专利名称：一种用幽门螺杆菌感染小鼠的方法
技术领域：
本发明属微生物学和实验动物学领域，具体涉及一种用幽门螺杆菌感染小鼠的方法。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)为革兰阴性菌，是胃炎和胃溃疡的主要病因，亦与胃癌密切相关。人是HP感染的唯一易感宿主；胃粘膜则为细菌的主要定植部位。在发达国家，HP感染率为40％-50％；而在发展中国家则为60％-90％。感染率随年龄增加而有所增长。为此，各国学者正在通过建立HP感染的动物模型，进行HP致病机制和特异性防治的研究。
为了寻觅敏感动物，Sturegard等用HP感染豚鼠，分别在3周和7周处死动物，取胃粘膜作HP分离，29份标本中有22份为HP培养阳性。缺点是豚鼠价贵、胆小和厌食易死亡。Kimura和Karita等用HP感染裸鼠，出现较高的感染率，但裸鼠伴有免疫系统缺陷，不适用于致病、免疫和疫苗等的研究。Wang和Marchetti等研究小组，用口服109/ml HP感染小鼠(CD1、Balb/c A及Balb/c)，但感染率不高，且不稳定。其他动物有恒河猴、沙鼠和悉生小猪等，虽有感染成功的报道，但存在价贵、量少、饲养条件高等限制因素。
国内对HP动物模型的研究，亦选用雪貂、沙鼠、大鼠和小鼠，但还存在感染成功率不稳定，故不能将其作为动物模型用于检测和药物筛选等用。
目前上述研究常用的感染途径为口服HP，感染剂量为108-109/mlHP量。感染前预处理动物的方法常采用①用去氧胆酸钠、消炎痛等药物破坏胃粘膜，造成胃溃疡；②口服碳酸氢钠中和胃酸，或用甲氰咪胍抑制胃酸分泌，以促进HP定植。
确定HP感染成功的主要方法是以HP分离培养作为“金标准”；尿素酶等生化反应为常用鉴定方法；抗体检测和胃粘膜病理变化为辅助判断。
本发明的目的是提供一种用幽门螺杆菌感染小鼠的方法。通过HP感染Balb/c，建立实验动物模型，用于HP致病机制和特异性防治的研究和抗HP药物(包括中草药)的筛选及疗效观察。
本发明的技术方案主要是通过动物感染法来实现的，感染动物的方法如下1、通过动物感染法采用HP选择培养基，筛选HP临床分离株和鼠胃组织HP，其中HP培养基的主要成分及含量为万古霉素 5～12mg/L两性霉素B 2～4mg/L萘啶酮酸10～20mg/L多粘菌素B 2000～2800IU/LTTC 35～45mg/L(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)。
2、用临床分离菌株直接注射Balb/c鼠胃。
3、鼠胃组织HP分离、鉴定。
4、鼠胃组织病理切片鉴定。
本发明经手术法感染后14、28、35和42天处死小鼠，取胃组织作HP分离与鉴定。结果显示HP感染率极高。表1为Balb/c小鼠胃活检组织分离结果。表1
接种后35和42天，HP分离阳性率为100％。综合4次实验，在48份胃组织中，HP分离培养阳性为45/48，阳性率高达93.85％。
多次实验证明，HM-HP适应鼠胃生长，且感染方法稳定，重复性好。
实施例1建立HP感染实验动物模型(1)用动物感染法筛选HP临床分离株从临床诊断为胃炎和胃溃疡的病人，取胃活检组织分离培养，采用HP选择培养基，其主要成分及含量为万古霉素8mg/L、两性霉素B3mg/L萘啶酮酸、15mg/L、多粘菌素B2400IU/L、TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)40mg/L。该培养基的主要成分与弯曲菌培养基组合，为分离HP最佳培养基。经培养获7株HP菌株。选4株分别接种Balb/c小鼠，每株感染4只小鼠，2周后取胃组织分离HP，其中3株HP感染的鼠胃标本，HP分离均为阴性，1株则为阳性，命名为HM-HP。
(2)HM-HP菌株感染Balb/c选择6-8周龄Balb/c，在接种前禁食24小时。在严格无菌条件下打开腹腔，用镊子取出鼠胃，再用微血管钳夹在十二指肠与胃幽门连接区，从胃窦部注射0.2ml HP菌液(细菌数为109/ml)至胃内，使HP在胃内潴留40min后，取出微血管钳，缝合腹部切口。置温室饲养。分别于接种后14、28、35和42天，经腋动脉放血处死小鼠，取胃组织作HP分离和病理切片。
(3)鼠胃组织HP分离与鉴定将鼠胃组织在HP选择培养平板局部涂抹，通过分区划线接种于平板表面，置37℃微需氧环境(5％O2、7％CO2、8％H2和80％N2)培养4天左右作如下鉴定观察菌落HP菌落为0.2-0.4mm大小；圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐；菌落表面有金黄色光泽。
革兰染色HP呈红色，为革兰阴性菌；排列为弧状、S状或海鸥状。
生化反应HP尿素酶试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验均为阳性；马尿酸水解试验则为阴性。
(4)鼠胃组织病理切片鉴定切片后作HE染色观察病理变化。炎症特点为单核细胞浸润。
实施例2
为了证实HP动物模型可用于药物疗效观察，筛选抗菌药物，实验选用已知抗HP药物阿莫西林，试用于治疗HP实验感染的Balb/c。结果显示，实验小鼠口服阿莫西林(剂量为110μg/g体重)，连续5天，10只小鼠胃组织HP分离均为阴性；口服生理盐水的10只对照小鼠，胃组织HP分离则均为阳性。表2为阿莫西林治疗HP感染小鼠结果。
表2
本发明感染方法稳定，重复性好，还可用于HP疫苗的研制和开发研究清除和预防HP感染的微生态调节剂等。
权利要求
1.一种用幽门螺杆菌感染小鼠的方法，其特征在于采下述步骤(1)采用HP选择培养基筛选HP临床分离株，其中HP培养基的主要成分及含量为万古霉素 5～12mg/L两性霉素B 2～4mg/L萘啶酮酸 10～20mg/L多粘菌素B2000～2800IU/LTTC 35～45mg/L(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)。(2)用临床分离菌株做胃部直接感染Balb/c。(3)鼠胃组织HP分离、鉴定。(4)鼠胃组织病理切片鉴定。
2.按权利要求1所述的一种用幽门螺杆菌感染小鼠的方法，其特征在于所述的HP选择培养基主要成分及含量为万古霉素8mg/L、两性霉素B3mg/L、萘啶酮酸15mg/L、多粘菌素B2400IU/L、TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)40mg/L。
3.按权利要求1所述的一种用幽门螺杆菌感染小鼠的方法，其特征在于所述的胃部直接感染方式为从胃窦部注射菌液至胃内。
全文摘要
本发明属微生物学和实验动物学领域,具体涉及一种用幽门螺杆菌感染小鼠的方法。本发明主要通过HP感染实验动物的方法,采用HP选择培养基筛选临床分离株后,直接感染Balb/c鼠胃,实验证实本方法稳定、重复性好,通过本方法建立的实验动物模型,可用于HP致病机制和特异性防治研究以及抗HP药物的筛选、疗效观察和HP疫苗研制等。
文档编号A61K35/74GK1304729SQ0110511
公开日2001年7月25日 申请日期2001年1月9日 优先权日2001年1月9日
发明者钱利生, 严英, 王文凤 申请人:复旦大学