专利名称：异构性固化瘤苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种含免疫因子的医用配制品，特别是一种从异体某种肿瘤(癌、肉瘤)全细胞提取制备针对该种肿瘤的异构性固化抗原肽瘤苗及其制备方法。
背景技术：
近代已公认肿瘤是一种基因性疾病，但细胞癌变是因哪些基因突变或哪些基因缺失的基础研究尚未形成完整的理论。因此，肿瘤的免疫治疗在方法上显得更为重要的是实践论的研究方法。
目前国内外文献报导中的抗肿瘤免疫生物制剂大致可分为以下几类1、白细胞介素类；2、干扰素、免疫核糖核酸；3、肿瘤坏死因子；4、共刺激分子基因治疗；5、特殊病毒基因治疗；6、白介素-2扩增的拉克细胞(LAK)疗法；7、细胞转基因抗癌治疗；8、抗体抗癌生物治疗，包括免疫毒素及导向弹头药物治疗；9、中药免疫抗癌药物；10、自体瘤苗免疫。以上各类产品和研究成果，对免疫抗癌从动物实验到临床应用都有产生疗效的报导，但实际上很难重复其稳定效果，且它们都存在以下几个共同的不足之处1、免疫疗效不确切，常常是动物实验有效，而临床应用疗效却不明显；2、临床应用多产生“高烧”，过敏等不安全的毒副反应，甚至促癌生长；3、尚难建立确认的特异性抗癌免疫功能；4、制备昂贵，很难由实验室转化进入工业化生产；5、更为关键的是，它们都局限于某一“克隆，基因或因子”去研究解决肿瘤免疫治疗，故很难实现治疗目的，其原因是肿瘤细胞的抗原性极其微弱，且是多克隆，多癌变基因的内源性肽性产物，故其机制有待探讨及深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可进行工业化生产的，具有确切抗癌肿免疫疗效的应用异体某种肿瘤(癌、肉瘤)全细胞提取制备针对该种肿瘤的特异性的异构性固化瘤苗及其制备方法。
本发明是基于这样的免疫机制来实现发明目的的它采用由同种异体(病人)癌细胞中收集纯度高，低分化癌细胞，从癌细胞核中提取全息性多克隆特异性抗原肽，并固化消除瘤细胞膜的抗原性及促癌性；再将此种异体癌细胞的抗原肽进行修饰后，注入机体使之成为能适应被接受治疗病人的主要组织相容性基因复合体(MHC)的异构性(同分子异构体)内源性抗原肽决定簇，达到能特异性激活病人体内的静止T淋巴细胞；将此种抗原肽(异构性固化瘤苗)注入病人体内(肌肉、静脉、腔内)，能通过抗原提呈细胞(APC)和树突状细胞(DC)免疫反应系统的启动因子和调节因子，消除免疫麻痹，激活体内细胞免疫，使静止T淋巴细胞，转化成T抗原受体免疫细胞(TCR)；最后使该类T淋巴细胞能特异性攻入癌细胞内，释放溶癌细胞因子等，激活癌细胞内自我剪切酶(酶-RNA)，使癌细胞发生自杀性凋亡和自溶。
本发明具体是这样实现的一种异构性固化瘤苗，其特征在于它是由异体癌细胞中提取制备的异构性固化瘤苗，能产生特异性免疫抗癌和溶癌的专一免疫制剂，无促癌生长作用，可静脉、肌肉、腔内注射；它可产生类植物血凝素作用，使静止淋巴细胞转化成免疫淋巴细胞；它具有类白介素-2扩增淋巴细胞作用，且扩增的淋巴细胞是免疫淋巴T细胞；可以在常温下保存而不减低瘤苗的免疫效应；它可用下述方法得到由同种异体癌细胞中收集纯度高、低分化癌细胞组织，并粉碎癌细胞组织，用氯化钠溶液、中性磷酸钠缓冲液处理收集其中的癌细胞物质，再用生理盐水稀释癌细胞物质，并加入溶菌酶酶解，然后加入氯化十二烷基吡啶，定性过滤，收集癌细胞液放于60℃/5分钟水浴中进行射频热电子效应的固化处理；将经固化处理的癌细胞液照射X线、冷藏静置，用氯仿-戊醇抽提、离心得核酸溶液，并用生理盐水脱盐，收集核酸生理盐水溶液；将收集的核酸生理盐水溶液加入偶联佐剂，并用超声波处理，促进抗原肽偶联反应，然后将得到的抗原肽放入高压仓中，用紫外线照射，再对其进行微孔过滤，在真空泵压力下进行提纯浓缩，最后，将浓缩抗原肽用生理盐水稀释成106/ml个癌细胞，即得到异构性固化瘤苗。
本发明所述异构性固化瘤苗的具体制备方法是1、材料选择及预处理(1)用无菌操作，由手术台上收集切除的实体瘤，剔除结缔组织和非肿瘤组织进行系统的肿瘤病理诊断和分类，收集高纯度、低分化癌细胞，并将这类肿瘤组织剪碎，放于深低温液氮保存；(2)癌细胞的粉碎在温度4℃条件下，按10％的浓度比例(重量)将上述剪碎的肿瘤组织放入0.15mol/L氯化钠溶液中，用高速组织捣碎机进行粉碎处理30分钟，密度梯度离心，清除非癌细胞物质，收集其中的癌细胞物质，再在收集的癌细胞物质中加入中性磷酸钠缓冲液(PBS)，使其酸碱度PH值介于6.25～6.35之间；然后用生理盐水稀释至每毫升含108个癌细胞，并按每毫升加入500mg溶菌酶，37℃温度条件下保温30分钟；再加入适量氯化十二烷基吡啶，定性过滤后，收集癌细胞液放于60℃/5分钟水浴中进行射频热电子效应的固化处理；2、异构性固化抗原的提取(1)将固化处理后的癌细胞液照射X线，剂量为2格瑞/10分钟；(2)将照射后的癌细胞液静置4小时，静置温度为4℃；(3)将静置后的癌细胞液中加入氯化钠，调整其浓度成为1mol/L的氯化钠溶液，再用氯仿-戊醇摇荡抽提；癌细胞液内的蛋白质在氯仿-戊醇水界面形成凝胶，离心后除去凝胶，将核酸留在水溶液中，可反复2次或2次以上；(4)将收集的核酸溶液应用生理盐水脱盐，达到透析液内外平衡，用比重法测试，成为具有癌变基因的核酸生理盐水溶液；3、免疫抗原肽偶联(1)将上述核酸生理盐水溶液按5％浓度(体积)加入偶联佐剂达到可明显增强特异抗原肽交联反应；(2)加入偶联佐剂的核酸生理盐水溶液，应用超声波处理30分钟，促进抗原肽偶联反应；(3)将上述得到的抗原肽放入2个大气压的高压仓中，用200W紫外线照射6小时；(4)无菌操作将紫外线照射后的抗原肽应用所定的分子量(4～5万)截止的微孔滤膜(6B)，在真空泵压力下进行提纯浓缩；(5)将浓缩抗原肽按原108/ml个癌细胞的浓度，用生理盐水稀释成为106/ml个癌细胞(相当于100万单位每毫升)，得成品。
上述偶联佐剂可采用这样的方法制备将清洗好的黄芪、当归按1∶1的重量比例配料，在80℃温度下烘烤72小时；之后研磨成200目粉末，再进行超声粉碎，达到中心粒径8μm；再按黄芪∶当归∶水＝1∶1∶2重量比例加入酸化双重蒸馏水，即蒸馏水的PH值为6.25～6.35；在20磅高压高温消毒30分种，定性滤纸过滤，取滤液；用超临界流体萃取法萃取，达到有效物质溶解；超滤法分离纯化，达到5000道尔顿物质分离、纯化、浓缩，无菌收集；最后将黄芪、当归浓缩液与铝佐剂按1∶1重量比例配制成偶联佐剂。
本发明所述瘤苗之所以称之为“异构性瘤苗”是由于这种瘤苗是利用同种同源同脏器组织生长的异体癌细胞具有能产生微弱类同免疫反应基因调控的基因群功能，经特殊工艺流程处理后，使该异体的主要组织相容性基因复合体(MHC)，进入病人机体后能够实现选择性的被抗原提呈细胞摄入，并通过抗原提呈细胞的胞内酶解转化功能，使瘤苗中的癌蛋白多克隆抗原分子片段(不是全识别)与抗原提呈细胞中的MHC分子结合；构成能激活病人体内静止T淋巴细胞转化成能特异性攻击癌细胞的T淋巴细胞群的抗原复合体(抗原肽)，这种应用异体癌细胞制备的同分异构的瘤苗，称之为异构性瘤苗；本发明所述瘤苗之所以称为“固化瘤苗”，是指该瘤苗在制备中，应用射频热电子效应，将癌细胞膜性抗原中的促癌抗原(癌胚抗原)进行了特殊的60℃/5分钟固化分子反应，使其完全失去膜性抗原活性，因而消除该瘤苗的封闭抗原和促癌生长抗原的活性和其过敏反应原性，因此该瘤苗可以常温保存，用于动物或人体均不会产生促癌生长的免疫麻痹性和过敏反应性，这种能锁定肿瘤瘤苗毒副反应的特性，称之为“固化”。本发明所述异构性固化瘤苗的化学名为H-固化免疫因子，英文Heteroidity Solidified Tumor Vaccime，拉丁文Vaccinum heteroidiumSolidatum tamori。
本发明所述异构性固化瘤苗的制备方法，其特征在于由同种异体癌细胞中收集纯度高、低分化癌细胞组织，并粉碎癌细胞组织，用氯化钠溶液、中性磷酸钠缓冲液处理收集其中的癌细胞物质，再用生理盐水稀释癌细胞物质，并加入溶菌酶酶解，然后加入氯化十二烷基吡啶，定性过滤，收集癌细胞液放于60℃/5分钟水浴中进行射频热电子效应的固化处理；将经固化处理的癌细胞液照射X线、冷藏静置，用氯仿-戊醇抽提、离心得核酸溶液，并用生理盐水脱盐，收集核酸生理盐水溶液；将收集的核酸生理盐水溶液加入偶联佐剂，并用超声波处理，促进抗原肽偶联反应，然后将得到的抗原肽放入高压仓中，用紫外线照射，再对其进行微孔过滤，在真空泵压力下进行提纯浓缩，最后，将浓缩抗原肽用生理盐水稀释成106/ml个癌细胞，即得到异构性固化瘤苗。
本发明所述异构性固化瘤苗具体的制备方法是这样的A、材料选择及预处理(1)、用无菌操作，由手术台上收集切除的实体瘤，剔除结缔组织和非肿瘤组织进行系统的肿瘤病理诊断和分类，收集高纯度、低分化癌细胞，并将这类肿瘤组织剪碎，放于深低温液氮保存；(2)、癌细胞的粉碎在温度4℃条件下，按10％的浓度(重量)比例将上述剪碎的肿瘤组织放入0.15mol/L氯化钠溶液中，用高速组织捣碎机进行粉碎处理30分钟，密度梯度离心，清除非癌细胞物质，收集其中的癌细胞物质，再在收集的癌细胞物质中加入中性磷酸钠缓冲液(PBS)，使其酸碱度PH值介于6.25～6.35之间；然后用生理盐水稀释至每毫升含108个癌细胞；并按每毫升加入500mg溶菌酶，37℃温度条件下保温30分钟；再加入适量氯化十二烷基吡啶，定性过滤后，收集癌细胞液放于60℃/5分钟水浴中进行射频热电子效应的固化处理；B、异构性固化抗原的提取(1)、将固化后的细胞液照射X线，剂量为2格瑞/10分钟；(2)、将照射后的细胞液静置4小时，静置温度4℃；(3)、将静置后的癌细胞液中加入氯化钠，调整其浓度成为1mol/L的氯化钠溶液，再用氯仿-戊醇摇荡抽提；癌细胞液内的蛋白质在氯仿-戊醇水界面形成凝胶，离心后除去凝胶，将核酸留在水溶液中，可反复2次或2次以上；(4)、将收集的核酸溶液应用生理盐水脱盐，达到透析液内外平衡，用比重法测试，成为具有癌变基因的核酸生理盐水溶液；C、免疫抗原肽偶联(1)、将上述核酸生理盐水溶液按5％浓度加入偶联佐剂达到可明显增强特异抗原肽交联反应；(2)、加入偶联佐剂的核酸生理盐水溶液，应用超声波处理30分钟，促进抗原肽偶联反应；(3)、将上述得到的抗原肽放入2个大气压的高压仓中，用200W紫外线照射6小时；(4)、无菌操作将紫外线照射后的抗原肽应用所定的分子量(4～5万)截止的微孔滤膜(6B)，在真空泵压力下进行提纯浓缩；(5)将浓缩抗原肽按原108/ml个癌细胞的浓度，用生理盐水稀释成为106/ml个癌细胞(相当于100万单位每毫升)，得成品。
上述偶联佐剂可以采用下述方法制得将清洗好的黄芪、当归按1∶1的重量比例配料，在80℃温度下烘烤72小时；之后研磨成200目粉末，再进行超声粉碎，达到中心粒径8μm；再按黄芪∶当归∶水＝1∶1∶2重量比例加入酸化双重蒸馏水，即蒸馏水的PH值为6.25～6.35；在20磅高压高温消毒30分种，定性滤纸过滤，取滤液；用超临界流体萃取法萃取，达到有效物质溶解；超滤法分离纯化，达到5000道尔顿物质分离、纯化、浓缩，无菌收集；最后将黄芪、当归浓缩液与铝佐剂按1∶1配制成偶联佐剂。
众所周知，肿瘤抗原几乎有无限的多样性，一个编码蛋白上可以存在多个CTL识别肽部位，这些肽可以受不同HLA分子的限制，所以当把这些肽用于肿瘤疫苗时，就要选择合适的，既能够有很强的免疫原性，又能抑制多种肿瘤的生长，同时最好还不要引起对自身正常组织的反应，而且还要考虑患者的HLA分子基因是否适合这样的抗原肽，要找到这样的肽非常困难。所以，真正要使肿瘤抗原肽(瘤苗)应用到临床更是难上加难，而本发明却解决了这一系列难题。同时，它与其他抗肿瘤的瘤苗相比，还具有以下积极效果1、该制备方法的制备瘤苗材料较易于获得，可进行工业化生产；2、目前临床所用的瘤苗，须在低温下保存才能保证其瘤苗效应，但本发明所述的瘤苗可以在常温下保存，而不会减低瘤苗的免疫效应，且临床应用不产生免疫耐受和过敏反应；3、现有的国内外报导的自体肿瘤瘤苗研究已承认有产生抗肿瘤免疫反应，但未见报导有自体瘤苗在实验研究中证实它具有扩增淋巴细胞的功能，但本发明所述的异构性固化瘤苗有类白介素-2的扩增淋巴细胞的独特性能，见
图1、图2；4、目前国内外临床研究抗肿瘤的瘤苗，均为自体肿瘤细胞制备，本发明应用异体癌细胞制备固化瘤苗，能用于肿瘤临床，且证实是一种能产生特异性免疫抗癌和溶癌的生物制剂。见图3、图4；5、本发明所述的异构性固化瘤苗为专一免疫制剂，如肝癌的异构性固化瘤苗只能免疫治疗肝癌患者，肺癌瘤苗只对肺癌病人产生特异性免疫反应，无促癌生长作用，且肝癌瘤苗对肺癌病人治疗是无效的；6、现有的抗肿瘤的瘤苗通常不能静脉注射，而本发明所述瘤苗可供临床(静脉、肌肉、腔内注射)应用。临床应用验证可使机体抗癌免疫力增强，使直径3公分以下的癌肿缩小或消失，本发明所述瘤苗无毒副作用，不产生发热反应。
7、通过实验已证明了本发明能实现三分子复体免疫机制，将本发明应用于临床，能实现特异性免疫防、治癌肿目的。见图5。
具体实施例方式
实施例1一种异构性固化瘤苗，其特征在于它是由异体癌细胞中提取制备的异构性固化瘤苗，能产生特异性免疫抗癌和溶癌的专一免疫制剂，无促癌生长作用，可静脉、肌肉、腔内注射；它可产生类植物血凝素作用，使静止淋巴细胞转化成免疫淋巴细胞；它具有类白介素-2扩增淋巴细胞作用，且扩增的淋巴细胞是免疫淋巴T细胞；可以在常温下保存而不减低瘤苗的免疫效应；它可用下述方法得到1、材料选择及预处理(1)、用无菌操作，由手术台上收集切除的实体瘤-肺癌肿瘤，剔除结缔组织和非肿瘤组织进行系统的肿瘤病理诊断和分类，收集高纯度、低分化癌细胞，并将这类肿瘤组织剪碎，放于深低温液氮保存；(2)、癌细胞的粉碎在温度4℃条件下，按10％的浓度比例(重量)将上述剪碎的肺癌肿瘤组织放入0.15mol/L氯化钠溶液中，用高速组织捣碎机进行粉碎处理30分钟，密度梯度离心，清除非癌细胞物质，收集其中的癌细胞物质，再在收集的癌细胞物质中加入中性磷酸钠缓冲液(PBS)，使其酸碱度PH介于6.25～6.35之间；然后用生理盐水稀释至每毫升含108个癌细胞；并按每毫升加入500mg溶菌酶，37℃温度条件下保温30分钟；再加入适量氯化十二烷基吡啶，定性过滤后，收集癌细胞液放于60℃/5分钟水浴中进行射频热电子效应(4-8MHZ)的固化处理；2、异构性固化抗原的提取(1)、将固化处理后的癌细胞液照射X线，剂量为2格瑞/10分钟；(2)、将照射后的癌细胞液放入4℃冰箱中静置4小时；(3)、将静置后的癌细胞液中加入氯化钠，调整其浓度成为1mol/L的氯化钠溶液，再用氯仿-戊醇摇荡抽提；癌细胞液内的蛋白质在氯仿-戊醇水界面形成凝胶，离心后除去凝胶，将核酸留在水溶液中，可反复2次或2次以上；(4)、将收集的核酸溶液应用生理盐水脱盐，达到透析液内外平衡，用比重法测试，成为具有癌变基因的核酸生理盐水溶液；3、免疫抗原肽偶联首先，制备偶联佐剂，其制备方法如下将清洗好的黄芪、当归按1∶1的比例配料，在80℃温度下烘烤72小时；之后研磨成200目粉末，再进行超声粉碎，达到中心粒径8μm；再按黄芪∶当归∶水＝1∶1∶2比例加入酸化双重蒸馏水，即蒸馏水的PH值为6.25～6.35；在20磅高压高温消毒30分种，定性滤纸过滤，取滤液；用超临界流体萃取法萃取，达到有效物质溶解；超滤法分离纯化，达到5000道尔顿物质分离、纯化、浓缩，无菌收集；最后将黄芪、当归浓缩液与铝佐剂按1∶1配制成偶联佐剂。
(1)、将上述核酸生理盐水溶液按5％浓度(体积)加入偶联佐剂达到可明显增强特异抗原肽交联反应；(2)、加入偶联佐剂的核酸生理盐水溶液，应用超声波处理30分钟，促进抗原肽偶联反应；(3)、将上述得到的抗原肽放入2个大气压的高压仓中，用200W紫外线照射6小时；(4)无菌操作将紫外线照射后的抗原肽应用所定分子量4～5万截止的微孔滤膜(6B)，在真空泵压力下进行提纯浓缩；(5)将浓缩抗原肽按原108/ml个癌细胞的浓度，用生理盐水稀释成为106/ml个癌细胞(相当于100万单位每毫升)，得异构性固化瘤苗；(6)检测该异构性固化瘤苗的理化性质生物活性(类白介素-2的生物制剂特性和扩增的T淋巴细胞攻击癌细胞有效性证实实验)；细菌培养(应无菌生长)，毒性试验和热源反应等试验均应为阴性；(7)合格后，分装成每支2ml＝每支含抗原肽200万单位，备临床应用。在治疗过程中，其用量为1～5支/天。
本发明人为了研究本发明所述异构性固化瘤苗免疫治疗癌症，采用上述肺癌LA795制备成异构性固化瘤苗进行了横向比较的动物实验，观察其抗肺癌LA795肺克隆转移率。结果是其抑癌率对照组为0(平均肺转移156个克隆)，化疗组(紫杉醇)96.09％，手术组76.9％，放疗组75.72％，异构性固化瘤苗组76.15％，白介素-2+手术组65.32％。这一系列数据中，异构性固化瘤苗疗效可列入手术、化疗、放疗之中。异构性固化瘤苗+手术与放疗+手术有效率达96％±3。并从电镜中证实异构性固化瘤苗免疫组均发现“凋亡小体”和一系列癌细胞自溶凋亡现象，呈现自主特异性细胞免疫效应。具体情况如下一、材料1、癌细胞自发性肺癌LA795细胞。由天津医药工业研究院提供(系一种极易转移的恶性细胞株)。
2、动物T-739小鼠，雄性，体重18-22克，160只分8个实验组，每组20只。由中国医学科学院肿瘤研究所实验动物室培育，合格证号9810M051。
3、异构性固化瘤苗用肺癌LA795采用本发明所述方法精制的异构性固化瘤苗(Solidified Tumor Vaccine-STV)，由重庆热疗肿瘤研究所研制和提供。
4、直线加速器(日本8MV-X线)。
5、药物及制剂紫杉醇，重组白介素-2。
二、方法1、实验前准备(1)分组实验前四周用肺癌LA795STV免疫20只小鼠作为免疫组。方法STV0.2ml(20万单位)/只，皮下和腹腔交替注射各3次/周共4周。正常对照组用同样方法注射生理盐水0.2ml。
2、接种癌细胞按相同时间和条件用冷冻复苏后第二代肺腺癌LA795细胞，无菌操作下在各组实验鼠的左后足心皮下接种106个肺癌细胞(0.05ml)，第7日对照组接种处肿瘤体积增长明显(最大直径5.5mm±0.5)，开始分组进行治疗实验。
3、分组实验(1)正常对照组生理盐水0.2ml/只/日，皮下注射3次/周。
(2)手术组接种癌12日，行肿瘤患肢截肢术。
(3)放疗组；接种癌第7日开始20Gy/次剂量率410Gy/分(4)放疗+手术组接种癌第7日开始20Gy/次至12日行肿瘤截肢。
(5)化疗组紫杉醇0.2ml/只，静注3次/周。
(6)白介素-2+手术组白介素-2；1000单位/只/日，肌注5次/周至12日行荷瘤截肢。
(7)异构性固化瘤苗组肺癌STV0.2ml(20万单位)，皮下腹腔交替注射各3次/周。
(8)异构性固化瘤苗+手术组肺癌异构性固化瘤苗0.2ml，皮下与腹腔交替注射各3次/周。第12日行荷瘤侧截肢。
4.实验组第21日全部活杀，进行各组肺表面肺癌转移克隆计数和接种部肺癌电镜观察。
二、结果(一)、计算肺表面肺癌转移克隆数实验的8个组，均于接种后第28天活杀。取全肺用Bouins液固定，在解剖显微镜下计算各实验组每只鼠肺表面肺部转移克隆数。经统计学处理各实验组与正常对照比较，均有显著差异(P＜0.001)。基本可明确以下结果多种治癌方法抗肺腺癌LA795接种局部与肺转移比较(P＜0.001)
(1)以对照组作为与各实验治疗组的比较，显示各组均有显著的抗癌转移疗效。并首次横向比较性证实STV免疫组可进入肿瘤三大疗法疗效的行列之中，成为第四种免疫治癌有效方法之一。
(2)STV特异性免疫治疗抗肺转移抑制率76.15％与手术组76.92％放疗组75.72％水平接近。划时代提出肿瘤自主免疫治癌将成为可能。
(3)手术切除结合应用STV免疫治疗组抗肺癌转移率达到93.27％与放疗+手术切除组96.96％比较，说明STV治癌可提高抗癌效果。
(4)按抗肺癌LA795，肺转移抑制率结果排序A化疗(紫杉醇)96.09％，B手术组76.92％，C异构性固化瘤苗组76.15％，D放疗组75.72％。但这种百分比的排序，仅说明动物实验结果，而临床应用中由于化疗的严重副作用使它无法代替手术治疗的地位，应给予认定。
(二)、各组接种左后足心皮下肺腺癌于28天活杀后，肿瘤电镜所见(1)对照组(生理盐水)癌细胞排列紧密，结构清楚，细胞器完整，以常染色质为主，异染色质少，核仁小，核较规则。(见图6)TEM×4000。
(2)手术组细胞器及核膜清晰，以常染色质为主，细胞间构成微腔。(见图7)TEM×8000。
(3)放疗组多核瘤细胞，核仁多而大，异染色质不规则，表成微绒毛脱落。(见图8)TEM×7000。
(4)放疗+手术组癌细胞胞质崩解，细胞器退变模糊不清，核锯齿状不规则，染色质边集，异染色质成块，核不完整。(见图9)TEM×12000。
(5)化疗组癌细胞微绒毛脱落，胞浆内空泡，核仁大。(见图10)TEM×8000。
(6)白介素-2+手术组癌细胞结构清楚，癌细胞间隙增宽，可见核分裂相。其间可见淋巴细胞浸润，但其癌细胞变化不明显。(见图11)TEM×5000。
(7)异构性固化瘤苗组癌细胞器减少或消失，癌细胞胞浆外溢，核固缩。有凋亡小体。(见图12)TEM×25000。
(8)异构性固化瘤苗+手术组癌细胞腔襄内出现空泡，细胞器模糊，减少，部分胞核崩解。胞内有凋亡小体。(见图13)TEM×12000。
实施例2与实施例1所不同的是选用的肿瘤细胞为肝癌细胞，其他均与实施例1相同。所得的异构性固化瘤苗用于治疗肝癌患者。
实施例3与实施例1所不同的是选用的肿瘤细胞为胃癌细胞，其他均与实施例1相同。所得的异构性固化瘤苗用于治疗胃癌患者。
权利要求
1.一种异构性固化瘤苗，其特征在于它是由异体癌细胞中提取制备的异构性固化瘤苗，能产生特异性免疫抗癌和溶癌的专一免疫制剂，无促癌生长作用，可静脉、肌肉、腔内注射；它可产生类植物血凝素作用，使静止淋巴细胞转化成免疫淋巴细胞；它具有类白介素-2扩增淋巴细胞作用，且扩增的淋巴细胞是免疫淋巴T细胞；可以在常温下保存而不减低瘤苗的免疫效应；它可用下述方法得到由同种异体癌细胞中收集纯度高、低分子癌细胞组织，并粉碎癌细胞组织，用氯化钠溶液、中性磷酸钠缓冲液处理收集其中的癌细胞物质，再用生理盐水稀释癌细胞物质，并加入溶菌酶酶解，然后加入氯化十二烷基吡啶，定性过滤，收集癌细胞液放于60℃/5分钟水浴中进行射频热电子效应的固化处理；将经固化处理的癌细胞液照射X线、冷藏静置，用氯仿-戊醇抽提、离心得核酸溶液，并用生理盐水脱盐，收集核酸生理盐水溶液；将收集的核酸生理盐水溶液加入偶联佐剂，并用超声波处理，促进抗原肽偶联反应，然后将得到的抗原肽放入高压仓中，用紫外线照射，再对其进行微孔过滤，在真空泵压力下进行提纯浓缩，最后，将浓缩抗原肽用生理盐水稀释成106/ml个癌细胞，即得到异构性固化瘤苗。
2.如权利要求1所述的异构性固化瘤苗，其特征在于所述异构性固化瘤苗具体可采用以下方法制备A、材料选择及预处理(1)用无菌操作，由手术台上收集切除的实体瘤，剔除结缔组织和非肿瘤组织进行系统的肿瘤病理诊断和分类，收集高纯度、低分化癌细胞，并将这类肿瘤组织剪碎，放于深低温液氮保存；(2)癌细胞的粉碎在温度4℃条件下，按10％的浓度(重量)比例将上述剪碎的肿瘤组织放入0.15mol/L氯化钠溶液中，用高速组织捣碎机进行粉碎处理30分钟，密度梯度离心，清除非癌细胞物质，收集其中的癌细胞物质，再在收集的癌细胞物质中加入中性磷酸钠缓冲液(PBS)，使其酸碱度PH值介于6.25～6.35之间；然后用生理盐水稀释至每毫升含108个癌细胞，并按每毫升加入500mg溶菌酶，37℃温度条件下保温30分钟；再加入适量氯化十二烷基吡啶，定性过滤后，收集癌细胞液放于60℃/5分钟水浴中进行射频热电子效应的固化处理；B、异构性固化抗原的提取(1)将固化处理后的癌细胞液照射X线，剂量为2格瑞/10分钟；(2)将照射后的癌细胞液静置4小时，静置温度为4℃；(3)将静置后的癌细胞液中加入氯化钠，调整其浓度成为1mol/L的氯化钠溶液，再用氯仿-戊醇摇荡抽提；癌细胞液内的蛋白质在氯仿-戊醇水界面形成凝胶，离心后除去凝胶，将核酸留在水溶液中，可反复2次或2次以上；(4)将收集的核酸溶液应用生理盐水脱盐，达到透析液内外平衡，用比重法测试，成为具有癌变基因的核酸生理盐水溶液；C、免疫抗原肽偶联(1)将上述核酸生理盐水溶液按5％浓度(体积)加入偶联佐剂达到可明显增强特异抗原肽交联反应；(2)加入偶联佐剂的核酸生理盐水溶液，应用超声波处理30分钟，促进抗原肽偶联反应；(3)将上述得到的抗原肽放入2个大气压的高压仓中，用200W紫外线照射6小时；(4)无菌操作将紫外线照射后的抗原肽应用所定的分子量(4～5万)截止的微孔滤膜(6B)，在真空泵压力下进行提纯浓缩；(5)将浓缩抗原肽按原108/ml个癌细胞的浓度，用生理盐水稀释成为106/ml个癌细胞(相当于100万单位每毫升)，得成品。
3.如权利要求1、2所述的异构性固化瘤苗，其特征在于所述偶联佐剂可以采用下述方法制备将清洗好的黄芪、当归按1∶1的重量比例配料，在80℃温度下烘烤72小时；之后研磨成200目粉末，再进行超声粉碎，达到中心粒径8μm；再按黄芪∶当归∶水＝1∶1∶2重量比例加入酸化双重蒸馏水；在20磅高压高温消毒30分种，定性滤纸过滤，取滤液；用超临界流体萃取法萃取；超滤法分离纯化，达到5000道尔顿物质分离、纯化、浓缩，无菌收集；最后将黄芪、当归浓缩液与铝佐剂按1∶1重量比例配制成偶联佐剂。
4.如权利要求1、2所述的异构性固化瘤苗，其特征在于所述的固化处理中的射频热电子效应选用的是4～8MHZ。
5.如权利要求1所述的异构性固化瘤苗的制备方法，其特征在于由同种异体癌细胞中收集纯度高、低分子癌细胞组织，并粉碎癌细胞组织，用氯化钠溶液、中性磷酸钠缓冲液处理收集其中的癌细胞物质，再用生理盐水稀释癌细胞物质，并加入溶菌酶酶解保温，然后加入氯化十二烷基吡啶，定性过滤，收集癌细胞液放于60℃/5分钟水浴中进行射频热电子效应的固化处理；将经固化处理的癌细胞液照射X线、冷藏静置，用氯仿-戊醇抽提、离心得核酸溶液，并用生理盐水脱盐，收集核酸生理盐水溶液；将收集的核酸生理盐水溶液加入偶联佐剂，并用超声波处理，促进抗原肽偶联反应，然后将得到的抗原肽放入高压仓中，用紫外线照射，再对其进行微孔过滤，在真空泵压力下进行提纯浓缩，最后，将浓缩抗原肽用生理盐水稀释成106/ml个癌细胞，即得到异构性固化瘤苗。
6.如权利要求5所述的异构性固化瘤苗的制备方法，其特征在于所述异构性固化瘤苗具体的制备方法是这样的A、材料选择及预处理(1)用无菌操作，由手术台上收集切除的实体瘤，剔除结缔组织和非肿瘤组织进行系统的肿瘤病理诊断和分类，收集高纯度、低分化癌细胞，并将这类肿瘤组织剪碎，放于深低温液氮保存；(2)癌细胞的粉碎在温度4℃条件下，按10％的浓度比例将上述剪碎的肿瘤组织放入0.15mol/L氯化钠溶液中，用高速组织捣碎机进行粉碎处理30分钟，密度梯度离心，清除非癌细胞物质，收集其中的癌细胞物质，再在收集的癌细胞物质中加入中性磷酸钠缓冲液(PBS)，使其酸碱度PH值介于6.25～6.35之间；然后用生理盐水稀释至每毫升含108个癌细胞，并按每毫升加入500mg溶菌酶，37℃温度条件下保温30分钟；再加入适量氯化十二烷基吡啶，定性过滤后，收集癌细胞液放于60℃/5分钟水浴中进行射频热电子效应的固化处理；B、异构性固化抗原的提取(1)将固化处理后的癌细胞液照射X线，剂量为2格瑞/10分钟；(2)将照射后的癌细胞液静置4小时，静置温度为4℃；(3)将静置后的癌细胞液中加入氯化钠，调整其浓度成为1mol/L的氯化钠溶液，再用氯仿-戊醇摇荡抽提；癌细胞液内的蛋白质在氯仿-戊醇水界面形成凝胶，离心后除去凝胶，将核酸留在水溶液中，可反复2次或2次以上；(4)将收集的核酸溶液应用生理盐水脱盐，达到透析液内外平衡，用比重法测试，成为具有癌变基因的核酸生理盐水溶液；C、免疫抗原肽偶联(1)将上述核酸生理盐水溶液按5％浓度加入偶联佐剂达到可明显增强特异抗原肽交联反应；(2)加入偶联佐剂的核酸生理盐水溶液，应用超声波处理30分钟，促进抗原肽偶联反应；(3)将上述得到的抗原肽放入2个大气压的高压仓中，用200W紫外线照射6小时；(4)无菌操作将紫外线照射后的抗原肽应用所定的分子量(4～5万)截止的微孔滤膜(6B)，在真空泵压力下进行提纯浓缩；(5)将浓缩抗原肽按原108/ml个癌细胞的浓度，用生理盐水稀释成为106/ml个癌细胞(相当于100万单位每毫升)，得成品。
7.如权利要求5、6所述的异构性固化瘤苗的制备方法，其特征在于所述偶联佐剂可以采用下述方法制得将清洗好的黄芪、当归按1∶1的重量比例配料，在80℃温度下烘烤72小时；之后研磨成200目粉末，再进行超声粉碎，达到中心粒径8μm；再按黄芪∶当归∶水＝1∶1∶2重量比例加入酸化双重蒸馏水，即蒸馏水的PH值为6.25～6.35；在20磅高压高温消毒30分种，定性滤纸过滤，取滤液；用超临界流体萃取法萃取，达到有效物质溶解；超滤法分离纯化，达到5000道尔顿物质分离、纯化、浓缩，无菌收集；最后将黄芪、当归浓缩液与铝佐剂按1∶1重量比例配制成偶联佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种异构性固化瘤苗及其制备方法。它是由异体癌细胞中提取制备的瘤苗,能产生特异性免疫抗癌和溶癌的专一免疫制剂,无促癌生长作用,可静脉、肌肉、腔内注射;它可产生类植物血凝素作用,使静止淋巴细胞转化成免疫淋巴细胞;它具有类白介素－2扩增淋巴细胞作用,且扩增的淋巴细胞是免疫淋巴T细胞;可以在常温下保存而不减低瘤苗的免疫效应。本发明可进行工业化生产,具有确切抗癌肿免疫疗效。
文档编号A61P37/02GK1346679SQ0112882
公开日2002年5月1日 申请日期2001年9月7日 优先权日2001年9月7日
发明者黄皎林, 黄海 申请人:黄皎林