACTCGC(SEQIDNO4)，它们分别对应HSV-2基因组中的58160和52930序列，被用来藉由PCR来扩增一个大约5200bp的产物。另一种PCR产物藉由使用引物gB2(SEQIDNO3)和引物gB4，具有下面的序列CGCGTCTAGACCTTCATGACCGCGCTGGTCCT(SEQIDNO5)而产生。它们分别对应HSV-2基因组的58160和49670序列。这产生了一个大约8500bp的产物。两种产物都包含编码糖蛋白B蛋白的基因组序列。PCR循环详述是98℃30秒，70℃10分钟，进行35个循环。使用扩展的长模板PCR系统(ExpandLongtemplatePCRsystem)(BoehringerMannheim)进行PCR反应。反应条件是每个引物20pmoles，1μgHSV-2基因组DNA，1×buffer#1((5mMTris-HCl，pH9.2，1.6mM(NH4)2SO4，1.75mMMgCl2)，200μM脱氧核糖核苷(dNTPs，Sigma)，1％DMSO，10mMMgSO4，加水至50μL，并加入1个单位(U)的扩展DNA聚合酶(ExpandDNApolymerase)。PCR产物藉由在添加额外的100μMdNTPs之后，在72℃用1个单位TaqDNA聚合酶(Promega)孵育10分钟进行“加A尾”。PCR片段从琼脂糖凝胶纯化纯化出来并且按照制造商的说明书连接到pGEM-TEasy载体系统(Promega)。用连接混合物电击转化TOP10大肠杆菌感受态菌体(Stratagene)，保留有质粒的细菌在用氨苄青霉素制备的平板上被分离出来。从选择的细菌菌落的过夜培养物进行DNA小量制备，纯化的质粒用作测试所需要的插入物。琼脂糖凝胶上的迁移率和一个适当的限制性模式用来鉴定阳性的质粒。B.包被微粒的制备使用Eisenbraun等(1993)DNACellBiol.12791-797描述的技术，质粒DNA被包被在1-3μm金颗粒(DegussaCorp.，SouthPlainfield，NJ)上。简而言之，藉由把金粉和一个适当量的质粒DNA加入到一个含有亚精胺离心管中，质粒DNA就被粘附到金颗粒上。质粒DNA和金通过在涡动过程中逐滴地加入CaCl2(Fujisawa)而共沉淀，之后，沉淀物容许沉降数分钟。金/DNA沉淀物通过在微量离心机中离心而浓缩，在无水乙醇中洗三次并且重悬在适量的乙醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中。悬浮液然后被转移到一个小玻璃瓶中，盖上瓶盖，浸入超声水浴中2-5秒以溶解团块。乙醇溶液然后被注射到Tefzel管(McMaster-Carr)中，用离心力使金/DNA粘附到管的一边。剩余的乙醇然后通过使用小的、受控制的氮气流被逐出。然后管用氮气流干燥一小时，并切割成半英寸的筒。筒在一个有紧紧加盖的玻璃闪烁小瓶中4℃存储直到使用。C.免疫通过包被质粒(大约每毫克金1个μg质粒，每一次射击递送0.5毫克金)的金珠的单发射击，使用颗粒介导的递送，免疫C57/black小鼠。在初次免疫4星期之后动物被加强免疫。收集在加强免疫同时(4星期)及两星期之后(6星期)的血清。小鼠血清抗体水平在6星期时使用ELISA检测，大体上与上文实施例1所述的完全相同。也进行了脾细胞增殖试验以进一步评定HSV-2基因组来源的质粒诱发细胞介导的免疫(CMI)应答的能力。因此，本研究证明了基于质粒的DNA疫苗引发免疫应答的用途。因此，已经描述了引发免疫应答的新的组合物。也已描述使用这些组合物的方法。虽然描述了主题发明优选实施方案的一些细节，应当理解可以进行不离开由附加权利要求所定义的本发明精神和范围的明显的变化。权利要求1.遗传构建体在药物生产中的用途，该遗传构建体携带有来源于病原体的至少5kb大小的基因组DNA片段，该药物通过施用所述构建体给脊椎动物受试者，引发免疫应答，藉此包含在所述基因组DNA片段中的序列编码的抗原得以表达，其表达量足以引发免疫应答。2.根据权利要求1的用途，其中包含在所述基因组片段里面的编码序列的表达不是被异源的启动子驱动的。3.根据权利要求1或2的用途，其中构建体是一个携带5kb到25kb大小所述基因组片段的质粒。4.根据权利要求1或2的用途，其中构建体是一个携带至少25kb大小的所述基因组片段的粘粒。5.根据权利要求4的用途，其中基因组DNA片段大小为大约35kb至大约50kb之间。6.根据前述任何一项权利要求的用途，其中构建体携带来自两个或多个病原体的基因组片段。7.根据前述任何一项权利要求的用途，其中病原体是一种细菌。8.根据前述任何一项权利要求的用途，其中病原体是一种病毒。9.根据权利要求6的用途，其中基因组片段来自不止一种病毒。10.根据前述任何一项权利要求的用途，其中构建体藉由穿越皮肤的给药而施用。11.根据权利要求10的用途，其中构建体提供在一个核心载体上。12.遗传构建体在药物生产中的用途，该遗传构建体携带有编码来源于一个或多个病原体的抗原的大小至少5kb的基因组DNA片段，该药物用于在脊椎动物受试者中引发免疫应答，其中该遗传构建体包被在核心载体上，经由穿越皮肤的颗粒介导的递送技术施用给受试者，并且，进一步，其中由存在于基因组片段的一个编码序列编码的抗原得以在受试者中表达，其表达量足以引发免疫应答。13.根据权利要求12的用途，其中包含在所述基因组片段里面的编码序列的表达不是被异源的启动子驱动的。14.根据权利要求12或13的用途，其中构建体是一个携带5kb到25kb大小的所述基因组片段的质粒。15.根据权利要求12或13的用途，其中构建体是一个携带至少25kb大小的所述基因组片段的粘粒。16.根据权利要求12至15任何一项的用途，其中基因组DNA片段来自两个或多个病原体。17.根据权利要求12至16任何一项的用途，其中病原体是一种病毒。18.根据权利要求12至17任何一项的用途，基因组DNA片段来自两个或多个病毒。19.根据权利要求12至17任何一项的用途，其中病原体是一种细菌。20.根据权利要求12至19任何一项的用途，其中所述施用被重复以提供一个初始和一个加强的给药。21.根据权利要求12至20任何一项的用途，其中核心载体有一个大约0.5至大约5μm的平均直径和一个足以准许穿越皮肤的递送进入受试者之内的密度。22.根据权利要求12至21任何一项的用途，其中核心载体由金属组成。23.根据权利要求22的用途，其中金属是金。24.遗传构建体在组合物生产中的用途，该遗传构建体携带有来源于一个或多个病原体的大小至少5kb的基因组DNA片段，该组合物通过给受试者施用所述构建体，确定编码抗原性多肽的序列，其中基因组DNA片段包含一个所述抗原性多肽的编码序列并且，在递送之后，抗原性多肽能以足以引发免疫应答的表达量得以表达；并且确定构建体上编码抗原性多肽的序列。25.根据权利要求24的用途，其中包含在所述基因组片段里面的编码序列的表达不是被异源的启动子驱动的。26.根据权利要求24或25的用途，其中构建体是一个携带5kb到25kb大小的所述基因组片段的质粒。27.根据权利要求24或25的用途，其中构建体是一个携带至少25kb大小的所述基因组片段的粘粒。28.根据权利要求24至27任何一项的用途，其中编码抗原性多肽的序列藉由施用一个或多个所述遗传构建体片段并且确定哪个片段包含编码抗原性多肽的序列而确定。29.根据权利要求24至27任何一项的用途，其中编码抗原性多肽的序列通过对遗传构建体进行测序而确定。30.一种含有携带来自一种或多种病原体基因组DNA片段的一种或多种构建体的疫苗组合物，其中基因组片段至少5kb大小并且包含至少一个抗原编码序列。31.一种根据权利要求30的疫苗组合物，其中包含在所述基因组片段里面的编码序列的表达不是被异源的启动子驱动的。32.一种疫苗组合物，其含有携带有来自单纯疱疹病毒-2(HSV-2)的基因组DNA片段的一种或多种核酸构建体。33.一种根据权利要求32的疫苗组合物，其中包含在所述基因组片段里面的编码序列的表达不是被异源的启动子驱动的。34.一种根据权利要求32或33的疫苗组合物，其中来自HSV-2的基因组DNA片段包含与如图1HSV-2基因组图谱中所示的从第7扩展到第10个EcoR1位点的序列大体上同源的一段序列.35.一种在脊椎动物受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括施用携带有至少5kb大小基因组DNA片段的核酸构建体，其中基因组片段是从一种或多种病原体来源或获得的而且构建体以足够的量施用到受试者中，该量足以引发免疫应答以对抗包含在所述基因组DNA片段的序列所编码的抗原。36.一种在脊椎动物受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括(a)提供一个以携带有来源于或获得自一个或多个病原体的基因组DNA片段的构建体包被的核心载体，其中基因组DNA片段包含有一个抗原编码序列，并且在大小方面大于5kb；和(b)使用颗粒介导的穿越皮肤的递送技术，将包被的核心载体施用给受试者，藉此存在于基因组DNA片段的一个编码的序列编码的抗原在受试者中得以表达，其表达量足以引发免疫应答。37.确定编码抗原性多肽序列的方法，该方法包括(a)施用一个或多个携带有至少5kb大小的从一个或多个病原体的基因组DNA片段获得或来源的构建体，其中基因组DNA片段包含有一个编码所述抗原性多肽的序列并且，当被递送至受试者后，抗原性多肽能以足以引发免疫应答的表达量从编码序列表达；和(b)确定构建体上的编码抗原性多肽的编码序列。38.根据权利要求35至37的任何一项的方法，其中包含在所述基因组片段里面的编码序列的表达不是被异源的启动子驱动的。全文摘要提供了通过在受试者中施用一种或多种大的基因组DNA片段引发免疫应答的方法。也提供了确定编码抗原性多肽的序列的方法。也提供了含有一个或多个大的基因组DNA片段的疫苗组合物。文档编号A61P31/00GK1409641SQ00816887公开日2003年4月9日申请日期2000年11月2日优先权日1999年11月3日发明者威廉·F·斯威恩,李·K·罗伯茨,兰德恩·G·佩恩,拉尔夫·P·布劳恩申请人:宝德杰克特疫苗有限公司