控制端粒长度的方法

专利名称：控制端粒长度的方法
技术领域：
本发明涉及控制端粒长度的方法，其中真核细胞中内源Mrell蛋白的生理学活性经过修饰，以在真核细胞中修饰内源Mrell蛋白的生理学活性的物质为活性组分的端粒长度控制剂，和与端粒长度相关的疾病的基因治疗剂，所述的基因治疗剂包含作为活性成分的能在真核细胞中修饰内源Mrell蛋白的生理学活性物质。
背景技术：
端粒是位于组成真核细胞的丝状染色体的双链DNA末端的功能性结构。已知这一结构通常包含简单重复序列，并且在阻止由于染色体融合造成的染色体畸变，在有丝分裂过程中的染色体配对，控制基因表达，和决定在核中染色体的形成中起着重要的作用。
一般来说，双链DNA的复制是通过由引物酶合成RNA引物，在其末端由DNA聚合酶使DNA链的延长-合成而进行的。上述RNA引物通过DNA聚合酶的5′-3′内切酶活性去除，同时所去除的部分通过DNA聚合酶的作用由DNA链所替代。但是对于丝状染色体，没有DNA链替换大多数新生DNA链5′-端的RNA引物，因此当复制完成后所得的染色体短了RNA引物大小的一段。由此每次细胞分裂所得的子细胞中都累积性地由染色体的末端缩短其长度，最终染色体变得不稳定并导致细胞死亡。另一方面，已表明在无限增殖的细胞中，可使端粒延长的端粒酶高度表达，从而使端粒的长度不能缩短。由此我们对有关细胞寿命的调节剂或在其机制中涉及端粒酶活性的抗癌剂进行了详细地研究。
然而，最近有报道在酵母和小鼠等生物中，即使其端粒酶基因被破坏，其端粒的缩短仍然要耗费一定的时间[Blasco，M.A.，et al.Cell，9125-34(1997)；Rudolph，K.L.，et al.Cell，96701-12(1999)；Herrera，E.，etal.Embo 3，182950-60(1999)]，另外并不与端粒酶活性直接相关的基因的变异体也导致端粒的缩短或延长[Boulton，S.3.，et al.Embo 3，171819-28(1998)；Furuse，M.，et al.Embo 3，176412-25(1998)；Wilson，S.et al.Nucleic Acids Res，272655-61(1999)]。因此，说明存在维持端粒的非端粒酶的潜在机制[Nakamura，T.M.，et al.Science，282493-6(1998)；Reddel，R.R.，et al.A review.Biochemistry(Mosc)，621254-62(1997)]。具体说来，已有报道，用于修复双链DNA断裂等的Mrell-Rad5O-Xrs2复合物也与控制端粒酶长度相关[Boulton，5.3.，et al.Embo 3，171819-28(1998)；Puruse，M.，et al.Embo 1，176412-25(1998)；Le，S.，et al.Genetics，152143-52(1999)]。Mrell-Rad5O-Xrs2(Nbsl)复合物[Ajimura，M.，et al.Genetics，13351-66(1993)；Johzuka，K.，et al.Genetics，1391521-32(1995)]是以具有强DNA结合活性且起双链DNA外切酶和单链内切酶作用的Mrell作为核心所形成的的蛋白复合物[Furuse，M.，et al.Embo 3，176412-25(1998)；Paull，T.T.，et al.Mol Cell，1969-79(1998)；Usui，T.，et al.Cell，95705-16(1998)；Trujillo，K.M.，et al.3 Biol Chem，27321447-50(1998)]。所述的复合物作为核心酶起始修复DNA双链断裂或染色体重组的反应。在出芽酵母中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，即使组成这种酶-复合物的蛋白之一缺失，也可观察到端粒的明显缩短[Boulton，S.J.，et al.Embo 3，171819-28(1998)]。在人体中存在Mrell-Rad5O-Xrs2(Nbsl)复合物中所有组成型蛋白的同系物[Dolganov，G.M.，et al.Mol Cell Biol，164832-41(1996)；Petrini，J.H.，et al.Genomics，2980-6(1995)]，据认为它们在从酵母到人的所有真核生物中具有共同的功能。

发明内容
本发明的一个目的在于提供控制端粒长度的方法，该方法包括修饰真核细胞中内源Mrell蛋白的生理学活性。
对上述内容进行详细研究的结果的基础上，本发明人发现修饰真核细胞中内源Mrell蛋白的生理学活性可以控制端粒的长度，进而完成了本发明。
换句话说，本发明是一种控制端粒长度的方法，该方法包括修饰真核细胞中内源Mrell蛋白的生理学活性。此处，所述的修饰内源Mrell蛋白的生理学活性是通过在下述DNA能够表达的状态下向细胞中引入编码外源Mrell蛋白的DNA或编码其中的外源Mrell蛋白的核酸酶结构域或C-末端结构域经过修饰的蛋白的DNA而进行的。
而且，本发明是包含以在真核细胞中修饰内源Mrell蛋白的生理学活性的物质作为活性组分的端粒长度控制剂和与端粒长度相关的疾病的基因治疗剂。此处，在真核细胞中修饰内源Mrell蛋白的生理学活性的物质可以包括含有处于能够表达状态下的下述DNA的DNA构建体即编码外源Mrell蛋白的DNA或编码其中的外源Mrell蛋白的核酸酶结构域或C-末端结构域经过修饰的蛋白的DNA。
在本发明中提供下述的蛋白(a)或(b)，其作为外源Mrell蛋白(a)包含如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的蛋白；或(b)包含从、在或对如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性的蛋白。
而且，在本发明中提供下述DNA(c)或(d)，其作为编码外源Mrell蛋白的DNA(c)包含如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列的DNA；或(d)可在严谨条件下与(c)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性的蛋白的DNA。
本发明还提供下述蛋白(e)或(f)，作为其中的外源Mrell蛋白核酸酶结构域经过修饰的蛋白(e)包含如SEQ ID NO6或7所示氨基酸序列的蛋白；或(f)包含从、在或对如SEQ ID NO6或7所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性(除核酸酶活性之外)的蛋白。
而且在本发明中提供下述DNA(g)或(h)，作为编码其中的外源Mrell蛋白核酸酶结构域经过修饰的蛋白的DNA(g)包含如SEQ ID No5所示核苷酸序列的DNA；或(h)可在严谨条件下与(g)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性(除核酸酶活性之外)的蛋白的DNA。
而且本发明还提供下述蛋白(i)或(j)，作为其中的外源Mrell蛋白C-末端结构域经修饰的蛋白(i)包含如SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白；或(j)包含从、在或对如SEQ ID NO8所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性(除双链DNA结合活性之外)的蛋白。
再一方面，本发明提供下述DNA(k)或(l)，作为编码其中的外源Mrell蛋白C-末端结构域经修饰的蛋白的DNA(k)包含如SEQ ID No7所示核苷酸序列的DNA；或(l)可与(k)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性(除双链DNA结合活性之外)的蛋白的DNA。
通过下述内容对本发明进行详细介绍。
依照本发明控制端粒长度的方法是基于对真核细胞中的内源Mrell蛋白的生理学活性进行修饰而进行的。此处所用的术语“控制端粒的长度”是指缩短，保持或延长细胞中端粒的长度。术语“内源Mrell蛋白”是指天然存在于细胞内并具有Mrell蛋白生理学活性的蛋白。术语“Mrell蛋白生理学活性”是指至少下列活性之一与Rad50蛋白和Xrs2(Nbsl)蛋白形成复合物的能力，双链DNA结合活性，双链DNA外切酶活性和单链DNA内切酶活性。所述的双链DNA外切酶活生和单链DNA内切酶活性作为一个整体指核酸酶活性。另外“修饰”是指提高，降低或缺失，部分或全部内源Mrell蛋白的生理学活性。例如，端粒的缩短可以通过在下述DNA可以表达的状态下向细胞中引入编码全长外源Mrell蛋白的DNA或编码其中的外源Mrell蛋白核酸酶结构域经过修饰的蛋白的DNA。此处“DNA可以表达的状态”是指一种状态，其中所述的DNA包含在带有与所述表达有关的DNA区域，如启动子，的载体中，以使由所述的DNA编码的蛋白能在引入了所述DNA的细胞中表达。相反，端粒长度的维持或增加是通过在下述DNA可以表达的状态下将编码其中的外源Mrell蛋白C末端结构域经修饰的蛋白的DNA引入细胞而进行的。此处术语“外源Mrell蛋白”是指由靶细胞外衍生的Mrell蛋白。术语“修饰”是指从、在或对功能结构域进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加。
1.编码外源Mrell蛋白的DNA的制备(1)编码外源Mrell蛋白的DNA的来源任何生物来源的细胞，只要具有编码Mrell蛋白的DNA的均可作为编码可用于控制端粒长度的外源Mrell蛋白的DNA的来源，没有特别地限定。其实例包括来源于多种真核生物如人(Homo sapiens)，小鼠(Musmusculus)，南非爪蛙(Xenopus laevis)，蝇(Drosophila melanoaster)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiac)，Coprinuscinereus，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。优选地，编码用于控制端粒长度的外源Mrell蛋白的DNA可以来源于与端粒长度控制靶细胞相同的种。对于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)与Mrell蛋白相应的蛋白称作Rad32。例如，控制人细胞端粒长度，优选使用编码人Mrell蛋白的DNA，控制酿酒酵母细胞的端粒长度优选使用编码酿酒酵母的Mrell蛋白的DNA。
(2)编码外源Mrell蛋白的DNA的制备编码外源Mrell蛋白的DNA可以通过筛选由上述(1)中所述生物体的细胞制备的DNA基因组文库或cDNA文库获得，或用基因组DNA文库或cDNA文库作为模板直接由PCR扩增获得。
例如，通过筛选cDNA文库获得编码Mrell蛋白的DNA，开始通过例如硫氰酸胍法从上述(1)中所述的生物体的细胞制备mRNAs。接下来，与含寡-dT序列的合成DNA引物杂交，然后通过反转录酶合成单链cDNA。然后利用大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA连接酶和RnaseH通过常规的方法合成双链cDNA，然后由T4DNA聚合酶将cDNA的末端补平，由T4DNA连接酶将DNA接头如EcoRI接头连接到cDNA链的两端。再通过常规的方法将添加了DNA接头的cDNA链插入到可商购的λ噬菌体载体(如可购自Stratagene的λZAP)或质粒载体(如在购自PromegaBiotech的pGEM2)上。这样即可获得一组重组的噬菌体DNA或质粒DNA。
接下来，用可商购的体外包装试剂盒(如购自PromegaBiotech的Gigapack Gold)对上述组的重组λ噬菌体DNA组进行体外包装，以产生包含重组λ噬菌体DNAs的噬菌体颗粒。将所得的重组λ噬菌体颗粒通过常规方法转化宿主细胞，如大肠杆菌[Maniatis，T.，et al.Molecular Cloning.ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989]。扩增所得的转化子，由此获得噬菌体cDNA文库。
另一方面，对于重组质粒DNAs的组，例如，通过常规方法将质粒DNAs转化宿主细胞，如大肠杆菌。扩增所得的转化子，由此获得质粒cDNA文库。
接下来，将上述的转化子扩增，转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，如购自DuPont的Gene Screening Plus，在碱性条件下去除蛋白膜上的λ噬菌体DNAs或质粒DNAs与用放射性标记的来自编码Mrell蛋白的DNA的部分片段的探针杂交，选择阳性克隆。此处所用的探针可由根据编码Mrell蛋白部分氨基酸序列的DNA序列设计的引物通过PCR制备。例如用于筛选包含编码酵母Mrell蛋白的阳性克隆的探针可用5′-gtgccattattatttcagaa-3′(SEQ ID NO9)和5′-gggatcaagtacaactattttc-3′(SEQ ID NO10)为引物由PCR-制备。培养所得的阳性克隆并由此培养物获得λ噬菌体DNAs或质粒DNAs。
另外，通过直接PCR-扩增编码Mrell蛋白的DNA，首先由如上述(1)中所述的生物体细胞中制备基因组DNA或cDNA。然后，用所获得的基因组DNA或cDNA为模板，以编码Mrell蛋白N末端氨基酸序列的DNA和编码Mrell蛋白C末端氨基酸序列的DNA为引物进行PCR。然后将PCR-扩增片段连接到合适的载体上。用于扩增编码酵母Mrell蛋白的DNA的引物的例子包括5′-atggactatcctgatccaga-3′(SEQ ID NO11)和5′-gggatcaagtacaactattttc-3′(SEQ ID NO12)。对于通过直接PCR扩增的方法获得编码Mrell蛋白的DNA的情况，优选使用pfu聚合酶作为DNA合成酶，因为该酶的错读率低。
由任何已知的方法，如双脱氧法，确定核酸序列，以证明依照上述方法获得的DNA是编码Mrell蛋白的DNA。通常确定核苷酸序列可以通过自动核酸测序仪(如PERKIN-ELMER制造的373ADNA测序仪)进行。
SEQ ID NOS1和3分别是编码酿酒酵母和人的Mrell蛋白的DNAs的核酸序列，SEQ ID NOS2和4分别是所述蛋白氨基酸序列的示例。但是只要所述蛋白具有Mrell蛋白的生理学活性，所述蛋白也可以是由这些氨基酸序列缺失，取代和添加一个或多个氨基酸而形成的变异体。
例如可由如SEQ ID NOS2或4所示的氨基酸序列中缺失一个或多个，优选约20到30个，更优选10到20个氨基酸。也可以向如SEQ ID NOS2或4所示的氨基酸序列中添加一个或多个，优选约20到30个，更优选10到20个氨基酸。或者用其他氨基酸取代如SEQ ID NOS2或4所示的氨基酸序列中的一个或多个，优选约20到30个，更优选10到20个氨基酸。
而且可以在严谨条件下与上述基因杂交的DNA，只要其编码具有Mrell蛋白生理学活性的蛋白均可用于本发明。术语“严谨条件”是指例如，钠浓度在33到70mM，优选50到66mM温度为40到70℃，优选55到68℃。
所述的Mrell蛋白的生理学活性如上所述是指双链DNA结合活性，双链DNA内切酶活性和单链DNA内切酶活性，这些活性均可依照Furuse等所述的方法确定[Furuse et al.EMBO J 176412-25(1998)]。
2.向编码外源Mrell蛋白的DNA中引入变异在以下述DNA能够表达的状态下，与将编码野生型Mrell蛋白的DNA引入细胞的情况相比，将编码核酸酶结构域经过修饰的外源Mrell蛋白变异体的DNA引入细胞使端粒变得更短。与将编码野生型Mrell蛋白的DNA引入细胞的情况不同，将编码C-末端结构域经过修饰的外源Mrell蛋白变异体的DNA以下述DNA能够表达的状态引入细胞时，端粒长度保持不变或加长。此处，术语“核酸酶结构域”是指在组成Mrell蛋白的氨基酸序列中负责所述蛋白的双链DNA内切酶活性和单链DNA内切酶活性的氨基酸序列。具体说来，例如对于酵母Mrell蛋白，所述的核酸酶结构域对应于自N-末端起算第225到450位的氨基酸。术语“C末端结构域”是指在组成Mrell蛋白的氨基酸序列中处于羧基端负责所述蛋白双链DNA结合活性的氨基酸序列。具体说来，例如对于酵母Mrell蛋白，所述的C末端结构域对应于从N末端起算从第600个氨基酸向前的区域。
编码Mrell蛋白变异体的DNA可如下述制备。例如，制备编码在Mrell蛋白的核酸酶结构域具有一个或多个氨基酸被不同氨基酸取代的蛋白的DNA，可以用例如基于PCR的定点诱变的方法[Saigo Kaoru et al.″BUNSHISEIBUTSU-GAKU JIKKEN PROTOCOL I(Experiment Protocol Ifor Molecular Biology)，p.263-270，Maruzen，1997]，其在本发明所属领域中是已知的。
3.编码Mrell蛋白或Mrell蛋白变异体的DNA引入细胞可以通过下述方法将编码Mrell蛋白或Mrell蛋白变异体的DNA引入细胞。即，在如上述1或2中所述制备了包含编码Mrell蛋白或其变异体的DNA的载体后，将所得的重组载体引入宿主细胞。
(1)重组载体的制备可以通过将编码Mrell蛋白或Mrell蛋白变异体的DNA连接(插入)到合适的载体中而获得重组载体。此处所用的载体没有特别的限定，只要其能在宿主细胞中复制即可。所述载体的实例包括质粒载体和病毒载体。
用于酵母细胞的质粒载体可以是pMAC56laur，YEp13，YEp24，YCp50等，用于动物宿主细胞的病毒载体可以是反转录病毒，痘病毒等。
将编码Mrell蛋白或Mrell蛋白变异体的DNA连接到载体上可以应用下述方法，其中，先用合适的限制性内切酶切割包含上述DNA的DNA片段，再将其连接到载体DNA的限制性内切酶位点或多克隆位点。
必须将所述的编码Mrell蛋白或Mrell蛋白变异体的DNA以其在所述宿主细胞中可表达的方式整合到所述载体中。因此除启动子和编码Mrell蛋白或Mrell蛋白变异体的DNA之外，需要时还可连接上顺式元件如增强子，剪接信号，polyA附加信号和选择标记。此处选择标记的例子包括二氢叶酸还原酶基因，杀稻瘟菌素抗性基因，aureobasidin抗性基因，和G418抗性基因。
顺便提到的是，包含编码Mrell蛋白的DNA重组载体pMACMrellD16A，其中用丙氨酸取代从Mrell蛋白N-末端起第16位的精氨酸，和包含带有C-末端结构域缺失的编码Mrell蛋白的DNA的重组载体pMACMrellΔC49分别引入大肠杆菌DH5α菌株(ERKNMREllD16AYOPAUR和ERKNMREllDC49YOPAUR)并在1999年12月22日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，(Higashi 1-1-3，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号为Nos.FERMBP-7421和FERM BP-7422。
(2)转化细胞的制备可以将重组载体引入宿主细胞来制备转化细胞，从而使所需基因得以表达。此处宿主细胞可以是任何真核细胞，没有特别的限定，只要其丝状染色体包含端粒即可。这样的实例包括酵母，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，动物细胞如COS细胞和CHO细胞，或昆虫细胞如Sf9，Sf21。
当用酵母作为宿主时，可使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)等。这种情况下可以用能在酵母中表达的任何启动子，而没有特别的限定。这样的实例包括gal1启动子，gal10启动子，热激蛋白启动子，MFαl启动子，PH05启动子，PGK启动子，GAP12启动子，ADH启动子，AOX1启动子。向酵母细胞中引入重组载体的方法可以是能将DNA引入酵母的任何方法，而没有特别的限定，例如电穿孔[Becker，D.M.etal.Methods.Enzymol.，194182(1990)]，原生质体法[Hinnen，A.等Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，751929(1978)]，和醋酸锂法[Itoh，H.3.Bacteriol.，153163(1983)]。
当用动物细胞作为宿主细胞时，可以使用猴COS-7细胞，Vero，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，小鼠L细胞，大鼠GH3，或人FL细胞。作为启动子可以使用SRα启动子，SV40启动子，LTR启动子，CMV启动子等，也可以用人巨细胞早期基因启动子。将重组载体导入动物细胞的方法的例子包括电穿孔法，醋酸锂法和脂质转染法。
当用昆虫细胞作为宿主时可以使用Sf9细胞，Sf21细胞等。将重组载体导入昆虫细胞的方法的例子包括磷酸钙法，脂质转染法，电穿孔法等。
4.端粒长度分析可以利用能与端粒序列特异性杂交的探针进行杂交分析端粒长度。例如为分析酵母细胞中的端粒长度，可以先从作为对照的酵母细胞和试验用酵母细胞中抽提基因组DNAs。接下来用合适的限制性内切酶(如XhoI)消化所得的基因组DNA，再通过琼脂糖凝胶电泳分离所得的片段。此后在碱性条件下将其转移到尼龙膜上，在合适的条件下和能与端粒序列特异性杂交的标记探针杂交。此处所用的探针可以是包含序列5′-gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt-3′(SEQ ID NO13)的寡核苷酸。洗膜后，通过放射自显影或imaging plate(如由Fuji Photo Film有限公司制造的BAS2000)观察。比较作为对照的酵母细胞的泳道和试验酵母细胞的泳道，清楚地表明它们端粒长度的不同。
5.作为控制端粒长度的试剂和对治疗与端粒长度-相关的疾病进行基因治疗的试剂的用途通过修饰真核细胞中内源Mrell蛋白的生理学活性可以在细胞中控制端粒的长度。因此，包含以修饰真核细胞中内源Mrell蛋白的生理学活性的物质作为活性组分的试剂，作为控制端粒长度的试剂和对治疗与端粒长度-相关的疾病进行基因治疗的试剂价值巨大。上述修饰真核细胞中内源Mrell蛋白的生理学活性的物质的例子包括，含有以能够表达的状态存在的下述DNA的DNA构建体，所述DNA为编码Mrell蛋白DNA或编码其中的Mrell蛋白核酸酶结构域或C-末端结构域经过修饰的蛋白的DNA。
(1)控制端粒长度的试剂含有以能够表达的状态存在的编码Mrell蛋白DNA的DNA构建体，所述的Mrell蛋白是一种其中的Mrell蛋白核酸酶结构域或C-末端结构域经过修饰的蛋白，上述DNA构建体作为端粒长度控制剂(如控制端粒长度的试剂)是有用的。在具有含端粒的染色体的任何生物的任何细胞中控制端粒长度都是可能的。为促进端粒缩短可向细胞中引入下述DNA构建体，其含有以能够表达的状态存在的编码Mrell蛋白或含有经修饰的Mrell蛋白核酸酶结构域的核酸酶结构域的蛋白的DNA。相反，为了维持或延长端粒长度可向细胞中引入下述DNA构建体，其含有以能够表达的状态存在的编码其中的Mrell蛋白C末端结构域经修饰的蛋白的DNA。
将基因引入酵母细胞的方法可以是能将DNA引入酵母的任何方法，没有特别的限定，例如电穿孔[Becker，D.M.et al.Methods.Enzymol.，194182(1990)]，原生质体法[Hinnen，A.等Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，751929(1978)]，和醋酸锂法[Itoh，H.3.Bacteriol.，153163(1983)]。将基因引入动物细胞的方法的例子包括电穿孔法，磷酸钙法和脂质转染法。
(2)与端粒长度-相关的疾病的基因治疗试剂术语“端粒长度-相关疾病”是指任何初起涉及端粒长度的疾病。所述疾病的例子包括恶性肿瘤(如黑素瘤，肝细胞瘤，乳腺癌，胃癌，脑瘤)其中，因为其中提高的端粒酶活性，在其染色体上并不出现端粒缩短；老年性疾病，其与正常细胞相比端粒缩短加剧。当将一种DNA构建体作为与端粒长度-相关疾病的基因治疗剂时，所述的DNA构建体含有以下述DNA能够表达的状态存在的编码Mrell蛋白的DNA或编码其中的Mrell蛋白的核酸酶结构域或C末端结构域经修饰的蛋白的DNA，可以通过诸如注射，基因枪等方法将所述DNA构建体直接施用于受治疗者。用于DNA构建体的载体的例子包括腺病毒载体，腺病毒伴随病毒载体，疱疹病毒载体，痘病毒载体，反转录病毒载体等。这些病毒载体能使DNA更有效地导入细胞。而且，可以使用将DNA构建体导入磷酸脂质载体，如脂质体再将脂质体施用于受试者的方法。在这一方法中，由于脂质体是一种包括生物可降解材料的封闭载体，将本发明的基因与所述脂质体混合可以使所述基因锁定在脂质体(脂质-基因复合物)的脂双层或含水层内。接下来在所述复合物存在下培养，所述的基因即可整合到所述细胞中(脂质转染法)。然后再由下述方法将所获得的细胞施用于受试者。
作为本发明的基因治疗试剂的施用形式除全身施用如动脉内或静脉内施用等外也可以局部施用于上皮组织(表皮)或其它任何多种器官或组织。而且所述施用方式还可以与导管技术和外科手术结合使用。
本发明的基因治疗试剂的剂量依病人的年龄、性别和所患疾病的不同，施用途径和频率或剂型而易，但通常对于成人可使用0.1到100mg本发明的基因/人/天的剂量。
附图的简要说明

图1是重组载体的结构图。
图2是酵母染色体臂的示意图。
图3是引入了重组载体的酵母细胞中端粒长度的凝胶电泳照片。
本发明的最佳实施方式参考下述实施例对本发明进行详细说明，但本发明的范围并不因此受到限制。
制备编码酵母Mrell蛋白和变异的Mrell蛋白的DNA重组载体(1)制备编码Mrell蛋白的DNA将含有用YEp24酵母-大肠杆菌穿梭载体构建的(由M.Carlson构建)酵母菌株DBY939基因组DNA文库的大肠杆菌细胞涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，将所得的克隆转移到尼龙膜，然后用常规的方法使来自这些克隆的DNA结合到膜上。用分别具有相应于编码Mrell蛋白N末端和C末端区域的DNA序列的寡核苷酸作为引物，用野生型酵母母细胞菌株ORD149的基因组DNA作为模板进行聚合酶链反应(PCR)。将所得的DNA片段克隆到大肠杆菌的载体中，再将上述片段从所述载体上切割下来用[32P]-dCTP标记。这一探针与上述制备好的尼龙膜接触在严谨条件下进行杂交，以确定含Mrell基因片段的克隆。分离这一克隆，与上述类似重复进行亚克隆(scolony)杂交，以获得含有Mrell基因片段的单克隆。用内切酶将Mrell片段从这一质粒DNA上切下来，克隆到另一适合于大肠杆菌的载体上，即获得了质粒pMRElltr。
(2)制备编码变异的Mrell蛋白的DNA用由(1)中获得的编码Mrell蛋白的DNA依照Hashimoto-Gotoh等[Hashimoto-Gotoh，T.，et al.Gene，152271-275(1995)]所述的方法制备编码下述蛋白的DNAsMrell蛋白C-末端结构域缺失的蛋白(也指DI6A型Mrell蛋白)，距Mrell N-末端第16位的精氨酸被丙氨酸取代的蛋白(也指DC49型MreIl蛋白)，Mrell蛋白C-末端结构域缺失的距Mrell N-末端第16位的精氨酸被丙氨酸取代的蛋白。即为形成DI6A型变异体，进行第16位的密码子从gat到gct的单核苷酸取代，而且第643和第644位的密码子由gct agt变为gcc tag以引入终止密码子，形成DC49型变异体。
(3)含编码Mrell蛋白或Mrell蛋白变异体的DNA重组载体的构建由上述(1)和(2)获得的编码Mrell蛋白和Mrell蛋白变异体的DNA片段，如图1所示，插入到含aureobasidin抗性基因的酵母-大肠杆菌穿梭载体的ADH1启动子和CYCl终止子之间的EcoRI位点构建了能在酵母中高表达的载体，含有编码野生型Mrell蛋白的DNA的重组载体命名为pMACMreIlWT，含编码距Mrell N-末端第16位的精氨酸被丙氨酸取代的Mrell蛋白的DNA的重组载体命名为pMACMrellD16A，含编码C-末端结构域缺失的Mrell蛋白的DNA的重组载体命名为pMACMrelIΔC49；含编码包括Mrell蛋白C-末端结构域缺失的，且距Mrell N-末端第16位的精氨酸被丙氨酸取代的蛋白DNA的重组载体命名为pMACMreIlD16AΔC49。
用重组载体转化酵母细胞用如实施例1中获得的重组载体转化由Dr.Alain Nicolas(InstitutCurie，France)惠赠的酿酒酵母菌株ORD149(Saccharomyces cerevisiae)(具有arg4rv/arg4bg and trpl-289/trpl-289等位基因的二倍体)，如下。将上述酵母细胞用1M的山梨醇洗，再与所述载体混合。通过电穿孔使所述DNA导入酵母细胞(所述酵母菌株带有trp1基因突变，所述载体带有TRP1基因选择标记)，使所述细胞在含有1M山梨醇不含色氨酸的基本琼脂培养基上生长，即选择出带有所述质粒的克隆。这些酵母克隆继续在含有0.2μg/ml aureobasidin的培养基上生长。
端粒长度分析对由实施例2所得的每一转化子的端粒长度进行如下分析。即将仅含有pMAC56laur载体的酵母细胞和由实施例2获得的分别含有重组载体pMACMrellWT，pMACMreIlD16A，pMACMrellΔC49，和PMACMreIlDl6AΔC49的转化酵母细胞在含有0.2μg/ml aureobasidin的营养培养基上培养12-16小时后，收获细胞。接下来依照常规的方法从所述细胞中抽提基因组DNA，用内切酶XhoI消化，用凝胶琼脂糖电泳分离所得的DNA片段。琼脂糖凝胶上的DNA片段在碱性条件下真空转移到尼龙膜上，然后依照Church等[Church，G.M.et.al.Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.，811991-1995(1984)]所述的方法用通过Southern杂交分析。用放射性同位素32P于5′-末端标记的含20个核苷酸5′-gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt～3′(SEQID NO13)作为探针，于50℃下杂交20小时。洗膜后用放射自显影和FujiPhoto Film有限公司制造的imaging plate观察放射性信号。
所得酵母的染色体具有如图2所示的结构。探针可以杂交的区域除存在于染色体末端的端粒(Y′型)还存在于中间点(X型)。与仅带有不含编码Mrell蛋白的DNA的载体的酵母细胞相比，当野生型Mrell蛋白或带有核酸酶结构域的DI6A型Mrell蛋白高表达时，在X和Y型中均可观察到端粒区域中端粒的缩短(图3)。具体地说，带有核酸酶结构域突变的D16A型Mrell蛋白高表达的酵母中端粒缩短显著。相反，对于带有C-末端区域缺失的DC49型Mrell蛋白高表达的细胞系，所有X和Y型的端粒均出现端粒延长。前述内容表明可以通过向细胞中引入编码带有Mrell蛋白C-末端结构域缺失的蛋白的DNA可以延长端粒长度，引入编码Mrell蛋白的DNA可以使端粒长度缩短。
工业实用性依照本发明，提供控制端粒长度的方法，控制端粒长度的控制剂，端粒长度-相关疾病的基因治疗剂。
序列表<110>理化学研究所(RIKEN)科学技术振兴事业团(Japan Science and TechnologyCorporation)<120>控制端粒长度的方法<130>PH-1136-PCT<150>JP 2000-41929<151>2000-2-18<160>13<210>1<211>2079<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220><221>CDS<222>(1)..(2076)<400>1atg gac tat cct gat cca gac aca ata agg att tta att act aca gat 48Met Asp Tyr Pro Asp Pro Asp Thr Ile Arg Ile Leu Ile Thr Thr Asp1 5 10 15aat cat gtg ggt tac aac gaa aat gat ccc att act ggc gat gat tct 96Asn His Val Gly Tyr Asn Glu Asn Asp Pro Ile Thr Gly Asp Asp Ser20 25 30tgg aaa act ttc cat gaa gtc atg atg ctg gcc aaa aat aac aac gta 144Trp Lys Thr Phe His Glu Val Met Met Leu Ala Lys Asn Asn Asn Val35 40 45gac atg gtt gta cag tcc ggt gat ctt ttt cac gtg aat aag cct tcc 192Asp Met Val Val Gln Ser Gly Asp Leu Phe His Val Asn Lys Pro Ser50 55 60aag aag tca ctc tac caa gta ctg aaa act ttg aga tta tgt tgc atg 240Lys Lys Ser Leu Tyr Gln Val Leu Lys Thr Leu Arg Leu Cys Cys Met65 70 75 80ggt gac aag cct tgc gag tta gaa tta ttg agc gat ccc tca caa gtt 288Gly Asp 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权利要求
1.一种控制端粒长度的方法，该方法包括修饰真核细胞中内源Mrell蛋白的生理学活性。
2.如权利要求1所述的控制端粒长度的方法，其中，所述的内源Mrell蛋白的生理学活性的修饰是通过以下述DNA能够表达的方式向细胞中引入编码外源Mrell蛋白的DNA或编码其中的外源Mrell蛋白的核酸酶结构域或C-末端结构域经过修饰的蛋白的DNA。
3.如权利要求2所述的控制端粒长度的方法，其中，所述的外源Mrell蛋白是下述蛋白(a)或(b)(a)包含如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的蛋白；或(b)包含从、在或对如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性的蛋白。
4.如权利要求2所述的控制端粒长度的方法，其中，所述的编码外源Mrell蛋白的DNA是下述的DNA(c)或(d)(c)包含如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列的DNA；或(d)可在严谨条件下与(c)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性的蛋白的DNA。
5.如权利要求2所述的控制端粒长度的方法，其中，所述的其中的外源Mrell蛋白的核酸酶结构域经过修饰的蛋白是下述蛋白(e)或(f)(e)包含如SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白；或(f)包含从、在或对如SEQ ID NO6所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性(除核酸酶活性之外)的蛋白。
6.如权利要求2所述的控制端粒长度的方法，其中，所述的编码其中的外源Mrell蛋白的核酸酶结构域经过修饰的蛋白的DNA是下述的DNA(g)或(h)(g)包含如SEQ ID No5所示核苷酸序列的DNA；或(h)可在严谨条件下与(g)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性(除核酸酶活性之外)的蛋白的DNA。
7.如权利要求2所述的控制端粒长度的方法，其中，所述的其中的外源Mrell蛋白的C-末端结构域经过修饰的蛋白是下述的蛋白(i)或(j)(i)包含如SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白；或(j)包含从、在或对如SEQ ID NO8所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性(除双链DNA结合活性之外)的蛋白。
8.如权利要求2所述的控制端粒长度的方法，其中，所述的编码其中的外源Mrell蛋白的C-末端结构域经过修饰的蛋白的DNA是下述的DNA(k)或(l)(k)包含如SEQ ID No7所示核苷酸序列的DNA；或(l)可与(k)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性(除双链DNA结合活性之外)的蛋白的DNA。
9.一种控制端粒长度的试剂，其包含作为活性成分的修饰真核细胞中内源Mrell蛋白的生理学活性的物质。
10.如权利要求9所述的控制端粒长度的试剂，其中所述的物质是含有处于能够表达状态下的下述DNA的DNA构建体，即编码外源Mrell蛋白的DNA或编码其中的外源Mrell蛋白的核酸酶结构域或C-末端结构域经过修饰的蛋白的DNA。
11.如权利要求10所示的控制端粒长度的试剂，其中，所述的外源Mrell蛋白是下述蛋白(a)或(b)(a)包含如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的蛋白；或(b)包含从、在或对如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性的蛋白。
12.如权利要求10所示的控制端粒长度的试剂，其中，所述的编码外源Mrell蛋白的DNA是下述的DNA(c)或(d)(c)包含如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列的DNA；或(d)可在严谨条件下与(c)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性的蛋白的DNA。
13.如权利要求10所示的控制端粒长度的试剂，其中，所述的其中的外源Mrell蛋白的核酸酶结构域经过修饰的蛋白是下述蛋白(e)或(f)(e)包含如SEQ ID NO6或7所示氨基酸序列的蛋白；或(f)包含从、在或对如SEQ ID NO6或7所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性(除核酸酶活性之外)的蛋白。
14.如权利要求10所示的控制端粒长度的试剂，其中，所述的编码其中的外源Mrell蛋白的核酸酶结构域经过修饰的蛋白的DNA是下述的DNA(g)或(h)(g)包含如SEQ ID No5所示核苷酸序列的DNA；或(h)可在严谨条件下与(g)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性(除核酸酶活性之外)的蛋白的DNA。
15.如权利要求10所示的控制端粒长度的试剂，其中，所述其中的外源Mrell蛋白的C-末端结构域经过修饰的蛋白是下述的蛋白(i)或(j)(i)包含如SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白；或(j)包含从、在或对如SEQ ID NO8所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性(除双链DNA结合活性之外)的蛋白。
16.如权利要求10所示的控制端粒长度的试剂，其中，所述编码其中的外源Mrell蛋白的C-末端结构域经过修饰的蛋白的DNA是下述的DNA(k)或(l)(k)包含如SEQ ID No7所示核苷酸序列的DNA；或(l)可与(k)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性(除双链DNA结合活性之外)的蛋白的DNA。
17.一种治疗端粒长度-相关疾病的基因治疗剂，其包含作为活性组分的修饰真核细胞中内源Mrell蛋白的生理学活性的物质。
18.如权利要求17所述的基因治疗剂，其中所述的物质是含有处于能够表达状态下的下述DNA的DNA构建体即编码外源Mrell蛋白的DNA或编码其中的Mrell蛋白的核酸酶结构域或C-末端结构域经过修饰的蛋白的DNA。
19.如权利要求17所述的基因治疗剂，其中，与端粒长度-相关的疾病是恶性肿瘤或细胞衰老性疾病。
20.如权利要求19所述的基因治疗剂，其中，所述的恶性肿瘤至少选自下述之一黑素瘤，肝细胞瘤，乳腺癌，胃癌，脑瘤。
21.如权利要求18所述的基因治疗剂，其中，所述的外源Mrell蛋白是下述蛋白(a)或(b)(a)包含如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的蛋白；或(b)包含从、在或对如SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性的蛋白。
22.如权利要求18所述的基因治疗剂，其中，所述的编码外源Mrell蛋白的DNA是下述的DNA(c)或(d)(c)包含如SEQ ID NO1或3所示核苷酸序列的DNA；或(d)可在严谨条件下与(c)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性的蛋白的DNA。
23.如权利要求18所述的基因治疗剂，其中，所述的其中的外源Mrell蛋白的核酸酶结构域经过修饰的蛋白是下述蛋白(e)或(f)(e)包含如SEQ ID NO6所示氨基酸序列的蛋白；或(f)包含从、在或对如SEQ ID NO6所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性(除核酸酶活性之外)的蛋白。
24.如权利要求18所述的基因治疗剂，其中，所述的编码其中的外源Mrell蛋白的核酸酶结构域经过修饰的蛋白的DNA是下述的DNA(g)或(h)(g)包含如SEQ ID No5所示核苷酸序列的DNA；或(h)可在严谨条件下与(g)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性(除核酸酶活性之外)的蛋白的DNA。
25.如权利要求18所述的基因治疗剂，其中，所述其中的外源Mrell蛋白的C-末端结构域经过修饰的蛋白是下述的蛋白(i)或(j)(i)包含如SEQ ID NO8所示氨基酸序列的蛋白；或(j)包含从、在或对如SEQ ID NO8所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸缺失，取代或添加后所获得的氨基酸序列并且具有Mrell蛋白生理学活性(除双链DNA结合活性之外)的蛋白。
26.如权利要求18所述的基因治疗剂，其中，所述编码其中的外源Mrell蛋白的C-末端结构域经过修饰的蛋白的DNA可以是下述的DNA(k)或(l)(k)包含如SEQ ID No7所示核苷酸序列的DNA；或(l)可在严谨条件下与(k)中DNA杂交的且编码具有Mrell蛋白生理学活性(除双链DNA结合活性之外)的蛋白的DNA。
全文摘要
一种控制端粒长度的方法，该方法包括向细胞中引入编码Mrell蛋白的DNA或编码含部分或全部核酸酶结构域，C－末端结构域经修饰或缺失的Mrell蛋白的蛋白的DNA。
文档编号A61K48/00GK1425065SQ01808230
公开日2003年6月18日 申请日期2001年2月14日 优先权日2000年2月18日
发明者太田邦史, 柴田武彦 申请人:理化学研究所, 科学技术振兴事业团