专利名称：用于胰岛素依赖型糖尿病基因治疗中的重组载体及治疗性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及适用于胰岛素依赖型糖尿病基因治疗中的重组载体，及包含作为有效成分的重组载体的药物组合物。尤其地，本发明涉及一种有效且安全地治疗胰岛依赖型糖尿病的基因治疗系统，其利用了果蝇P-转座子的基因输送能力及K14启动子的组织特异性和表达增强性。
基因治疗为治疗人体疾病提供了一个新范例。确切而言与利用与基因产物相互作用或其自身是基因产物的制剂改变疾病表型不同的是，基因治疗理论上可修饰特异的基因，因而在单次施用之后即可治愈疾病。开始时，基因治疗预想用于治疗遗传疾病，但目前研究其用于治疗广谱疾病，包括癌症，周围血管病，关节炎，神经退化性疾病及其它后天的疾病。另外，与人类基因组计划组合，基因治疗期望在更多的疾病治疗中起重大作用。对基因治疗而言，基因输送至细胞及其在细胞中的表达可人为调节，以便患者的突变的基因可通过基因重组而校正。
现有一些揭示基因治疗的专利，例如，PCT公开号1997-27310要求了一种能用于基因治疗的反转录病毒载体，PCT公开号1997-34009揭示了一种用于通过基因治疗治疗人体肿瘤的重组腺病毒载体。然而病毒载体只限于治疗遗传性疾病，这是从其安全角度及高度复杂的程序而考虑的。对这种患者利用病毒载体的基因治疗耗时较长且花费较高。现有技术中没有揭示非病毒胰岛素载体。
作为所利用的燃料被肝脏过量产生及被其它器官利用的葡萄糖的不正常，糖尿病是一种由胰岛素缺少所引起的代谢疾病。在各种糖尿病类型中，胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)称为I型糖尿病，是由于胰腺产生胰岛素的β细胞自身免疫破坏所致。目前，每年每7,000名儿童中就发生1起糖尿病，IDDM占所有新发生的糖尿病的3％。
目前用于治疗IDDM的方法包括监测血糖，多次注射胰岛素，特殊的饮食及锻炼。尽管严格根据这种深入细致的糖尿病管理措施，仅能期望糖尿病情加重的患者有50-70％减轻。因此，需要开发更好的治疗方法。
作为自我更新组织的表皮及其附属物具有干细胞的区室，每个区室具有充分增殖能力以覆盖机体表面，Greer等(1983)的先驱研究证实人皮肤角质形成细胞可在培养基中连续增殖至几百代，因而用培养的皮肤角质形成细胞进行烧伤植皮手术，该手术目前广泛用于医院外伤科。利用各种不同的能驱动各种分泌产物表达的外源启动子，已证实基因转移至培养的角质形成细胞中。表皮中的角质形成细胞通过复制属于以下两类细胞的细胞而自我更新(1)能延长或无限制地生长的干细胞；及(2)干细胞后代的瞬时扩增细胞，其在经历终末分化之前复制有限次数。干细胞呈缓慢细胞周期且很少能被核苷酸类似物标记，但一旦标记，可保持长期标记。干细胞和瞬时扩增细胞位于表皮基底层的区室中，终末分化的细胞形成分层的基底层上层。干细胞及其后代扩增和终末分化的细胞在称为“表皮增殖单位”的独立空间列阵中簇集。角蛋白14(K14)及其配偶体K5是由表皮及其附属物的活性细胞表达的主要蛋白，且编码这些角蛋白的基因高丰度地在培养的人角质形成细胞中转录。因此，K14与K5启动子是用于角质形成细胞介导的基因治疗的特别感兴趣的候选物。
自从70年代首次发现P转座子包括在杂种败育中，果蝇的P-因子已经被充分研究。报道了一种技术，其中克隆的基因通过用P-转座子可转移至果蝇的胚胎中(Rubin，G.M.，等，科学，1982，218328-353)。但是此技术甚至不能用于同一系的物种。另外，也未报道如本发明所述的将果蝇的转座子导入哺乳动物中。
根据本发明，本发明人对基因治疗进行了深入细致及全面研究，目的在于提供治疗I型糖尿病的更有效，更安全，更简便的基因治疗，从而导致如下发现，即设计用于控制人体胰岛素基因表达的K14启动子基因呈现如下这种组织特异性增强活性，即人胰岛素基因借助于果蝇的转座酶可整合入角质形成细胞染色体中，且胰岛素可由角质形成细胞以足够保持正常血糖水平的量产生。
因而，本发明一个目的在于提供适用于糖尿病基因治疗的非病毒重组胰岛素表达载体。
本发明另一目的在于提供适用于基因治疗的含有编码果蝇的P-转座子的DNA序列的非病毒载体。
本发明另一目的在于提供非病毒重组胰岛素表达载体在治疗糖尿病中的应用。
本发明另一目的在于提了含有编码果蝇的P-转座子的DNA序列的非病毒载体在将基因整合入哺乳动物染色体中的应用。
本发明另一目的在于提供含有编码果蝇的P-转座子的DNA序列的非病毒载体在治疗糖尿病中的应用。
本发明另一目的在于提供一种通过基因治疗治疗糖尿病的方法。
本发明另一目的在于提供一种组合物，其用于胰岛素依赖型糖尿病的基因治疗，其是安全且便于用于人体的。
附图简述
图1a示出具有完整lacZ基因及具有K14启动子(左侧，pUC KZ)和不具有K14启动子(右侧，pUC 4.3Z)的β-半乳糖苷酶表达质粒载体的示意图。
图1b示出能表达果蝇P-转座酶的辅助质粒载体(pπ25.7wcΔ2-3)的示意图。
图2示出在共注射pUC KZ及辅助质粒载体之前及之后，鼠皮肤组织的显微照片。随着注射后的时间(1天至20周)，鼠皮肤组织呈现不同的蓝色，这是皮肤组织中表达自质粒的β-半乳糖苷酶与X-gal反应的结果。
图3示出在共注射pUC KZ及辅助质粒载体之前及之后，鼠皮肤组织的显微照片，组织用X-gal(左栏A，C，E，G)或用苏未精/伊红(右栏B，D，F，H)染色。与正常皮肤组织(上面一组)相对比，共注射后随着时间，共注射的皮肤组织观测到有更多的β-半乳糖苷酶积累(1天第二组，1周第三组，4周底部一组)，如由X-gal染色所证实。H/E染色清楚地阐明表达β-半乳酶基因的细胞是角质形成细胞。在照片中，箭头表示β-半乳糖苷酶的表达。
图4是PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳的照片。PCR产物扩增自基因组DNAs，该DNAs是在共注射pUC KZ及辅助载体之后的第5天(3泳道)，1周(4泳道)，2周(5泳道)，3周(6泳道)及4周(7泳道)制备的。将PCR产物与作为阳性对照的pUC KZ(1泳道)，作为阴性对照的基因组DNA(2泳道)，及标记(M)一起电泳，以证实通过转座酶的酶促作用，β-乳糖苷酶基因整合入染色体中。
图5是Southern印迹放射自显影图，示出靶鼠组织中β-半乳糖苷酶基因的染色体整合。基因组DNAs从共注射pUC KZ和辅助质粒载体之后第5天(3泳道)，1周(4泳道)，2周(5泳道)，3周(6泳道)，4周(7泳道)，5周(8泳道)，及6周(9泳道)的皮肤样品中制备。为了对比，加样200ng的pUC KZ作为阳性对照(1泳道)，制各自未注射的正常小鼠皮肤样品的基因组DNA用作阴性对照(2泳道)。
图6是示出本发明胰岛素表达质粒载体pUCK14-INS的示意图。
图7是编码包含在胰岛素表达质粒载体pUCK14-INS中的K14启动子和人胰岛素的碱基序列。
图8示出直方图，其中小鼠血糖水平是根据在用65mg/kg(a)和200mg/kg(b)的链脲菌素处理诱导的糖尿病小鼠中pUCK14-INS的给药剂量而测定的。
图9中示出放大12.5倍(上面一组A，B，C)，40倍(D)，200倍(E)，和400倍(F)的小鼠胰腺显微照片，在正常胰腺(A)中，观测到郎氏(Langerhans)胰岛分布在血管周围。在放大倍数更高的照片中(D，E，F)正常郎氏胰岛可看得更清楚。相反，在糖尿病小鼠的胰腺(B)中郎氏胰岛减少或消失。在另一小鼠的胰腺(C)中，观测到郎氏胰岛被破坏，该小鼠在诱导为糖尿病之后，其血糖水平通过注射胰岛素表达载体(pUCK14-INS)降至正常范围。
图10示出未处理的正常小鼠(最左侧)，糖尿病小鼠(中间)，及注射载体的正常小鼠(最右侧)的郎氏胰岛显微照片，它们均用抗胰岛素抗体(上面一组)，抗胰高血糖素抗体(中间一组)及抗促生长素抑制素抗体(下面一组)免疫染色。
本发明涉及一种基因治疗系统，其能向哺乳动物染色体输送相应的基因。特别地，此基因治疗系统用于治疗胰岛素依赖型糖尿病，为此利用的K14启动子在整合相应基因至靶组织的染色体中的组织特异性及增强活性。同样，根据本发明，果蝇的P-转座子也用于基因的染色体整合。
因此，通过K14启动子的组织特异性与转座酶的酶促活性的协同作用，可将基因整合入靶组织的染色体中。为证实染色体整合，选择β-半乳糖苷酶作为报道基因，因为β-半乳糖苷酶基因的表达可通过X-gal染色而轻易可见。
首先，构建两个哺乳动物表达质粒一个含有与人K14启动子基因相连的lac Z基因；另一个含有lac Z基因而无K14启动子基因，如图1a所示。为此，将人K14启动子基因插入pUChsneo中的EcoRI位点，然后得自cpwβ-22的4.3kb的lac Z基因插入相同质粒的BamHI和SalI之间。所得质粒称为pUC KZ。另外，将等长lac Z基因插入pUChsneo中，此重组质粒称为pUC 4.3Z。通过电穿孔转染入E.coli后，制备质粒DNAs并用限制酶酶切以证实基因亚克隆。同样，P-因子转座酶基因插入pπ25.7wcΔ2-3的ORF2和ORF3之间的内含子中，如图1b所示，以构建能使相应基因整合入染色体中的辅助载体。
接下来，哺乳动物转染要求大量浓缩的高纯度的质粒DNA。一可商购的质粒DNA制备试剂盒，例如QIAGEN质粒最大试剂盒(QIAGEN GmbH，德国)，用于此目的。在本发明中，哺乳动物转染通过脂质体介导而达到，适于脂质体介导的基因输送的试剂也可购买，例如GenePORTERTM转染试剂(GTS公司，San Diego，CA，美国)。在使用之前，此试剂用0.75ml的水合缓冲液在室温水合并旋动。将各种浓度的质粒DNAs与各种体积的试剂组合以制备DNA/脂质体复合物。向此复合物中加入辅助载体的40％(w/v)稀释的DNA溶液，随后加入1体积的GenePORTERTM。所得溶液加入PBS至终体积为130μl，并在使用前在室温培养30分钟。
用无针喷射注射器如Mada Medical Products公司生产的注射器，通过加压注射对10-12周龄的小鼠施用各种浓度的DNA/脂质体复合物。被给药的小鼠在应用DNA之后的第1天至20周通过颈部关切错位处死，并从注射DNA的皮肤区域立即取样品。
为评定lac Z基因在皮肤组织中的表达，将组织样品浸泡在X-gal溶液中，在X-gal染色之前，此组织样品用PBS洗涤并在固定剂中固定。X-gal溶液优选在即将使用前制备。
接下来，将由于在X-gal中染色而呈不同深浅的蓝色的皮肤样品用PBS洗涤2次，随后在福尔马林中固定。此固定物能保持活组织的形态以进行H/E染色。福尔马林，最常用的固定剂之一，使核酸与蛋白质交联，由此使分子呈刚性且可被机械剪切。固定的持续时间优选16小时至3天。然后，对固定的组织样品进行常规H/E染色。为此，进行组织样品的石蜡包理，切片及封固。优选地，将此组织样品近可能地封固在玻片的中心。切片要求薄于10μm，因为较厚的切片难以观测。
lacZ基因整合入靶组织的染色体可通过PCR筛选及Southerm印迹分析证实。
为此，基因组DNA首先从注射载体处的鼠皮肤(直径2cm)中制备。用弯剪将鼠皮肤剪成碎片并在tail tip缓冲液(60mM Tris PH8.0，100mM EDTA，0.5％ SDS)中充分切碎。在用RNase A和蛋白酶K处理后，将鼠皮肤样品离心。应用苯酚提取法从上清中沉淀基因组DNA。
用此基因组DNA作模板进行PCR。为检测lacZ区，可从包括lacZ基因的E.coli HB101中产生引物。PCR产物长度期望是3110bp。
以如上相同方式，从注射载体的腹部皮肤处制备基因组DNA，该处皮肤在应用载体时被标记。此基因组DNA在1×TAE缓冲液中于琼脂糖凝胶上电泳，并移至膜上，接着在80℃干燥2小时。使转移的DNAs与[α-32P]dCTP-标记的探针在杂交缓冲液(5×SSC，1/20稀释的液体封阻剂，0.1％SDS，5％硫酸右旋糖酐)中杂交。然后，用洗涤缓冲剂将此膜洗多次并进行放射自显影分析。
在以上验中，发现lacZ基因稳固地整合入角质形成细胞的染色体中，并通过果蝇的P-转座酶和K14启动子的协同作用而强表达。
当研究人胰岛素基因时，发现这些结果也是如此。
为构建含有K14启动子基因的胰岛素表达质粒载体，用人前胰岛素原基因和K14启动子区的已知碱基序列产生两对PCR引物，并用于用人基因组DNA作模板经PCR扩增基因。这两个PCR产物，前胰岛素原基因和K14启动子基因串联插入pUChsneo中的Sal I位点。所得胰岛素表达载体称为pUCK14-INS。
此胰岛素表达重组载体pUCK14-INS在2001年1月5日保藏在韩国生物科学及生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心，保藏号KCTC 0928BP。
为证实基因的克隆，扩增胰岛素表达载体并用ABI Prism 377XL(PE，美国)进行碱基测序。
为使小鼠糖尿病化，将链脲菌素(STZ)以总剂量为65mg/kg和200mg/kg分10次施用于小鼠。用Super GlucocardTM试剂盒(Arkary KDK Corp.，Kyoto，日本)确定血糖水平。将一滴得自尾部的血液样品置于Glucocard试条顶部。此试条的反应室自动通过毛细管作用将血液吸入试条内部。当反应室充满时，该Glucocard试剂盒开始测定血糖水平。样品中的葡萄糖和试条中葡萄糖氧化酶及铁氰化钾反应，产生与血液样品中的葡萄糖浓度成比例的铁氰化钾。铁氰化钾的氧化产生电流，其然后用仪表转换以显示葡萄糖浓度。
为免疫染色胰腺β细胞，将6只小鼠通过颈关节错位处死，收集其胰腺并在10％福尔马林固定剂中固定，这6只小鼠中1只是正常的，2只糖尿病小鼠分别注射了65mg/kg和200mg/kg STZ，另3只小鼠注射了1μg，50μg和100μg胰岛素表达载体。为观测正常胰腺及糖尿病胰腺中郎氏胰岛的分布情况，如上所述对组织样品进行H/E染色，石蜡包埋，切片及封固。用抗体，包括抗胰岛素抗体，抗胰高血糖素抗体，及抗促生长素抑制素抗体，对β细胞产生胰岛素的能力进行定量分析。
通过以下实施例对本发明可有一步理解，以下实施例只是举例说明本发明，而非限制本发明。
实验实施例1在鼠皮肤中的β-半乳糖苷酶基因表达第一步构建β-半乳糖苷酶表达载体将人K14启动子基因插入pUChsneo的EcoRI位点，随后在紧邻克隆的K14启动子位点的该质粒BamHI和SalI位点之间加入得自cpwβ-22的4.3kb的lacZ基因。所得质粒称为pUC KZ，如图1a(左侧)所示。另外，只将全长lacZ基因克隆入pUChxsheo中以制备pUC 4.3Z，如图1a(右侧)所示。在转染入E.coli之后，通过苯酚/氯仿/异戊醇纯化这个两个质粒DNAs，并通过限制酶切作图证实。测试含有lacZ基因的这两个质粒DNAs的K14启动子活性。
第二步构建辅助载体为补偿pUCshneo不能自我转座入染色体中，构建辅助载体，该载体锚定P-因子转座酶基因。为此，在辅助质粒pπ25.7wcΔ2-3的ORF2和ORF3之间的内含子进行操作，以便具有产生转座酶的能力，如图1b所示。
第三步制备DNA/脂质体复合物将在第一步制备的β-半乳糖苷酶表达载体用QIAGEN质粒大试剂盒(QIAGEN GmbH，德国)纯化，并将GenePORTERTM转染试剂与0.75ml水合缓冲液在室温水合。将各2μg，5μg，10μg，50μg和100μg纯化的质粒DNA与各5μl，10μl，20μl的脂质体组合，以制备DNA/脂质体复合物。向这些稀释的DNA溶液中，加入能表达果蝇的P-转座酶的辅助质粒，加入量为40％(w/v)纯化的质粒DNA，随后加相同体积的GenePORTERTM转染试剂。在用PBS试剂稀释后，所得溶液在室温培养30分钟。
第四步将DNA注射至小鼠中用无针喷射注射器(Madajet XL)将在第三步制备的DNA/脂质体复合物注射入小鼠的后腿，小鼠是平均体重大约为26g的10-12周龄小鼠。在施用DNA后第1天到第20周的预定时间，将小鼠以颈关节错位处死，剔净处理区域的外皮，用无菌外科剪剪下而收集样品。
第五步X-gal染色在第四步获得的皮肤样品用PBC洗2次，并在固定剂(含有2％低聚甲醛，0.2％戊二醛的0.1M磷酸钠缓冲洗，pH7.3)中在4℃固定30分钟，将样品在37℃在X-gal溶液(1.3mM MgCl2，3mMK4Fe(CN)6，3mM Fe3(CN)6，1mg/ml X-gal，0.1M磷酸钠缓冲剂，PH7.3)中浸泡3小时，该溶液在即将使用前制备。为进行对比，以相同方式制备注射只含脂质体的PBS溶液的对照鼠样品，分析lacZ在皮肤组织中的表达。
在显微镜下观察到lacZ在注射无K14启动子的质粒载体之后第5天仅低水平表达，如在X-gal染色中的微弱的蓝色所示。相反，共注射具有K14启动子区域的pUC KZ载体，发现能使β-半乳糖苷酶基因强表达，如在X-gal染色后20周的样品中发现深蓝色，如图2所示，另外，在注射pUC KZ之后，发现K14启动子的组织特异性增强。
第六步H/E(苏木精/伊红)染色在X-gal溶液中反应表达蓝斑点的皮肤样品用PBS洗2次并在福尔马林中固定以进行H/E(苏木精/伊红)染色，在固定16小时至3天后，用常规H/E染色法对厚度低于10μm的切片进行染色。
结果示于图3，发现X-gal反应物以蓝斑点或扩散形式围绕在核周围。图3还示出，由于组织特异性所致，β-半乳糖苷酶基因在角质形成细胞层中表达强烈，并在注射后第4天至5～6周持续表达。
第七步制备鼠基因组DNA把鼠皮肤切成碎片并充分切碎在少量tail tip缓冲液(60mM TrisPH8.0，100mM EDTA，0.5％ SDS)中形成浆状。在加入600μl tailtip缓冲液并用RNase A(20m/ml)处理后，在37℃培养30分钟，加入500μg/ml浓度的蛋白酶K，在50-55℃反应。将此反应物以1200rpm在20℃离心15分钟。在再次离心之前将所得三层中的中间层除去。在用苯酚/氯仿提取3次及用氯仿提取1次之后，将上清在20℃以10000rpm离心15分钟。向分离的水相中加入1/10体积的3MNaOAc，PH5.2，及等体积的95％EtoH以沉淀DNA。将干燥的沉淀物再溶于TE缓冲液(pH7.4)中，并测定此TE溶液的1/5000稀释液在260nm的O.D。
第八步进行PCR筛选证实β-半乳糖苷酶基因的染色体整合如第七步所述相同方式，从取自注射后第5天至4周的注射区域(直径2cm)的鼠皮肤样品中纯化基因组DNA。为证实在注射后β-半乳糖苷酶基因在染色体中的整合，合成以下引物，设计产生3110bp的PCR产物。在下表1所述条件下进行PCR。
LacZ正向引物-5’TCACTCTAGAAACAGCTATGA 3’LacZ反向引物-5’TCGACCCGGTTATTATTA 3’表1在基因组DNA中扩增lacZ的PCR条件
扩增的5个样品分别取自注射含有β-半乳糖苷酶基因的载体后第5天，1周，2周，2周，3周及4周的皮肤样品，这5个PCR产物通过凝胶电泳均发现大约3100bp长。示于图4的电泳数据表明β-半乳糖苷酶基因插入染色体。
第九步进行Southern印迹分析证实β-半乳糖苷酶基因的染色体整合为用于Southern印迹分析，以如第七步所述相同方式得自注射β-半乳糖苷酶表达载体后的鼠皮肤的基因组DNA被纯化。为进行对照，制备自未处理的小鼠及注射pUC KZ的小鼠的基因组DNA样品分别用作阴性及阳性对照。
这些基因组DNAs在1×TAE缓冲液中在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，并将各个分离的DNAs移至Hybond N+膜上。在80℃烘干2小时，印迹的DNAs与[α-32p]dcTP标记的探针在杂交缓冲液(5×SSC，1/20稀释的液体封阻剂，0.1％SDS，5％硫酸右旋糖酐)中杂交。接下来，将此膜用洗涤缓冲液(2×SSC，0.1％SDS)在42℃洗10分钟，最后用缓冲液(1×SSC，0.1％SDS)在65℃洗二次，每次10分钟。
图5示出放射自显影分析。如放射自显影所示，尽管在得自给药第5天及1周后处死的小鼠的样品的泳道中条带不清晰，但通过共注射辅助载体2～5周后得到的基因组DNAs的清晰条带示出的表达的转座酶的酶促活性表明β-半乳糖苷酶成功整合入鼠染色体中。
实施例1构建胰岛素载体通过人前胰岛素原基因和K14启动子区的已知碱基序列，设计两对PCR引物，如下表2所示，并用于通过PCR扩增基因。将两个PCR产物，前胰岛素原基因及K14启动子基因，分别亚克隆入pUChsneo和pGEM T-easy中，随后将它们串联插入pUChsneo中的Sal I位点。所得胰岛素表达载体称作pUCK14-INS。
表2 胰岛素基因及K14启动子的PCR引物
胰岛素表达重组载体pUCK14-INS2001年1月10日保藏在韩国生物科学及生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心，保藏号KCTC 0928P。
实施例2胰岛素表达载体的碱基序列分析实施例1中制备的胰岛素表达载体用QIAGEN质粒mini(QIAGEN，Valencia，CA，美国)纯化，并用ABI Prism 377 XL(PE，美国)进行序列分析。K14启动子及前胰岛素原基因的碱基序列见于图7所示。如图所示，K14启动子区在Sac I位点与胰岛素基因相连，该胰岛素基因由3个胰岛素肽部分，即胰岛素原肽B、胰岛素原肽C及胰岛素原肽A，和C链中790bp的内含子组成。
实施例3诱导小鼠糖尿病及给予胰岛素表达载体后血糖变化将总剂量为65mg/kg和200mg/kg的链脲菌素(STZ)分10次经皮下注射施用于小鼠诱导糖尿病。在即将注射之前，将STZ溶于冷0.1M柠檬酸缓冲液(PH4.5)中。在注射STZ 4天后，将胰岛素表达载体以1μg，2μg，3μg，10μg，50μg和100μg的剂量注射入每组诱导的糖尿病小鼠，每组有4只小鼠。每4天交替注射一次STZ和胰岛素表达载体。监测糖尿病小鼠的血糖水平。
用Super GlucocardTMII试剂盒(Arkary KDK Corp.Kyoto，日本)测定血糖水平。其中，血液样品取自尾部，并将一滴血置于Glucocard试条的顶部。
每2小时监测血糖的结果显示，测定的正常血糖水平在65mg/dl至145mg/dl范围，一天之内平均值为105mg/dl。在每次注射及给药后测定的血糖水平见表3至表5所示，并如图8a和8b所示。
如上所述，胰岛素表达载体以剂量依赖方式降低血糖水平。用胰岛素及STZ交替处理方法导致血糖水平的波动。然而，血糖水平增加值在后几轮交替用65mg/kg的STZ及胰岛素表达载体的处理中比初始几轮处理的要低，而胰岛素表达载体降低血糖水平的作用在全部处理中持续保持。以200mg/kg的剂量施用STZ的一组小鼠在相对短的一段时间内呈高血糖症。在这种情况下，注射胰岛素表达载体也导致以剂量依赖型降低血糖。
表3.由STZ导致的糖尿病小鼠的血糖水平
表4.由65mg/kg STZ处理的糖尿病小鼠血糖水平变化
表5.由200mg/kg STZ处理的糖尿病小鼠血糖水平变化
*血糖水平保持在85-120mg/dl，且不超过320mg/dl。
实施例5郎氏胰岛的免疫组织化学一只正常小鼠，2只注射65mg/kg和200mg/kg的STZ的糖尿病小鼠，及3只注射1μg，50μg和100μg胰岛素表达载体的小鼠通过颈关节错位处死，并收集它们的胰腺在10％福尔马林固定剂中固定。为定量分析β细胞产生胰岛素的能力，用抗体对固定的胰腺进行免疫染色及H/E(苏木精/伊红)染色，所用抗体包括抗胰岛素抗体，抗胰高血糖素抗体，及抗促生长素抑制素抗体。
在染色之后，对胰腺进行照相，结果示于图9。如图9所示，在正常小鼠胰腺中平均10个郎氏胰岛分布在血管周围，而在糖尿病小鼠中，它们几乎完全消失，或者如果发现有的话，是以非常收缩的形式存在。对血糖水平在注射胰岛素表达载体之后恢复到正常水平的小鼠而言，在其胰腺中发现极少或未发现郎氏胰岛。另外，它们的胰腺形态被破坏。为测试三种胰腺细胞-α，β，和δ细胞中的哪一种组成胰岛，用抗胰岛素抗体，抗胰高血糖素抗体及抗促生长素抑制素抗体对胰腺进行免疫分析。如图10所示，在显微镜下观察到几乎没有β细胞存在，反而是α细胞主要占据糖尿病小鼠胰腺中的β细胞的空间，δ细胞位于周边。因而可总结出在用STZ诱导糖尿病后通过注射胰岛素表达载体而使其血糖水平正常化的小鼠中，从其中注射的载体表达胰岛素基因的角质形成细胞负责保持正常血糖水平，取代了胰腺产生胰岛素的细胞行使作用。
总而言之，得自以上实施例的数据表明含有果蝇的P-因子序列的辅助载体，能辅助胰岛素基因有效地整合入角质形成细胞的染色体中。另外，当与K14启动子基因一起掺入染色体中时，发现胰岛素基因在体内强表达，从而发挥其保持正常血糖水平的激素活性。进一步地，与常规逆转录病毒输送系统相反，本发明的非病毒胰岛素载体是安全及简便的。因而，本发明非常有用于治疗糖尿病，对基因治疗领域起巨大推进作用。
本发明以例证方式阐述，且应知所用术语是描述性而非限制性的。根据以上教导可对本发明做一些修改及变化。因而应知在所附权利要求范围内，本发明可以与本文不同方式实施。
权利要求
1.一种制备胰岛素表达载体的方法，其中将胰岛素基因和K14启动子基因一起插入pUChsneo，该胰岛素基因通过使用以下序列I代表的一对胰岛素引物从人基因组DNA中扩增，该K14启动子基因通过以下序列II代表的一对K14启动子引物扩增胰岛素正向引物5′CCTGCCTGTCTCCCAGAGCTCTGTCCTTCT 3′胰岛素反向引物5′GCAGGGCTGGTTCTAGAGCTTTATTCCATC 3′(I)K14启动子正向引物5′ATTGCTGAAGTTTTGATCTAGACACCTCCA 3′K14启动子反向引物5′CTGAGTGAAGAGAAGGAGCTCGGGTAAATT 3′ (II)
2.根据权利要求1的方法构建的一种非病毒胰岛素表达载体pUCK14-INS，保藏号KCTC 0928BP。
3.编码胰岛素表达载体pUCK14-INS的K14启动子和人胰岛素基因的碱基序列，由以下序列代表K14 启动子 5′---------→ATTGCTGAAG TTTTGATATA CACACCTCCA AAGCAGGACC AAGTGGACTC------------------------------------------------------CTAGAAATGT CCCCTGACCC TTGGGGCTTC AGGAGTCAGG GACCCTCGTG------------------------------------------------------TCCACCTCAG CCTTGCCCTT GCACAGCCCA GCTCCACTCC AGCCTCTACT------------------------------------------------------CCTCCCCAGA ACATCTCCTG GGCCAGTTCC ACAAGGGGCT CAAACGAGGG------------------------------------------------------CACCTGAGCT GCCCACACTA GGGATGTTCT GGGGGTCTGA GAAGATATCT------------------------------------------------------GGGGCTGGAA GAATAAAAGG CCCCCCTAGG CCTGTTCCTG GATGCAGCTC------------------------------------------------------CAGCCACTTT GGGGCTAAGC CTGGGCAATA ACAATGCCAA CGAGGCTTCT------------------------------------------------------TGCCATACTC GGTTTACAAA ACCCTTTACA TACATTGTCG CATTGGATTC------------------------------------------------------TCAGAGCTGA CTGCACTAAG CAGAATAGAT GGTATGACTC CCACTTTGCA------------------------------------------------------GATGAGAACA CTGAGGCTCA GAGAAGTGCG AAGCCCTGGG TCACAGAGGC------------------------------------------------------GTAAATGCAG AGCCAGGACC CACCTGAAGA CCCACCTGAC TCCAGGATGT------------------------------------------------------TTCCTGCCTC CATGAGGCCA CCTGCCCTAT GGTGTGGTGG ATGTGAGATC------------------------------------------------------CTCACCATAG GGAGGAGATT AGGGTCTGTG CTCAGGGCTG GGGAGAGGTG------------------------------------------------------CCTGGATTTC TCTTTGATGG GGATGTTGGG GTGGGAATCA CGATACACCT------------------------------------------------------GATCAGCTGG GTGTATTTCA GGGATGGGGC AGACTTCTCA GCACAGCACG------------------------------------------------------GCAGGTCAGG CCTGGGAGGG CCCCCCAGAC CTCCTTGTCT CTAATAGAGG------------------------------------------------------GTCATGGTGA GGGAGGCCTG TCTGTGCCCA AGGTGACCTT GCCATGCCGG------------------------------------------------------TGCTTTCCAG CCGGGTATCC ATCCCCTGCA GCAGCAGGCT TCCTCTACGT------------------------------------------------------GGATGTTAAA GGCCCATTCA GTTCATGGAG AGCTAGCAGG AAACTAGGTT------------------------------------------------------TAAGGTGCAG AGGCCCTGCT CTCTGTCACC CTGGCTAAGC CCAGTGCGTG------------------------------------------------------GGTTCCTGAG GGCTGGGACT CCCAGGGTCC GATGGGAAAG TGTAGCCTGC------------------------------------------------------AGGCCCACAC CTCCCCCTGT GAATCACGCC TGGCGGGACA AGAAAGCCCA------------------------------------------------------AAACACTCCA AACAATGAGT TTCCAGTAAA ATATGACAGA CATGATGAGG------------------------------------------------------CGGATGAGAG GAGGGACCTG CCTGGGAGTT GGCGCTAGCC TGTGGGTGAT------------------------------------------------------GAAAGCCAAG GGGAATGGAA AGTGCCAGAC CCGCCCCCTA CCCATGAGTA------------------------------------------------------TAAAGCACTC GCATCCCTTT GCAATTTACC CGAGCTCTGT CCTTCTGCCA----------------------------------Sac I --------------TGGCCCTGTG GATGCGCCTC CTGCCCCTGC TGGCGCTGCT GGCCCTCTGG------------------------------------------------------GGACCTGACC CAGCCGCAGC CTTTGTGAAC CAACACCTGT GCGGCTCACA---------------------------- B chain ----------------CCTGGTGAAG CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT TCTTCTACAC------------------------------------------------------ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGGTGAG CCAACCGCCC-------------- C chain -------------------------------ATTGCTGCCC CTGGCCGCCC CCAGCCACCC CCTGCTCCTG GCGCTCCCAC------------------------------------------------------CCAGCATGGG CAGAAGGGGG CAGGAGGCTG CCACCCAGCA GGGGGTCAGG------------------------------------------------------TGCACTTTTT TAAAAAGAAG TTCTCTTGGT CACGTCCTAA AAGTGACCAG------------------------------------------------------CTCCCTGTGG CCCAGTCAGA ATCTCAGCCT GAGGACGGTG TTGGCTTCCG-----------------------------------------------------GGCAGCCCCGA GATACATTAG AGGGTGGGCA CGCTCCTCCC TCCACTCGCC------------------------------------------------------CCCCTCAAAC AAATGCCCCG CAGCCCATTT CTCCACCCTC ATTTGATGAC------------------------------------------------------CGCAGATTCA AGTGTTTTGT TAAGTAAAGT CCTGGGTGAC CTGGGGTCAC------------------------------------------------------AGGGTGCCCC ACGCTGCCTG CCTCTGGGCG AACACCCCAT CACGCCCGGA------------------------------------------------------GGAGGGCGTG GCTGCCTGCC TGAGTGGGCC AGACCCCTGT CGCCAGGCCT------------------------------------------------------CACGGCAGCT CCATAGTCAG GAGATGGGGA AGATGCTGGG GACAGGCCCT------------------------------------------------------GGGGAGAAGT ACTGGGATCA CCTGTTCAGG CTCCCACTGT GACGCTGCCC------------------------------------------------------CGGGGCGGGG GAAGGAGGTG GGACATGTGG GCGTTGGGGC CTGTAGGTCC------------------------------------------------------ACACCCAGTG TGGGTGACCC TCCCTCTAAC CTGGGTCCAG CCCGGCTGGA------------------------------------------------------GATGGGTGGG AGTGCGACCT AGGGCTGGCG GGCAGGCGGG CACTGTGTCT------------------------------------------------------CCCTGACTGT GTCCTCCTGT GTCCCTCTGC CTCGCCGCTG TTCCGGAACC------------------------------------------------------TGCTCTGCGC GGCACGTCCT GGCAGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGGGG---------------------------------- C chain -----------CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA------------------------------------------------------AGCGTGGCAT TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG------ A chain ---------------------------------------CTGGAGAACT ACTGCAACTA GACGCAGCCT GCAGGCAGCC CCACACCCGC------------------------------------------------------CGCCTCCTGC ACCGAGAGAG ATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGCCCTGC---------------------------------------------------←--------- 胰岛素 3′引物
4.一种适用于治疗胰岛素依赖型糖尿病的治疗性组合物，包括一种作为治疗有效成分的混合物，该混合物由权利要求2的非病毒胰岛素表达载体与脂质体的复合物及含有果蝇的P-因子序列的辅助载体组成。
5.一种将基因整合入哺乳动物染色体中的方法，其中使用果蝇的P转座酶。
全文摘要
本发明公开了用于胰岛素依赖型糖尿病的基因治疗中的重组载体和治疗性组合物。以脂质体介导方式将具有K14启动子基因的β－半乳糖苷酶表达载体与果蝇P转座酶表达辅助载体一起注射进鼠皮肤后,测得该酶基因在角质形成细胞层表达。因具有增强效果和组织特异性,K14启动子用于在角质形成细胞中表达人胰岛素基因,提示了胰岛素依赖型糖尿病的新基因治疗方法。当与P－因子表达辅助载体组合将具有K14启动子的人胰岛素表达载体注射进缺少胰腺β－细胞的糖尿病小鼠皮肤中时,小鼠血糖水平保持在正常范围。
文档编号A61K35/56GK1366062SQ01104370
公开日2002年8月28日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年1月15日
发明者徐东祥 申请人:徐东祥