专利名称：具有抑菌功效的胶原－DNA－Ag复合物及其制备方法
技术领域：
本发明属生化制品，特别涉及一种具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物及其制备方法。
有报道用III型胶原与Ag-SD(磺胺嘧啶银)混合制成的溶液治疗烧伤后残余伤面(III型胶原Ag-SD液治疗烧伤后残余伤面，吴小龙等。江苏医药1992；18(3)；137-138)。它是将浓度为0.5～0.1％的III型胶原溶液与半量的Ag-SD霜混合，然后涂在创面上使用。但由于胶原溶液在储存过程中容易腐败变性，所以这种溶液只能现用现配。且在这种溶液中，胶原分子与Ag-SD分子是互相独立的。
特开平6-304241介绍了一种含银胶原海绵膜。其制造方法是将水溶性银盐吸附到陶瓷类物质或是通过离子交换结合后，在银的熔点以上烧结、粉碎制得结合了银的陶瓷类物质。然后将该物质添加到胶原溶液中。搅拌。冷冻干燥。即得一种抗菌性胶原膜。在这种方法制得的胶原海绵膜中，陶瓷银类物质与胶原的吸附是物理吸附。所得胶原膜的抗菌效果取决于陶瓷银类物质的粒度和与胶原吸附结合的数量。结合的少，影响抗菌效果；结合的多又使得到的胶原膜变硬。
Cu2+、Hg2+、Ag+等重金属离子具有杀菌功能，其共同点是通过与细菌体内含巯基活性基团的酶类结合使其失去活性，从而使细菌生长繁殖受到抑制。同样，作为重金属离子，它亦能使蛋白质失去生物活性。
发明内容
本发明的目的在于克服以上技术不足，提供一种具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物及其制备方法，使得这些金属离子与胶原复合，既发挥这些金属离子的抑菌特性，又保留胶原蛋白的生物活性，制取一种性能优异的胶原复合物，用做医学临床生物敷料。
本发明通过采用DNA与Ag+结合，然后再与胶原复合，得到一种胶原-DNA-Ag复合物，解决了胶原遇重金属离子失活变性的问题，制备一种具有抑菌功能，同时兼具一定强度的胶原-DNA-Ag复合物。DNA可与胶原分子结合成凝胶类物质。当在DNA钠盐的水溶液中加入可溶性银盐溶液时，通过离子交换，使得DNA钠盐中的部份Na+被Ag+取代，然后，再通过透析除去溶液中游离的小离子，即可得到一种分子中含有Ag+的DNA溶液。
本发明还提供了一种用于治疗烧、烫伤及止血的药物，该药物含有上述复合物作为活性成分。所述药物可含有同类药物中通常含有的辅剂、成型剂等，并可制成各种剂型，如敷料、片剂、粉剂等。
本发明提供了胶原-DNA-Ag复合物及其制备方法本发明所采用的原料为胶原蛋白水溶液采用从小牛皮中提取的胶原，浓度0.1-10％，最好是0.4-1.0％。DNA采用从鱼精中提取的、分子量100万以上的DNA，浓度0.1-5.0％，最好是0.1-1.0％。可溶性银盐使用的是1％至饱合浓度的AgNO3水溶液，最好是1％-10％。
将DNA溶解于4℃以下的去离子水中，制备浓度0.1-5.0％的DNA水溶液。加入1％-饱合的可溶性银盐水溶液，搅拌5-20min，透析24-96h，至透析外液中检测不出相应的游离离子。
将浓度为0.1-10％的胶原蛋白溶液在-20-40℃透析。在3.3-26.6KPa下，减压脱气5-20min，在0.05-0.5MPa下，用φ0.05-1.0mm喷嘴喷入上述DNA溶液中。将形成的凝胶沥去水份，洗涤，装入10×10×0.5cm模型中，在-20--200℃下冻结，以P205及KOH为干燥剂，在-30-40℃、0.038-7.4KPa下真空干燥或真空冷冻干燥得胶原海绵膜。或将已喷入DNA的胶原液搅拌，得一无色透明状胶乳，将其用0.3-1.0MPa、80-200℃的干热空气喷雾干燥，即得胶原-DNA-Ag白色粉末。包装、灭菌。
与现有技术相比，本发明技术效果1、提供了一种具有抑菌性能的胶原-DNA-Ag复合物制品做生物敷料，该制品对金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿浓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)有较强的抑制作用，做生物敷料时可有效地抑制细菌感染。
2、在本发明提供的这种具有抑菌性能的胶原-DNA-Ag复合物制品中，Ag+与DNA以离子键结合并隐藏在大分子内部，所以具有缓释性。
3、本发明提供的这种具有抑菌性能的胶原-DNA-Ag复合物制品，与液态胶原制品相比，可在室温下长时间地有效保存。
4、本发明提供的这种具有抑菌性能的胶原-DNA-Ag复合物，根据干燥方法的不同，可以制成膜状物、粉状物使用。
5、在依据本发明提供的具有抑菌性能的胶原-DNA-Ag海绵膜制品中，由于DNA-Ag是以分子状态与胶原分子通过范德华力及氢键结合，所以，与陶瓷银胶原膜相比，胶原-DNA-Ag海绵膜柔软性更好，不板结。
6、在本发明的胶原-DNA-Ag复合物中，引入的多糖大分子DNA与胶原分子通过范德华力及氢键结合，互相缠绕成网状结构，从而，增强了这种胶原复合物的机械强度7、本发明中采用的胶原与Ag+复合的媒介DNA与胶原一样，都是来自生物体的具有生物活性的物质。因此，保证了胶原-DNA-Ag复合物中的胶原蛋白的生物活性不丧失。
8、在本发明提供的这种具有抑菌性能的胶原-DNA-Ag复合物制品中，Ag含量可以通过调整DNA溶液的PH值及加入的可溶性银盐量来调节。
9、本发明提供的这种胶原复合物也可以附着在其它基材上使用。如各种天然纤维、人造纤维、高分子材料等。
具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物及其制备方法。
具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物由以下原料制备胶原蛋白浓度为0.1-10％，最好是0.4-1.0％，DNA浓度0.1-5.0％，最好是0.1-1.0％，DNA盐是DNA钠盐，可溶性银盐浓度为1％至饱合的AgNO3，最好是1％-10％。胶原DNA∶Ag比例为1.5-2.5∶0.5-1.5∶0.05-0.2(W/W/W)。
具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，以浓度0.1-10％胶原蛋白、浓度0.1-5.0％DNA、浓度1％至饱合浓度的可溶性银盐，经离子交换、透析、脱气、成型、冷冻、干燥、灭菌制成医用抑菌胶原复合物。离子交换，将DNA溶于预冷至4℃的去离子水中，加入1％-饱合AgNO3溶液，搅拌5-20min，反应温度-20-40℃，将离子交换反应完成后的DNA-AgNO3混合液透析，温度-20-40℃，时间24-96h。透析，将0.1-10％的胶原溶液透析，透析温度为-20-40℃，时间24-96h。将透析后的胶原溶液脱气，压力为3.3-26.6KPa，时间5-20min。将脱气后的胶原溶液喷入DNA-Ag溶液中，喷嘴孔径0.05-1.0mm、孔密度5-50个/cm2、压力0.05-0.5MPa。将成型后的胶原-DNA-Ag复合物冷冻，温度-20--200℃。将冷冻后的胶原-DNA-Ag复合物干燥，干燥温度-30-40℃，压力0.038-7.4KPa，干燥剂为P2O5、KOH、液氮、干冰，为真空干燥或真空冷冻干燥，得胶原-DNA-Ag海绵膜，包装，灭菌。或将已喷入DNA的胶原液搅拌，得一无色透明状胶乳，将获得的胶原-DNA- Ag胶乳喷雾干燥，干燥用热风压力为0.3-1.0MPa，温度为80-200℃，得粉状胶原-DNA-Ag复合物，包装，灭菌。胶原-DNA-Ag复合物具有抑菌功效，抑制的菌种有金黄色葡萄球菌、绿浓杆菌、大肠杆菌，用于治疗烧、烫伤及止血的药物。
图1、金黄色葡萄球菌——胶原-DNA-Ag海绵膜。
图2、金黄色葡萄球菌——胶原-DNA海绵膜。
图3、金黄色葡萄球菌——纯胶原海绵膜。
图4、纯金黄色葡萄球菌。
图5、绿脓杆菌——胶原-DNA-Ag海绵膜。
图6、绿脓杆菌——胶原-DNA海绵膜。
图7、绿脓杆菌——纯胶原海绵膜。
图8、纯绿脓杆菌。
图9、大肠杆菌——胶原-DNA-Ag海绵膜。
图10、大肠杆菌——胶原-DNA海绵膜。
图11、大肠杆菌——纯胶原海绵膜。
图12、纯大肠杆菌。
具体实施例方式
实施例1将1g DNA在搅拌下溶于预冷至4℃的1000ml去离子水中。加入1％AgNO32g。搅拌10分钟。将该溶液置于透析袋中，透析24-96h。
取0.7％胶原溶液300ml，在4℃下，透析24-96h。在13.3KPa下脱气10分钟。然后用直径1cm，孔径0.4mm，孔数为50个/cm2的喷头，在0.15MPa压力下，将其喷入上述DNA溶液中。将得到的凝胶置于100目的筛网上沥去水份，用200ml预冷至4℃的去离子水洗涤三次，装入10×10×0.5cm的模型中，冷冻温度-20℃，用P2O5、KOH做干燥剂，真空干燥，可得10片胶原蛋白海绵膜，总重3.1g，Ag含量0.21％(W/W)。包装、Co60照射。
实施例2将5g DNA在搅拌下溶于预冷至4℃的100ml去离子水中，调溶液PH值为8-10，加入饱和AgNO30.5g，搅拌20min，透析24-96h.
取0.5％胶原溶液2000ml，在4℃下，透析24-96h，在13.3KPa下脱气10min。然后用直径1cm、孔径0.5mm、孔数50个/cm2的喷头，在0.1MPa压力下，将其喷入上述DNA溶液中。将得到的凝胶置于100目的筛网上沥去水份，用2000ml预冷至4℃的去离子水洗涤三次，装入10×10×0.5cm的模型中，冷冻温度-20℃。用P2O5、KOH做干燥剂，干燥，得55片胶原蛋白海绵膜，重16.2g，Ag含量0.25％(W/W)，包装、Co60照射。
实施例3将1g DNA在搅拌下溶于预冷至4℃的100ml去离子水中，加入2％AgNO3溶液1g，搅拌10min，透析24-96h.
取0.5％胶原溶液400ml，在4℃下，透析24-96h，在13.3KPa下脱气10min，然后用直径1cm、孔径0.5mm、孔数50个/cm2的喷头，在0.1MPa压力下，将其喷入上述DNA溶液中，搅拌，将得到的无色透明胶乳用压力为0.5MPa、温度为120℃的空气喷雾干燥，得胶原-DNA-Ag复合物粉末1.8g，Ag含量0.20％(W/W)，包装、Co60照射。
抑菌实验实施例4(1)、混菌培养基平板制备将已培养好的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的斜面培养物分别用接种环刮下少许菌苔，然后用已灭菌的营养肉汤培养基制成5ml菌悬液。取该菌悬液0.1ml用营养肉汤稀释10倍备用。
取无菌培养皿12个，分组，编号。其中I组1-4号各加入上述已配制好的金黄色葡萄球菌菌悬液1ml；II组5-8号各加入上述已配制好的绿脓杆菌菌悬液1ml；III组9-12号各加入上述已配制好的大肠杆菌菌悬液1ml。再分别加入冷却至50℃左右的20ml营养肉汤琼脂培养基，摇匀，充分冷凝后备用。
(2)、抑菌试验将直径2.5cm，经Co60灭菌后的胶原-DNA-Ag、胶原-DNA复合海绵膜及纯胶原海绵膜按下述分组后，贴于混菌液培养基平板中央位置，做好标记，于35-37℃倒置在恒温培养箱培养24-48小时，观察细菌生长情况。分组情况如下I组1-4号，金黄色葡萄球菌试验组1、胶原-DNA-Ag海绵膜图1；2、胶原-DNA海绵膜图2；3、胶原海绵膜图3；4、空白金黄色葡萄球菌图4。
II组5-8号，绿脓杆菌试验组
5、胶原-DNA-Ag海绵膜图5；6、胶原-DNA海绵膜图6；7、胶原海绵膜图7；8、空白 绿脓杆菌图8。
III组9-12号，大肠杆菌试验组9、胶原-DNA-Ag海绵膜图9；10、胶原-DNA海绵膜图10；11、胶原海绵膜图11；12、空白大肠杆菌图12。
(3)、试验结果胶原-DNA-Ag海绵膜对三种菌均有抑菌作用，抑菌圈直径3cm以上，清晰；胶原-DNA海棉膜对金黄色葡萄球菌有抑制作用，24小时抑菌圈直径3cm以上，清晰；48小时模糊。对其余二种菌没有抑菌作用；纯胶原海绵膜对三种菌均无抑菌作用。
止血实验实施例5(1)实验动物及材料胶原-DNA-Ag海绵膜由实施例一及实施例二提供的产品；明胶海绵由南京第三制药厂生产；实验动物大耳白兔由大连医学院附属医院动物实验室提供。
(2)动物模型的建立选10只健康大耳白兔，体重2.5-3.0Kg，雌雄不限，单笼饲养，自由饮水进食，在实验室饲养1周后进行实验。每5只一组分成实验组和对照组两组，在大耳白兔耳部制造2cm×1cm大小的出血创面。实验组用胶原-DNA-Ag海绵膜，对照组用明胶海绵膜。
(3)观察指标用胶原-DNA-Ag海绵膜和明胶海绵膜敷压后，记录大耳白兔耳部创面止血时间。
(4)实验结果止血时间胶原-DNA-Ag海绵膜和明胶海绵膜止血时间分别为57.2±15.4S和96.0±15.1S；出血量分别为1.6±0.3ml和2.6±0.7ml，二者比较有显著性差异(P≤0.05)。
用胶原-DNA-Ag海绵膜敷压后10min、24h、48h观察均末见海绵脱落和再出血现象，有效地密封出血创面。而明胶海绵膜三例在敷料与组织间有渗出现象，另外，对出血急促的兔耳部创面，血流常会穿过明胶的泡孔结构面渗出，根据上述动物实验，胶原-DNA-Ag海绵膜止血效果优于明胶海绵。
胶原-DNA-Ag海绵膜对烧伤的治疗实施例6(1)、病例选择4例烧伤后残余伤面患者，平均深II度、III度烧伤，治疗组用胶原-DNA-Ag海绵膜2例，对照组用胶原海绵2例，创面细菌培养分别为金黄色葡萄球菌，绿浓杆菌各一例。
(2)、处置方法创面用无菌生理盐水清洗之前，做创面组织细菌培养，计数。创面用无菌生理盐水清洗后，分别覆盖胶原-DNA-Ag海绵膜、胶原海绵膜，隔日用无菌生理盐水清洗换药一次，比较二者治疗的结果。
(3)、治疗结果
结果表明治疗组较对照组残余伤面痊愈时间稍有缩短，创面细菌数量差异较大。病理组织学观察发现，4例全部具有肉芽组织特点，均无痂皮形成。
具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物，用于治疗烧、烫伤及止血有着促进肉芽组织形成、抑制痂皮形成的特点，用于生物敷料在医学临床使用，柔软舒适，创面贴合性好，透气、吸水、止血、抑菌消炎，促进皮肤再生。
权利要求
1.具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物，其特征在于由以下原料制备胶原蛋白浓度为0.1-10％，，DNA浓度为0.1-5.0％，可溶性银盐AgNO3溶液浓度为1％至饱合，胶原蛋白DNA∶Ag比例为1.5-2.5∶0.5-1.5∶0.05-0.2(W/W/W).
2.根据权利要求1所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于是以胶原蛋白浓度为0.1-10％、DNA浓度为0.1-5.0％、可溶性银盐AgNO3溶液浓度为1％至饱合浓度，经离子交换、透析、脱气、成型、冷冻、干燥、灭菌制成医用抑菌胶原复合物。
3.根据权利要求1所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于是以胶原蛋白浓度为0.4-1.0％，DNA浓度为0.1-1.0％，AgNO3溶液浓度为1％-10％，经离子交换、透析、脱气、成型、冷冻、干燥、灭菌制成医用抑菌胶原复合物。
4.根据权利要求2所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于在离子交换步骤中，将DNA溶于预冷至4℃的去离子水中，加入1％-饱合的AgNO3溶液，搅拌5-20分钟，反应温度为-20-40℃。
5.根据权利要求2所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于将离子交换反应完成后的DNA-AgNO3混合液透析，温度为-20-40℃，时间为24-96h。
6.根据权利要求2所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于在透析步骤，将0.1-10％的胶原溶液透析，透析温度为-20-40℃，时间为24-96小时。
7.根据权利要求2所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于将透析后的胶原溶液脱气，压力为3.3-26.6 KPa，时间为5-20min。
8.根据权利要求2所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于将脱气后的胶原溶液喷入DNA-Ag溶液中，喷嘴孔径0.05-1.0mm、孔密度为5-50个/cm2、压力为0.05-0.5MPa.
9.根据权利要求2所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于将成型后的胶原-DNA-Ag复合物冷冻，温度为-20—-200℃
10.根据权利要求2所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于将冷冻后的胶原-DNA-Ag复合物干燥，干燥温度为-30-40℃，压力为0.038-7.4 KPa，干燥剂为P2O5、KOH、液氮、干冰，干燥方法为真空干燥或真空冷冻干燥，得胶原-DNA-Ag海绵膜。
11.根据权利要求2所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于将获得的胶原-DNA-Ag胶乳喷雾干燥，干燥用热风压力为0.3-1.0MPa，温度为80-200℃，得粉状胶原-DNA-Ag复合物。
12.根据权利要求2所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物的制备方法，其特征在于灭菌，灭菌方法为Co60照射。
13.根据权利要求1所述的具有抑菌功效的胶原-DNA-Ag复合物，其特征在于DNA盐是DNA钠盐。
14.一种用于治疗烧、烫伤及止血的药物，其特征在于该药物含有权利要求1所述的复合物或按照权利要求2至12任一项所述方法制备的复合物。
全文摘要
本发明属生化制品，特别涉及一种具有抑菌功效的胶原－DNA－Ag复合物及其制备方法，以浓度为0.1－10％胶原蛋白、浓度为0.1－5.0％DNA、浓度为1％至饱合AgNO
文档编号A61K35/12GK1406489SQ01128060
公开日2003年4月2日 申请日期2001年8月18日 优先权日2001年8月18日
发明者周久才, 刘占龙, 金桂菊, 邢磊 申请人:阜新橡胶有限责任公司