专利名称：柿叶多糖及其生物活性的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物多糖提取及它的生物活性，更具体地说是柿树多糖及它的降血糖作用。
诸如肝素之类的多糖在血液系统中具有抗凝血作用是较早被发现的，它已作为药物应用于临床。五十年代以后随着对糖功能认识的深入，逐步发现一定结构的多糖对机体的免疫系统有显著的作用如抗肿瘤作用，抗病毒作用特别是抗艾滋病作用，抗炎作用和抗辐射作用。这些多糖也已有三种作为药物在国内外临床上正式使用(非正式使用的还有数种)。当然还发现某些结构的多糖对消化道系统也有作用如抗呕吐、抗溃疡等。所有作为药物而应用于临床的多糖最大特点是毒副作用小。另外也有一些多糖具有降血糖活性的报导，但效果不显著。由于糖尿病已成为一种常见病，严重影响患者的生活质量，甚至生命，所以寻找高效低毒的降血糖药物具有重要的社会意义及应用价值。
柿树广泛分布在我国河南等北方省份其果实、柿子是家喻户晓的，而其树叶大多作为燃料白白浪费掉，本发明从柿叶中提取多糖并进行各种药理试验表明它具有显著的降血糖作用和免疫促进作用。
本发明目的是提供一种从植物中提取有效成份对降血糖具有明显作用的具副作用小的多糖药物或保健品。
本发明是这样实施的新鲜的或干燥的柿树叶子在乙醇中浸泡72小时以上，取出风干，称取干燥后的柿叶，加10-15倍(w/w)去离子水加热于沸腾情况下3-8小时，过泸残渣，再用8-10倍(w/w)去离子水如上法再提取一次，合并二次泸液，减压浓缩至原体积的1/15-/20，加入3-5倍乙醇搅拌沉淀，沉淀物经离心，真空干燥，得到多糖的粗制品，该粗制品即可作为保健品而应用。粗制品经水溶解后，对水透析2天，未透过液减压浓缩至原体积的1/10加入3倍乙醇沉淀，取沉淀物溶于水中通过DEAE-纤维素柱、水及0.2M NaCl分步洗脱，流出液经硫酸苯酚法检测，取阳性部份，合并透析，冷冻干燥，冷冻干燥物溶于水中，上样于Sephacrgl S-300凝胶柱，0.1M NaCl展层，示差检测仪检测，合并主峰部分，透析，冷冻干燥。该样品经HPLC检测，结果为一单一对称峰，证明该多糖为纯品(即均一部分)，该纯品可作为药物而应用。
采用多糖分离方法，我们在国内首先从柿叶中获得多糖的粗制品(作保健应用)及纯品(作药物应用)。该多糖不但具有免疫促进作用，更重要的是具显著的降血糖活性，粗品可作为糖尿病患者的保健品，其纯品即可作为糖尿病患者的治疗药品。
在生物活性试验中，将PTP1B表达纯化，得到的酶以GST融合蛋白的形式存在。PTP1B水解底物PNPP的磷脂键，得到的产物在410nm处有很强的光吸收。因此可以直接检测410nm处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况(Zhang，ZY.，Dixon，JE.(1994)Adv.Enzymol.681-36)。标准测活体系如下10mM Tris.Cl，pH 7.6，10mM PNPP，2％DMSO，200nM PTP1B。结果分别在浓度为100μg/m(粗品)及10μg/m(纯品)对蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTPIB抑制率达95％以上，蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTPIB能够使磷酸化的胰岛素受体发生去磷酸化，从而在体内对胰岛素的作用起到调节作用，因此，对II型糖尿病和肥胖具有治疗作用。
免疫活性试验淋巴细胞在有丝分裂原如PHA，ConA，LPS等的刺激下，细胞的形态和代谢可发生一系列的变化，转化为母细胞，并分化增殖。以MTT法定量测定细胞的增殖。本实验加入LPS(脂多糖)10μg/ml诱导B淋巴细胞增殖。结果显示浓度分别为0.01mg/ml(粗品)及0.01mg/ml(纯品)其对B淋巴细胞的增殖反应的均属显著(P＜0.01)，上述多糖粗品及纯品经小鼠LD50试验其小鼠口服最大耐受量均大于8g/kg，由此结论，粗品及纯品不但均具显著生物活性，而且无毒副作用，可以单独或者复合作保健品，或进一步作为药物应用。
本发明的优点1.柿叶来源广泛，变废为宝，由原来丢弃或作燃料变为保健品或药物。
2.提取工艺简便，成本低廉。
实施例新鲜柿叶在乙醇中浸泡72小时，取出，自然通风干燥，称取1Kg干燥之柿叶，加入10l去离子水，加热沸腾4小时，过滤得泸液，泸渣再加10l去离子水，加热沸腾4小时过泸得第二次泸液，合并二次泸液，减压浓缩到800ml，在搅拌下，徐徐加入3倍量90％7醇，获得沉淀，沉淀物经离心，于真空干燥箱内(＜60℃)干燥24小时，取出，粉碎即得到可作保健品应用的多糖28g。
取上述粗制品多糖10g溶于去离子水(100ml)中，对去离子水透析2天，取出透析袋内未透过液，浓缩至100ml上，DEAE-纤维素柱层析，0.2MNaCl洗脱，取流出液糖反应阳性部分，合并，对蒸留水透析二天，未透过液浓缩至10ml上Sephacrgl S-300柱，0.1M NaCl展层，合并有效部位，透析2天减压浓缩，然后冷冻干燥，得纯品254mg。降血糖试验取上述粗制品及纯品分别溶于水中，使成浓度为100μg/ml及10μg/ml，观察其对蛋白质酪氨酸磷酸酯的抑制率结果发现其抑制率分别为99％及95％，该实验所用的磷酸酯PTPIB是从大肠杆菌中表达并纯化，实验中采用阳性参照药物为2μM的正钒酸钠。
权利要求
1.一种由柿叶提取的多糖，其特征在于由柿叶在乙醇中浸泡，然后风干，加入去离子水，加热至沸腾3-8小时，过滤、残渣再用去离子水提取一次，合并滤液，减压浓缩到小体积，加入3-5倍乙醇搅拌、沉淀，沉淀物离心，再溶于水中对水透析48小时，未透过液减压浓缩至原体积的1/10，再加入乙醇沉淀，沉淀物溶于水中通过DEAE-纤维素柱，用水及稀NaCl分步洗脱，流处液经硫酸苯酚法检测，取阳性部分，合并透析液冷冻干燥。冷冻干燥物溶于水中，上样于Sephacrgl凝胶柱，用稀NaCl展层，示差检测仪检测，合并主峰部分，透析，冷冻干燥，样品HPLC检测，取单一对称峰的多糖。
2.根据权利要求1所述由柿叶提取的多糖，其特征在于沉淀物通过DEAE-纤维素柱用水及0.1-0.3M NaCl分步洗脱。
3.根据权利要求1所述由柿叶提取的多糖，其特征在于冷冻干燥物上样于Sephacrgl凝胶柱，展开剂为0.1-0.3M NaCl溶液。
4.根据权利要求1所述由柿叶提取的多糖，其特征在于由HPLC检测样品取单一对称峰的多糖。
5.一种柿叶提取的多糖，其特征在于它对治疗II型糖尿病药物中应用。
6.一种柿叶提取的多糖，其特征在于它对肥胖病的治疗中应用。
全文摘要
本发明提供一种采用由柿叶提取多糖及它的提取方法,该多糖具有免疫促进作用对II糖尿病人具有降糖作用。
文档编号A61K31/715GK1371920SQ0110548
公开日2002年10月2日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者方积年, 陈林祥 申请人:中国科学院上海药物研究所