专利名称：使Akt癌基因失活并活化p38前细胞凋亡基因的组合物和方法
技术领域：
本发明是根据国家健康研究院RO1-CA58880号和乳腺癌研究计划ROI-CA77858号提出的，因此政府享有本发明的权利。
本发明普遍地涉及分子生物学、肿瘤学和基因治疗领域。更具体来说，它涉及基于E1A基因的癌症治疗方法的建立，该方法针对Akt癌基因和/或p38前细胞凋亡基因。本发明提供了包括磷酸化Akt表达的癌症和/或下调磷酸化p38的基因治疗方法。
癌症已成为西方国家中主要的死因之一，仅次于心脏病而排在第二。目前的估计预期在美国三个人中就有一个会罹患癌症，每五人中有一个会死于癌症。所有癌症都有重大问题尚待解决，这就使得揭示导致癌症的不同分子过程成为必要。
癌症是使正常细胞转化为癌变细胞的多步骤分子过程的结果。在两个DNA肿瘤病毒、腺病毒和多瘤病毒中所做的研究提供了支持这一假说的分子模型。在腺病毒的例子中发现初级细胞的转化需要早期区1A(E1A)和1B(E1B)基因的表达(Houweling等，1980)。其中，E1A基因产物与SV40中等T抗原或者活化的H-ras基因共同作用使初级细胞发生转化(Ruley，1985)。
在过去10年间，许多人类恶性肿瘤被发现与人基因组中的癌基因的存在和表达有关。肿瘤发生牵扯到20种以上的不同癌基因，并且这些癌基因被认为在人类癌症中起着直接的作用(Weinberg，1985)。这些癌基因中有许多是从被称为“原癌基因”的正常细胞相应成分经进化发展而来的，这导致基因表达或者基因产物活性的改变。有许多实验数据将原癌基因与细胞生长联系在一起，其包括它们在胚胎发育中的表达(Muller等，1982)，以及对增殖信号的应答(Campisi等，1983)。而且，许多原癌基因与生长因子或生长因子受体有关。这些观察报告暗示在转化过程中涉及到多种功能，不同癌基因在细胞水平上可能表现出类似的功能。
腺病毒E1A基因编码具有许多有趣特性的几个相关蛋白质。E1A不仅在转化中辅助第二个癌基因(H-ras)，而且另外一个密切相关的功能使得E1A能将初级细胞永生化(Ruley，1985)。例如，向初级细胞中导入E1A基因产物显示能使这些细胞在有血清的情况下进行培养时具有无限增殖能力。E1A的另一个有趣的功能模式是“反式激活”，其中E1A基因产物能刺激由多种病毒和细胞启动子(包括腺病毒早期和主要晚期启动子)起始的转录。但是，反式激活不是所有启动子的通常情况。在某些情况中，E1A导致与增强子元件相连的细胞启动子驱动的转录下降(Haley等，1984)。已经证实外源加入的E1A基因通过激活细胞内NM23基因(它与低转移潜力相关)可以减少ras-转化的小鼠胚胎成纤维细胞的转移潜力(Pozzatti等，1988；Wallich等，1985)。
另一个病毒癌蛋白，SV40大抗原(LT)与E1A和c-myc有结构和功能上的同源性(Figge等，1988)。LT、E1A和c-myc的转化结构域具有氨基酸序列同源性和类似的二级结构(Figge等，1988)。这三个蛋白质与肿瘤抑制子成视网膜细胞瘤基因产物(Rb)形成复合体(Whyte等，1988，DeCapric等，1988，Rustgi等，1991)，并且LT和E1A的Rb结合结构域与它们的转化结构域相符。基于这一类似性，可以相信LT和E1A是通过结合细胞Rb，消除其肿瘤抑制功能从而使细胞转化。利用小鼠胚胎成纤维细胞通过癌基因协作检测法确定将LT、E1A和c-myc也被分组到永生化癌基因中(参见Weinberg，1985)。
尽管在鉴定造成恶性肿瘤发展的某些成分中取得了进展，很显然现有技术中缺乏抑制癌症发生的有效手段。Hung及其合作者的工作确定了E1A基因事实上能抑制多种癌症中的转化、肿瘤发生和细胞凋亡(参见，例如Yu等，1991、1992和1993；以及Hung等的综述，1995，Yu和Hung，1995，和Mymryk，1996)。此外，Hung及其合作者在抑制癌基因转化中取得了进展。某些进展，特别是在癌基因(被不同地称为c-erbB-2、HER-2或neu(文中指neu癌基因)过表达介导的肿瘤病例中取得的进展，在美国专利5,814,315、5,651,964、5,641,484和5,643,567中有描述(每个全文引入此处作为参考文献)。同样由Hung及其合作者提出的美国专利6,197,794(此处引入作为参考文献)描述了小E1A基因的构建，所述基因只包含E1A基因中抗癌作用所需要的区域，从而提供了抗癌疗法。此外，在授予Frisch的美国专利5,776,743中描述了通过导入E1A基因使肿瘤细胞对化学和辐射疗法敏感。
这些专利明确了E1A作为肿瘤抑制被基因的功能，并进一步暗示E1A是治疗多种人类癌症的潜在治疗剂。的确，利用E1A作为肿瘤抑制基因在人癌症的动物模型中取得的成功有益于I期人临床实验的开展，目前是由位于西雅图的Virginia Mason Medical Center的Targeted Genetics Corporation、休斯顿的M.D.Anderson Cancer Center、底特律的Wayne State University和芝加哥的Rush Presbyterian St.Luke′s Medical Center赞助的。此外，Targeted Genetics的欧洲伙伴-Groupe Fournier已经接到卫生部的批准，开始在法国作相应的临床实验。
尽管有这些进展，还有几种癌症涉及到其他癌基因和信号分子，它们还没有被从治疗的角度充分地讨论。例如，有一类癌症中Akt癌基因过表达。Akt(又称为PKBγ和RAC-PKγ)是丝氨酸/苏氨酸激酶AKT/PKB家族的成员，首次分离自小鼠脑cDNA，主要在中枢神经系统和睾丸中表达(Konishi等，1995)。
Akt与AKT/PKB家族的其他成员一样，位于未活化细胞的细胞液中，并在被几种配体(包括分裂素和生存因子)刺激后转位到细胞膜上(Meier等，1997)。该活化过程要经过对渥曼青霉素敏感的PI3激酶(Franke等，1997)。Akt结合到PI3激酶的脂产物上，借助蛋白内的普列克底物蛋白同源结构域(PH)通过引导Akt转位到膜上使它呈递给其上游激活子。Akt的磷酸化是其活化所必需的，并且已确定造成该活化的激酶是PDK1(Cohen等，1997)。一旦定位到膜上，Akt能介导细胞内的几种功能，包括胰岛素的代谢效应(Walker等，1998)。Akt活化(例如，增强的磷酸化Akt表达)的癌症很难治疗，并且包括了卵巢、乳腺、前列腺、脑、结肠癌和其他癌症。
另一组现有技术基本上没有研究的癌症是那些其中的前细胞凋亡因子p38被下调的癌症。丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白p38也是一种分裂素激活性蛋白激酶(MAPK)。p38的磷酸化是其活化所必需的。还知道p38是一种细胞因子抑制性抗炎药物结合蛋白(CSBP)和RK。开始p38分离自转染了脂多糖(LPS)受体CD14并用LPS进行诱导的鼠科前B细胞。从那时起已对p38以及人和鼠中编码它的cDNA进行了分离和测序。
已经确定p38是与造成DNA损伤的事件有关的早期胁迫反应的MAPK。在被胁迫，比如脂多糖(LPS)、UV、茴香霉素或者渗透压休克处理时，以及细胞因子(比如IL-1和TNF)刺激的细胞中曾观察到p38的活化。
已经证实p38 MAPK是p53应答UV辐射和某些抗癌药物的显著激活子。p38与p53在关键丝氨酸残基上物理结合并使后者磷酸化。这与p53介导的最终导致细胞凋亡的转录级联有关。因此，p38是一种前细胞凋亡因子，它能导致DNA损伤的细胞发生凋亡。
虽然E1A的作用在导致某些类型癌症(比如neu-介导的癌症)中的分子途径已有描述，仍需要系统地研究和鉴定由E1A调控的其他基因和蛋白，它们可能参与其他类型癌症的发生和发展。Hung的专利或者Frisch的专利都没有概括出Akt和/或p38在各种癌症中的作用，而且没有论及指向这些癌症的特殊疗法。因此，对于与Akt癌基因活化(例如，增强的磷酸化Akt表达)相关的癌症，或者涉及到p38失活(例如磷酸化p38下调)的癌症，或者有这两种情况的癌症仍没有特别成功的抑制方法。因此，需要治疗这些类型的癌症的方法。
本发明提供了基于E1A的癌症基因疗法，所述癌症或者是癌基因Akt的磷酸化水平上调，或者前细胞凋亡基因产物p38的磷酸化水平下调，或者具有这两种情况。这类癌症的例子，包括但不限于，乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤等。
本发明人首次阐述通过E1A基因产物来调整以上靶物质，E1A基因产物在此以E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸为例。
因此，本发明提供了使细胞内的Akt失活的方法，包括使细胞与E1A蛋白、肽或多肽接触。在某些实施方案中，所述细胞是过表达活化Akt的细胞。活化Akt是Akt癌基因的磷酸化形式。在另一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。在具体实施方案中，所述细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、脑癌细胞或直肠癌细胞。
在另一个实施方案中，所述细胞在体外。再其他的实施方案中，所述癌细胞包含在肿瘤中。还有另外一些实施方案中，所述细胞包含在动物中。特殊方面中该动物是人。
在一个实施方案中，所述方法定为癌症治疗方法。在另一个实施方案中，所述方法定为预防癌症的方法。在某些方面中，所述细胞的转化被抑制。在另一些方面中，所述细胞的生长被抑制。所述细胞的生长可以是转移生长。
在所述方法的其他实施方案中，所述细胞进一步具有p38失活的特征。活化的p38包括磷酸化形式的p38前细胞凋亡蛋白。因此，失活的p38对应p38的非磷酸化形式。在所述方法的一个实施方案中，与E1A蛋白、肽或者多肽进行接触导致p38活化。
在所述方法的另一个实施方案中，用E1A蛋白、肽或者多肽与细胞进行接触包括提供编码E1A蛋白、肽或者多肽的核酸以及表达E1A蛋白、肽或者多肽。E1A蛋白、肽或者多肽的表达发生在细胞内。
在某些方面，E1A蛋白、肽或者多肽由一个核酸载体编码。在特殊方面，所述载体是病毒载体，可以是腺病毒载体、逆转录病毒载体或者慢病毒载体。
在其他特殊方面，E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸包含在脂质体中。
所述脂质体可以包含任何脂类化合物，但是在一个具体实施方案中，脂质体包含DOTMA、DOPE或者DC-Chol。在具体实施方案中，脂质体包含DC-Chol。在另一些具体实施方案中，脂质体包含DC-Chol和DOPE。
在某些方面，所述接触包括将E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸给药于动物。在这些方面中，可将E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸局部给药。例如，可以通过直接肿瘤内注射或者注射到肿瘤脉管系统来给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
可选择地，可以系统地给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。例如，可以静脉内、动脉内、腹膜内给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本发明人还预见了与本发明联合应用的癌症疗法。因此，在某些实施方案中，所述方法进一步包括使细胞与化疗剂接触。所述化疗剂可以是gemcitabine、novelbine、taxtere、紫杉酚、顺铂、阿霉素、VP16、TNF、大黄素、柔红霉素、更生霉素、米托蒽醌、甲基苄肼、丝裂霉素、碳铂、博来霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、抗瘤氨酸、六甲密胺、thiopeta、白消安、卡氮芥、罗氮芥、司莫司汀、链唑霉素、氮烯米胺、羟基柔红霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜树碱、放线菌素-D、过氧化氢、亚硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、他莫昔芬、反铂、长春新碱、长春碱、TRAIL或甲氨蝶呤。
E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸与化疗剂可以同时给药或者，可以不同时间给药。例如，可以在给予化疗剂之前或之后给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本发明还提供了活化细胞中的p38的方法，包括使E1A蛋白、肽或多肽与细胞接触。在一个实施方案中，所述细胞是活化p38表达不足的细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是癌细胞。在具体实施方案中，癌细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞或者结肠癌细胞。
在另一个实施方案中，所述细胞在体外。再一个实施方案中，所述癌细胞包含于肿瘤中。还有的实施方案中，所述细胞包含在动物内。特殊方面中，所述动物是人。
在一个实施方案中，所述方法定为癌症治疗方法。在另一个实施方案中，所述方法定为预防癌症的方法。在某些方面中，所述细胞的转化被抑制。在另一些方面中，所述细胞的生长被抑制。所述细胞生长可以是转移生长。
在其他实施方案中，所述方法进一步定为诱导细胞凋亡的方法。
在一个方面，细胞进一步具有Akt活化的特征。在这些方面中，与E1A蛋白、肽或者多肽进行接触导致Akt失活。
在所述方法的另一个实施方案中，用E1A蛋白、肽或者多肽与细胞接触包括提供编码E1A蛋白、肽或者多肽的核酸以及表达E1A蛋白、肽或者多肽。E1A蛋白、肽或者多肽的表达发生在细胞内。
在某些方面，E1A蛋白、肽或者多肽由一个核酸载体编码。在特殊方面，所述载体是病毒载体，可以是腺病毒载体、逆转录病毒载体或者慢病毒载体。
在其他特殊方面，E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸包含在脂质体中。
所述脂质体可以包含任何脂类化合物，但是在一个具体实施方案中，脂质体包含DOTMA、DOPE或者DC-Chol。在具体实施方案中，脂质体包含DC-Chol。在另一些具体实施方案中，脂质体包含DC-ChoI和DOPE。
在某些方面，所述接触包括将E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸给药于动物。在这些方面中，可以将E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸局部给药。例如，可以通过直接肿瘤内注射或者注射到肿瘤脉管系统来给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
可选择地，可以系统地给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。例如，可以静脉内、动脉内、腹膜内给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本发明人还预见了与本发明联合应用的癌症疗法。因此，在某些实施方案中，所述方法进一步包括使细胞与化疗剂接触。所述化疗剂可以是gemcitabine、novelbine、taxtere、紫杉酚、顺铂、阿霉素、VP16、TNF、大黄素、柔红霉素、更生霉素、米托蒽醌、甲基苄肼、丝裂霉素、碳铂、博来霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、抗瘤氨酸、六甲密胺、thiopeta、白消安、卡氮芥、罗氮芥、司莫司汀、链唑霉素、氮烯米胺、羟基柔红霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜树碱、放线菌素-D、过氧化氢、亚硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、他莫昔芬、反铂、长春新碱、长春碱、TRAIL或甲氨蝶呤。
E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸与化疗剂可以同时给药或者，可以不同时间给药。例如，可以在给予化疗剂之前或之后给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本发明还提供了在细胞内下调磷酸化Akt表达和上调磷酸化p38表达的方法，其包括使E1A蛋白、肽或多肽与细胞接触。
在具体实施方案中，所述细胞是癌细胞，可以是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、脑癌细胞、淋巴癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、骨癌细胞、直肠癌细胞或者血癌细胞。
在另一个实施方案中，所述细胞在体外。再一个实施方案中，所述癌细胞包含于肿瘤。还有的实施方案中，所述细胞包含在动物内。特殊方面中，所述动物是人。
在一个实施方案中，所述方法定为癌症治疗方法。在另一个实施方案中，所述方法定为预防癌症的方法。在某些方面中，所述细胞的转化被抑制。在另一些方面中，所述细胞的生长被抑制。所述细胞生长可以是转移生长。
在其他实施方案中，所述方法进一步定为诱导细胞凋亡的方法。
在所述方法的另一个实施方案中，用E1A蛋白、肽或者多肽与细胞接触包括提供编码E1A蛋白、肽或者多肽的核酸以及表达E1A蛋白、肽或者多肽。E1A蛋白、肽或者多肽的表达发生在细胞内。
在某些方面，E1A蛋白、肽或者多肽由一个核酸载体编码。在特殊方面，所述载体是病毒载体，可以是腺病毒载体、逆转录病毒载体或者慢病毒载体。
在其他特殊方面，E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸包含在脂质体中。
所述脂质体可以包含任何脂类化合物，但是在一个具体实施方案中，脂质体包含DOTMA、DOPE或者DC-Chol。在具体实施方案中，脂质体包含DC-Chol。在另一些具体实施方案中，脂质体包含DC-ChoI和DOPE。
在某些方面，所述接触包括将E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸给药于动物。在这些方面中，可以E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸局部给药。例如，可以通过直接肿瘤内注射或者注射到肿瘤脉管系统来给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
可选择地，可以系统地给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。例如，可以静脉内、动脉内、腹膜内给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本发明人还预见了与本发明联合应用的癌症疗法。因此，在某些实施方案中，所述方法进一步包括使细胞与化疗剂接触。所述化疗剂可以是gemcitabine、novelbine、taxtere、紫杉酚、顺铂、阿霉素、VP16、TNF、大黄素、柔红霉素、更生霉素、米托蒽醌、甲基苄肼、丝裂霉素、碳铂、博来霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、抗瘤氨酸、六甲密胺、thiopeta、白消安、卡氮芥、罗氮芥、司莫司汀、链唑霉素、氮烯米胺、羟基柔红霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜树碱、放线菌素-D、过氧化氢、亚硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、他莫昔芬、反铂、长春新碱、长春碱、TRAIL或甲氨蝶呤。
所述E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸与化疗剂可以同时给药或者，可以不同时间给药。例如，可以在给予化疗剂之前或之后给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本发明还提供了细胞内诱导细胞凋亡的方法，包括使E1A蛋白、肽或多肽与细胞接触。在一个实施方案中，所述细胞是p38表达不足的细胞。细胞还可以包括癌细胞。在这些方面，癌细胞可以包含于肿瘤中。还有的实施方案中，细胞包含于动物中。特殊方面中，所述动物是人。
在一个实施方案中，用E1A蛋白、肽或者多肽与细胞接触包括提供编码E1A蛋白、肽或者多肽的核酸以及表达E1A蛋白、肽或者多肽。特殊方面中，E1A蛋白、肽或者多肽的表达发生在细胞内。
一个方面中，E1A蛋白、肽或者多肽由一个核酸载体编码。其他实施方案中，E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸包含于脂质体。在该方法的其他实施方案中，所述接触包括将E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸给予动物。
根据专利法的惯例，在本说明书，包括权利要求书中，词语“一个”与“包含”一起使用时意味着“一或多个”。
以下各图构成本说明书的一部分，包含在此用来进一步阐述本发明的某些方面。参照这些附图中的一或多个，并结合文中具体实施方案的详细说明可以更好地理解本发明。
图1A和图1B乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中，E1A下调Akt的磷酸化，上调p38的磷酸化。
图2E1A抑制MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中胰岛素诱导的Akt磷酸化。
图3A、图3B、图3C和图3DAkt和p38没有直接结合，但相互调节。
图4E1A体外抑制细胞生长需要Akt的失活或p38的活化。
图5A和图5BE1A抑制Akt活化的乳腺癌MDA-MB-231细胞在软琼脂中的锚依赖性和锚独立性细胞生长。
图6E1A抑制Akt活化乳腺癌MDA-MB-231细胞的体内肿瘤发生。
鉴定导致癌症病理的关键基因和过程能给癌症治疗提供新的和特异性的治疗方法。虽然已经知道一些导致其抗癌作用的E1A功能的机理，例如在神经膜(neu)介导的癌症中，仍需要去鉴定由E1A调控的其他分子成分。
本发明人已经发现E1A基因的表达能下调癌基因Akt，其参与促进细胞存活，并已知它在几种癌症中是过表达的。此外，发明人还发现E1A的表达上调另一个蛋白质p38，其是一个细胞死亡启动子，同样已经知道它在几种人癌症中被下调。因此，本发明提供了基于E1A的癌症治疗方法，所述癌症包括Akt被上调或者p38被下调或者具有两种情况的癌症。这样的癌症可以，但不限于，乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌和直肠癌为例。
Akt蛋白和p38蛋白的活性形式均包含其蛋白的磷酸化形式。使用抗Akt的磷特异性抗体，本发明人阐明了，在转染了表达E1A的构建体的乳腺癌细胞中磷酸化Akt(活化Akt)的水平下降。E1A表达构建体在此定为编码并表达E1A蛋白、肽或多肽的核酸。另外，抗p38的磷特异性抗体显示，转染了E1A表达构建体的乳腺癌细胞中磷酸化p38(活化p38)的水平显著增加。这些体外结果进一步被体内研究证实，所述研究使用Akt活性增强和/或p38活性减弱或者具有两种情况的直生鼠乳腺癌模型。用E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸进行治疗能降低活化Akt(癌基因)的水平并提高活化p38(前细胞凋亡蛋白)的水平，从而能抑制裸鼠中的诱导性肿瘤发生。
本发明人还进行了几项实验来研究Akt和/或p38的作用机理。例如，利用合成化合物SB203580阻断p38的活性，提高了E1A稳定表达的MDA-MB-231细胞中的Akt活性。相反，当利用渥曼青霉素阻断Akt的活性时，p38的活性增强。因此，Akt和p38是反向调节的。在利用遗传学阻断p38或Akt活性的实验中也见到了类似的结果。
E1A对涉及Akt和/或p38的癌症的化学敏感性的影响也被实验。结果显示除了下调Akt和上调p38的活性，E1A还能够介导对化疗剂(比如紫杉酚)的敏感性。E1A的这些作用是其目前已众所周知的下调神经膜(neu)癌基因的能力之外的再一发现。这些实验是在稳定的人癌细胞系中进行的，这些细胞系在低的神经膜(neu)本底水平下，高水平表达野生型E1A蛋白。使用直生鼠癌症模型的体内研究也证实了体外实验结果，即与对照相比，导入E1A能明显地提高癌细胞对紫杉酚细胞毒性的敏感性；显著增强肿瘤衰退；以及延长鼠的存活。
此外，利用化学抑制剂，比如SB203589，或者遗传学手段，比如使用诱导性显性阴性p38突变体，来阻断p38的活性，并且导入组成性活化Akt能够部分地消除E1A使细胞对紫杉酚介导的细胞毒性敏感的能力。而且，导入p38或阻断癌细胞中的Akt活性也能增强对紫杉酚诱导的细胞凋亡的敏感性。尽管通过免疫沉淀没有发现Akt和p38之间的直接结合，但观察到了这两个途径之间的交叉调节。因此，本发明人已证实，通过在乳腺癌细胞中下调Akt和上调p38活性来调整细胞凋亡的阈值，可以实现E1A介导的化学敏感性。这些结果提供了一种有力的人类癌症的辅助化疗策略，它包括通过将E1A基因治疗与化疗联合使用，使Akt下调和/或p38上调。
因此，本发明提供了基于腺病毒5型E1A的基因疗法，用于与Akt活化或p38失活有关的肿瘤/癌症患者。
A.E1A蛋白、肽和多肽本发明通过提供一或多种E1A基因产物给那些Akt活性/表达增强或者p38活性/表达下降或者有两种情况的癌症患者提供了一种基因疗法，其中的基因产物在此定为腺病毒E1A蛋白、肽或多肽或者编码该E1A蛋白、肽或多肽的核酸。预计可用于本发明的E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸，可以编码多种蛋白质。这里的论述描述了许多具体的E1A基因产物，它们可以用于本发明述及的疗法。
一般来说，最方便的是直接简单地使用野生型E1A基因。但是，预计专门使用E1A基因的特定区域，而不用整个野生型E1A基因。预计最终优选的是使用抑制Akt基因所需的最小区域和/或活化p38基因所需的最小区域，这样就不会将不必要的DNA导入接受E1A基因构建体的细胞中。
在一些实施方案中，预计使用13S产物或者12S产物。称为13S和12S产物的E1A基因产物反映编码这些产物的两个mRNA的沉降值)。这两个mRNA来自共有前体的不同剪接方式，分别编码有289和243个氨基酸的相关蛋白质。所述蛋白质的内在不同在于13S蛋白所特有的46个氨基酸。本发明人先前的研究已经表明12S和13S E1A基因产物能抑制神经膜(neu)基因表达(参见美国专利号5,814,315、5,651,964、5,641,484和5,643,567，这些专利均全文引入本文作为参考文献)。实施本发明时，建议可以将两种产物交换使用，或者一起使用。
在另外一些实施方案中，预计可以使用许多其他种类E1A蛋白，这些蛋白是对初级翻译产物进行广泛的翻译后修饰产生的，通过PAGE分析可以看到(Harlow等，1985)。
再一些实施方案中，还可以使用一种小E1A基因产物，在美国专利6197754(其全文引用在此作为参考文献)和1998年3月19日提交的待审美国专利申请序号08/809,021(其全文引用在此作为参考文献)中描述了这种基因产物。所述小基因包含E1A蛋白的羧基端区域，其包括与13S E1A大约209-289位氨基酸对应的羧基端大约80个氨基酸残基。这个较小的羧基端区域在体内显示出明显的肿瘤抑制活性。此外，还可以使用位于13S E1A基因产物209-289部分内的更小片段，该片段保持抑制肿瘤发生的能力，它由去掉或改变这个结构域内的残基衍生出。
因此，可以用于治疗癌症的小E1A基因产物可包含位于E1A的第2个外显子内的E1A羧基端片段。所述小E1A基因产物可以缺少部分氨末端片段。预计小E1A基因产物可以缺少E1A氨末端片段中至少有一10、15、20、25或30个氨基酸部分。
其他一些实施方案涉及E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸，其中去掉了CR1区域。可选择地，E1A基因产物可以是从中去掉了CR2区域的E1A基因产物。还可以选择的是，所述E1A基因产物可以是从中去掉了CR1和CR2区域的E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
所述E1A基因产物还可以包含具有E1A基因产物中大约第4位氨基酸和大约第25位氨基酸之间的氨基酸序列的氨末端片段。所述E1A基因产物还可以包含具有E1A基因产物中大约第40位氨基酸和大约第80位氨基酸之间的氨基酸序列的氨末端片段。
E1A蛋白、肽或多肽可以另外包含一个间隔区，它位于E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸的CR1结构域的羧基端。该间隔区可以包含一个氨基酸片段，其包含E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸中大约81位氨基酸和大约101位氨基酸之间氨基酸序列。
由这些讨论很显然，可以使用编码E1A蛋白的整个E1A基因或者蛋白；或者E1A基因或其蛋白的任何部分，这些部分具有适合用于Akt和/或p38相关癌症之治疗的肿瘤抑制特性。
B.体内递送和治疗方案当利用基因本身来导入基因产物时，方便的导入方法是借助带有所需基因的重组载体，基因通常与有关调控序列连接在一起，该调控序列能启动和/或调节基因的表达。制备这类重组载体以及使用各种调控序列是本领域技术人员熟知的，在许多参考文献中有描述，比如，例如Sambrook等(1989，特地在此引用本文作为参考文献)。
在载体中，可以理解，编码待表达序列的DNA(在此情形下其编码抑制癌发生的基因产物)通常邻近并受控于一个启动子。本领域都知道要使编码序列受控于这样一个启动子，一般将待表达基因产物的转录读码框的转录起始位点5’端定位在所选启动子的下游(即，其3’方向)。正如本领域已知的，改变启动子和邻近转录起始位点间的空间经常可以用来影响转录物的表达水平。当使用异源启动子来驱动基因的表达时(即，对E1A基因是一个非E1A启动子)，可以首先采用与异源启动子和它正常情况下调控的基因之间的空间相类似的空间(通常少于100到几百碱基对)。但是，优化表达可能包括将启动子从转录起始位点移近或移远。如果原来插入的DNA中未含有的话，有人还可能希望向载体的转录单元中并入一个合适的多腺苷酸化位点(例如，5′-AATAAA-3′)。通常，将这些多腺苷酸(poly A)附加位点置于转录终止子前面，编码序列下游大约30到2000个核苷酸的一个位置。
采用特定基因的调控序列(即，E1A启动子)时，也可以使用细胞中发挥功能的其他调控序列。许多这类启动子，包括组成型启动子和诱导型启动子，在本领域已有描述，并且一般有多种来源，包括例如ATCC和商业来源。因此，可以通过举例的方式提及其他有用的启动子，包括，例如SV40早期启动子、CMV启动子、来自逆转录病毒的长末端重复启动子、肌动蛋白启动子、热震启动子、金属硫蛋白启动子等。
为了导入E1A基因，一般希望采用还能协助将所需基因递送到侵袭细胞的载体构建体，这可能需要将构建体递送到患者体内的目标肿瘤细胞(例如，乳腺、卵巢、胰腺、结肠、前列腺或其他肿瘤细胞)。协助递送的一个方法是利用病毒载体携带E1A序列以便有效地感染肿瘤或前肿瘤组织。病毒载体的例子包括腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒和腺相关病毒载体。这些和/或其他病毒载体已成功地用于将所需序列以高感染效率递送到细胞。
常使用的表达载体的病毒启动子来源于多瘤(polyma)、巨细胞病毒、腺病毒和猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子尤其有用，因为它们都能很容易地从病毒中以一个还含有SV40病毒复制原点的片段形式得到。此外，使用正常情况下与所需基因序列连在一起的启动子或调控序列，也是可能，并且经常是有益的，只要这些调控序列与宿主细胞体系相容。
可以通过构建载体包括一个外源原点，比如来源于SV40或其他病毒(例如多瘤、腺病毒、VSV、BPV)的原点，或者通过宿主细胞的染色体复制机制，来提供复制原点。
可以用来作为构建起点的载体的例子是一个含有E1A的逆转录病毒载体，称为pSVXE1A-G，Robert等描述过(1985)。该载体包含受控于SV40早期启动子的E1A基因。本发明人建议实施本发明时，可以直接使用该载体或E1A构建体，或者可以将它们作为起点来导入其他更需要的启动子，比如上面讨论过的。
(i)腺病毒 体内递送本发明所述抑瘤基因的一个方法涉及使用腺病毒载体。“腺病毒表达载体”意味着包括那些含有腺病毒序列的构建体，这些序列足以(a)支持构建体的包装和(b)表达克隆在里面的多核苷酸。腺病毒转移EIA非常方便，因为E1A本身就是腺病毒基因。因此，需要在腺病毒载体中插入非病毒基因序列来完成E1A的腺病毒递送。
一个示范性的表达载体包含遗传工程化的腺病毒。对腺病毒基因结构(36kb，线性双链DNA病毒)的了解，使得能用高达7kb的外来序列替代大段的腺病毒DNA。与逆转录病毒不同，腺病毒DNA感染宿主细胞不会发生染色体整合，因为腺病毒DNA能以外实体方式复制，没有潜在的基因毒性。同时，腺病毒结构稳定，大量扩增后没有检测到基因组重排。事实上腺病毒可以感染所有上皮细胞，并能感染许多其他细胞。
腺病毒是一种特别合适的基因转移载体，因为它有中等大小的基因组，易于操作，滴度高，广泛的靶细胞范围和高感染性。病毒基因组的两端都含有100-200个碱基对的反向重复(ITR)，其是病毒DNA复制和包装所需的顺式元件。基因组的早期区(E)和晚期区(L)含有不同的转录单位，其在病毒DNA复制时分开。E1区(E1A和E1B)编码那些负责调控病毒基因组和某些细胞基因的转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)的表达导致合成用于病毒DNA复制的蛋白质。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因的表达和宿主细胞关闭(Renan，1990)。晚期基因的产物，包括大多病毒衣壳蛋白，仅在主要晚期启动子(MLP)驱动产生的一单一初级转录物被有效加工后才被表达。位于16.8mμ的MLP在感染晚期尤其高效，所有产生自该启动子的mRNA都有一个5’三联前导(TL)序列，这使它们成为翻译的优选mRNA。
在一个现有的体系中，重组腺病毒产生自穿梭载体和前病毒载体之间的同源重组。由于两个前病毒载体之间可能发生重组，可从该过程制备到野生型腺病毒。因此，从单独一个噬斑中分离病毒单克隆并检查其基因组结构，是非常关键的。使用YAC系统是制备重组腺病毒的替代做法。
将E1A基因导入动物的优选方法是导入一个含有E1A基因的复制缺陷的腺病毒。这种腺病毒的一个例子是Ad.E1A(+)。由于腺病毒是自然界中一种感染人类的常见病毒，E1A基因是存在于天然腺病毒中的基因的一部分，利用复制缺陷型E1A病毒来导入基因，可以有效地影响E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸的递送和在靶细胞中的表达。
通过例如缺失E1B和E3制备的复制缺陷型E1A病毒，还能避免病毒在细胞内复制并转移到其他细胞，这意味着病毒感染活性被有效地限制在第一次感染的靶细胞中。E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸仍会在这些细胞中表达。同时，与只能感染正在增殖的细胞的逆转录病毒不同，腺病毒能将E1A基因转移到正在增殖的细胞中，以及可能是通过刺激未增殖细胞而转移到未增殖细胞中。此外，腺病毒在被感染细胞中位于染色体外减少了受处理动物的细胞内癌基因活化的机会。
复制型腺病毒可以直接用来将E1A基因转移到癌细胞中，但是复制型病毒能在人体内产生大量腺病毒，因此可能会由于野生型腺病毒的可复制性而带来潜在的副作用。因此使用复制缺陷型腺病毒，比如E1B和E3缺失突变体Ad.E1A(+)来防止这些副作用是有益的。事实上，许多对天然腺病毒的修饰能产生适用于本发明目的的修饰过的病毒。对腺病毒的进一步修饰，比如E2A缺失可提高E1A产物的表达效率并减少副作用。对天然或修饰过的腺病毒的唯一要求是它应当能够递送可在靶细胞中进行表达的E1A基因，以利用本发明。
将含有肿瘤抑制基因(例如E1A基因)的腺病毒导入合适的宿主，通常是通过注射包含在缓冲液中的病毒来完成的。正如上面讨论过的，如果腺病毒载体是复制缺陷型的或者至少是条件缺陷型，是很有利的。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或亚群A-F中的任一种。腺病毒C亚群5型目前是获得用于本发明的条件复制缺陷型腺病毒的优选起始材料。这是因为腺病毒5型是一种人的腺病毒，其多数生化和遗传学信息是已知的，一直用于采用腺病毒为载体的多数构建过程。
在腺病毒载体中使用了E1A基因的情况下，它可以占据正常情况下E1A基因占据的位置，或者可以将其放置在腺病毒构建体中的另一个位置。
腺病毒易于生长和操作，并且显示出广泛的体内和体外宿主范围。这群病毒可以获得高滴度，例如109-1011噬斑形成单位/ml，而且它们有高感染性。腺病毒的生命周期不需要它整合到宿主细胞基因组中。免疫接种野生型腺病毒的研究没有报道任何副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，显示了它们的总体安全性和作为体内基因转移载体的治疗潜力。
腺病毒已用于真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和开发疫苗(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。动物实验提示重组腺病毒可以用于基因治疗(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。将重组腺病毒给药于不同组织的研究包括气管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周静脉内注射(Herz和Gerard，1993)和立体定位(stereotactic)接种到脑中(Le Gal La Salle等，1993)。
(ii)逆转录病毒 逆转录病毒是一群单链DNA病毒，特征在于它们能通过逆转录过程将其RNA转变为双链DNA给感染细胞(Coffin，1990)。所得的DNA能够稳定地整合到细胞染色体中成为原病毒，并引导病毒蛋白质的合成。整合导致病毒基因序列存留在受纳细胞及其后代中。逆转录病毒基因组含有三个基因，盖奇基因(gag)、聚合酶基因(pol)和包膜基因(env)，它们分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜成分。已有人构建了盖奇基因上游的一段称为“PSI成分”的序列(Mann等，1983)。当含有人cDNA和逆转录病毒LTR以及PSI序列的重组质粒被导入该细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀)，PSI序列使重组质粒的RNA转录物包装到病毒颗粒中，后者然后分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。之后收集含有重组逆转录病毒的培养基，可选择性地经过浓缩，用于基因转移。逆转录病毒载体颗粒能感染多种细胞类型。但是，整合和稳定表达需要宿主细胞发生分裂(Paskind等，1975)。
一种设计来使逆转录病毒载体能特异寻靶的新方法是在对逆转录病毒进行化学修饰的基础上建立起来的，所述修饰经过向病毒包膜上化学添加乳糖残基。这种修饰使得能经由唾液酸糖蛋白受体特异地感染肝细胞。
还设计了另一种重组逆转录病毒的寻靶方法，其中使用了生物素化抗体抵抗逆转录病毒包膜蛋白和抵抗特异细胞受体的。这些抗体利用链亲合素偶联上了生物素成分(Roux等，1989)。利用抗主要组织相容性复合I类和II类抗原的抗体，研究人员证明用嗜亲性病毒在体外能感染多种带有这些表面抗原的人细胞(Roux等，1989)。逆转录病毒载体的用途有某些潜在的限制。例如，逆转录病毒载体通常整合到细胞基因组的随机位点。这会通过打断宿主基因或插入可能干扰旁侧基因的功能的病毒调控序列，导致插入诱变(Varmus等，1981)。使用缺陷型逆转录病毒载体的另一个考虑是在包装细胞中可能出现野生型可复制的病毒。这可能源于某些重组事件，其中来自重组病毒的完整序列插入整合在宿主细胞基因组中的盖奇基因(gag)、聚合酶基因(pol)和包膜基因(env)序列的上游。但是，现在有新的包装细胞系，能大大降低重组的似然(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。体内使用逆转录病毒载体的一个限制是产生大于106感染U/mL的逆转录病毒载体滴度的能力有限。许多体内应用需要比这高10至1000倍的滴度。
Paul和Overell(Targeted Genetics Corporation)在美国专利5,736,387中描述了利用逆转录病毒载体来引导基因递送到特定靶细胞(比如癌细胞)的更新的方法，这些方法能避免许多这样的局限性。
(iii)慢病毒载体 慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因盖奇基因(gag)、聚合酶基因(pol)和包膜基因(env)，它还含有其他具有调控或结构功能的基因。更高的复杂性使这种病毒能调整它的生命周期，与在潜伏感染过程中一样。慢病毒的一些例子包括人免疫缺陷病毒HIV-1、HIV-2和猴免疫缺陷病毒SIV。已经由多重减毒的HIV毒性基因制备了慢病毒载体，例如将包膜基因、vif基因、vpr基因，vpu基因和nef基因删除使载体达到是生物学上的安全。
重组慢病毒载体能感染未分裂细胞，可以用于体内和来自体内的基因转移以及核酸序列的表达。慢病毒基因组和原病毒DNA有三个可发现于逆转录病毒的基因盖奇基因(gag)、聚合酶基因(pol)和包膜基因(env)，它们侧接两个长末端重复(LTR)序列。盖奇基因基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；聚合酶基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、一蛋白酶和一整合酶；包膜基因编码病毒包膜糖蛋白。5′和3’LTR用于提高转录以及毒粒RNA的聚腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有的附加基因包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx基因。
邻近5′LTR的是基因组逆转录所需的(tRNA引物结合位点)以及将病毒RNA有效地包裹到颗粒中(Psi位点)所需的序列。如果病毒基因组中缺少壳体化(或者将逆转录病毒RNA包装到感染性毒粒中)所需的序列，顺式(cis)缺陷会阻止基因组RNA的壳体化。但是，得到的突变体仍能引导所有毒粒蛋白质的合成。
慢病毒载体是本领域内已知的，参见Naldini等，(1996)；Zufferey等(1997)；美国专利6,013,516和5,994,136。通常，载体是基于质粒或病毒的，设定成携有使外来核酸结合、核酸选择和转移到宿主细胞中的必要序列。目的载体中的盖奇基因(gag)、聚合酶基因(pol)和包膜基因(env)也是本领域已知的。因此，将有关基因克隆到所选的载体中，然后用它转化感兴趣的靶细胞。
在美国专利5,994,136(在此引用作为参考文献)中描述了能够感染未分裂细胞的重组慢病毒，其中用携有包装功能的两个或多个载体(即盖奇基因、聚合酶基因和包膜基因，以及rev和tat)转染合适的宿主细胞。该文描述了能提供编码病毒盖奇和聚合酶基因的核酸的第一载体，以及能提供编码病毒包膜基因以便产生包装细胞的核酸的另一个载体。将提供异源基因，比如本发明所述E1A基因，的载体导入包装细胞中得到一个生产细胞，该细胞能释放携有目的外来基因的感染性病毒颗粒。包膜基因是优选的一个双嗜性包膜蛋白，能够保证它转导人和其他物种的细胞。
可以通过将包膜蛋白与抗体或者与能寻靶到一个特定细胞型的受体的独特配体连接在一起来寻靶所述的重组病毒。通过将目的序列(包括调控区)和另一个基因插入病毒载体，例如该基因编码特定靶细胞上的受体的配体，这个载体就是靶特异性的。
提供病毒包膜基因(env)核酸序列的载体可操纵地连接着调控序列(例如启动子或增强子)。所述调控序列可以是任何真核启动子或增强子，包括例如，Moloney鼠白血病病毒启动子-增强子元件、人巨细胞病毒增强子或者痘病毒P7.5启动子。在某些情况中，比如Moloney鼠白血病病毒启动子-增强子元件，启动子-增强子元件位于LTR序列内或者邻近LTR序列。
异源或者外来核酸序列，比如文中的编码E1A蛋白、肽或多肽的多核苷酸序列可操纵地连接着调控核酸序列。优选地，所述异源序列连接了启动子，形成一个嵌合基因。异源核酸序列还可以受控于病毒LTR启动子-增强子信号或者内部启动子，逆转录病毒LTR中保留下来的信号仍能使转基因有效地表达。可以利用标记基因来检验载体的存在，从而证实发生了感染和整合。有标记基因存在能保证仅有那些表达插入片段的宿主细胞被挑选出来并生长。典型的选择基因编码某些赋予对抗生素和其他有毒物质(例如，组氨醇、嘌呤霉素、潮霉素、新霉素、甲氨蝶呤等)的抗性的蛋白质以及细胞表面标记。
通过转染或感染可将载体导入包装细胞系。包装细胞系产生含有载体基因组的病毒颗粒。转染和感染的方法是本领域技术人员熟知的。将包装载体和转移载体共转染到包装细胞系中之后，从培养基中回收重组病毒，利用本领域技术人员使用的常规方法测定滴度。这样，可以通过磷酸钙转染、脂质体感染或电穿孔，将包装构建体通常与有显性选择标记(neo、DHFR、Gln合成酶或ADA)一起导入人细胞系中，随后在有适当的药物存在的情况下进行挑选并分离克隆。选择标记可以与构建体中的包装基因直接连接。
慢病毒转移载体(Naldini等，1996)已用于感染体外生长停滞的人细胞，以及在直接注射到成年大鼠的脑中之后转导神经元。该载体能有效地将标记基因体内转移到神经元中，并实现了在没有可发觉的病理现象的情况下长期表达。一次注射载体10个月后的动物分析显示，转基因表达的平均水平没有下降，没有组织病理征兆或者免疫反应(Blomer等，1997)。因此，在本发明中，用编码核酸表达E1A蛋白、肽或多肽的重组慢病毒、来自体内地转染细胞，或者直接体内感染细胞。
(iv)其他作为表达构建体的病毒载体 在本发明中可以采用其他病毒载体作为表达构建体。可以采用来源于诸如痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺相关病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和嗜肝DNA病毒等病毒的载体。它们为各种哺乳动物细胞提供了几个有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等1988；Howrich等，1990)。
一公司(Targeted Genetics Corporation及其合作者)曾描述过用AAV载体进行基因递送的各种优点，以及制备这些载体的方法和组合物，参见例如，Allen等，W096/17947；Flotte等，美国专利5,658,776。其他描述可以用于本发明所述方法的AAV载体的参考文献包括Carter，B.，1990；Carter，1992；Muzyczka，1992；Flotte，1992；Chatteijee等，1995；Kotin，1994；Flotte，1995；以及Du等，1996。
随着对缺陷型乙肝病毒的认识，对不同病毒序列的结构-功能之间的关系有了新的看法。体外研究显示，即使将其基因组的80％删除，病毒也能维持辅助病毒依赖性包装和逆转录的能力(Hoiwich等，1990)。这提出了基因组的一大部分可以被外来遗传物质所取代。趋肝性和持续性(整合)对于肝指导基因转移尤有吸引力。Chang等将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因导入鸭子乙肝病毒基因组中聚合酶、表面和前表面编码序列的位置。它与野生型病毒共转染鸟肝细胞瘤细胞系。用含有高滴度重组病毒的培养基来感染初级小鸭子肝细胞。至少转染后24天能检测到稳定的CAT基因表达(Chang等，1991).
(v)基于脂类的基因递送 在本发明另一个实施方案中，表达构建体可以与一或多种脂类结合在一起。这在本领域内称为基于脂类的基因递送，这类核酸-脂类复合体可以采取多种不同的形式，通常取决于所使用的脂类的特性、核酸与脂类和/或其他可能成分的比率、以及复合体形成方法。示范型的复合体包括形成一定结构的复合体，比如脂质体和胶粒，以及比较没有固定结构的复合体，比如脂类分散体。为了说明，脂质体是泡状结构，通常具有双层膜，这种磷脂双层包围着内部的水基质。多层脂质体有多重被水基质分开的脂类层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，自动形成脂质体。在形成封闭结构之前，脂类成分进行自我重排，捕获水分和脂质双层之间的溶解物(Ghosh和Bachhawat，1991)。同样考虑到的是脂质转染胺试剂-DNA复合体。因此本发明还提供了特别有用的方法来向细胞中导入E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。一个导致转染到细胞内的基因实现表达的体内基因转移方法包括利用脂质体。脂质体可以用于体外和体内转染。脂质体介导的基因转移似乎在某些动物体内应用方面有很大的潜力(Nicolau等，1987)。研究表明静脉注射的脂质体主要通过网状内皮系统的巨噬细胞被肝和脾摄取。摄取所注射的脂质体的特异细胞部位似乎主要是脾的巨噬细胞和肝的枯否氏细胞。静脉注射脂质体/DNA复合体可以导致DNA被这些细胞位点摄取，从而导致DNA所编码的基因产物的表达(Nicolau，1983)。本发明人考虑可以利用脂质体介导的基因转移，将E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸导入细胞。建议这些构建体可以按照Nabel等的描述(1990)偶联上脂质体，直接经导管导入。采用这些方法，本发明的肿瘤抑制基因产物可以在体内特定部位有效表达，而不仅在能通过静脉注射可到达的肝和脾细胞。因此，本发明还包括的编码E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸的DNA构建体的组合物，其配制成DNA/脂质体复合体，以及利用这些构建体的方法。
可以利用多种脂类成分(和可能的其他成分)中的任何一种来制备脂质体、胶粒和脂类分散体，所述脂类能与核酸发生复合或者能捕获例如包含核酸的水结构。可以采用的分子的例子包括卵磷脂(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、胆固醇(Chol)、N-[1-(2，3-dioleyloxy)丙基)-N，N三甲基氯化铵(DOTMA)、dioleoyl磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或3.β[N-(N′，N′-二甲基氨基-乙烷)-氨基甲酰胆固醇(DC-Chol)，以及其他本领域技术人员已知的脂类。本领域技术人员会认识到有许多基于脂类的转染技术可以用于本发明。其中的一些技术有Nicolau等(1987)、Nabel等(1990)和Gao等(1991)描述的。本发明人在包含DC-Chol的脂类/DNA复合体尤其成功。具体来说，本发明人按照L.Huang及其合作者的技术(参见，例如Gao等，1991；Epand等，PCT/US92/07290和美国专利5,283,185)成功制备了包含DC-Chol和DOPE的脂质/DNA复合体。也可以使用包含DOTMA的脂质复合体，比如一公司(Vical，Inc.，San Diego，Calif.)出售的商标为Lipofectin.TM.的商品。L.Huang及其同事(Deshmukh el aL，PCT/US97/06066；Liu等人，PCT/US96/15388，和Huang等人，PCT/US97/12544)公开了多种以脂类为基础的基因递送的改良技术，这些技术可以用于递送基因，例如递送本发明公开的基因。
可以引入脂类/核酸复合物与用多种方法转染的细胞接触。细胞培养中，只是将所述复合物简单地分散在所述的细胞培养液中。就体内使用而言，该复合物典型地采用注射途径。静脉内注射可以使复合化后的DNA脂类介导转染入，例如，肝及脾内。为了使得DNA转染入经静脉注射无法进入的细胞中，可将所述的脂类-DNA复合物直接注射入动物体内的特定位置。例如，Nabel等人教导通过一导管将脂质体注射入动脉壁。另一个实施例中，本发明人已使用腹膜内注射脂类/DNA复合物从而将基因转移入小鼠。
本发明还提供了含有脂类复合物的组合物。该脂类组合物通常包括一种脂类成分和编码肿瘤抑制基因的DNA片段。脂类复合物中使用的所述肿瘤抑制基因可以是，例如E1A基因。可以类似地将一E1A基因与脂类复合形成脂类/DNA复合物用于基因递送。
用于制备脂类复合物的脂类可以是任一种上述脂类。具体地，可以用DOTMA、DOPE和/或DC-Chol形成脂类复合物的全部或部分。本发明人用含有DC-Chol的复合物已经取得了相当的成功。在一个优选的实施方案中，所述的脂类复合物包括DC-Chol和DOPE。尽管DC-Chol与DOPE之间的多种配比都可以使用，但是其中含有DC-Chol∶DOPE之比为1∶20～20∶1的脂类复合物有着明显的优势。本发明人已发现按照DC-Chol∶DOPE之比约1∶10～约1∶5制备的脂类复合物从稳定性和有效性角度看都是特别有用的。可以用来与E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸组合递送的脂类和脂质体也已公开于美国专利号5,922,688、5,814,315、5,651,964、5,641,484和5,643,567中，在此引用所有文献的全文作为参考；还可参见1998年3月19日提交的序号为08/809,021的待审美国专利申请，其在此引用作为参考。
在本发明的特定实施方案中，也可以将所述脂类与血凝病毒(HVJ)复合在一起。其已显示促进与细胞膜的融合并且加速了脂质体包裹的DNA进入细胞(Kaneda等人，1989)。在其他实施方案中，所述脂类与核无组蛋白染色体蛋白(HMG-1)(Kato等人，1991)复合或者偶联在一起。在另外的其他实施方案中，所述脂类与HVJ和HMG-l二者复合或偶联在一起。Huang及其同事也已提供了多种脂类为基础的基因递送复合物，其中一些包括核酸缩合剂和其他成分；并且进一步详细地描述了可用于制备这类基因递送复合物的技术(参见，例如，目标基因公司PCT/US97/12544以及上述Huang等人其他参考文献)。
由于此类表达构建体都已成功地应用于核酸的体内及体外转移及表达，因而它们可以用于本发明。如本领域所知，基因递送复合物中还可含有其他成分，包括蛋白质和/或其他分子，它们有利于所递送DNA靶向特定细胞、被靶细胞结合并吸收、在特定亚细胞腔室(例如，核及细胞溶质)中的定位、及其整合和/或表达。目标基因公司在PCT′US95/04738中描述了多种这样的单个成分及其结合体。
(vi)其他非病毒载体 为了实现正义或含义基因构建体的表达，通常必须将所述表达构件体递送到细胞中。这种递送可以用实验室用于转化细胞系的方法在体外来实现，或者象治疗特定疾病那样在体内或来自体内细胞系(exvivo)(见下文)来实现。如上所述，递送可以通过病毒感染实现，其中所述的表达构建体包裹入一感染性的病毒颗粒中。
本发明还提供了用于将表达构建体转移入培养哺乳动物细胞中的几种非病毒方法。这些方法包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe el aL，1990)DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa等人g 1986；Pouer er aL，1984)、直接微注射(Harland和Weintraub～1985)、DNA运载脂质体(Nicolau和Sene，1982；Fraley et al.，1979)和脂质转染胺(lipofectamine)-DNA复合物、细胞声波化(Fechheimer等人，1987)、高速微粒基因轰击(Yang等人，1990)、以及受体介导转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。这些技术可以经调整后成功用于体内或来自体内细胞系的用途。
使用基因递送融合蛋白(GDFPs)的非病毒基因递送改良法已由Overell和Weisser(目标基因公司)于PCT/US95/04738。
一旦表达构建体被递送到细胞中，那么编码目的基因的核酸就可以在不同位点定位并表达。在特定实施方案中，编码该基因的核酸可以作为分离的附加DNA片段稳定地保留在细胞中。这类核酸片段或“附加体”编码序列足以允许独立于宿主细胞循环之外保留并复制，或者与其同步化。表达构建体如何递送入细胞以及该核酸停留在细胞内何处，这些取决于所用表达构建体的类型。
在本发明的一个实施方案中，所述表达构建体可以仅由裸露的重组DNA或质粒简单地构成。所述构建体的转移可以采用上述的任一种方法，这些方法利用物理或化学原理使细胞膜通透化。这特别适用于体外转移但也可以体内使用。Dubensky等人(1984)成功地将多瘤病毒DNA以磷酸钙沉淀物的形式注射入成年或新生小鼠的肝或脾内，显示了活跃的病毒复制及急性感染。Benvenisty等人，(1986)也表明磷酸钙沉淀质粒直接腹膜内注射可以导致所转染基因的表达。可以预见编码一目的基因(例如，E1A基因)的DNA也可以类似方式进行体内转移并表达基因蛋白。
本发明中将裸露DNA表达构建体转移到细胞中的另一实施例，可以采用颗粒轰击。该方法取决于能否将DNA包裹的微粒加速到一高速度从而使得它们可以穿过细胞膜进入细胞且并未杀死细胞(Klein等人，1987)。现已发展了几种加速小颗粒的装置。一种所述装置依赖于一能产生电流的高电压放电，该电流反过来提供动力。所使用的微粒由钨或金珠等生物惰性物质组成。
已经选用器官包括大鼠和小鼠的肝、皮肤及肌肉组织，进行体内轰击(Zelenin等人，1991)。为了去除枪与目标器官之间的任一干扰组织，可能需要将所述组织或细胞外科方法暴露，即来自体内处理。另外，编码一特定基因的DNA可以通过该方法递送，并且也被包括在本发明中。
可以用来将编码特定基因的核酸递送入细胞的其他表达构建体为受体介导递送介质。这些构建体利用几乎所有真核细胞中通过受体介导内吞选择性吸收大分子。鉴于各种受体的细胞型特异性分布，所述递送可以实现高度特异性(Wu和Wu，1987；1988；Overell和Weisser(目标基因公司)，PCT/US95/04738)。
受体介导的基因靶向介质通常由两种成分组成细胞受体特异性配体以及DNA结合试剂。现已有几种配体用于受体介导基因转移。最有代表性的配体是脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987)以及运铁蛋白(Wagner等人，1990)。一种合成的新糖蛋白与ASOR识别同一受体，它已被用作基因递送介质(Ferkol等人，1993；Perales等，1994)，且表皮生长因子(EGF)也已被用来将基因递送给磷状癌细胞(squamous carcinoma cells)(Myers，EPO 0273085)。
在其他实施方案中，所述递送介质可包括一配体和一脂类复合物。例如，Nicolau等人(1987)将乳糖苷神经酰胺，一种半乳糖端asialganglioside，引入脂质体，并且观察到肝细胞胰岛素基因摄入量的增加。因此，可以通过任意数目的含或不含脂类的受体-配体系统，将编码某一特定基因的核酸特异地递送到诸如肺、表皮或肿瘤等类型的细胞中，这样是切实可行的。例如表皮生长因子可以用作受体用于将编码基因的核酸介导递送到多种呈现上调EGF受体的肿瘤细胞中。可以用甘露糖将甘露糖受体靶向肝细胞。另外，也可类似地将抗CD5(CLL)，CD22(淋巴瘤)、CD25(T细胞白血病)及MAA(黑素瘤)的抗体用作靶向基元。
在特定实施方案中，基因转移在离体条件下更容易进行。离体基因治疗是指从动物中分离出细胞，将核酸体外递送到细胞中，以及然后将修饰后的细胞送回到动物体。这涉及到从动物体外科摘取组织/器官或者细胞及组织原代培养。参见，例如，Anderson等人，美国专利5,399,346。
C.药用组合物及给药途径本发明的组合物将有效量的基因用于治疗给药，任选地与有效量的第二种试剂联合使用，例如一种化疗试剂或任一种上述的其他抗癌试剂。通常所述组合物溶于或分散于药物学上可接受的载体或含水介质中。
术语“药物学或药理学上可接受”是指当施用给动物或人时不会产生负作用、过敏或其他不良反应分子组成和组合物。如在此所用的“药物学上可接收的载体”包括任一种或所有溶剂、分散介质、包被剂、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些介质及试剂用于药物活性物质为本领域众所周知。任一种常规介质或试剂除非与活性成分是不相容的，都可以尝试用于所述治疗组合物中。补充活性组分，例如其他抗癌试剂，也可以引入所述组合物中。
除配制成非肠道给药的化合物外，例如静脉内或肌内注射之外，其他药物学上可接受的方式包括，例如片剂或其他用于口服的固体；缓释胶囊；以及当前使用的任一种其他形式，包括乳剂、洗剂、漱剂、吸入剂等。
本发明所述的表达载体及递送介质可以包括经典的药物制剂。根据本发明所述的这些组合物的给药方式，可是任一种常规途径，只要目标组织通过该途径可以获得。这包括通过口腔、鼻腔、颊、直肠、阴道、或表面给药。可选择性地，可以通过，例如，常位、皮内、皮下、肌内，腹膜内或静脉内注射给药。通常，该类组合物可以作为药物学上可接受的组合物施用，如上所述。
本发明所述的载体优选以可注射组合物的方式给药，可以液体溶液或悬液。也可以配制成适于注射前才溶于或悬浮于液体中的固体形式。也可以将这些制剂乳化。用于此目的的典型组合物包括浓度为每毫升磷酸缓冲盐水含50mg～约100mg的人血清白蛋白。其他的药用可接受载体包括水溶液、非毒性赋形剂、包括盐、防腐剂、缓冲液等。无水溶剂的实例包括丙二醇，聚乙二醇、植物油以及可注射用有机酯，例如theyloleate。含水载体包括水、醇/水溶液、盐水溶液、非肠道介质例如氯化钠、葡萄糖盐水(Ringer′s dextrose)等。静脉内介质包括流体及营养补充剂。防腐剂包括抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体。药物组合物中各种成分的pH值及精切的浓度根据众所周知的参数来调节。
另外的制剂适合口服。口服制剂包括典型的赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。所述组合物可以采用溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末。当采用表面局部给药方式时，所述形式可以是乳剂、油膏、油药膏或喷剂。
治疗药物的有效剂量是根据期望目标确定的。术语“单位剂量”是指适用目标体的物理形态上离散的单元，每个单元包括预定量的治疗组合物，经计算能够产生与其施用，即合适的途径及治疗方案相关的预期反应。所述的给药量，根据治疗次数及单位剂量，取决于所要治疗的目标体、目标体的状态以及期望的保护。治疗组合物的确切的量也取决于临床医师的判断并且因个体而异。
抑制肿瘤细胞增殖所需要的所有主要物质及试剂都可以装配于试剂盒中。当试剂盒中的成分以一种或多种液体溶液提供时，所述的液体溶液优选地是一种含水溶液，特别优选灭菌后的水溶液。
就体内使用而言，化疗试剂可以配制成单一或分离的药理学上可接受的注射用组合物。这种情况下，所述包装形式本身可以是一种吸入、注射、移液瓶、滴眼液瓶或其他类似容器，所述制剂由这些容器而出施用到肌体的患处，例如肺，注射入动物体，或者甚至使用并与试剂盒中的其他成分混合。
试剂盒中的成分还可以干燥或冻干的形式提供。当试剂或成分以干燥后的形式提供时，通常通过另外加入合适的溶剂重配。还可以将所述溶剂以另外的包装形式提供，这也是行得通的。本发明所述的试剂盒还可以包括解释所述基因治疗和/或化疗药物如何使用的说明书页。
本发明所述的试剂盒典型地还可以包括一种用于以密闭形式盛装小瓶的器皿以利于出售，例如注射或吹胀器皿，内装合乎需要的小瓶。抛开器皿的数目或类型不说，本发明所述的试剂盒还可以包括一种有助于最终的复合组分在动物体内注射/施用或者停留的装置，或者用该装置来包装。这样的装置可以为吸入、注射、移液管、镊子、量匙、滴眼瓶或者其他任一种医学上适合的送递器具。
非肠道施用 本发明所述的活性化合物通常配制成非肠道使用的制剂，例如配制成通过静脉内、肌内、皮下，或者甚至腹膜内途径注射的形式。阅读本发明公开内容后，本领域技术人员可以获知配制任选含有用作活性成分的第二种试剂的含水组合物的方法。典型地，将所述组合物配制成可注射形式，如液体溶液或悬浮液；也可以配制成适于注射前才另加液体制备成溶液或悬液的固体形式；也可以将这些制剂乳化。
可以将活性化合物以游离基或药学上可接受盐形式在水中与羟丙基纤维素等表面活性剂适当地混合配制成溶液。也可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物以及油类中制备分散体系。在一般的存储及使用条件下，这些制剂含有一种旨在防止微生物生长的防腐剂。适于注射使用的药用形式包括灭菌的水溶液或分散体系；含有芝麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；以及适于现用现配成灭菌注射液或分散体系的无菌粉末。在所有情况下，所述形式都必须是无菌的并且是一定程度上易于注射排出的流体。它还必须在制备及存储条件下是稳定，以及必须能防止微生物，例如细菌和真菌的污染。
可以将所述活性化合物以中性或盐的形式配制成组合物。药物学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)、与无机酸例如盐酸或磷酸或者乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等有机酸形成。也可以从无机碱或有机碱衍生出的物质与游离的羧基基团形成的盐，所述无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁等，所述有机碱可以是异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
所述载体也可以是含有下列物质的溶剂或分散介质例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇等)、及其合适的混合物、以及植物油。可以通过下述操作来保持适当的流动性例如用卵磷脂等包被、保持分散状态下所需的颗粒大小以及使用表面活性剂。可以通过各种抗菌或抗真菌剂防止微生物的作用，例如parabens、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。多数情况下，优选地包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂来实现注射组合物的延迟吸收，例如单硬脂酸铝及明胶。
可以通过下述操作制备无菌注射液将所需量的活性化合物引入到已含有上述其他成分的适当溶剂中，按照要求，然后过滤除菌。通常通过下述操作制备分散体系将各种无菌活性成分引入到一无菌载体中，该载体中含有碱性分散介质和上述的所需的其他成分。就用于制备无菌注射液的无菌粉末而言，优选的制备方法为真空干燥及冻干技术，这些技术可以制备出活性成分粉末外加来自其上述消毒过滤溶液的任一附加的需要的成分。在某些情况下，本发明的治疗制剂还可以配制成适合局部给药的形式，例如乳剂和洗剂。这些形式可以用于治疗皮肤相关疾病，例如各种肉瘤。
配制时，溶液可以与剂量制剂形式相容的方式给药，并采用治疗有效量。所述制剂很容易按照多种剂量形式来给药，例如上述类型的注射溶液，药物缓释胶囊等。
就含水溶液的非肠道给药而言，例如如有必要应将溶液适当缓冲处理，并且首先用足量的盐或葡萄糖液态稀释使其等渗。这些特定的含水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下以及腹膜内给药。在这种情况下，本领域技术人员可以从本发明的公开内容中获知可以使用的无菌含水介质。例如，可以将一份剂量溶解在1mL等渗的NaCl溶液中，以及要么加入1000ml皮下灌注液要么在预定的灌注位点注射(参见例如，″Remington′s Pharmaceutical Sciences″15th Edition，pp.1035-1038和1570-1580)。必要时可根据接受治疗的患者的情况对剂量进行一些调整。无论何种情况下，负责给药的人员都应当确定适于患者个体的合适剂量。
从多种方式中任选一种都可以实现癌组织的靶向。通过质粒载体、反转录病毒载体、腺病毒载体以及其他现有的病毒及非病毒载体都可靶向人体癌症部位。本发明人已相当成功地实现了使用以脂类为基础的复合物将E1A基因靶向癌细胞。可以通过静脉内注射将基因导向细胞，包括转化细胞。直接注射复合物到癌症邻近部位也可以用来将所述复合物靶向一些形式的癌症。例如通过将脂类混合物直接注射入患有卵巢癌患者的腹膜腔中，可以实现卵巢癌的定位。当然，被癌细胞群选择性吸收的脂类复合物也可以如上所述那样用来将肿瘤抑制基因选择性地靶向特定的癌细胞。
本领域技术人员可以认识到简单地就能够确定用E1A抑制癌症的最佳方案。这并非一个试验性问题，而是一个最优化的问题，常规上是在医学领域完成。本发明所述的体内研究提供了一个开始点，可以从此对剂量和递送方案进行优化。最初的注射频度是一周一次，在小鼠试验中是这样。然而，根据最初临床试验得到的结果以及特定患者的需要，可以将这种频度从一天优化调整到以月来计算。最初确定人用量是从小鼠使用E1A的量推算出来的，大约每50g体重15μg。因此，一位50kg的妇女需要的治疗剂量为每剂量中含15mgDNA。当然，所述剂量可以上下调整，如这类治疗方法中常规操作的那样，这要视最初临床试验的结果和特定患者的需要而定。
D.配合治疗为了增强与本发明所述的E1A为基础的基因治疗配合治疗的效果，可以期望将这些组合物与其他能有效治疗癌症的药物配合。
在本发明的范围内，因此尝试将E1A为基础的基因治疗与其他本领域已知的抗癌治疗配合使用以治疗涉及Akt活化和/或p38灭活的癌症。涉及Akt和p38的多种癌症，包括前期癌、肿瘤、恶性癌症，都可以用本发明所述的方法进行治疗。可以用本发明所述方法进行治疗的一些癌症包括乳腺、前列腺、肝、骨髓瘤、膀胱、血、骨、骨髓、脑、结肠、食管、胃肠、头、肾、肺、鼻咽、颈、卵巢、皮肤、胃以及子宫癌。
其他抗癌治疗方法可以在以E1A为基础的基因治疗之前或随后进行，间隔为几分钟至几天至几周。在将另一抗癌治疗方法和E1A为基础的基因治疗一起进行的实施方案中，通常应当确保间隔的时间段不超过每一送递的时间。这些情况下，预计用这两种模式对病人给药，每种模式的给药时间为12-24小时，优选为6-12小时，其最优选的延迟时间只有约12小时的。在一些情况下，为了显著治疗可以超过时间段，但是，此时每一次治疗之间应当间隔几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
另外可以相信的是，需要用另一抗癌治疗和E1A为基础的基因治疗其中之一进行不止一次的治疗直至实现癌症的痊愈。各种配合都可以使用，其中所述另一种抗癌治疗药物为“A”，E1A为基础的基因治疗为“B”，例示如下A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/AA/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B其他配合也可以试用。每一药剂的确切剂量及方案可由本领域技术人员进行适当调整。
使用的其他抗癌治疗的一些实例如下所述。
a)化疗药物能够破坏DNA的药物为化疗药物。这些可以是，例如直接交联DNA的药物，嵌入DNA的药物，以及通过影响核酸合成引发染色体及有丝分裂异常的药物。直接交联核酸，特别是DNA的药物是可以见到的，以顺铂，以及其他DNA烷基化试剂为代表。破坏DNA的药物也可以包括干扰DNA复制、有丝分裂以及染色体分离的化合物。
化疗药物的一些实例包括抗生化疗药物，例如阿霉素，道诺霉素，丝裂霉素(也称为丝泰霉素和/或丝裂霉素-C)，放线菌素D，博来霉素，普卡霉素(plicomycin)，植物生物碱，例如红豆杉醇、长春新碱、长春碱，烷基化试剂，例如，卡氯芥、苯丙氨酸氮芥(又称左旋溶内瘤素、L-苯基丙氨酸芥、苯基丙氨酸芥、L-PAM、或L-sarcolysin，其是氮芥的一种苯基丙氨酸衍生物)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安(又称myleran)、罗氮芥；以及混溶剂(miscellaneousagents)，例如顺铂(CDDP)，碳化铂，甲基苄肼，二氯甲基二乙胺，喜树碱，异环磷酰胺，亚硝基脲，Etoposide(VP16)，他莫昔芬，肿瘤坏死因子，雷诺昔芬，雌激素受体结合剂，Gemeitabine，Navelbine，法尼基-转移酶抑制剂，反铂，5-氟尿嘧啶，以及甲氨蝶呤，Temazolomide(DTIC的含水形式)，或者上述物质的任一类似物或衍生变体。
(i)抗生素阿霉素 阿霉素盐酸盐，5，12-萘醌，(8s-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三乙氧基a-L-来苏(lyxo)-六吡喃基)氧代]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-羟乙基)-1-甲氧基-氢氯化物(羟基化道诺霉素氢氯化物，亚德里亚霉素)是一种广谱的抗肿瘤药物。它可结合DNA并抑制核酸合成，抑制有丝分裂并促进染色体异常。
单独使用时，它是治疗甲状腺瘤和初期肝细胞瘤的首选药物。它是治疗下列肿瘤的31种首选配合中的一种成分卵巢、子宫内膜和乳腺癌、支气管原燕麦细胞癌、非小叶细胞肺癌、胃腺癌、眼癌、成神经细胞瘤、蕈样霉菌病、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、骨髓瘤、扩散的组织细胞淋巴瘤、维耳姆斯氏瘤、何杰金氏病、肾上腺肿瘤，骨源性肉瘤、软组织肉瘤、尤因、氏瘤，横纹肌肉瘤以及急性淋巴细胞白血病。它是治疗岛细胞、子宫颈、睾丸和肾上腺皮质癌的替代药物。它还是一种免疫抑制剂。
阿霉素吸收程度很低，其必须经静脉内给药。药物动力学为多间隔的。分布相的半衰期为12分钟和3.3小时。清除半衰期约为30小时。其中的40～50％分泌到胆汁中。大部分残余物在肝胀中代谢，部分为活性代谢产物(阿霉素)，而其中的百分之几排放到尿中。当有肝损伤存在时，应当减小剂量。
合适的剂量是，静脉内，成人，60～75mg/m2间隔21天，或者20～30mg/m2或者每隔3～4周重复连续2或3天连续给药，或者20mg/m2每周一次。当此前的化疗或肿瘤性转化的骨髓发作造成骨髓抑制，或者在与其他骨髓形成的抑制性药物联用的情况下，老年患者应当采用最低量。如果血清胆红素为1.2～3mg/dL，则应将剂量减少50％，如果高于3mg/dL，则减少75％。心脏功能正常的患者的终生总剂量不能超过550mg/m2，接受过纵膈照射的人该用量为400mg/m2。替代地，每隔4周连续3天给药一次，用量为30mg/m2。例举剂量可以为10mg/m2、20mg/m2、30mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、150mg/m2、175mg/m2、200mg/m2、225mg/m2、250mg/m2、275mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2、425mg/m2、450mg/m2、475mg/m2、500mg/m2。当然，所有这些剂量都是列举的，任一落入这些点之间的剂量也在本发明范围之内。
道诺霉素 道诺霉素盐酸盐，5，12-萘醌，(8s-顺式)-8-乙酰基-10-[(3-氨基-2，3，6-三乙氧基a-L-来苏(lyxo)-六吡喃基)氧代]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-10-甲氧基-氢氯化物；又称柔红霉素。道诺霉素嵌入DNA，阻断DNA引导的MA聚合酶，并抑制DNA的合成。可以采用能阻止细胞分裂但不干扰核酸合成的剂量。
与其他药物联用时，它可以纳入成人急性髓细胞性白血病(引起缓解)、急性淋巴细胞白血病以及慢性髓细胞性白血病的急性期首选化疗中。口腔吸收性差，必须静脉注射。分布半衰期为45分钟，清除半衰期为约19小时。其活性代谢物道诺霉素的半衰期为约27小时。道诺霉素大部分在肝胀内代谢，还有分泌到胆汁中(ca40％)。肝或肾功能不全则者必须减少用量。
合适剂量为(基本量)，成人静脉内，小于60岁，45mg/m2/天(就大于60岁患者而言为30g/m2)每隔3或4周给药1、2或3天，或者0.8mg/kg/天每隔3或4周给药3～6天；终生用量应不超过550mg/m2，如已接受过胸部照射只为450mg/m2；儿童，25mg/m2每周一次，小于2岁的患儿或者体表面积小于0.5m的除外，这种情况下可以使用以重量为基础的成人方案。注射剂量形式可获得(基本量)20mg(作为相对21.4mg盐酸的基本量)。例举剂量可以为10mg/m2、20mg/m2、30mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、150mg/m2、175mg/m2、200mg/m2、225mg/m2、250mg/m2、275mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2、425mg/m2、450mg/m2、475mg/m2、500mg/m2。当然，所有这些剂量都是列举，任一落入这些点之间的剂量也在本发明范围之内。
丝裂霉素 丝裂霉素(又称丝泰霉素和/或丝裂霉素-C)是一种分离自新生头状链霉菌的抗生素，现已表明其具有抗肿瘤活性。该化合物是热稳定性的，具有一高熔点，可自由溶解于有机溶剂中。
丝裂霉素可选择性地抑制脱氧核糖核酸(DNA)的合成。鸟嘌呤及胞核嘧啶的含量与丝裂霉素介导的交联程度相关。当药物高浓度时，细胞RNA及蛋白质的合成也受到抑制。
在人体内，静脉给药后丝裂霉素迅速地从血清中清除。30mg批量注射后血清浓度减少50％所需时间为17分钟。静脉注射30mg、20mg或10mg后，最大血清浓度分别为2.4mg/mL、1.7mg/mL和0.52mg/mL。清除主要受肝内代谢的影响，但是其他组织内也发生代谢。清除速率与最大血清浓度成反比，这是由于降解途径的饱和的原因。
约占剂量10％的丝裂霉素完整地排泄入尿中。由于代谢途径在相对低剂量时饱和，所以排放入尿中的剂量的百分随剂量的增大而增加。就儿童而言，静脉内注射的丝裂霉素的排泄情况也是类似的。
放线菌素D 放线菌素D[50-76-0]；C62H86N12O16(1255.43)，一种抗能够抑制DNA依赖性RNA聚合酶的抗癌药。它是用于治疗下列肿瘤的首选联用方案的一种成分绒膜癌、胚横纹肌肉瘤、睾丸肿瘤和维耳姆斯氏瘤。对全身治疗无应答的肿瘤有时会应答局部灌注的肿瘤，放线菌素D可增强放疗效果。它是次级(传导)免疫抑制剂。
放线菌素D用于与初期手术治疗、放疗以及其他药物联用，具体为长春新碱和环磷酰胺。抗癌活性在尤因氏瘤、卡波济氏肉瘤和软组织肉瘤中也已观察到了。放线菌素D对患有进行性绒膜癌的妇女也有效。与苯丁酸氮芥和甲氨蝶呤联用可以对患有转移性睾丸癌的患者有持续的作用。有时在患有何杰金氏疾病和非何杰金氏淋巴组织瘤的患者中也可以观察到应答。放线菌素D也可以用于抑制免疫应答，尤其是肾抑制排异反应。
剂量的一半完整地排放到胆汁中，10％入尿；半衰期为约36小时。该药物不通过血脑屏障。放线菌素D以冻干粉末的形式提供(每小管0.5mg)。常规每日剂量为10～15mg/kg；静脉内给药5天；如无毒性反应，隔3～4周后给另外的疗程。儿童的每日注射量为100～400mg，共10～14天；在其他方案中，已经使用，3～6mg/kg，总共为125mg/kg，每周保留剂量为7.5mg/kg。尽管将药物使用到静脉灌注的小管中更为安全，但是也已给出了直接静脉注射，为了避免皮下反应，应当注意要将从小管中取液用过的针头丢弃。例举剂量为100mg/m2、150mg/m2、175mg/m2、200mg/m2、225mg/m2、250mg/m2、275mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2、425mg/m2、450mg/m2、475mg/m2、500mg/m2。当然，所有这些剂量都是列举，任一落入这些点之间的剂量也在本发明范围之内。
博来霉素 博来霉素是一种从一株轮枝链霉菌中分离的细胞毒性的糖肽类抗生素的混合物。其可以无限制地溶于水。尽管博来霉素确切的作用机制还是未知的，但是现有证据表明主要的作用模式是抑制DNA的合成，一些证据表明较少地抑制RNA和蛋白质的合成。
就小鼠而言，高浓度博来霉素被发现于皮肤、肺、肾、腹膜和淋巴管。现已发现皮肤和肺的肿瘤细胞有着高浓度的博来霉素，而造血组织中的浓度较低。骨髓中博来霉素浓度较低，这与该组织中发现的高水平的博来霉素降解酶有关。
每分钟肌酸酐清除大于35ml的患者，博来霉素的血清或血浆终末清除半衰期为约115分钟。每分钟肌酸酐清除小于35ml的患者，博来霉素的血清或血浆终末清除半衰期随着肌酸酐清除的减小而指数级的增大。就人而言，使用剂量的60％～70％可作为活性博来霉素从尿中回收。
博来霉素被认为是一种缓和治疗。可以独自或与治疗鳞状细胞癌的化疗药物联用治疗下列癌症例如头及颈部(包括口腔、舌头、扁桃腺、鼻咽、口咽窦、上腭、唇、口腔黏膜、齿龈、会厌、喉)、皮肤、茎、子宫颈以及阴户。它还可以用于治疗淋巴瘤和睾丸癌。
由于可能出现抗过敏反应，淋巴瘤患者前两个剂量应该用两个单元或更少量来治疗淋巴瘤患者。如无急性反应发生，那么就可以采用常规的剂量方案。
何杰金氏疾病和睾丸肿瘤的疗效是明显的，在两周内就可显效。如果此时未见效果，则不可能出现效果。磷状细胞癌的应答是更加缓慢，有时在出现效果前需要长达3周的时间。博来霉素可以经肌内，静脉内，或皮下途径给药。
(ii)混溶剂顺铂 顺铂已广泛地用于治疗癌症例如转移性睾丸或卵巢癌，进行性膀胱癌、头颈癌、子宫颈癌、癌或者其他肿瘤。顺铂可以单独使用，也可与其他试剂联用，临床使用的有效剂量为15-20mg/m2每隔3周用药5天，共3个疗程。例举剂量可以为0.50mg/m2、1.0mg/m2、1.50mg/m2、1.75mg/m2、2.0mg/m2、3.0mg/m2、4.0mg/m2、5.0mg/m2、10mg/m2。当然，所有这些剂量都是列举，任一落入这些点之间的剂量也在本发明范围之内。
顺铂无法通过口服吸收，因此必须通过静脉内、皮下、肿瘤内或腹膜内注射来递送。
顺铂可以与大黄素或大黄素类化合物联合用来治疗非小叶细胞肺癌。顺铂与大黄素或大黄素类化合物联用也可以用来治疗任一种神经-介导的癌症。
VP16 VP16又称依托泊苷主要用于治疗睾丸肿瘤，与博来霉素和顺铂联用，以及与顺铂联用用来治疗肺的小叶细胞癌。它还具有抗下述病症的活性非-何杰金氏淋巴瘤，、急性非淋巴细胞性淋巴瘤、乳腺癌以及与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)有关的卡波济氏肉瘤。
VP16可以作为溶液形式(20mg/ml)用于静脉内给药，以及制成口服用的5mg充满脂类胶囊。就小叶细胞肺癌而言，所述静脉内剂量(联合治疗)可以多达100mg/m2或者低至2mg/m2，常规为35mg/m2，每天用药共4天，也可以采用每天用药50mg/m2共5天。当口服给药时，所述剂量可以加倍。因此小叶细胞肺癌的剂量可以高达200～250mg/m2。睾丸癌的静脉用量(联合治疗)为每日用药50～10mg/m2共5天，或者100mg/m2隔天使用，共三个剂量。通常每隔3～4周重复治疗周期。为了避免高血压和支气管痉挛应当在30～60分钟输注过程中缓慢给药，这有可能是由于制剂中使用的溶剂引发的。
肿瘤坏死因子 肿瘤坏死因子[TNF；Cachectin]是一种糖蛋白，它能够杀死某些类型癌细胞、活化细胞因子的生成、活化巨噬细胞及内皮细胞、促进胶原及胶原酶的生成，是一种炎性介质，还是一种腐败性休克的介质，并且可以加速分解代谢、促进发热和睡眠。一些感染因子由于TNF生成的刺激会导致肿瘤回归。当以有效量单独使用时TNF毒性很强，因此最佳方案可能可能采取低剂量并联用其他药物。它的免疫抑制作用可以通过γ干扰素增强，因此这种联用有潜在的危险性。另外发现一种TNF与干扰素α的杂合体具有抗癌活性。
(iii)植物生物碱红豆杉醇 红豆杉醇是一种实验性抗有丝分裂剂，其分离自灰树的树皮，短叶紫杉(Taxus brevifolia)。它能结合微管蛋白(其位点与长春蔓生物碱所使用的位点不同)并能促进微管的组装。红豆杉醇目前正在临床评估阶段；它还具有抗恶性黑素瘤和卵巢癌的活性。每天的最大剂量为30mg/m2使用5天或者210-250mg/m2每隔3周给药一次。当然，所有这些剂量都是列举，任一落入这些点之间的剂量也在本发明使用范围之内。
长春新碱 长春新碱能够阻断有丝分裂并出现中期停顿。这种药物的上述生物活性的大部分可以从它能够特异性结合微管蛋白并能够阻断蛋白质多聚化为微管的能力得到解释。通过有丝分裂器微管的破裂，细胞分裂在中期停顿。有丝分裂期间不能正确分离染色体可能会导致细胞死亡。
长春新碱对于正常骨髓细胞及表皮细胞相对低的毒性使得该抗肿瘤药物与不同于其他抗肿瘤药物，而且它常常与其他髓抑制药物(myclosuppressiveagents)联用。
长春碱或长春新碱口服用药之后的非预期吸收已有报道。常规临床用量时每种药物的浓度峰值都约为0.4mM。
长春碱和长春新碱结合血浆蛋白。它们广泛地浓缩于血小板中，并且较少部分浓集于淋巴细胞和红细胞中。
长春新碱从血浆中的清除方式为多阶段方式；终末半衰期约为24小时。该药物在肝中代谢，但是还未鉴定到任何具有生物活性的衍生物。肝功能异常的患者应该减小剂量。如果血浆中胆红素的浓度大于3mg/dl(约50mM)，则建议减少至少50％的剂量。
长春新碱的硫酸盐可以溶液形式(1mg/ml)静脉注射。将与皮质甾类联用是目前减少儿童白血病免除的治疗选择；这些药物的最佳剂量为长春新碱，静脉内，2mg/m2体表面积，每周用药，以及脱氢皮质(甾)醇，口服，40mg/m2，每日用药。患有何杰金氏疾病或非何杰金氏淋巴瘤的成年患者通常作为复合方案的一部分收到长春新碱。当用于MOPP治疗方案时，长春新碱的建议用量为1.4mg/m2。高剂量长春新碱似乎对于患有白血病的儿童来说似乎比成年人能更好的耐受，成年人可能经受严重的神经毒性。以比每隔7天更高的频度或以更大剂量施用时会增加毒性程度但反应速率并没有相应加快。静脉施用长春新碱时应当注意避免溢出。长春新碱(以及长春碱)可以输注到为肿瘤提供的动脉血中，其剂量可比那些带有相应毒性静脉输注的药物的剂量大数倍。
长春新碱在何杰金氏疾病及其他淋巴瘤中已经显示了疗效。尽管单独用于何杰金氏疾病时其效果略差于长春碱，但是当与氮芥、脱氢皮质(甾)醇，及甲基苄肼联用(即所谓的MOPP治疗方案)时，它是该病后期(III和IV期)的优选治疗药物。就非何杰金氏淋巴瘤而言，长春新碱是一种重要的药物，特别是与环磷酰胺、博来霉素、阿霉素和脱氢皮质(甾)醇联用时。在淋巴细胞性白血病中长春新碱比长春碱更有效。患有多种其他肿瘤的患者，特别是维耳姆斯氏瘤、成神经细胞瘤、脑瘤、横纹肌肉瘤、和乳腺癌、膀胱癌、男性或女性生殖系统的患者已经报道了良好的疗效。
长春新碱的用量由临床医师根据患者个体需要来确定。可以施用0.01～0.03mg/kg或者0.4～1.4mg/m2或者也可以按1.5～2mg/m2施用。替代地，可以连续静脉输注的方式按下列剂量给药0.02mg/m2、0.05mg/m2、0.06mg/m2、0.07mg/m2、0.08mg/m2、0.1mg/m2、0.12mg/m2、0.14mg/m2、0.15mg/m2、0.2mg/m2、0.25mg/m2。当然，所有这些剂量都是列举，任一落入这些点之间的剂量也在本发明使用范围之内。
长春碱 当用长春碱温育细胞时，发生微管分解。已经报道了口服长春碱或长春新碱后的非预期吸收。常规临床用量时每种药物的浓度峰值都约为0.4mM。长春碱和长春新碱结合血浆蛋白。它们广泛地浓缩于血小板中，并且较少部分浓集于淋巴细胞和红细胞中。
静脉注射后，长春碱从血浆中的清除方式为多阶段方式；分布后，药物从血浆中消失的半衰期约为1～20小时。
长春碱在肝内代谢成生物活性衍生物脱乙酰基长春碱。约占施用剂量15％可以在尿中完整地检测到，并且胆汁排泄后约10％可从粪便中回收。肝功能异常的患者应该减小剂量。如果血浆中胆红素的浓度大于3mg/dl(约50mM)，则建议减少至少50％的剂量。
长春碱的硫酸盐可以制成注射液的制剂形式。该药物静脉给药；特别注意要防止皮下溢出，由于这会导致发炎和溃疡。这种药物不要注射到引发损害循环的极点。0.3mg/kg体重的单剂量后，髓抑制7～10天到达最大。如果不能将白细胞保持在中等水平(约3000细胞/mm3)，那么就可以通过0.05mg/kg体重的增量来逐渐增加每周剂量。在为治愈睾丸癌而设计的方案中，无论血细胞数量或毒性如何，长春碱的剂量都为每3周0.3mg/kg。
长春碱最重要的用途是与博来霉素及顺铂联用于转移性睾丸肿瘤的治疗中。各种淋巴瘤，特别是何杰金氏疾病中已取得了良好的疗效，其中50～90％的病例有了显著的改善。当淋巴瘤对烷基化剂有抗性时，长春碱在大部分淋巴瘤中的效果都不会减弱。它在卡波济氏肉瘤、成神经细胞瘤、以及累-赛二氏疾病(组织细胞增多病x)、以及妇女的胸腺及绒(毛)膜癌中都具有活性。
长春碱的用量由临床医师根据患者个体需要来确定。可以施用0.1～0.3mg/kg或者也可以施用1.5～2mg/m2。替代地，可以按照0.1mg/m2、0.12mg/m2、0.14mg/m2、0.15mg/m2、0.2mg/m2，、0.25mg/m2、0.5mg/m2、1.0mg/m2、1.2mg/m2、1.4mg/m2、1.5mg/m2、2.0mg/m2、2.5mg/m2、5.0mg/m2、6mg/m2、8mg/m2、9mg/m2、10mg/m2、20mg/m2给药。当然，所有这些剂量都是列举，任一落入这些点之间的剂量也在本发明使用范围之内。
(iv)烷基化剂卡氯芥 卡氯芥(无菌的卡氯芥)是一种用于治疗某种肿瘤疾病的亚硝基脲。它是1，3-二(2-氯乙基)-1-亚硝基脲。它为冻干的浅黄色絮片或分子量约214.06的凝块。在乙醇和脂类中高度可溶，微溶于水。卡氯芥按照说明书重配后静脉输注给药。通常，无菌卡氯芥的包装为冻干形式装于100mg的单剂量小瓶中。
尽管通常认为卡氯芥会将使DNA和RNA烷基化，但是它并不与其他烷基化剂交互抵触。如同其他亚硝基脲一样，它也可以通过将蛋白质中的氨基酸氨甲酰化来抑制几种酶促过程。
卡氯芥被认为是一种缓和治疗作为单一药物或者与其他在脑瘤中显效的化疗药物联用建立联合治疗，例如成胶质细胞瘤、脑干神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、星细胞瘤、室鼓膜瘤、以及转移性脑瘤。还可以与脱氢皮质(甾)醇联用治疗多发性骨髓瘤。现已证明卡氯芥可以用于治疗何杰金氏疾病和非-何杰金氏淋巴瘤，作为次级治疗与其他在下述患者中显效的药物联用初级治疗时会复发的患者，或者对初级治疗不应答的患者。
卡氯芥作为单一药物用于此前未接受任何处理的患者时，其建议用量为150～200mg/m2每隔6周静脉内给药。这既一次性给药也可以分成每日注射，例如连续两天施用75～100mg/m2。当卡氯芥与其他髓抑制药物联用或者用于骨髓储量耗尽的患者时，应对剂量相应调整。初始剂量之后的用量应当根据患者对于在前剂量的血液学反应进行调整。当然可以理解到其他剂量也可以用于本发明，例如10mg/m2、20mg/m2、30mg/m2、40mg/m2、50mg/m2、60mg/m2、70mg/m2、80mg/m2、90mg/m2、100mg/m2。本领域技术人员可以参考“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第15版，第61章。必要时根据所要治疗对象的情况对剂量做一些改变。无论何种情况，负责给药的人员都应当根据对象个体来确定合适的剂量。
美法仑 美法仑又称左旋溶肉瘤素、L-苯基丙氨酸芥、苯基丙氨酸芥、L-PAM或L-溶肉瘤素，其是氮芥的苯基丙氨酸衍生物。美法仑是一种双功能的烷基化试剂，具有抗选择性人肿瘤疾病的活性。化学上称为4-[二(2-氯乙基)氨基]-L-苯基丙氨酸。
美法仑是该化合物的活性L-异构体，由Bergel和Stock于1953年首次合成；D-异构体，称为抗瘤氨酸，具有较低的抗动物肿瘤活性，其影响染色体的需要量要比L-异构体大。消旋的(DL-)形式称为抗瘤氨酸(merphalan)或溶肉瘤素(sarcolysin)。美法仑不溶于水，其pKa1的值为-2.1。美法仑可以制成口服的片剂，已经用于治疗多发性骨髓瘤。
现有证据表明，约1/3～1/2患有多发性骨髓瘤的患者口服该药后都表现出了良性应答。
美法仑已经用于治疗上皮细胞卵巢癌。用于治疗卵巢癌常规方案为单一疗程、共5天、每天用量为0.2mg/kg。每隔4～5周重复疗程，视血液学耐受程度而定(Smith和Rutledge，1975；Young等，1978)。替代地，美法仑使用量可以低至0.05mg/kg/天或者高达3mg/kg/天或者落在这些剂量之间或者超过这些剂量的任一剂量。必要时根据所要治疗对象的情况对剂量做一些改变。无论何种情况，负责给药的人员都应当根据对象个体来确定合适的剂量。
环磷酰胺 环磷酰胺是2H-1，3，2-Oxazaphosphorin-2-胺、N，N-二(2-氯乙烯基)四氢-2-氧化物、一水合物；购自Mead Johnson的名为癌得散(Cytoxan)的产品；购自Adria的名为Neosar的产品。环磷酰胺是在三乙胺催化的条件下由3-氨基-1-丙醇与N，N-二(2-氯乙基)二氯氨基磷酸[(ClCH2CH)2N-POCl2]在二氧杂环己烷溶液中缩合合成。缩合反应是双相的，涉及羟基和氨基，因此会影响环化。
与其他β-氯乙胺烷基化剂不同，在肝细胞酶活化之前它不易环化成活性的乙基ethyleneimonium形式。因此，该物质在胃肠道中是稳定的，口服或非肠道给药的耐受性好并且有效，而且不会引起局部起疱、坏死、静脉炎或者甚至疼痛。
成人的合适用量包括，口服，1～5mg/kg/天(通常联用)，根据胃肠道耐受程度而定；或者1～2mg/kg/天；静脉内，2～5天期间分割剂量初始为40～50mg/kg或者每隔7～10天、10～15mg/kg/天或每周2次3～5mg/kg或1.5～3mg/kg/天。可以用250mg/kg/天的剂量抗肿瘤。由于胃肠道的副作用，所以优选静脉内途径。保持期间，通常期望的白细胞数目为3000～4000/mm3。该药物也可以肌内给药，通过渗透或进入体腔。剂量形式还可以采用注射100、200及500mg，以及片剂25及50mg，有关用量的细节本领域技术人员可以参考″Remington′s Pharmaceutical Sciences″第15版，第61章，在此引入作为参考。
苯丁酸氮芥 苯丁酸氮芥(又称瘤可宁)由Everett等人(1953)首次合成。是一种双功能的烷基化试剂，具有抗选择性人肿瘤疾病的活性。化学上称为4-[二(2-氯乙基)氨基]-苯丁酸。
苯丁酸氮芥可以采取口服给药，它可被胃肠道迅速并完全地吸收。单一口服剂量为0.6-1.2mg/kg，血浆苯丁酸氮芥水平服药后1小时达到峰值，parentdrug药物的终末半衰期为1.5小时。可以按照0.1～0.2mg/kg/天或3～6mg/m2/天或替代地0.4mg/kg的量用于抗肿瘤治疗。治疗方案为本领域技术人员所熟知，可参见“Physicians Desk Reference”和”Remingtons Pharmaceutical Sciences”作为参考。
苯丁酸氮芥可用于治疗慢性淋巴(淋巴细胞)白血病、恶性淋巴瘤包括淋巴肉瘤、巨淋巴小结的淋巴瘤以及何杰金氏疾病。虽然该药物不能治疗上述的任一病症，但是可以临床上起到减缓的作用。
白消安 白消安(又称马勒兰)是一种双功能烷基化剂，化学上称为1，4-丁二醇二甲基磺酸盐(dimethanesulfonate)。
白消安是氮芥的一种结构类似物。白消安可以片剂形式口服。每一片中含2mg白消安以及非活性成分硬脂酸镁和氯化钠。
白消安对于慢性骨髓性(骨髓瘤、骨髓细胞、粒细胞)白血病有指示。尽管没有治疗意义，但是白消安可以减少粒细胞的量、减轻疾病症状和改善患者的临床状态。慢性骨髓性白血病此前未经治疗的成年患者中约90％通过使用白消安后内脏巨大退化或稳定而获得了血液缓解。表明从存活时间和血球蛋白水平保持的角度来看，该药物优于脾脏照射，等效于对照用脾大上的照射。
洛莫司汀 洛莫司汀是一种用于治疗某种肿瘤疾病的亚硝基脲。它是1-(2-氯-乙基)-3-环己基-1亚硝基脲。它是一种黄色粉末，实验式为C9H16ClN3O2，分子量为233.71。洛莫司汀可溶于10％乙醇(0.05mg/mL)以及无水酒精(70mg/mL)。洛莫司汀相对不溶于水(＜0.05mg/mL)。相对统一为生理pH值。洛莫司汀胶囊中的非活性成分是硬脂酸镁和甘露醇。
尽管通常认为洛莫司汀会将DNA和RNA烷基化，但是它并不与其他烷基化剂交互抵触。如同其他亚硝基脲一样，它也可以通过将蛋白质中的氨基酸氨甲酰化来抑制几种酶促过程。
其可以口服，口服剂量为30mg/m2～100mg/m2的放射性洛莫司汀后，所给的降解活性约一半在24小时内以降解产物的形式排泄。
代谢物的血清半衰期为16小时～2天。静脉给药15分钟后，组织水平与血浆水平相当。
除其他治疗形态外，洛莫司汀可以用作单一药剂，或者用于已有的联合治疗，与其他在原发及转移性脑瘤显效的化疗药物联用，用于已经接受了外科手术和/或放疗的患者。现已证明洛莫司汀在抗何杰金氏疾病的次级治疗中有效，与其他在下述患者中显效的药物联用初级治疗时会复发的患者，或者对初级治疗不应答的患者。
当洛莫司汀对预先未接受治疗的患者单独用药时，建议剂量为每隔6周单一口服剂量130mg/m2。就骨髓功能易受损害的患者而言，该剂量应当减小至每隔6周100mg/m2。当洛莫司汀与其他骨髓抑制药物联用时，应对剂量进行调整。应当理解到的是可以使用其他剂量，例如20mg/m2、30mg/m2、40mg/m2、50mg/m2、60mg/m2、70mg/m2、80mg/m2、90mg/m2、100mg/m2、120mg/m2或其他任一位于这些数值之间的剂量，这需要由临床医师根据接受治疗个体的情况来决定。
b)放疗试剂放疗试剂及因素包括放射以及能够导致DNA损伤的波，例如γ-照射、X-射线、UV-照射、微波、电子发射、放射性同位素等。通过用上述的照射形式对定位后的肿瘤位点进行照射可以达到治疗的目的。最大可能是所有这些因素会大范围地损伤DNA、破坏DNA前体、影响DNA的复制及修复，以及染色体的组配及维持。
X-射线的剂量范围为从每日剂量50～200伦琴，长时间段(3～4周)，到单剂量2000～6000伦琴。放射性核素的用量差异很大，这取决于核素的半衰期、放射发射强度及类型以及肿瘤细胞的摄入。
c)外科治疗大约60％的癌症患者都会接受某种类型的外科治疗，其中包括预防性、诊断及分类性、治疗及减缓性手术。治疗性手术是一种可以与其他治疗手段联用的癌症治疗手段，例如与本发明所述治疗方法、化疗、放疗、激素疗法，基因治疗、免疫治疗和/或替代疗法。
治疗性外科手术包括切除术，在此过程中全部或部分癌组织被物理性地去除、切割和、或破坏。肿瘤切除术是指机械地除去至少部分肿瘤。除肿瘤切除术外，外科治疗方法还包括激光手术、冷冻手术，电外科以及纤维控制手术(莫尔式手术)。进一步表明本发明可以与表面癌、前期癌或者偶然量的正常组织的摘除配合使用。
当将一部分癌细胞、组织或者肿瘤切除时，体内会形成一个空腔。通过灌注、直接注射或局部使用结合另外的抗癌治疗手段达到治疗目的。这些治疗手段可以重复，间隔1、2、3、4、5、6或7天，或者间隔1、2、3、4和5周或者间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗在剂量上也可以不同。
d)免疫治疗免疫治疗通常依赖于免疫效应细胞及分子来定位并破坏癌细胞。所述免疫效应物可以是，例如特异于某一肿瘤细胞表面的某一标记的抗体。该抗体本身可以用作治疗的效应物，或者它可以征集其他实际上具有杀死细胞能力的细胞。还可以将所述抗体偶合到一种药物或毒素(化疗、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)上并且仅作为一种靶向试剂来使用。替代地，所述效应物可以是一带有表面分子的淋巴细胞，该表面分子能够直接或间接地与肿瘤细胞的靶位相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。免疫治疗也可以用作联合治疗的一部分，与基于以E1A为基础的基因治疗上的治疗手段联用。
接下来讨论联合治疗的常规方法。一方面，所述免疫治疗可以用来定位肿瘤细胞。存在着许多的肿瘤标记，它们中的任一种都适于本发明所述的定位。常见的肿瘤标记包括癌胚抗原、前列腺特定抗原、尿肿瘤相关抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B以及p155。还有交替免疫刺激分子，包括细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趋化因子(chemokine)例如MIP-1、MCP-1、IL-8以及生长因子例如FLT3配体。将免疫刺激分子与本发明所述的基于以E1A为基础的基因治疗的联合治疗方法联用，将会增强抗肿瘤的效果。
(i)被动免疫治疗 现有多种不同被动免疫治疗癌症的方法。广义上可以分为下列类型单独注射抗体；注射抗体与毒素或化疗药物偶联在一起；注射偶联有放射性核素的抗体；注射抗独特型抗体；以及最终，净化骨髓中的肿瘤细胞。
(ii)主动免疫治疗 主动免疫治疗中，施用一种抗原性肽、多肽或蛋白、或者一种自身或异源肿瘤细胞组合物或“疫苗”，通常配以一独特的细菌佐剂(Ravindranath和Morton，1991；Morton和Ravidranath，1996；Morton等人，1992；Mitchell等人，1990；Mitchell等人，1993)。
(iii)获得性免疫治疗 在获得性免疫治疗中，体外分离患者的循环淋巴细胞、或其浸润细胞，用IL-2活化或用肿瘤坏死基因转导，然后重新给予(Rosenberg等人，1988；1989)。为了实现这一目的，将免疫有效量的活化淋巴细胞与本发明所述的引入佐剂的抗原性肽组合物联用，给予动物。所述的活化淋巴细胞最优选为患者自身的细胞，这样就更容易从血液或肿瘤样品中分离，并体外活化(或“膨胀”)。
e)基因治疗在另一个实施方案中，将其他基因治疗手段与本发明所述的以E1A为基础的基因治疗联用。根据该实施方案适合使用的基因为编码下列物质的基因肿瘤抑制因子(p53、Rb、p16)、反义癌基因(ras、myc、erb)、凋亡诱导物(Bcl-2、Bax)、激酶以及其他这类基因。
f)其他试剂还提了供可以与本发明联用以增强疗效的其他试剂。一种适于与化疗联用的治疗形式包括高热，它是一种将患者组织暴露于高温(达106°F)。外源或内源性供热装置可以提供局部、区域或者全身高热。局部高热是指向一小的面积例如肿瘤供热。热量可以由从肌体之外的装置靶向肿瘤的高频波从外部提供。内热使用的是一根灭菌探针，其中包括细的加热金属丝或者充满热水的中空管、植入微波天线或者射频(radiofrequency)电极。
患者器官或四肢的加热为局部治疗，它可以利用能产生高能的装置实现，例如磁铁。替代地，可以在灌注入将要内源加热的区域前取出少量患者的血液并加热。当癌症扩散到全身时还要进行全身加热。热水敷层、热蜡、感应线圈以及温盒都可以用于该目的。
激素治疗也可以与本发明联用。激素可以用于某些癌症例如乳腺、前列腺、卵巢、或子宫颈的治疗中，从而降低某些激素，例如睾丸激素或雌激素的水平或者阻断其作用，这样可以减小转移的危险。
E.实施例给出下列实施例是为了对优选实施方案进行说明。本领域技术人员应该理解的是实施例中公开的技术是本发明人为了能很好地实施本发明而提供的代表性技术，因而可以认为是实施本发明的优选模式。但是，本领域技术人员应当理解根据本发明公开的特定实施例所做的任何变化，以及同样或类似的结构，皆不超过本发明的精神和范围。
实施例1材料和方法细胞系和培养人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞在添加10％胎牛血清的杜拜克改进的Eagle’s培养基/F-12(Life Technologies，Inc.)中生长。用pSV-E1A-neo质粒DNA转染MDA-MB-231和MCF-7细胞建立E1A稳定表达细胞系，同时将pSV-neo载体转染到上述细胞中作为转染对照。通过G418筛选(750μg/ml)分离稳定的细胞系，并通过western印迹分析验证。胸苷整合分析该分析如前所述进行。简单地说，将细胞用胰蛋白酶消化，在96-孔板上铺板(3×103个细胞/孔)，然后于各孔中加入0.5μCi[3H]胸苷培养5小时。然后除去标记培养基，并用PBS冲洗。用50μl的1％的胰蛋白酶/PBS使各孔中的细胞释放出来，然后用自动细胞收获仪溶解细胞，将DNA吸附到玻璃纤维滤膜上。干燥滤膜，封进含有10ml闪烁体的样品管中。通过在Betaplate液体闪烁记录仪中进行闪烁记数测定滤膜上存在的放射性。
MTT分析利用活细胞接触紫杉酚后将四唑盐(MTT)代谢转化为甲对活细胞进行间接测定。将细胞(3×103/孔)在每孔含0.2ml培养基的96-孔培养板上接种三次，使细胞粘附24小时。接触紫杉酚一定时间后，向各孔加入20μl的MTT。细胞再次培养2小时，然后加入100μl的提取缓冲液(20％SDS在50％的N，N-二甲基甲酰胺中，pH4.7)。将细胞在37℃培养过夜，测定平板在570nm的吸收度。
制备总-细胞溶解液，Western印迹分析和抗体将细胞用磷酸盐缓冲的盐水冲洗一次，在含20mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、5mM EDTA、10mM NaF、1％Nonidet P-40、1mM PMSF(苯甲基磺酰基氟化物)、1mM NaVO3(原钒酸钠)、和1.5％抑肽酶的溶胞缓冲液中溶解细胞。离心分离细胞提取物，通过Bio-Rad蛋白质分析试剂测定蛋白质的浓度，利用BSA(牛血清白蛋白，Sigma，St.Louis，WA)作为蛋白标准品在分光光度计中分析，然后用标准方法对25微克蛋白质液进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PEGE)分析，并转移到硝酸纤维素膜上(Millipore Corp.，Bedford，MA)。然后对膜进行Western印迹，用增强的化学发光(ECL)系统(Amersham)对印迹显影。
用下列抗体进行免疫印迹抗E1A蛋白的单克隆抗体M58(PharMingen)被用于在稳定细胞克隆中筛选E1A蛋白的表达。从Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)购买兔抗-Bax多克隆抗体和仓鼠抗-人Bcl-2单克隆抗体。从NEB购买兔抗磷酸-特异性p38(p38-p)、磷酸-特异性Akt(Akt-p)、和总p38或Akt多克隆抗体。为了检测HA-标记的p38和Akt，使用单克隆抗-HA抗体(Boerhinger和Mannheim)。
瞬时转染在该研究中使用用于HA-标记的p38MAPK(pMT2T，HA-p38)、HA-myr-Akt(组成性地被激活的Akt，CA-Akt)或HA标记的显性阴性Akt(DN-Akt)的表达载体，以及细胞巨化病毒(CMV)启动子-荧光素酶表达载体(pCMV-luc)。如以前所述应用DC-Chol阳离子脂质体，用2.2μg总DNA转染直径60mm平皿中的1×105个细胞。再次生长48小时后，将细胞分成三组，一组细胞用于接触或不接触紫杉酚24小时后，进行荧光素酶分析，另一组用于分析Akt和38蛋白的表达，第三组进行FACS分析。
免疫沉淀用HA-标记的p38和/或CA-Akt瞬时转染后，用10μM胰岛素刺激细胞15分钟，然后于4℃在含50mM HEPES、pH7.6、150mM NaCl、10mM EDTA、2mM原矾酸钠、100mM NaF、0.5mM PMSF、1mM抑肽酶和1％tritonX-100的缓冲液中溶解细胞15min，制备细胞提取物。在14,000rpm下离心细胞溶解液30分钟。将上清液转移到新试管中。加入正常小鼠或兔IgG，清除蛋白质，用抗-p38、抗-Akt、或抗-HA抗体免疫沉淀。免疫沉淀物在10％SDS-PEGE上溶解分散，然后转移到硝酸纤维素膜上。通过Western印迹检测Akt和p38。用抗-IKK-a抗体作为探针通过Western印迹对同样的膜进行分析，作为Akt免疫沉淀的阳性对照。
常位乳腺癌模型的建立为了在裸鼠中建立常位乳腺癌模型，将人MDA-MB-231细胞接种到小鼠乳腺脂肪垫(m.f.p.)中。监测肿瘤大小，每周测量尺寸。
实施例2Akt和p38在癌细胞中的表达Akt的磷酸盐形式代表活化/过表达的Akt。在筛选中发现，与在不死的NIH3T3非-癌细胞中相比，活化Akt水平在大多数癌细胞中增加。一些被筛选的代表性人癌细胞类型包括乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、和结肠癌细胞系。相比较而言，代表p38活性形式的磷酸化p38蛋白在大多数癌细胞中未检测到。然而，在相同蛋白质含量条件下，在不死NIH3T3非-癌细胞中检测到磷酸化p38蛋白。这证明大多数癌上调或激活了Akt致瘤蛋白，并下调或灭活原-细胞凋亡因子p38。
实施例3E1A下调乳腺癌细胞中的Akt和上调p38磷酸化用单独载体(V)(作为对照)或用E1A(E)转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7，然后生长到指数生长期、收获、制备全细胞溶解液。通过分别抗磷酸-p38和磷酸-AktS437(New England Biolab，NEB)的多克隆抗-磷酸-特异性抗体检测活化磷酸化p38(p38-p)和磷酸化Akt(Akt-p)(图1A)。同时利用来自NEB的抗p38和Akt的多克隆抗体检测总p38和Akt蛋白(图1A)。为了验证E1A在稳定细胞中的表达，使用抗E1A(M58)的单克隆抗体(也参见图1A)。用单独载体转染的两种细胞系中磷酸-p38蛋白水平均在可检测范围内，然而，导入E1A蛋白，磷酸p-38的水平上调。相比较而言，基础磷酸-Akt水平在用单独载体转染的细胞中比在用E1A转染的细胞中高，虽然总p38和Akt蛋白水平在不同转染体中是可比较的。
通过用密度计量仪转化图3A中显示的色带密度(下面将详细描述)，比较载体和E1A稳定细胞之间的比较量差异。分别描记相对p38活性(p38-p对p38-c)和相对Akt活性(Akt-p/Akt-c)。结果在图1B中显示。
应用抗p38和Akt的抗-磷酸特异性抗体得到的结果一致，通过应用GST-ATF-2融合蛋白作为p38激酶的底物，本发明人还发现E1A在MDA-MB-231和MCF-7细胞中的表达显著增强p38激酶的活性。同时，通过应用GST-GSK-3-β作为底物进行的Akt-激酶分析检测到，在这些E1A表达细胞中Akt激酶活性显著被抑制。
分析了E1A抑制胰岛素诱导的Akt激活的能力。细胞在血清饥渴条件下培养过夜，然后用或不用10μM胰岛素刺激15分钟。然后收获细胞，应用抗磷酸-特异性Akt多克隆抗体检测Akt的磷酸化(其是Akt的活性形式)。还检测了总Akt水平，作为蛋白质含量的对照。结果在图2中显示。
实施例4Akt和p38被反向调节为了确定Akt途径和p38途径之间的关系，用这两个途径的抑制剂进行实验。用渥曼青霉素抑制Akt途径。渥曼青霉素是抑制PI3K的药物，其是Akt途径中Akt直接上游的信号蛋白。一种合成化合物，SB203580，用作p38特异性抑制剂。细胞在血清饥渴条件下过夜，然后用SB203580(20μM)或渥曼青霉素(0.1μM)处理4小时、8小时、16小时、24小时、36小时。在E1A稳定表达的MDA-MB-231细胞中，当用SB203580处理8小时阻断p38活性时，Akt活性约增加3倍。而当渥曼青霉素处理4小时阻断Akt活性时，p38活性约增加6倍。相对p38活性(p38-p对p38-c)和相对Akt活性(Akt-p对Akt-c)分别在图3A、图3B和图3C中显示。
实施例5Akt和p38非物理相连为了检测p38和Akt是否物理相连，进行免疫沉淀分析。用HA-标记的组成性活化Akt和野生型p38共转染MDA-MB-231细胞(231)和293T细胞。溶解细胞，转染36小时后收获。分别用抗Akt和p38的多克隆抗体与细胞溶解液共同培养。用蛋白A-琼脂糖小珠沉淀后，冲洗下小珠上的蛋白质，溶解于30ml 2x装样缓冲液，然后进行10％SDS-PEGE。转移到硝酸纤维素膜上后，用抗-Akt(1∶500)和抗-p38(1∶500)抗体作为探针分析膜。这些实验的结果在图3D中显示说明。
实施例6E1A在体外抑制细胞生长需要磷酸-Akt的下调或磷酸-p38的上调亲代MDA-MB-231和E1A稳定细胞在六孔板中铺板三次，生长24小时后，用显性阴性Akt(DN-Akt)或活化的p38加pcDNA3-荧光素酶报告物共转染MDA-MB-231细胞，而用pcDNA3-荧光素酶报告物或组成性活化Akt(CA-Akt)表达构建体，加pcDNA3-荧光素酶报告物基因共转染231-E1A稳定细胞。细胞再次生长48小时，之后收获。然后测定荧光素酶活性，用蛋白浓度标准化，将这些值与亲代MDA-MB-231细胞相比较。应用SB203580(以20μM的浓度加入培养基)，抑制p38的活性。在存在SB203580的条件下，使细胞生长24小时，之后收获用于荧光素酶分析。这些实验的结果在图4中显示，结果证明Akt的灭活或p38的激活对于E1A抑制细胞生长是必要的。
实施例7体外抑制肿瘤发生用野生型E1A或突变E1A转染乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，通过MTT分析(参见图SA)和软琼脂分析(图5B)测定细胞生长。对照包括单独转染到细胞中的pSV-neo载体；WTE1A包括野生型E1A稳定细胞；12S包括12S E1A稳定细胞；dlNT包括N-末端缺失突变的稳定细胞；dlCR1包括CR1区缺失突变的稳定细胞；dlCR2包括CR2区缺失突变的稳定细胞；dlDM包括N-末端加CR2区缺失突变的稳定细胞。因此，这些实验分析了各种不同E1A蛋白、肽、或多肽，或者编码E1A蛋白、肽、或多肽(包括E1A突变体)的核酸对过表达Akt的癌细胞的影响。因此，在Akt-活化的乳腺癌MDA-MB-231细胞中，E1A抑制软琼脂中的固定物-依赖性和固定物-独立性细胞的生长。
实施例8体内抑制肿瘤发生如前面实施例1所述，在裸鼠中建立常位乳腺癌模型。简单地说，将人MDA-MB-231细胞接种到小鼠乳腺脂肪垫(m.f.p.)中。每只小鼠接种两次，一次在乳腺脂肪垫(mfp)上部，另一次在下部，对于每组转染体接种5只小鼠。每只mfp接种2x106个细胞。接种后八天监测肿瘤体积，然后每4天监测一次，连续八周。用下面的公式计算肿瘤重量肿瘤重量(mg)＝1/2lw2，其中l代表长度，w代表宽度。
如图6所示，野生型E1A和12S EIA显著抑制裸鼠体内肿瘤生长，而CR1区或CR2区加N-末端区的突变消除了E1A在MDA-MB-231细胞中的肿瘤抑制活性。
实施例9E1A基因治疗和其它化疗的组合
E1A的表达增强了化疗药紫杉酚在裸鼠体内的抗肿瘤作用，延长了动物的存活率。在用单独载体(对照)转染的231细胞和形成肿瘤的231-E1A稳定细胞中，紫杉酚治疗均抑制肿瘤生长，然后在紫杉酚处理的231-E1A细胞中观察到更显著的治疗效果。用或不用紫杉酚处理的肿瘤组织中凋亡细胞的TUNEL标记液证实了这一点。治疗组包括SN载体、SN-脂质体-E1A、紫杉酚、和紫杉酚加SN-E1A。每组至少包括7只动物。
也尝试使用其它的化疗剂，例如但不限于顺铂、gemcitabine、novelbine、阿霉素、VP16、TNF、大黄素、柔红霉素、更生霉素、米托蒽醌、甲基苄肼、丝裂霉素、碳铂、博来霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、抗瘤氨酸、六甲密胺、thiopeta、白消安、卡氮芥、罗氮芥、司莫司汀、链唑霉素、氮烯米胺、羟基柔红霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜树碱、放射菌素-D、过氧化氢、亚硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、他莫昔芬、反铂、长春新碱、长春碱、TRAIL、或甲氨蝶呤。
实施例10人的治疗方案在上述体内动物研究结果的基础上，本领域技术人员将理解并预测用可能与脂类或脂质体复合的E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸治疗人类癌症的巨大潜力。事实上，如前面的说明，在动物模型中的成功已经得以承认并开始一期人类临床实验，这些实验目前正在很多中心进行着。期望这些临床实验将证实E1A、和其它肿瘤抑制基因产品在治疗人类癌症中的用途。剂量和给药频率方案将首先以上述体内动物研究得到的数据为依据。
通过导入E1A基因治疗人类癌症是可能的。可以更优选地通过应用病毒或非-病毒载体导入所需基因，以便运载E1A序列以有效感染肿瘤、或前-肿瘤组织，治疗人类癌症。病毒载体将优选为腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒载体或腺相关病毒(Muro-cacho等，1992)。这些载体是优选的，因为它们已经成功地用于将所需序列传送到细胞中，并可能表现高感染效率。Hung等进行的研究表明，天然腺病毒可以用于转移本发明的E1A基因。然而，特别优选的腺病毒类型是复制-缺陷腺病毒组。
如上所述，人Akt致癌基因的过表达(或活化)和/或人p38的下调(或灭活)在很多类型的人癌症中经常出现，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌等。
该实施例描述了促进E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸在上述癌症治疗中的方案。表现癌症的患者可以用下列方案治疗。患者可以，但不是必需，已经接受了前期的化疗、放疗、或基因治疗处理。任选地患者将表现足够的骨髓功能(定义为外周绝对粒细胞数＞2,000/mm3，血小板数为100,000/mm3，足够的肝功能(胆红素1.5mg/dl)，以及足够的肾功能(肌氨酸酐1.5mg/dl)。
对于过表达Akt的肿瘤，可以在治疗前、治疗中、和治疗后监测Akt的表达水平。可以通过测定免疫学方法，测定Akt的表达。简单地说，切下3至4mm厚的原发肿瘤和细胞阻滞制品切片，在二甲苯中脱蜡(deparaffinize)，在浓度递减(100-70％)的乙醇中再水化。用3％过氧化氢的甲醇液封闭内源性过氧化酶活性。用蒸馏水和磷酸盐缓冲的盐水中冲洗几次后，将切片置于1∶10稀释度的正常马血清中培养，以便使背景染色降至最低。然后用一级抗体在室温下培养1小时。过氧化酶染色程序应用ABC Elite Kits(Vector Laboratories，Burlingame，Calif.)。用3-氨基-9-乙基咔唑作为色原体使免疫染色反应显色。切片和/或cytospin制剂用甲苯胺蓝染色，在permount中制成标本。同时制备免疫染色的阳性和阴性对照。
对于不足表达p38的肿瘤，将在治疗前、治疗中、和治疗后监测p38的表达水平。可以通过测定类似于上述的免疫学方法，用抗-p38抗体或抗-磷酸p38抗体测定p38的表达。
切片由病理学家评价。将用一种半定量标准记录免疫反应的两个特征阳性细胞的相对数目(0％、＜10％、10-50％和＞50％)和反应深度(0-3)。分别记录免疫染色的模式(膜的，细胞质的)。如果任何肿瘤细胞分别表现对抗磷酸-Akt抗体染色阳性和/或对抗磷酸-p38抗体染色阴性，则认为肿瘤为Akt阳性和/或p38阴性。因强阳性膜染色著称的乳腺癌将用作阳性对照。可以用SAMBA 4000 Cell Image Analysis System(Image Products International，Inc.，Chantilly，Va.)应用计算机成像分析结合基于Windows的软件，定量测定磷酸-Akt和/或磷酸-p38的免疫染色。强烈染色的肿瘤组织切片将用作阳性对照。将用同种型-匹配的相关抗体替换一级抗体，以得到阴性对照阈值，其为平均十个照射野得到的结果。
应用E1A基因产品治疗癌症的方案本发明的组合物通常以含标准品、已知的非毒性生理可接受载体、辅料、和必要赋形剂的单剂量制剂形式非肠道或口服给药。本文使用的术语“非肠道”包括皮下注射、静脉内、肌内、动脉内注射、或灌输方法。E1A蛋白、肽、多肽、或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，和/或其它肿瘤抑制产品可以在使用其它抗癌药之前、之后或同时施用。常规疗程可以包括在7到21天的时间段内约给药六个剂量。基于临床医生的判断，可以每三周或以间隔更长的频率(每月、每两月、每季度等)进行连续六个剂量的给药方案。当然，这仅是治疗的举例说明的时间，有经验的实践人员将容易认识到其它一些时间-疗程也是可能的。
临床肿瘤学的一个主要挑战是一些肿瘤细胞对化学试剂治疗有抗性。本发明人的一个努力目标已经发现了改善化疗效果的方法。在本发明的情况下，E1A蛋白、肽、或多肽，或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸可以与一些常规化疗方案组合。
为了应用本发明所述的方法和组合物杀死癌细胞，通常将使目标细胞与E1A蛋白，肽，或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，以及至少一种化疗药(第二药物)接触，所述化疗药的例子为前面描述的那些。这些组合物将以杀死或抑制细胞增殖的混合有效量提供。该方法可以是用E1A蛋白，肽，或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，以及第二药物同时接触细胞。或者，该方法可以是用包括两种药物的的单一组合物或药理学制剂接触细胞，或者同时用两种不同组合物或制剂接触细胞，其中一种组合物包括E1A蛋白，肽，或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，另一种包括第二药物。
或者，可以在第二药物给药之前或之后间隔几分钟到几周，施用E1A蛋白，肽，或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸。在E1A蛋白，肽，或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸和第二化合物分别施用的实施方式中，确信每次给药时间之间的有效时间段将不会到期，以便第二药物和E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸仍将能对癌症发挥有利的组合作用。在该例子中，考虑用两种药物以彼此间隔约6小时到一周接触细胞，更优选彼此间隔24-72小时内。然后，在某些情况下，期望延长有效治疗的时间段，其中分别给药之间间隔几天(2，3，4，5，6，7或更多)到几周(1，2，3，4，5，6，7或更多)。
E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸区域性递送将是一种递送治疗有效剂量以抑制临床疾病的有效方法。同样，可以向特定效应区实施化疗。或者，一种或二种药物的系统递送也是合适的。本发明的治疗组合物直接施用到患者的肿瘤部位。这是癌症表面局部治疗的关键。组合物的量通常应当足以确保肿瘤的全部表面接触到E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸和第二药物。在一个实施方式中，给药仅局限于将治疗组合物注射到肿瘤中。在另一个实施方式中，将导管插入肿瘤区中，管腔可以在所需时间内连续灌注。
可以通过可接受的测量判定临床反应。例如，全部可测定的疾病至少消失一个月判定为完全反应。而部分反应判定为所有可评价的肿瘤体的垂直直径乘积的总和减少50％或更多，或者至少1个月肿瘤区没有表现增大。与其类似，混合反应可以定义为在一个或多个部位所有可测量损伤的垂直直径的乘积减少50％或更多。
当然，上述治疗方案可以按照临床实验例如本文所述的临床实验得到的结果改变。本领域技术人员将能够掌握本说明书中公开的资料，在说明书所述的临床实验基础上优化治疗方案。
实施例11临床实验该实施例涉及单独应用E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，或者与其他抗癌药物组合，建立人类治疗方案。E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，以及抗癌药治疗将用于临床治疗各种与Akt激活或p38灭活有关的、其中转化细胞或癌细胞发挥重要作用的癌症。该治疗将成为抗肿瘤治疗中特别有用的工具，例如，在对常规化疗方案产生抗性的卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、脑、结肠、和肺癌患者的治疗中。
本领域技术人员在本发明公开内容的指教下，将掌握进行临床实验的各要素，包括患者的治疗和检测。下列内容将作为建立E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸的临床实验的一般性指导原则。
表现高级的、转移性的乳腺、上皮性卵巢癌、胰腺、结肠或选择用于临床研究的其他癌症的患者通常将不能对至少一个疗程的常规治疗反应。在一个临床方案的例子中，将坦克霍夫导管，或其他适当装置放置到患者胸膜或腹膜腔中，并接受连续胸膜/腹膜渗出物取样。通常，期望确定胸膜或腹膜腔无已知的分室、肌氨酸酐水平在2mg/dl以下，胆红素水平在2mg/dl以下。患者应当表现正常的凝固曲线。
关于E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸和其他抗癌药物的给药，可以将坦克霍夫导管或其他装置置于胸膜腔或腹膜腔中，除非该装置已经在前期手术的位置。可以得到胸膜内液或腹膜内液的样品，从而可以评价和记录基线细胞结构、细胞学、LDH、和液体中(CEA、CA15-3、CA125、PSA、p38(磷酸化和非-磷酸化型)、Akt(磷酸化和非磷酸化型)和细胞中(E1A蛋白、肽、或多肽或者编码它们的核酸)的适当的标志物。
在相同的程序中，可以单独给药E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，或者与其它抗癌药组合给药。可以在胸膜/腹膜腔内直接施用到肿瘤中，也可以以系统方式给药。起始剂量可以为0.5mg/kg体重。可以以不大于3级毒性的各剂量水平处理三位患者。可以以100％的增量增加剂量(0.5mg，1mg，2mg，4mg)，直到检测到药物相关的2级毒性。之后可以以25％的增量增加剂量。如果测定的多种E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸和多种抗-癌药的组合内毒素水平对于任何给定患者都超过5EU/kg，则给药剂量可以等分成两次灌输，间隔六小时。
可以以较短灌输时间施用E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，和/或其它抗癌药的组合，或者在7到21天的时间内以稳定速率灌输。E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸的灌输可以单独施用，也可以与抗癌药和/或大黄素样酪氨酸激酶抑制物组合施用。以任何剂量水平进行的灌输将依赖于每次灌输后得到的毒性而定。因此，如果任何单次灌输或在一个特定时间内的稳速灌输后得到II级毒性，则应当停止进一步的剂量，或者中止稳速灌输，除非毒性改善。将给若干组患者施用增加剂量的E1A蛋白、肽、或多肽或者编码E1A蛋白、肽、或多肽的核酸和一种抗癌药的组合，直到约60％的患者表现不能接受的任何类型的III级或IV级毒性。该剂量的2/3剂量可以确定为安全剂量。
在治疗前和治疗后约间隔3-4周，应当进行身体检查、肿瘤测量、和实验室实验。实验室研究应当包括CBC、差异因子和血小板记数、尿分析、SMA-12-100(肝和肾功能实验)、凝结曲线、和任何其它适当的化学研究，以便确定疾病的进程，或确定存在症状的原因。同样也应当监测血清中适当的生物学标记物，例如CEA、CA 15-3、p38(磷酸化和非磷酸化形式)和Akt(磷酸化和非磷酸化形式)、p185等。
为了监测疾病病程和评价抗-肿瘤反应，应当考虑每4周检查患者的合适的肿瘤标记物，如果开始即异常，则每周两次进行CBC、差异因子和血小板记数，连续4周；然后，如果没有观察到骨髓抑制，则每周检查。如果患者表现延时的骨髓抑制，建议进行骨髓检查，以排除肿瘤侵入骨髓成为全血细胞减少的原因的可能性。每4周应当记录凝结曲线。SMA-12-100应当每周进行。第一个剂量后72小时可以对胸膜/腹膜内渗出液取样，之后每周取样，前两个疗程均如此，然后每4周取样直至推进或中止研究。可以评价细胞结构、细胞学、LDH、和液体中(CEA，CA15-3，CA125，p185，p38，Akt)和细胞中(p38，Akt)的适当标志物。当存在可测定的疾病时，将每4周进行肿瘤测量。适当的放射性研究应当每8周重复一次，以便评价肿瘤反应。肺活量测定和DLCO可以在开始治疗后和研究接近末期每4和8周重复。尿分析可以每4周进行。
临床反应可以通过可接受的测定确定。例如，所有可测定疾病至少消失一个月判定为完全反应。而部分反应判定为所有可评价的肿瘤体的垂直直径的乘积的总和减少50％或更多，或者至少1个月肿瘤区没有表现增大。与其类似，混合反应可以定义为在一个或多个部位所有可测量的损伤的垂直直径的乘积减少50％或更多。
根据本发明所公开和要求的所有组合物和方法可以制备和实施，而无不适当的实验。因为本发明的组合物和方法已经以优选实施方式的形式描述，对于本领域技术人员来说，可以不偏离本发明的概念、本质和范围调整该组合物和方法，和改变本发明所述方法的步骤或连续步骤，这是显而易见的。更具体地说，某些无论化学还是生理均相关的试剂可以取代本发明所述的药物，而得到同样或类似的结果，将是显而易见的。所有对本领域技术人员显而易见的上述类似取代和修饰，注定在本发明权利要求的本质、概念和范围内。
参考文献再此特别引用下列文献作为参考合并到本发明中，在某种程度上它们提供了作为示例的程序性的或其它详细的资料，以补充说明本发明阐述的内容。Abu-Abid等，“用肿瘤坏死因子灌注单独肢体用于治疗肢体恶性肿瘤”摘要，Harefuah，131(7-8)227-232，295-296，1996；Ames等(1990)病毒学杂志，64，4115-4122；Ames等，“通过腺病毒E1A引导的对α肿瘤坏死因子的细胞毒作用的敏感性独立于转化和转录活性”，病毒学杂志，64(9)4115-4122，1990；Barbacid，“ras基因”，生化年度综述，56779-827，1987；Barbeau等(1994)致癌基因，9，359-373；Barbeau等，“腺病毒E1A蛋白复合物之间的功能相互作用”致癌基因，9359-373，1994；Bargmann和Weinberg，“与活化neu致癌基因编码的蛋白质相关的酪氨酸激酶活性的增强″美国国立科学院学报，855394-5398，1988；Bargmann等，“由改变p185跨膜区的点突变引起的neu致癌基因的多种独立活化”，细胞，45649-657，1986。Bargmann等，“neu致癌基因编码表皮生长因子受体相关蛋白”，自然，319
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权利要求
1.一种使细胞内的Akt失活的方法，其包括使细胞与E1A蛋白、肽或多肽进行接触。
2.一种使细胞内的p38活化的方法，其包括使细胞与E1A蛋白、肽或多肽进行接触。
3.一种使细胞内的磷酸-Akt表达下调和磷酸p38表达上调的方法，其包括使细胞与E1A蛋白、肽或多肽进行接触。
4.一种诱导细胞内凋亡的方法，其包括使细胞与E1A蛋白、肽或多肽进行接触。
5.如权利要求1、2、3或4的方法，其中所述细胞是过表达的活化Akt细胞。
6.如权利要求1、2、3或4的方法，其中与E1A蛋白、肽或多肽进行接触导致Akt失活。
7.如权利要求1、2、3或4的方法，其中所述细胞是p38活化水平下降的细胞。
8.如权利要求1、2、3或4的方法，其中与E1A蛋白、肽或多肽进行接触导致p38活化。
9.如权利要求1、2、3或4的方法，其中所述细胞是活化p38表达不足的细胞。
10.如权利要求1、2或3的方法，其进一步限定为诱导细胞凋亡的方法。
11.如权利要求1、2、3或4的方法，其中所述细胞是癌细胞。
12.如权利要求1、2、3或4的方法，其中所述细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、膀胱癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、脑癌细胞、淋巴癌细胞、皮肤癌细胞、脑瘤细胞、骨癌细胞、直肠癌细胞或者血癌细胞。
13.如权利要求1、2、3或4的方法，其中所述细胞在体外。
14.如权利要求1、2、3或4的方法，其中所述癌细胞包含于肿瘤。
15.如权利要求1、2、3或4的方法，其中所述细胞包含于动物体内。
16.如权利要求15的方法，其中所述动物是人。
17.如权利要求15的方法，其进一步限定为癌症治疗方法。
18.如权利要求15的方法，其进一步限定为预防癌症的方法。
19.如权利要求1、2、3或4的方法，其中细胞的转化被抑制。
20.如权利要求1、2、3或4的方法，其中细胞的生长被抑制。
21.如权利要求20的方法，其中所述生长是转移生长。
22.如权利要求1的方法，其中所述细胞的特征在于p38失活。
23.如权利要求1、2、3或4的方法，其中细胞与E1A蛋白、肽或多肽进行的接触，其包括提供编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸以及表达E1A蛋白、肽或多肽。
24.如权利要求1、2、3或4的方法，其中表达E1A蛋白、肽或多肽发生在细胞内。
25.如权利要求24的方法，其中所述E1A蛋白、肽或多肽由核酸载体编码。
26.如权利要求25的方法，其中所述载体是一个病毒载体。
27.如权利要求26的方法，其中所述病毒载体是一个腺病毒载体、。
28.如权利要求26的方法，其中所述载体是一个逆转录病毒载体。
29.如权利要求26的方法，其中所述载体是一个慢病毒载体。
30.如权利要求1、2、3或4的方法，其中所述E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸包含在脂质体内。
31.如权利要求30的方法，其中所述脂质体包含DOTMA、DOPE或DC-Chol。
32.如权利要求30的方法，其中所述脂质体包含DC-Chol。
33.如权利要求30的方法，其中所述脂质体包含DC-Chol和DOPE。
34.如权利要求1、2、3或4的方法，其中所述接触包括将E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸给予动物。
35.如权利要求34的方法，其中局部给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
36.如权利要求35的方法，其中通过直接肿瘤内注射给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
37.如权利要求35的方法，其中通过注射到肿瘤脉管系统给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
38.如权利要求34的方法，其中系统地给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
39.如权利要求38的方法，其中静脉内给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
40.如权利要求38的方法，其中动脉内给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
41.如权利要求38的方法，其中腹膜内给予E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
42.权利要求1、2、3或4的方法，其进一步包括使细胞与化疗剂进行接触。
43.如权利要求42的方法，其中所述化疗剂是gemcitabine、novelbine、taxtere、紫杉酚、顺铂、阿霉素、VP16、TNF、大黄素、柔红霉素、更生霉素、米托蒽醌、甲基苄肼、丝裂霉素、碳铂、博来霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、抗瘤氨酸、六甲密胺、thiopeta、白消安、卡氮芥、罗氮芥、司莫司汀、链唑霉素、氮烯米胺、羟基柔红霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜树碱、放线菌素-D、过氧化氢、亚硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、他莫昔芬、反铂、长春新碱、长春碱、TRAIL或甲氨蝶呤。
44.如权利要求43的方法，其中E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸与化疗剂是同时给药。
45.如权利要求43的方法，其中E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸和化疗剂在不同时间给药。
46.如权利要求43的方法，其中E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸在给予化疗剂之前给药。
47.如权利要求43的方法，其中E1A蛋白、肽或多肽或者编码E1A蛋白、肽或多肽的核酸在给予化疗剂之后给药。
全文摘要
本发明提供了基于E1A基因的癌症治疗方法,该方法针对那些涉及磷酸化Akt表达(和/或Akt活化)和/或磷酸化p38下调(和/或p38失活)的癌症和肿瘤。
文档编号A61K51/00GK1375332SQ0111178
公开日2002年10月23日 申请日期2001年3月21日 优先权日2001年3月21日
发明者洪明奇, 廖勇 申请人:得克萨斯州立大学董事会