组织再生用基材、移植用材料及其制法的制作方法

专利名称：组织再生用基材、移植用材料及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及在整形外科、口腔外科、成形外科等医疗领域中可以广泛使用的组织再生用基材、移植用材料及其制法。
背景技术：
近年来，通过再形成、再构筑人体组织进行治疗的组织工程学(Tissue Engineering)的领域一直快速发展。这种组织工程学从二十世纪80年代初期开始，在整形外科领域等中，尝试在分解·非分解性材料中培养皮肤、软骨或者神经细胞。
在组织工程学中，已知以下方法，即在生物体内移植成为组织再生基础的基质，在生物体内(invivo)使细胞繁殖从而进行治疗的方法，或者在生物体外(in vitro)进行以基质为基础的细胞培养、繁殖后，将培养的细胞(组织)和基质一起，或者单独将再生组织移植到生物体内的方法等。
另外，关于成为组织再生基础的基质，也已知各种来源于生物体的材料和合成材料等，例如，可以在胶原或者聚乙醇酸的基质中进行细胞的三维培养，具有在生物体内分解·吸收的特征。
但是，这些基质的分解产物存在诱发炎症反应的可能性，而且，基质在组织再建前分解，或者在组织再生后长时间也不分解等，难于控制分解·消失时间。
本发明是鉴于上述课题而提出的，其目的在于提供可以进行组织再生，具备组织再建时所需的力学特性并具有在组织再建后的生物体内分解消失特性的组织再生用基材。另一目的在于提供可以良好地再建组织且具有在组织再建后的生物体内分解消失特性的移植用材料，再一目的在于提供这种移植用材料的制法。
发明公开为了解决上述课题，本发明涉及组织再生用基材，其特征在于，含有聚轮烷或者聚轮烷水凝胶，其中，该聚轮烷是在贯穿了多个环状分子的线形分子的两末端通过水解性键导入具有体积庞大的取代基的生物体亲和性基团得到的物质，该聚轮烷水凝胶是与该聚轮烷邻接的聚轮烷1分子中含有的环状分子之间、生物体亲和性基团之间或者环状分子和生物体亲和性基团之间通过交联键进行交联形成网状结构得到的物质。
使用本发明的由聚轮烷或者聚轮烷水凝胶构成的组织再生用基材，例如培养软骨细胞时，细胞一边维持类似软骨细胞的形态，一边繁殖。另外，即使在生物体内以单体移植该组织再生用基材，也不会损害细胞形态和繁殖。即可以进行组织再生。
另外，用于本发明的聚轮烷或者聚轮烷水凝胶具备组织再建时所需的力学特性。认为这是因为聚轮烷和聚轮烷水凝胶通过进行超分子结构即线形分子和环状分子这样的不同分子间的物理络合(非共价键)，从而具有高结晶性。
而且，用于本发明的聚轮烷或者聚轮烷水凝胶具有在组织再建后的生物体内分解消失的特性。认为其原因在于，由于具有水解性键，在生物体内该水解性键加水分解，并且体积庞大的生物亲和性基团(即帽子)从线形分子的两末端脱落，环状分子从该线形分子脱离，从而分解消失。
这样，根据本发明的组织再生用基材，可以进行组织再生，在具备组织再建时所需的力学特性的同时，具有在组织再建后的生物体内分解消失特性，因而适合于从细胞再构筑组织。
在本发明的组织再生用基材中，只要是线形分子或者环状分子具有生物亲和性(几乎不损害生物体的性质)的物质即可，没有特别的限定，作为线形分子，优选选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物以及聚甲基乙烯基醚的一种或两种以上。作为这样构成的环状分子或者线形分子，通过选择生物亲和性优良的分子，则合成的聚轮烷或者聚轮烷水凝胶生物亲和性优良，适合作为组织再生用移植材料。另外，平均分子量优选200-50000，特别优选400-5000。作为环状分子，优选α、β或者γ-环糊精，也可以是具有与其类似的环状结构的物质，作为这种环状结构，可以举出环状聚醚、环状聚酯、环状聚醚胺、环状聚胺等。作为线形分子和环状分子的组合，优选α-环糊精和聚乙二醇的组合。
在本发明的组织再生用基材中，作为水解性键，只要是在生物体内进行水解的键即可，可以是任意的键。其中，如果考虑在生物体内快速非酶地进行水解，优选酯键。
组织再生用基材是聚轮烷水凝胶时，交联键优选氨酯键(urethanebond)、酰胺键、脲键、醚键、硫键(sulfide bond)或者席夫碱型键。另外，环状分子彼此交联时，交联键优选与水解性键相比，对水稳定的。这是因为，水解性键首先分解，具有体积庞大的取代基的生物体亲和性基团从线形分子的两个末端脱落，交联结合的环状分子立刻脱落，从而可以得到良好的分解模式。
在本发明的组织再生用基材中，作为线形分子的两个末端的生物体亲和性基团，只要是对生物体的亲和性高的基团(相对于生物体安全性高的基团)即可，可以是任意基团，例如优选氨基酸、寡肽、寡糖类或者糖衍生物。作为氨基酸，例如可以举出丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等。另外，作为寡肽，可以举出上述多个氨基酸通过肽键形成的寡肽等。另外，作为寡糖类，可以举出重复单元为1-5且作为构成多糖为葡聚糖、透明质酸、甲壳质、脱乙酰壳多糖、海藻酸、硫酸软骨素、淀粉组成的物质。而且，作为糖衍生物，可以举出将寡糖类、多糖或者单糖进行乙酰化或者异丙基化等化学修饰得到的化合物等。其中，优选具有苯环的氨基酸，例如L-苯基丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等。
在本发明的组织再生用基材中，作为生物体亲和性基团具有的体积庞大的取代基，只要可以防止环状分子从线形分子脱落即可，可以是任意基团，例如优选具有1个以上苯环的基团或者具有1个以上叔丁基的基团。作为具有1个以上苯环的基团，例如可以举出苄氧基羰基(Z)基团、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团、苄基酯(OBz)基团等，另外，作为具有1个以上叔丁基的基团，可以举出叔丁基羰基(Boc)基团、氨基酸叔丁基酯(Obu)基团等，其中，优选苄氧基羰基。
作为本发明的组织再生用基材，特别优选上述线形分子是聚乙二醇，上述环状分子是α-环糊精，上述水解性键是酯键，上述具有体积庞大的取代基的生物体亲和性基团是苄氧基羰基-L-苯基丙氨酸。另外，在聚乙二醇贯穿α-环糊精时，α-环糊精和聚乙二醇的重复单元(环氧乙烷单元)的化学计量比为1∶2。
本发明的组织再生用基材是聚轮烷水凝胶时，通过改变聚轮烷水凝胶中的聚轮烷的重量比例(聚轮烷在聚轮烷水凝胶骨架中所占的重量比例)，可以控制聚轮烷水凝胶的分解速度。这是这次新得到的发现，优选利用该发现，如下确定聚轮烷在聚轮烷水凝胶中的重量比例。即，预先求得适合于组织再生用基材使用状况的分解速度，确定聚轮烷水凝胶中的聚轮烷的比例，使之达到该分解速度。结果可以得到适合于使用状况的组织再生用基材。
本发明的组织再生用基材是聚轮烷水凝胶，即通过交联用线形分子，以交联键将1分子相邻的聚轮烷中所含的环状分子之间(或者生物体亲和性基团之间，或者环状分子和生物体亲和性基团之间)交联得到的结构时，通过改变该交联用线形分子的平均分子量，可以控制聚轮烷水凝胶的分解速度或者分解模式。这也是这次新得到的发现，优选利用该发现，如下确定交联用线形分子的平均分子量。即，预先求得适合于组织再生用基材使用状况的分解速度或者分解模式，确定交联用线形分子的平均分子量，使之达到该分解速度或分解模式。结果可以得到适合于使用状况的组织再生用基材。
在此，作为分解模式，有以下模式，即在生物体内徐徐分解的模式，或者在生物体内经过某一时间为止几乎没有分解，之后急速分解的模式等。另外，作为交联用线形分子，例如优选聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物等生物体亲和性聚合物，其平均分子量优选在0-50000的范围。另外，交联部分的分子量是0时，意味着交联用线形分子不在其中，直接成键。另外，通过交联用线形分子交联时，优选在交联用线形分子的两端交联。
本发明的组织再生用基材优选由聚轮烷水凝胶构成，该聚轮烷水凝胶是对于在贯穿了多个环状分子的线形分子的两个末端通过水解性键导入具有体积庞大的取代基的生物体亲和性基团得到的聚轮烷，通过交联用线形分子，以交联键将1分子相邻的聚轮烷中含有的环状分子之间交联形成网状结构得到的物质，所述基材具有下述(a)和/或(b)的性质。
(a)聚轮烷水凝胶直至完全水解的时间不依赖于聚轮烷水凝胶中的含水率，伴随着聚轮烷水凝胶中的聚轮烷含量减少，或者伴随着交联用线形分子对环状分子的摩尔比增加，或者伴随着交联用线形分子的平均分子量减少而延长。
(b)以聚轮烷水凝胶直至完全水解的时间为t∞，经过的时间为t，初期水膨润状态下的聚轮烷水凝胶重量为M0，在时间t的聚轮烷水凝胶重量为Mt，以t/t∞为横轴，Mt/M0为纵轴描绘图时的分解模式不依赖于聚轮烷水凝胶中的聚轮烷含量，而是取决于交联用线形分子的分子量。
具有上述(a)性质时，预先求得适合于组织再生用基材的使用状况的分解速度，通过确定聚轮烷水凝胶中的聚轮烷的比例(含量)或者确定交联用线形分子对环状分子的摩尔比，或者确定交联用线形分子的平均分子量，使之达到该分解速度，从而可以得到适合于使用状况的组织再生用基材。
另一方面，具有上述(b)性质时，预先求得适合于组织再生用基材的使用状况的分解模式，通过确定交联用线形分子的平均分子量，使之达到该分解模式，从而可以得到适合于使用状况的组织再生用基材。另外，实际在生物体内使用时，如果要得到直至经过某一时间几乎没有分解，其后急速分解的模式，例如优选将交联用线形分子的平均分子量控制为4000-10000。
作为具有上述(a)和/或(b)性质的组织再生用基材，例如可以举出由聚轮烷水凝胶构成的基材，对于该聚轮烷水凝胶，环状分子是α-环糊精，线形分子是聚乙二醇，水解性键是酯键，交联用线形分子是聚乙二醇二胺，在聚乙二醇二胺的两个末端的NH2基上通过氨酯键将1分子相邻的聚轮烷中含有的α-环糊精的OH基团之间交联形成网状结构而得到。
本发明的组织再生用基材只要是可以培养或者引入细胞的形态即可，没有特别限定为什么样的形态。例如可以制成膜状，在其上接种细胞，或者制成凝胶状，在其上接种细胞，或者溶解于溶剂中，在该溶液中接种细胞，或者在溶剂中悬浊，在该悬浊液中接种细胞。特别是，如果从易于保持·培养细胞方面考虑，优选使用聚轮烷或者聚轮烷水凝胶的多孔体。对于此时的孔，只要是可以保持细胞的大小·密度即可，没有特别的限定。另外，不和细胞组合，以单体在生物体内移植组织再生用基材时，组织再生用基材的形态也没有限定。优选成为多孔体，因为来自移植周围组织的细胞给予了适合于繁殖的环境。此时，孔的大小、密度可以是适合于细胞从移植周围组织侵入并可以进行血管新生的大小、密度，没有特别的限定。另外，作为多孔体的制法，可以应用公知的方法，例如，可以应用在氯化钠存在下使之凝胶化的方法或者真空冷冻干燥含水水凝胶的方法等。
对于本发明的组织再生用基材，其表面也可以被细胞粘结促进物质覆盖。所谓细胞粘结促进物质只要是具有促进细胞粘结的性质的物质即可，没有特别的限定，例如可以举出胶原、明胶等。覆盖方法没有特别的限定，可以根据常规方法进行，简单地可以列举出调制多孔体后，浸渍在细胞粘结促进物质中，之后再次冷冻干燥的方法。
组织再生用基材特别是可以用于任何细胞的培养或者引入，例如，优选用于间质细胞、肝细胞、神经细胞的培养，在此，间质细胞包含软骨细胞、成纤维细胞、成骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、内皮细胞、上皮细胞以及这些全部的前驱细胞，特别优选本发明的组织再生用基材用于软骨细胞的培养。
作为使用本发明的组织再生用基材使组织再生的方法，可以考虑以单体使用聚轮烷和聚轮烷凝胶的方法，在该再生用基材中只引入细胞进行使用的方法，还有在该再生用基材上培养细胞进行使用的方法。
另外，作为使细胞固定化的方法，例如可以举出通过在聚轮烷水凝胶中添加高浓度的细胞培养液，在凝胶膨润的同时，将细胞引入凝胶孔内进行固定的方法；旋转培养的方法；接种细胞后，通过减压至不对细胞造成影响的程度进行固定的方法等。
如果使用在本发明的组织再生用基材中培养细胞或者引入细胞得到的移植用材料，可以进行组织再生。作为制造该移植用材料的方法，可以是任何制造方法，但是优选根据使用目的，将上述组织再生用基材调制成适当的大小或形状后，在该组织再生用基材中培养或引入细胞，得到移植用材料。例如，在用于耳软骨的再造时，为了适合于耳朵的应用部位，也可以在整形·加工的组织再生用基材中注入细胞分散液，培养一定时间，形成移植用材料。此时，将该移植用材料埋入耳的应用部位。相反，在组织再生用基材中培养或者引入细胞后，利用该移植用材料时，或者装运时，也可以调整成与应用部位相对应的适当的大小或者形状。
对于由聚轮烷或者聚轮烷水凝胶构成的组织再生用基材，例如培养软骨细胞的移植用材料，培养细胞在维持软骨细胞那样的形态的同时进行繁殖，丰富地产生软骨基质。软骨组织主要由软骨细胞和该细胞产生的基质修复，因此预先大量含有这些意味着该移植用材料具有高组织再生能力。这样，进行培养操作时，在繁殖组织修复所需的细胞或者在移植用材料中可以担载细胞的产生物质(基质或者生长因子等)方面优选，即使因某些理由细胞死亡的情况下，细胞产生的基质或者生长因子因残留在移植用材料中，因而对组织再生也有效。而且，在上述组织再生用基材中例如只接种软骨细胞，即，不进行培养只引入，为了维持细胞的形态，移植后这些细胞立刻对组织再生起作用，作为移植用材料也有效。


图1是表示生物降解性聚轮烷的合成顺序的说明图，图2是表示聚轮烷水凝胶的合成顺序的说明图，图3是聚轮烷水凝胶PRHG-5，6的非酶水解行为的图，图4是用于考察聚轮烷水凝胶PRHG-5，6的分解模式的图，图5是聚轮烷水凝胶PRHG-7～9的非酶水解行为的图，图6是用于考察聚轮烷水凝胶PRHG-7～9的分解模式的图，图7是表示使PEG二胺的分子量一定并改变聚轮烷含量的聚轮烷水凝胶的分解行为的图，图8是表示聚轮烷含量和完全分解时间的关系的图，图9是表示聚轮烷含量和含水率的关系的图，图10是表示PEG/α-CD比和完全分解时间的关系的图，图11是表示以t/t∞为横轴，Mt/M0为纵轴时的分解模式的图，图12是表示聚轮烷水凝胶PRHG-1，3上的兔软骨细胞培养的经时变化的图。
发明的最佳实施方式下面对于本发明的优选实施例进行说明，但本发明不受这些实施例的任何限定。
(1)生物降解性聚轮烷的合成(参照图1)(1-1)在两个末端具有氨基的PEG的合成在甲苯(220ml)中溶解分子量3300的聚乙二醇(PEG)(33g，10mmol)和琥珀酸酐(20g，200mmol)，在150℃下回流该溶液5小时。反应结束后，注入过量的乙醚，过滤·减压干燥后，得到粗产物。将其溶解在二氯甲烷中，离心分离除去不溶物，注入过量的乙醚中，过滤·减压干燥后，得到在两个末端具有羧基的PEG(化合物A)，为白色粉末。
在1，4-二氧六环和二氯甲烷的混合溶液(350ml，体积比1∶1)中溶解该化合物A(20g，5.7mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)(17.1g，148.2mmol)，用冰冷却后，添加二环己基碳二亚胺(DCC)(23.5g，114mmol)。在用冰冷却的状态下搅拌1小时，之后在室温下搅拌过夜。过滤作为副产物的二环氨基甲酸乙酯，将滤液浓缩后注入过量的乙醚中。过滤·减压干燥后，得到羧基被活化的PEG(化合物B)，为白色粉末。
在溶解了乙二胺(0.4ml，6mmol)的二氯甲烷(75ml)中，滴加溶解了化合物B(10g，2.7mmol)的二氯甲烷(75ml)，滴加结束后，在室温下搅拌1小时。反应结束后，将溶液注入到过量的乙醚中，过滤·减压干燥后，得到在两个末端具有氨基的PEG(化合物C)，为白色粉末。
(1-2)假聚轮烷的制备在室温下，在α-环糊精(α-CD)(48g，49.2mmol)的饱和水溶液(311ml)中滴加化合物C(4g，1.12mmol)的水溶液(20ml)。在照射超声波的同时搅拌1小时，之后，在室温下搅拌24小时。通过离心分离回收白色的沉淀物。在50℃下进行减压干燥，得到白色粉末状的假聚轮烷。
另外，所谓聚轮烷是指在多个环状分子(例如环糊精)上贯穿线状分子(例如PEG)，且用体积庞大的取代基封闭该线形分子的两个末端的物质，假聚轮烷是指未用体积庞大的取代基封闭聚轮烷的两个末端的物质。
(1-3)末端封闭剂的制备为了导入苯甲氧基羰基-L-苯丙氨酸(Z-L-Phe，Z表示苯甲氧基羰基)作为防止α-CD脱离的体积庞大的取代基，将Z-L-Phe的羧基活化。
即，在1，4-二氧六环(800ml)中溶解Z-L-Phe(100g，334mmol)，一边用冰冷却一边添加HOSu(38.42g，334mmol)。1小时后，缓慢添加溶解了DCC(75.7g，367mmol)的1，4-二氧六环溶液(200ml)，在用冰冷却的状态下搅拌1小时，之后，在室温下搅拌过夜。过滤作为副产物的二环氨基甲酸乙酯，浓缩滤液后，注入到过量的乙醚中，过滤·减压干燥后得到粗产物。在室温下，在二氯甲烷中溶解粗产物，尽可能达到饱和浓度后，适量添加石油醚并冷藏，进行重结晶。过滤·减压干燥晶体，得到白色针状晶体的Z-L-Phe的琥珀酰亚胺酯(Z-L-Phe-Osu)。
(1-4)生物降解性聚轮烷的制备在二甲基亚砜(DMSO)(60ml)中溶解Z-L-Phe-Osu(80g，200mmol)，添加假聚轮烷(45g，2mmol)。在室温下搅拌该不均匀溶液的同时，少量多次添加DMSO并搅拌96小时以达到均匀。反应结束后，在过量的乙醚中注入反应溶液，得到粗产物。以丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)的顺序洗涤粗产物，除去杂质(未反应的Z-L-Phe-Osu、α-CD、化合物C等)并过滤·减压干燥，得到生物降解性聚轮烷，为白色粉末。合成的确认通过1H-NMR进行。
(2)聚轮烷水凝胶的制备(参照图2)在氮气环境下，在DMSO(10ml)中溶解生物降解性聚轮烷(1g，2.91×10-5mol，[OH]＝16.2mmol)后，添加N，N’-羰基二咪唑(CDI)(8.13mmol)，在室温下搅拌3小时。反应结束后，注入到过量的乙醚中，过滤·减压干燥，得到白色粉末状的CDI活化聚轮烷(CDI-PR)。
根据下述表1所示的配合量，添加CDI-PR的DMSO溶液、PEG的二胺(PEG-BA，分子量600)和氯化钠，搅拌·脱气后，用聚四氟乙烯间隔物(直径13mm，深度2mm)，在35℃下凝胶化24小时。得到的凝胶用DMSO洗涤，接着用水洗涤直至重量没有变化，得到聚轮烷水凝胶(PRHG-1～4)。
这些聚轮烷水凝胶PRHG-1～4是通过PEG用交联键(氨酯键)将1分子相邻的聚轮烷中所含的环状分子(α-环糊精)彼此交联而形成三维网状结构得到的物质。另外，在氯化钠存在下进行凝胶化得到的PRHG-1～3是多孔体(用电子显微镜就可以确认)，在没有氯化钠的条件下进行凝胶化得到的PRHG-4是非多孔体。
表1


※)是非多孔体的测定值。
(3)聚轮烷水凝胶的物性测定聚轮烷水凝胶的含水率、作为力学强度指数的压缩弹性率以及膨胀时的交联密度(参照表1)。另外，这些虽然是非多孔体的测定值，但是对于压缩弹性率，即使是多孔体也同等或者约小1个数量级。对于交联密度，即使是多孔体也同等。
对于含水率，在室温下测定平衡膨润状态的聚轮烷水凝胶重量(Wset)，以及在50℃下减压干燥该凝胶后的干燥聚轮烷水凝胶重量(Wdry)，由下述数学式1算出。
数学式1


在室温下用热应力变形测定装置测定压缩弹性率，用压缩弹性率由下述数学式2计算出交联密度。另外，测定时，采用使用软木塞穿孔器旋孔达到与探针大致相同的截面积得到的平衡膨胀状态的聚轮烷水凝胶。
数学式2Ec＝3RT×ve/VEc压缩弹性率
ve/V交联密度R气体常数T绝对温度V膨胀时的凝胶体积(4)聚轮烷水凝胶的非酶水解行为的解析(4-1)有关聚轮烷水凝胶中的聚轮烷的比例的考察在上述(2)中，添加CDI-PR的DMSO溶液、PEG-BA的DMSO溶液和氯化钠进行凝胶化时，调制聚轮烷重量(从CDI-PR的DMSO溶液换算)和PEG-BA重量的比为70∶30的聚轮烷水凝胶(PRHG-5)以及60∶40的聚轮烷水凝胶(PRHG-6)。
将平衡膨润状态的聚轮烷水凝胶PRHG-5、PRHG-6浸渍在0.1M磷酸缓冲溶液(PBS)(pH＝8.0)中，在37℃下振荡，在每次规定的时间擦去水，测定凝胶的重量变化。以该重量变化作为非酶水解行为的评价。结果如图3所示。
聚轮烷水凝胶的分解模式是在初期重量一直增加，之后减少，最终为零的模式。其中，认为在重量增加时，聚轮烷水凝胶的交联点减少，三维结构的网眼质量扩大，从而容易保持水分，含水率增加，维持聚轮烷水凝胶的三维结构。另一方面认为不能维持聚轮烷水凝胶的三维结构而交联点减少时，溶解并重量一直减少，直至为零。因而，开始重量变化的测定之后，直至重量为零的时间表示分解速度。
根据图3，由于PRHG-5比PRHG-6分解速度快，可以说聚轮烷水凝胶中的聚轮烷的重量比例越多，聚轮烷水凝胶的分解速度越快。
另外，为了考察聚轮烷水凝胶的分解模式，用试验开始前的水膨润状态时的水凝胶的重量M0、直至聚轮烷水凝胶完全分解的时间(称为完全分解时间)t∞进行标准化，将水浸聚轮烷水凝胶后经过的时间t除以t∞得到的值t/t∞、时间t时的凝胶重量Mt除以M0得到的值Mt/M0作为标准化的数值，制作图4的图。考察分解模式时的视点之一在于，在t/t∞的数值为几时，聚轮烷水凝胶的分解是否开始(Mt/M0是否达到峰值)。所谓分解开始时的t/t∞的数值小是指分解开始后直至完全分解所需要的时间长，相反，分解开始时的t/t∞的数值大是指分解开始后直至完全分解所需的时间短。
根据图4，由于无论是PRHG-5还是PRHG-6，分解开始时的t/t∞数值大致相同(约0.5)，所以可以说聚轮烷水凝胶的分解模式不依赖于聚轮烷水凝胶中的聚轮烷的比例。
(4-2)有关聚轮烷水凝胶中的交联部分的分子量的考察在上述(2)中，在CDI-PR的DMSO溶液中添加PEG-BA和氯化钠进行凝胶化时，使PEG-BA相对于CDI-PR中含有的每1α-CD分子的投料比为1.0，调制使用分子量为600的PEG-BA得到的聚轮烷水凝胶(PRHG-7)、使用分子量为2000的PEG-BA得到的聚轮烷水凝胶(PRHG-8)以及使用分子量为4000的PEG-BA得到的聚轮烷水凝胶(PRHG-9)。
在0.1M磷酸缓冲溶液(PBS)(pH＝7.4)中浸渍平衡膨润状态的聚轮烷水凝胶PRHG-7、PRHG-8、PRHG-9，在37℃下振荡，在每次规定的时间擦去水测定凝胶的重量变化。以该重量变化作为非酶水解行为的评价。结果如图5所示。
根据图5，提示了聚轮烷水凝胶中的交联部分的分子量越小，聚轮烷水凝胶的分解速度越快。即，该结果提示如果改变聚轮烷水凝胶中的交联部分的分子量，则可以控制分解速度。
另外，为了考察聚轮烷水凝胶的分解模式，和图4-样，制作图6的图。根据图6，PRHG-7分解开始时的t/t∞在0.50附近，PRHG-8分解开始时的t/t∞在0.85附近，PRHG-9分解开始时的t/t∞在0.90附近。由此，可以说聚轮烷水凝胶中的交联部分的分子量越大，聚轮烷水凝胶的分解模式中的分解开始时的t/t∞越大。
(4-3)小结从以上结果可以看出，为了控制聚轮烷水凝胶的分解速度，可以改变聚轮烷水凝胶中的聚轮烷的重量比例，或者改变聚轮烷水凝胶中的交联部分的分子量。即，作为组织再生用基材，使用聚轮烷水凝胶时，可以求得适合于该组织再生用基材使用状况的分解速度，确定聚轮烷水凝胶中的聚轮烷的重量比例，或者确定聚轮烷水凝胶中的交联部分的分子量，使之得到该分解速度。
另外可知为了控制聚轮烷水凝胶的分解模式(分解开始时的t/t∞)，可以改变聚轮烷水凝胶中的交联部分的分子量。即，作为组织再生用基材，使用聚轮烷水凝胶时，可以求得适合于该组织再生用基材使用状况的分解模式，确定可以得到该分解模式这样的聚轮烷水凝胶中的交联部分的分子量。
(5)聚轮烷水凝胶的非酶水解行为的解析-之二在DMSO(5ml)中溶解上述CDI-PR(4.2×10-5mol，N-酰基碳酸酯基10.7mmol)，接着添加熔融的各种PEG二胺。该合成条件集中在表2中。对反应混合物除去气体，注入到聚四氟乙烯(Teflon)间隔物中，在35℃下维持24小时。之后，用DMSO洗涤得到的生成物，在室温下浸在水中，经过2天使之完全水合。由此得到聚轮烷水凝胶。
表2


※1)[E]后面接续的数字表示PEG二胺的平均分子量的1/1000，[RX]后面接续的数字表示聚轮烷的含量(wt％)。
※2)PEG/α-CD表示聚轮烷水凝胶中的PEG二胺和α-CD的计算摩尔比。
如下研究水解行为。即，将如上所述得到的聚轮烷水凝胶的膨润物切成1cm×1cm的片(厚度＜1mm)，在37℃下，在含有0.02％叠氮化钠的0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中浸渍这些片，用振荡机在130rpm下振荡。通过测定残存的聚轮烷水凝胶的重量来评价聚轮烷水凝胶的分解。试验进行3次。试验结果图示在图7-图9中。
图7是表示使PEG二胺的分子量一定并改变聚轮烷的含量的聚轮烷水凝胶的分解行为的图，(a)～(c)是PEG二胺的分子量分别为4000、2000、600。另外，图8是表示聚轮烷含量和完全分解时间的关系的图。从图7和图8可知，在PEG二胺的分子量相同的情况下，完全分解时间随着聚轮烷含量减少而延长。即，聚轮烷水凝胶中的聚轮烷的重量比例越多，聚轮烷水凝胶的分解速度越快。
图9是表示聚轮烷含量和含水率的关系的图。从图9可知，在PEG二胺的分子量相同的情况下，聚轮烷水凝胶中的含水率和聚轮烷含量没有关系，大致一定。该结果提示含水率不是改变完全分解时间的要素。
图10是表示PEG/α-CD比和完全分解时间的关系的图。在此，PEG/α-CD比是聚轮烷水凝胶中的PEG二胺和α-CD的摩尔比。从图10可知，在PEG二胺的分子量相同的情况下，完全分解时间随着PEG/α-CD比增加而延长。即，PEG/α-CD比越小，聚轮烷水凝胶的分解速度越快。如表2所示，常常将PEG/α-CD比调整到2以下。另外，PEG/α-CD比如果超过2，则由于聚轮烷水凝胶在生理学条件或者0.1M氢氧化钠水溶液下不分解，因而在此提出PEG/α-CD比为2以下。
图11和图4一样，是表示以t/t∞为横轴，Mt/M0为纵轴时的分解模式的图。从图11可知，该分解模式不依赖于聚轮烷水凝胶中的聚轮烷含量，如果PEG二胺的分子量相同，则成为同样的曲线。另外，直至聚轮烷水凝胶的分解开始点的延时随着PEG二胺的分子量增加而延长。该结果提示和绝对的分解时间没有关系，PEG二胺的分子量越大，直至分解开始点的延时进一步变长，分解开始后成为早期分解的模式。
(6)软骨细胞的培养在高压釜中放入表1所示的聚轮烷水凝胶PRHG-1、PRHG-3，在121℃下处理20分钟，进行灭菌。将灭菌后的聚轮烷水凝胶放入96孔培养板中，在每个孔接种2×105细胞/100μl的冷冻保存的兔软骨细胞，在37℃、5％ CO2恒温箱内静置，在各聚轮烷水凝胶上固定细胞(固定时间2小时或者24小时)。
将如此固定了软骨细胞的各聚轮烷水凝胶移到24孔培养板中，添加含有10v/v％牛胎儿血清(FBS)和50μg/ml抗坏血酸的Dulbecco改良Eagle’s最小必需培养基(DMEM)(以下仅称为培养基)，每7天更换培养基，共计培养6周。培养后，用10％福尔马林固定，用AlcianBlue(pH1.0)染色，脱色、脱水、使之清澈后密封。另外，Alcian Blue染色是酸性粘多糖染色法之一且是软骨组织染色法的一种。
固定时间为2小时的情况下，从培养开始后，圆形细胞形成菌落的同时开始繁殖，同时在培养期间大型化。具体地说，在培养第14天、第28天、第42天进行观察，确认了一直进行大型化的情况(参照图12)。这些菌落在菌落大型化的同时产生不透明的基质，在显微镜下观察到浑浊的影像。另外，培养4周后，在全体细胞菌落中观察到非常坚固的Alcian Blue阳性影像。即，使用该聚轮烷水凝胶，以三维形状培养软骨细胞时，可以确认软骨细胞在维持原本形状的同时进行繁殖，同时，也产生基质(酸性粘多糖类)。因此，可以将在聚轮烷水凝胶(PRHG-1，3)构成的组织再生用基材中以三维形状培养软骨细胞得到的物质用作移植用材料。另外，在固定时间为24小时的情况下，也观察到大致同样的情况。
另外，随着细胞的伸展或者聚轮烷水凝胶的分解，在培养板中软骨细胞的菌落溢出并粘附在底面。之后，具有成纤维细胞样形态的细胞离开粘附的菌落。这些细胞没有维持软骨细胞的圆形形态，AlcianBlue染色也显示阴性。该结果推测由于取出在聚轮烷水凝胶内维持的软骨样细胞菌落并进行单层培养后，丧失了软骨细胞样的特征，从而引起退行发育。
工业实用性根据本发明，可以提供可以在整形外科、口腔外科、成形外科等医疗领域中广泛使用的组织再生用基材、移植用材料。
权利要求
1.一种组织再生用基材，含有聚轮烷或者聚轮烷水凝胶，其中，该聚轮烷是在贯穿了多个环状分子的线形分子的两末端通过水解性键导入具有体积庞大的取代基的生物体亲和性基团得到的物质，该聚轮烷水凝胶是与该聚轮烷邻接的聚轮烷1分子中含有的环状分子之间、生物体亲和性基团之间或者环状分子和生物体亲和性基团之间通过交联键进行交联形成网状结构得到的物质。
2.权利要求1所述的组织再生用基材，上述线形分子是聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物或者聚甲基乙烯基醚，上述环状分子是α、β或者γ-环糊精。
3.权利要求1或2所述的组织再生用基材，上述水解性键是酯键。
4.权利要求3所述的组织再生用基材，上述交联键是氨酯键、酰胺键、脲键、醚键、硫键或者席夫碱型键。
5.权利要求1-4中任意一项所述的组织再生用基材，上述体积庞大的取代基是具有1个以上苯环的基团或者具有1个以上叔丁基的基团。
6.权利要求1-5中任意一项所述的组织再生用基材，上述生物体亲和性基团是氨基酸、寡肽、寡糖类或者糖衍生物。
7.权利要求1-6中任意一项所述的组织再生用基材，上述线形分子是聚乙二醇，上述环状分子是α-环糊精，上述水解性键是酯键，具有上述体积庞大的取代基的生物体亲和性基团是苄氧基羰基-L-苯基丙氨酸。
8.权利要求1-7中任意一项所述的组织再生用基材，上述聚轮烷或者上述聚轮烷水凝胶是多孔体。
9.权利要求1-8中任意一项所述的组织再生用基材，其特征在于，对于上述聚轮烷水凝胶，确定上述聚轮烷水凝胶中的聚轮烷的重量比例，使之达到适合于使用状况的分解速度。
10.权利要求1-9中任意一项所述的组织再生用基材，其特征在于，上述聚轮烷水凝胶通过为达到适合于使用状况的分解速度或者分解模式所确定的给定平均分子量的交联用线形分子，将环状分子之间、生物体亲和性基团之间或者环状分子和生物体亲和性基团之间用交联键交联而成。
11.具有下述(a)性质的组织再生用基材，由聚轮烷水凝胶构成，该聚轮烷水凝胶是对于在贯穿了多个环状分子的线形分子的两个末端通过水解性键导入具有体积庞大的取代基的生物体亲和性基团得到的聚轮烷，通过交联用线形分子，以交联键将1分子相邻的聚轮烷中含有的环状分子之间交联形成网状结构得到的物质，(a)聚轮烷水凝胶直至完全水解的时间不依赖于聚轮烷水凝胶中的含水率，伴随着聚轮烷水凝胶中的聚轮烷含量减少，或者伴随着交联用线形分子对环状分子的摩尔比增加，或者伴随着交联用线形分子的平均分子量减少而延长。
12.具有下述(b)性质的组织再生用基材，由聚轮烷水凝胶构成，该聚轮烷水凝胶是对于在贯穿了多个环状分子的线形分子的两个末端通过水解性键导入具有体积庞大的取代基的生物体亲和性基团得到的聚轮烷，通过交联用线形分子，以交联键将1分子相邻的聚轮烷中含有的环状分子之间交联形成网状结构得到的物质，(b)以聚轮烷水凝胶直至完全水解的时间为t∞，将聚轮烷水凝胶浸水后经过的时间为t，初期水膨润状态下的聚轮烷水凝胶重量为M0，在时间t的聚轮烷水凝胶重量为Mt，以t/t∞为横轴，Mt/M0为纵轴描绘图时的分解模式不依赖于聚轮烷水凝胶中的聚轮烷含量，而取决于交联用线形分子的分子量。
13.权利要求11或12所述的组织再生用基材，由聚轮烷水凝胶构成，对于该聚轮烷水凝胶，环状分子是α-环糊精，线形分子是聚乙二醇，水解性键是酯键，交联用线形分子是聚乙二醇二胺，在聚乙二醇二胺的两个末端的NH2基上通过氨酯键将1分子相邻的聚轮烷中含有的α-环糊精的OH基团之间交联形成网状结构而得到。
14.权利要求1-13中任意一项所述的组织再生用基材，用于间质细胞、肝细胞或者神经细胞的培养。
15.一种移植用材料，其特征在于，在权利要求1-14中任意一项所述的组织再生用基材中培养或引入细胞。
16.一种移植用材料的制备方法，其特征在于，通过在权利要求1-14中任意一项所述的组织再生用基材中培养或引入细胞，得到移植用材料。
全文摘要
本发明提供可以进行组织再生，具备组织再建时所需的力学特性并具有组织再建后在生物体内的分解消失特性的组织再生用基材以及使用该基材的移植用材料。本发明的组织再生用基材含有聚轮烷或者聚轮烷水凝胶，其中，该聚轮烷是在贯穿了多个环状分子的线形分子的两末端通过水解性键导入具有体积庞大的取代基的生物体亲和性基团得到的物质，该聚轮烷水凝胶是与该聚轮烷邻接的聚轮烷1分子中含有的环状分子之间、生物体亲和性基团之间或者环状分子和生物体亲和性基团之间通过交联键进行交联形成网状结构得到的物质。
文档编号A61L27/18GK1454100SQ00819864
公开日2003年11月5日 申请日期2000年11月27日 优先权日2000年7月3日
发明者由井伸彦, 大谷亨, 加藤雅一, 山本刚之 申请人:株式会社日本组织工程, 由井伸彦