专利名称：降低脑内与老年痴呆有关的淀粉样变纤维的融合人抗体的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及治疗老年痴呆症的免疫制剂，更具体地本发明提供了一种能够治疗和预防老年痴呆症的融合人抗体。
目前AD病的药物开发研究的一个方向是免疫治疗。方法之一是使用合成淀粉样变多肽Aβ作为疫苗刺激机体产生抗Aβ抗体，从而加快脑内免疫细胞将纤维化的Aβ从脑组织中的清除。这种疫苗已在小鼠动物试验中证明有效(Schenk D 1999；Morgan D 2000)。方法之二是在外周循环系统中注射抗Aβ抗体的被动免疫治疗。动物试验证明注射抗Aβ抗体也同样能达到清除小鼠脑内纤维化淀粉样斑块的作用(Bard F 2000)。但是，使用合成多肽作为疫苗成本高，对免疫能力低下的老年动物效果不好，临床应用受到一定限制。人的抗Aβ抗体很难制备。一般需要首先用小鼠制备抗Aβ抗体，然后将该小鼠抗体用基因工程方法改造成人抗体的结构。因此制备人的抗Aβ抗体困难比较大。鉴于此，本发明人设想利用基因工程方法将能够识别结合淀粉样变物质的多肽片段与能够被脑内免疫细胞识别的人抗体Fc段融合，使这一新的融合抗体具有类似抗Aβ抗体的功能，具有识别，结合和清除Aβ及其纤维的功能。根据这一思路，本发明人进行了深入的研究，终于完成了本发明。
本发明的另一方面涉及一种融合基因，其能表达本发明的融合蛋白。
本发明的再一方面涉及包含所述融合基因的原核和真核表达载体，以及由该表达载体转化或转染的原核或真核宿主细胞。
图2示出在CHO细胞中表达的融合抗体的鉴定试验。
图3A是含pelB信号多肽的融合抗体插入pET22b+表达载体NdeI至XhoI之间的DNA结构示意图。
图3B是利用载体pelB信号多肽的融合抗体插入pET22b+表达载体NcoI至XhoI之间的DNA结构示意图。
图3C是不含pelB信号多肽的融合抗体插入pET22b+表达载体NdeI至XhoI之间的DNA结构示意图。
具体实施例方式
的描述本发明的融合抗体的设计使得其识别结合区能与淀粉样变物质结合，结果使脑内Aβ纤维和淀粉样物质标记上人抗体的Fc段。脑内吞噬细胞表面带有Fc受体。当吞噬细胞发现标记有抗体Fc的Aβ纤维和淀粉样物质时会启动免疫吞噬反应将致病的Aβ纤维和淀粉样物质从病变部位清除。融合抗体采用人的识别结合序列和人抗体Fc片断氨基酸序列，就像病人自己产生的抗体一样，使病人在多次注射后不会产生对抗该融合抗体的抗体。对免疫反映能力低下，疫苗难以刺激机体产生抗体的老年人，融合抗体免疫治疗将是最佳选择。制造难度可以显著降低，生产成本也可以显著减少。
已有研究报告指出Aβ多肽的16-30区域含有Aβ相互识别与结合的多肽序列(Walsh DM 1997)。其中某些氨基酸在病人中有突变，但是仍然具有正常或更强的识别与结合功能。在本发明的一个实施方案中，本发明融合抗体的识别结合区的氨基酸序列为KLVFFAEDVGSNKGA。
其中黑体字母所代表的氨基酸可以用其他氨基酸替代而不丧失其功能。例如有研究指出，A可以被G取代(KLVFFGEDVGSNKGA)(HENDRIKS L1992；CRAS P 1998)；E可以被Q(KLVFFAQDVGSNKGA)(Levy E 1990)，或G(KLVFFAGDVGSNKGA)(Kamino K 1992)，或K(KLVFFAKDVGSNKGA)取代；D可以被N(KLVFFAENVGSNKGA)(Peacock ML 1994)取代。该多肽的氨基端和羧基端也可以缩短到较小的核心区VFFAEDVGSN，但是识别与结合能力可能会降低。延长该多肽的氨基端和/或羧基端则可能保留识别与结合功能。延长该多肽氨基端直至Aβ多肽的起始序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA，和/或全长该多肽的羧基端直至Aβ多肽的羧基端尾部，例如Aβ1-40(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)，Aβ1-42(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)，均有相同的识别与结合功能。因此，本发明所用识别结合区的氨基酸序列可以是与上述任一序列有70-80％同源性且具有识别结合区功能的序列。
本发明的融合抗体中的人抗体Fc段的功能是能与体内免疫吞噬细胞的Fc受体结合，以便吞噬细胞将抗体及其所结合的物质清除(Indik ZK 1995)。该Fc段含有人Fc的CH2和CH3区。在本发明的一个实施方案中，本发明所采用人Fc来源于Gene Bank登录号X70421。该Fc段的氨基酸序列是DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
当然，其它已知的Fc段也可以使用。
淀粉样变的识别结合功能区与Fc功能区融合时，在两个功能区之间加入2-4个较小的氨基酸作为连接区以区隔这两个功能区。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的融合人抗体的最终蛋白结构具有如下的氨基酸序列KLVFFAEDVGSNKGAVGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK其中黑体字VGS是区别两个功能区的连接区。该连接区氨基酸序列可以是由任何较小的氨基酸组成。在连接区前面(氨基端)是淀粉样变的识别与结合区，其长度可以有前述所说的变化，其中黑体字AED是该区的可变区，如上所述其氨基酸序列可被其他的氨基酸所取代。
本发明的融合抗体可以通过将包含编码该融合抗体的融合基因的表达载体在细菌或动物细胞中表达而提纯。但是细菌或动物细胞表达需要使用不同的DNA表达载体和信号多肽。下面将分别叙述这两类表达系统。
真核细胞表达的融合人抗体在释放到细胞外前还需要一个信号多肽在融合抗体的氨基端。该信号多肽来自于哺乳动物蛋白的信号多肽。该信号多肽序列可以选自如下一组tPA信号多肽、Moloney信号多肽、APP信号多肽、BACE信号多肽等。在本发明的一个实施方案中，本发明的融合抗体带有tPA信号多肽序列，其全序列为MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRKLVFFAEDVGSNKGAVGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK为取得融合抗体在哺乳动物细胞的高效表达，需将编码上述融合抗体的DNA序列克隆进哺乳动物细胞表达载体中。该载体需有动物细胞表达的启动子在融合抗体编码区之前，需有一个聚合腺苷酸(Poly A tail)序列在融合抗体编码区之后。例如载体pcDNA3.1系列(Invitrogen公司，含有CMV启动子和BGH聚合腺苷酸)，pCI系列(Promega公司，含有CMV启动子和SV40聚合腺苷酸)等。
本发明所说含哺乳动物细胞信号多肽的融合抗体DNA编码区的5’端含有HindIII内切酶序列；3’端含有XhoI内切酶序列；以便将融合抗体DNA克隆进表达载体pcDNA3.1zeo+多克隆位点的HindIII和XhoI内切酶位点区间。在本发明的一个实施方案中，编码含哺乳动物信号多肽的融合抗体的DNA序列如下AAGCTTGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCGCGCTTCAGAAGAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAGTTGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAACTCGAG其中黑体字ATG是融合抗体的起始蛋氨酸编码，黑体字TAA是融合抗体蛋白的截止信号。AAGCTT是内切酶HindIII的酶切位点，CTCGAG是内切酶XhoI的酶切位点。经内切酶消化后，将此DNA插入pcDNA3.1zeo+载体(HindIII和XhoI酶切位点之间)。这里所列举的DNA序列，其中至少有三分之一是可以改变而不改变所表达融合抗体的多肽序列和蛋白结构。
将上述携带融合抗体基因的pcDNA3.1zeo+载体DNA结构进行克隆，筛选，扩增后进行细胞转染。转染可使用电穿孔法(electroporation)，脂质体法(LipofectAmine from Invitrogen)，或钙沉淀法等。许多哺乳动物细胞可以用于该融合抗体的表达，例如CHO，HEK293，HELA细胞等等。在本发明的一个实施方案中，使用脂质体法转染CHO细胞，并使用抗生素Zeocin筛选出能高效稳定表达的细胞株。本发明已经建立此种高效表达的CHO细胞株。所表达的融合抗体可以分泌到细胞外的培养液中，使用Protein A Sepharose亲和层析法纯化。所分泌的融合抗体是以单体和二聚体两种形式存在。
以下将结合非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1融合抗体的真核细胞表达构建含tPA信号多肽的融合人抗体DNA使用PCR方法从淋巴细胞文库中选择性扩增人抗体Fc基因。选用ROCHE公司的EXPEND HIGH FIDELITY PCR KIT。PCR反应包括38ul去离子水，5ul试剂盒提供的10X缓冲液，3ul DMSO，1ul dNTP(10mM dATP，10mMdCTP，10mM dGTP，10mM dTTP)，1ul试剂盒提供的混合DNA聚合酶，1ul10uM含BamH1内切酶位点的正向引物AGTTGGATCCGACAAAACTCACACATG和1ul 10uM含XhoI内切酶位点的反向引物TCTAGACTCGAGTTATTTACCCGGAGACAG，1ul人淋巴细胞cDNA文库(CloneTech)。PCR反应使用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分钟；共30周期。经1％琼脂电泳分离证实PCR产物含有Fc大小的DNA后，提取1ul加入1ul 1uM浓度的下列含有tPA和Aβ纤维识别序列的引物tPA-M-RGGCTGGGCGAAACGAAGACTGCTCCACACAGCAGCAGCACACAGCAGAGtPA-Ab16-19-FCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCGCGCTTCAGAAGAAAATTGGTGTTCAb-Bam-R55GTCGGATCCGACTGCACCTTTGTTTGAACCCACATCTTCTGCAAAGAACACCAAT然后再加入1ul 10uM浓度的下列两种引物Hind tPA-FCTGTATAAGCTTGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAGGACTCTGCTGTG，和Xho Fc-RTCTAGACTCGAGTTATTTACCCGGAGACAG。5ul试剂盒提供的10X缓冲液，3ul DMSO，1ul dNTP(10mM dATP，10mM dCTP，10mM dGTP，10mM dTTP)，1ul试剂盒提供的混合DNA聚合酶，加去离子水至最终体积50ul。PCR反应使用94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟；共4个周期，然后用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分钟；共30个周期。PCR产物使用QIAGEN公司的QIAQUIK PCR PURIFICATION KIT纯化一份PCR反应产物与五份PB缓冲液混合，然后装入KIT所提供的小型离心柱离心；再使用0.5ml PB缓冲液离心洗柱一次；再用50ul KIT所提供的EB缓冲液装柱离心洗脱。经DNA浓度测定，吸取1ug纯化的PCR产物，加2ul 10X缓冲液，1ul Hind III内切酶和1ulXhoI内切酶(New England Biolab)，再加去离子水至最终体积20ul，37℃保温2小时。1ug pcDNA3.1zeo(Invitrogen)载体DNA加5ul 10X缓冲液，1ul Hind III内切酶和1ul XhoI内切酶(New England Biolab)，再加去离子水至最终体积48ul，37℃保温1小时，然后再加1ul Hind III内切酶和1ul XhoI内切酶，再37℃保温1小时，然后再加1ul CIP(Calf Intestinal Phosphatase，New EnglandBiolab公司)37℃保温20分钟。酶切后的PCR产物和载体经1％琼脂电泳分离，切出800bp大小含融合抗体的DNA带和5kb的载体带，再使用QIAGEN的AGROSE GEL EXTRACTION KIT将酶切后的目的基因和载体纯化称出含有目的DNA的琼脂重量，加入3倍体积的QG缓冲液，在50℃水浴保温10分钟以使琼脂溶化，再加入1倍于琼脂体积的异丙醇后过MinElute亲和柱。使用Eppendorff离心机离心一分钟后，目的DNA会滞留在亲和柱上。使用500ul QG缓冲液，而后750ul PE溶液离心清洗MinElute亲和柱各一次，然后用20ul 10mM pH8.5 Tds-Cl缓冲液洗脱目的DNA。得到内切酶处理和纯化过的融合抗体DNA和载体后，使用ROCHE公司的RAPID DNA LIGATION KIT将它们连接在一起3ul上述纯化过的融合抗体DNA加1ul载体，再加入1ul试剂盒提供的5X DNA混合溶液，混合好两种DNA后再加入5ul试剂盒提供的2X连接缓冲液和0.5ul试剂盒提供的连接酶(ligase)，混合后在23-25℃室温保温5-10分钟即可。使用2ul上述连接好DNA加20-40ul感受态DH5α细菌细胞，4℃冰上保温20分钟，42℃水浴热休克1分钟，4℃冷却2分钟，加入SOC培养液(Invitrogen公司)200ul，37℃摇床培养45分钟，然后涂含有AMPICILIN的LB琼脂平板。选阳性菌落小量扩增提取DNA(QIAGEN公司QIASPIN PLASMIDMINI KIT)，经HindIII和XhoI酶切，DNA序列分析验证表达质粒构建的正确性后，进行DNA大量扩增(QIAGENQ公司QIAFILTER PLASMID MAXIKIT)。
图1示出如此构建的含有融合基因的载体的示意图。
建立表达融合抗体的细胞株CHO细胞培养在含有10％小牛血清(Sigma公司)的DMEM培养液(Sigma公司)中。培养液还含有1X青霉素和链霉素(稀释自Sigma公司100X浓缩液)。当CHO细胞培养在60mm培养皿中至50-70％细胞密度，在转染前改换OptiMEM培养液(Invitrogen公司)2ml并准备进行细胞转染。3ug含有融合抗体的表达质粒与100ul OptiMEM混合，9ul LipofectAmine(Invitrogen公司)与100ulOptiMEM混合，再将两种溶液混合并在室温放置20分钟。将上述DNA-LipofecAmine混合液加入上述CHO细胞中，在37℃和5％CO2培养箱中培养3-4小时后，更换为5ml前述含有10％小牛血清的DMEM继续培养1至2天至满盘(confluence)。然后将细胞分养(split)到100mm培养皿中，平均每个培养皿分200至1000个细胞，使用上述含小牛血清的DMEM培养液，并添加筛选药Zeocin(Invitrogen公司)至200ug每毫升。细胞在此培养液中培养3至4周后，只有能稳定表达融合抗体的CHO细胞可以形成细胞群落。将独立的细胞群落分离出来分别独立培养于6孔培养板和使用上述的筛选培养液中直至60％细胞密度，更换3ml新鲜培养液培养24小时后，收集培养液1ml，加入25ul Protein ASepharose在室温混合1小时，离心后再依次以0.5M氯化钠Sten缓冲液1ml，Sten缓冲液1ml清洗各一次，然后以SDS溶液洗脱，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移(transfer)到硝酸纤维素膜上，使用蛋白质印迹法(Western-Blot)探测所表达的融合抗体。将硝酸纤维素膜在含5％牛奶的TBST缓冲液中轻摇1小时，更换含有抗人Fc抗体(1∶10000稀释自Zymet公司HRP酶联抗体)TBST缓冲液并轻摇1小时，然后使用TBST缓冲液清洗三次各15分钟，使用PIERCE的SUPER SIGNAL KIT荧光显色后再曝光胶片，以确定高效表达并释放融合抗体到细胞外的细胞株。高效表达融合人抗体的细胞株第7和第58既是这种方法选出，它们都有25和50kDa的单体和二聚体蛋白带。使用抗Aβ序列的17至24氨基酸区段单克隆抗体4G8作Western-Blot，(该区段序列也是本融合抗体识别结合区的一部分)以HRP酶联抗小鼠抗体作为第二抗体作Western-Blot，也可以探测到25和50kDa的单体和二聚体。
图2示出在CHO细胞中表达的融合抗体的鉴定试验。挑取稳定表达的细胞株7和56在10cm培养皿中用10ml培养液培养24小时，取1ml与25ul蛋白Asepharose珠混合1小时；经缓冲溶液清洗后，表达的融合抗体以SDS溶液洗脱，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移到硝酸纤维素膜上，使用蛋白质印迹法(Western-Blot)探测所表达的融合抗体。使用抗Aβ识别结合区抗体4G8可探测到～25kDa融合抗体单体和～50kDa二聚体。使用抗人Fc抗体也可探测到这种融合抗体，但是抗人Fc抗体对单体融合抗体较不敏感。上述试验显示细胞株7和56都能表达和分泌大量融合抗体；所表达的融合抗体单体和二聚体均含有Aβ识别结合功能区和抗体Fc片段。
实施例2融合抗体在细菌表达系统中的表达细菌表达的融合人抗体有两种。一种是只在融合抗体前加一个蛋氨酸，其融合抗体表达后主要集中于细菌内的包涵体；另一种在融合抗体的氨基端带有分泌到细菌细胞间质的信号多肽。对细菌表达载体的基本要求是在目标基因的5’端有细菌的表达启动子。本发明所用表达载体是pET22b+(Novagen)，它带有T7启动子。本发明所使用的信号多肽序列是pelB信号多肽MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA含有细菌间质信号多肽的融合抗体氨基酸序列是MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAKLVFFAEDVGSNKGAVGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK其中黑体字部分是细菌间质信号多肽，下横线表示的区域是融合抗体的识别结合区。在融合抗体释放到细胞间质前，细菌的酶将细菌间质多肽信号羧基端切断并将融合抗体释放到细菌间质。如前所述，融合抗体的识别结合区有可变的结合核心和多肽长度的变化。
为获得上述融合抗体，可以选用两种方案。方案之一是将细菌信号多肽pelB的DNA编码直接加在目标融合抗体的氨基端，从而获得与上述序列完全相同的蛋白编码结构，然后再将这一基因插入适当细菌表达载体。本发明所选用的带pelB的DNA编码结构是CATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAGTTGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAACTCGAG其中5’端有下线的CATATG序列是内切酶NdeI识别位点，3’端CTCGAG序列是内切酶XhoI识别位点。将此基因克隆进细菌表达载体pET22b+的NdeI和XhoI酶切位点之间即可(参见图3a载体示意图)。细菌表达融合抗体后，将融合抗体送达细菌间质，并将pelB信号多肽切除，释出游离融合抗体。
获得带有pelB细菌细胞间质信号多肽融合抗体的另一个方案是将融合抗体的基本结构基因克隆进含有pelB信号多肽的细菌表达载体，例如pET22b+。因为pET22b+载体在pelB后的克隆位点内切酶NcoI序列不能改变，pelB信号多肽与融合抗体之间插入两个NcoI编码的氨基酸，MA。该两个氨基酸在信号多肽去除之后仍留在融合抗体的氨基端，从而使融合抗体的N端加入两个非识别结合序列的氨基酸。利用pET22b+载体所带pelB信号多肽表达融合抗体所需DNA序列如下CCATGGCTAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAGTTGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAACTCGAG其中5’端和3’端有下横线的序列分别是NcoI和XhoI的内切酶位点。经酶切后，可将该基因克隆进pET22b+NcoI酶切位点和XhoI酶切位点之间(参见图3b载体示意图)。
利用pET22b+载体所带pelB信号多肽表达的融合抗体在切除信号多肽前的蛋白序列如下MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMAKLVFFAEDVGSNKGAVGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK其中下横线表示的pelB信号多肽在融合抗体进入细菌间质后被切除。黑体字MA所带表的两个氨基酸将留在融合抗体上。
细菌表达的产率是需要考虑的重要因素之一。针对不同的表达蛋白，有时在细菌间质表达较好，有时则在细菌内胞含体表达效率较高。因此构建细菌内表达所需要的DNA载体是必不可少的表达尝试。基本方法是在融合抗体的氨基端加上一个蛋氨酸，然后再将该基因克隆入不含细菌间质信号多肽的表达载体。针对本发明所需融合抗体，则仅需要在融合抗体编码区前5’端加入含有编码蛋氨酸的NdeI内切酶序列，在3’端加入XhoI内切酶核酸序列，然后克隆进pET22b+载体内切酶位点NdeI和XhoI之间即可(参见图3c载体示意图)。该DNA序列显示如下CATATGAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAGTTGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAACTCGAG其中5’端CATATG是NdeI的内切酶位点，并含有蛋氨酸编码ATG作为融合抗体的起始点。3’端CTCGAG是XhoI的内切酶位点。该基因所编码的融合抗体氨基酸序列如下MKLVFFAEDVGSNKGAVGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK上述细菌表达载体构建步骤具体如下。
构建带有信号多肽的融合抗体DNA与真核细胞表达载体构建方法类似，采用PCR方法构建带有信号多肽pelB的融合抗体DNA。从前述真核细胞表达载体构建Fc的PCR反应中提取1ul反映产物，加入1ul 1uM浓度的下列含有pelB和A纤维识别序列的引物pelB-M-R48GCAGCGAGGAGCAGCAGACCAGCAGCAGCGGTCGGCAGCAGGTATTTCpelB-Ab16-19FCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCAAATTGGTGTTCTTTGAb-Bam-R55GTCGGATCCGACTGCACCTTTGTTTGAACCCACATCTTCTGCAAAGAACACCAAT然后再加入1ul 10uM浓度的下列两种引物Nde pelB-FCTATACCATATGAAATACCTG，和Xho Fc-RTCTAGACTCGAGTTATTTACCCGGAGACAG然后加5ul试剂盒提供的10X缓冲液，3ul DMSO，1ul dNTP(10mM dATP，10mMdCTP，10mM dGTP，10mM dTTP)，1ul试剂盒提供的混合DNA聚合酶，加去离子水至最终体积50ul。PCR反应使用94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟；共4个周期，然后用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分钟；共30个周期。
构建使用表达载体pelB信号多肽的融合抗体DNA从前述真核细胞表达载体构建Fc的PCR反应中提取1ul反映产物，加入1ul 1uM浓度的下列含有Aβ纤维识别序列的引物Ab-Bam-R55GTCGGATCCGACTGCACCTTTGTTTGAACCCACATCTTCTGCAAAGAACACCAAT然后再加入1ul 10uM浓度的下列两种引物Nco Ab16-19FCAATGGCCATGGCTAAATTGGTGTTC，和Xho Fc-R，TCTAGACTCGAGTTATTTACCCGGAGACAG。然后加5ul试剂盒提供的10X缓冲液，3ul DMSO，1ul dNTP(10mM dATP，10mMdCTP，10mM dGTP，10mM dTTP)，1ul试剂盒提供的混合DNA聚合酶，加去离子水至最终体积50ul。PCR反应使用94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟；共4个周期，然后用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分钟；共30个周期。
构建不含信号多肽的融合抗体DNA从前述真核细胞表达载体构建Fc的PCR反应中提取1ul加入1ul 1uM浓度的下列含有Aβ纤维识别序列的引物Ab-Bam-R55GTCGGATCCGACTGCACCTTTGTTTGAACCCACATCTTCTGCAAAGAACACCAAT然后再加入1ul 10uM浓度的下列两种引物Nde Ab16-19FGACAAGCATATGAAATTGGTGTTC，和Xho Fc-RTCTAGACTCGAGTTATTTACCCGGAGACAG然后加5ul试剂盒提供的10X缓冲液，3ul DMSO，1ul dNTP(10mM dATP，10mMdCTP，10mM dGTP，10mM dTTP)，1ul试剂盒提供的混合DNA聚合酶，加去离子水至最终体积50ul。PCR反应使用94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟；共4个周期，然后用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分钟；共30个周期。
如真核细胞融合抗体DNA构建一样，PCR产物使用QIAGEN公司的QIAQUIK PCR PURIFICATION KIT纯化(见前述)。吸取1ug纯化的PCR产物，再将2ul 10X缓冲液和1ul XhoI内切酶分别加入上述3种纯化的PCR产物，1ul NdeI(New England Biolab)分别加入含pelB和不含信号多肽的纯化PCR产物，1ul NcoI内切酶(New England Biolab)只加入使用载体信号多肽的纯化PCR产物。最后再加去离子水至最终体积20ul，37℃保温2小时。
内切酶处理上述3种融合抗体所需表达载体pET22b+。1ugpET22b+(Novagen)载体DNA加5ul 10X缓冲液，1ul XhoI内切酶分别加入3个试管，1ul NdeI(New England Biolab)分别加入需插入含pelB和不含信号多肽的载体，1ul NcoI内切酶(New England Biolab)只加入使用载体信号多肽的载体。最后再加去离子水至最终体积50ul，37℃保温1小时。然后再重复加1ul相同内切酶各一次，再37℃保温1小时，然后再加1ul CIP(Calf IntestinalPhosphatase，New England Biolab公司)37℃保温20分钟。
酶切后的PCR产物和载体经1％琼脂电泳分离，切出800bp大小含融合抗体的DNA带和5.5kb的载体带，再使用QIAGEN的AGROSE GELEXTRACTION KIT将酶切后的目的基因和载体纯化。在得到内切酶处理和纯化过的融合抗体DNA和载体后，使用ROCHE公司的RAPID DNA LIGATIONKIT将它们连接在一起。使用2ul上述连接好DNA加20-40ul感受态DH5α细菌细胞，4℃冰上保温20分钟，42℃水浴热休克1分钟，4℃冷却2分钟，加入SOC培养液200ul，37℃摇床培养45分钟，然后涂含有AMPICILIN的LB琼脂平板。选阳性菌落小量扩增提取DNA(QIAGEN公司QIASPIN PLASMIDMINI KIT)，经相应酶切，DNA序列分析验证表达质粒构件的正确性后，进行DNA大量扩增(QIAGENQ公司QIAFILTER PLASMID MAXI KIT)。图3A-3C分别示出了如上所述构建的重组表达载体的示意图。其中图3A是含pelB信号多肽的融合抗体插入pET22b+表达载体NdeI至XhoI之间的DNA结构示意图。图3B是利用载体pelB信号多肽的融合抗体插入pET22b+表达载体NcoI至XhoI之间的DNA结构示意图。图3C是不含pelB信号多肽的融合抗体插入pET22b+表达载体NdeI至XhoI之间的DNA结构示意图。
参考文献Bard F等，Nature Medicine6916-919.Cras P，v.H.F等，Acta Neuropathol(Berl)96(3)253-60.Hendriks L等，Nat Genet1218-221.Indik ZK等，Blood86(12)4389-99.Kamino K等，Am J Hum Genet51(5)998-1014.Levy E等，Science2481124-1126.Morgan D等，Nature408915-916.Peacock ML等Ann Neurol35(4)432-8.Schenk D等，Nature400116-117.Walsh DM等，J Biol Chem27222364-22372.
权利要求
1.一种融合人抗体，其从N端至C端依次含有β-淀粉样肽及其所生成纤维的识别和结合区，2-4个氨基酸的连接肽以及能够让体内免疫细胞识别的人抗体Fc段。
2.根据权利要求1所述的融合人抗体，其中所说的β-淀粉样肽及其所生成纤维的识别和结合区是从人β-淀粉样多肽序列衍生出来的。
3.根据权利要求1和2所述的融合人抗体，其中所说的β-淀粉样肽及其所生成纤维的识别和结合区具有下述其中之一的氨基酸序列或KLVFFAEDVGSNKGA，KLVFFGEDVGSNKGA，KLVFFAQDVGSNKGA，KLVFFAKDVGSNKGA，KLVFFAGDVGSNKGA，KLVFFAENVGSNKGA，DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA，DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV，DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA，或与上述任一氨基酸序列至少70-80％同源的序列。
4.根据权利要求1所述的融合人抗体，其中所说的人抗体Fc段具有CH2和CH3区的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的融合人抗体，其中所说的人抗体Fc段具有下述氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
6.编码权利要求1-5任一项的融合人抗体的融合基因。
7.包含权利要求6所述融合基因的宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其为真核宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其为哺乳动物细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其为CHO，HELA或HEK293。
11.根据权利要求7所述的宿主细胞，其为原核宿主细胞。
12.由权利要求7-11任一项所述的宿主细胞表达的融合人抗体。
13.权利要求1-5任一项或权利要求12的融合人抗体在制备用于清除老年痴呆症致病淀粉样变纤维的药物中的应用。
14.权利要求1-5任一项或权利要求12的融合人抗体在制备用于治疗和预防老年痴呆症的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种能够治疗和预防老年痴呆症的融合人抗体，所述融合人抗体其从N端至C端依次含有β－淀粉样肽及其所生成纤维的识别和结合区，2－4个氨基酸的连接肽以及能够人体内免疫细胞识别的人抗体Fc段。本发明还涉及编码所述融合人抗体的融合基因，包含该基因的真核或原核表达载体，以及由所述表达载体基因工程化的宿主细胞。
文档编号A61P25/28GK1396183SQ01120278
公开日2003年2月12日 申请日期2001年7月13日 优先权日2001年7月13日
发明者张小如, 张冀民 申请人:张小如, 张冀民