治疗乙型肝炎和肝硬化的组合物的制作方法

专利名称：治疗乙型肝炎和肝硬化的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗乙型肝炎和肝硬化的组合物。更特别地，本发明涉及包含作为活性成分的黄柏(Phellodendri cortex)和败酱(Patriniascabiosaefolia FISCH)的混合提取物的药物组合物，该组合物抗乙型肝炎病毒活性和肝硬化是有效的，并具有抗病毒作用，免疫佐剂活性和在纤维化肝细胞的再生过程中的效力，还涉及制备这类组合物的方法。
在复制过程中，通过宿主RNA聚合酶II将DNA链转录成RNA链，然后用作模板，通过病毒反转录酶合成基因组DNA，不同于直接复制它们的DNA链的普通DNA病毒的复制。结果，与普通RNA病毒相比，HBV显示出高频率的突变。尽管HBV基因组中的突变随机发生，但增殖的速率和频率是恒定的。
由于宿主对HBV衍生的蛋白产生体液和细胞免疫反应，在这类反应中存活的病毒中不断地发生突变。尽管HBV复制级联独立于宿主染色体进行，但病毒DNA的一部分可整合到宿主基因组中。当HBV DNA已整合到宿主基因组中时，病毒基因组变得不稳定，并且从那里表达的X蛋白启动宿主细胞的转录，从而导致对p53基因功能的抑制。如果这些条件存在，将会发生肝细胞癌。
大部分原发性肝细胞癌起源于病毒性肝炎。肝炎病毒已被分为A-E5种类型。近来，一种新型肝炎病毒-G型已被克隆。因而已知有6种类型的肝炎病毒。其中，在流行病学上，乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)与肝脏中的癌发生有关。HBV的外衣壳直接地与宿主的免疫系统接触，因为病毒的那部分被暴露在表面上。
因而，HBV保持它表面抗原结构的改变以便逃避宿主的免疫系统，从而存活下来。抗原结构中的这类改变在疾病或持续感染的发展过程中显示出光谱特征，并成为重要的因素。由于这类因素使得宿主对病毒产生无效免疫反应，T细胞，包括类固醇的内分泌功能，药物等的功能缺失，急性肝炎发展成慢性形式。
当肝炎的症状持续至少6个月，并且在生化和血清学研究中未发现改善，将这种肝炎归为慢性肝炎。慢性肝炎又分为慢性持续性肝炎和慢性活性肝炎，后者发展成硬变，肝衰竭，并且由于肝脏中组织损伤的渐进发展甚至死亡。由HBV或HCV诱发的慢性肝炎显示出发展成硬变的高度倾向性，并且如果进一步发展，会发展成肝细胞癌。肝硬化可由各种原因包括病毒感染，寄生物，后天性梅毒，酒精，药物或化学毒性，胆梗阻(biliaryobstruction)，充血，血色病，威尔逊病等引起。
在肝硬化中，观察到肝实质细胞的缺失，伴随维管弯曲的网硬蛋白结构的萎陷，纤维质生成，残余肝细胞和普遍的结缔组织的增殖，并且肝脏逐渐地萎缩。由于伴随坏死和在实质中再生，胞外基质的增殖导致正常肝结构的变形，并且由于结缔组织增殖，通过分裂或合并小叶被改变。这个变更阻塞门静脉血液流动，导致门高血压，其又导致腹水，侧支循环(由于食管静脉曲张或脐静脉扩张，所谓的水母头(medusa head)的形成)，脾大等。在HBV阳性的硬变中发现的小结增殖形式包含内部细胞(intimatecell)，并且在前癌阶段观察到类似于克隆的群体的存在。然而，在这个阶段末观察到与癌起始有关的遗传异常。
基于它们的作用机制，已用于治疗慢性乙型肝炎的治疗剂分为抗病毒剂和免疫佐剂。例如，抗病毒剂包括Ara-A，Ara-Amp，无环鸟苷，和苏拉明。作为一种新的治疗慢性乙型肝炎的疗法，lamivudine，3TC处于临床试验阶段。Lamivudine是用作口服抗病毒剂的核酸衍生物，并且由于它特异地抑制HIV的反转录酶活性，自从1995年在西方国家其已被用作一种AIDS疗法。Lamivudine是由Dienstas等最初在慢性乙型肝炎患者身上进行试验。在给药期间，患者转向HBV DNA阴性，并且19％的患者显示恢复至正常的ALT范围，这表示在血清中延长的HBV DNA阴性。然而，Lamivudine具有一个缺点，即由于毒性它不能长期给药，并且如果停止给药，病毒的增殖回弹并恢复到最初阶段。近来，已发现给药6-12个月延长期，在显示给药抗性的患者中，出现HBV变种耐受Lamivudine。
仅具有非常有限的效力的干扰素，一种免疫佐剂，也已被用来治疗乙型肝炎。然而，标准给药持续3-6个月。尽管通过延长给药期望得到更好的结果，但却伴随着大量的副作用，并且如果停止给药，病毒恢复增殖被并恢复到最初状态。在治疗慢性乙型肝炎过程中，伴随HBe抗原阴性，ALT水平的改良可作为治疗指数。然而，尽管一些患者显示HBe抗原阴性，他们仍保持活性肝炎状态。
毕竟，迄今还没有任何治疗肝硬化的实用的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗肝硬化的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种用于抗体活性和T细胞增殖的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种制备治疗乙型肝炎的药物组合物的方法。
通过治疗乙型肝炎的药物组合物可达到本发明的目的，该药物组合物包含治疗有效量的黄柏和败酱的混合提取物。另外，按照本发明包含黄柏和败酱属混合提取物的组合物也用于肝硬化治疗，和抗体活性和T细胞增殖。
败酱属，包括Patrinia scabiosaefolia FISCH.，Patrinia villosa JUSS.，Patrinia sibirica JUSS.，等是一种在温带各处包括韩国的丘陵和山地中生长的多年生野生植物。它以全株(whole plant)形式使用，并且在东方医学中，在眼病，酿脓链球菌，水肿，白带等中用于抗炎作用。
已报道败酱属的热提取物具有抗肿瘤作用(如抗子宫癌，食管癌，肠癌，和肺癌)，并且在体外强烈地抑制金黄色葡萄球菌，链球菌等的生长。提取物也已知具有再生受损伤肝细胞，防止它们退化，并改善门静脉循环的能力，导致刺激肝细胞再生。它也作用于中枢神经系统以镇静神经，显示出强烈的镇痛作用以及降压作用(hypotensive effect)和制尿作用。
败酱属的根包含精油，各种皂苷，糖类，和痕量的生物碱如香豆素。在根真皮中，可发现乙酸，蚁酸，戊酸以及生物碱包括鬃草宁和缬草碱。其中，已知戊酸具有强烈的镇痛作用。干燥的种子含19.4-19.9％的蛋白和30-34.4％的脂肪。然而，还几乎没有对败酱属的活性成分或药理学性能的细节进行研究。
黄柏皮(cortex phellodendron)，本发明的另一种植物，是phellodendronamurense RUPRECHT的皮，phellodendron amurense RUPRECHT在东亚野生生长，并且是黄柏属种中最著名的。其它黄檗的变种包括P.latifoliolatumNakai，KAWAMOTO，P.japonicum OHWI，P.insulare NAKAI，P.molleNAKAI，和P.sargent。黄柏包含黄色或黄棕色素和1.5-4.5％的几种生物碱。生物碱的主要成分是小檗碱。还包含巴马亭(palmatine)，木兰花碱，胍，药根碱，黄柏碱，坎那辛，蝙蝠葛碱，和作为苦味物质，黄柏酮，黄柏内酯，β-谷固醇等。这些物质具有强烈的抗细菌活性，降压活性(hypotensiveactivity)，对中枢神经系统的抑制作用，乙酰胆碱能作用和抗炎作用，并且已知传统地用于骨病和黄疸。黄柏也用于治疗伤寒，霍乱和用于滋养胃和正常化肠内菌群。因此，黄柏已用于治疗胃炎，腹痛，黄疸等，作为苦补药剂，微生态制剂(probiotics)或抗炎收敛剂。
本发明的植物提取物具有一个重要的特征，即除了抑制HBV的增殖以外，它显示出对肝硬化的治疗作用。因此，使用败酱属和黄柏的混合提取物的本发明药物组合物显示出对由乙型肝炎病毒感染引起的肝炎的直接的抗病毒作用，并且同时具有治愈炎症和增强宿主免疫系统中辅助T细胞的作用。通过再生纤维化肝组织中的肝细胞，恢复肝脏中的中央静脉，它还显示出治疗肝硬化的作用。
按照本发明的组合物包含治疗有效量的黄柏和败酱属的混合提取物。可通过提取黄柏和败酱属的混合物或通过结合黄柏提取物和败酱属提取物来获得混合提取物。
在本发明中，处于混合状态的两种植物的提取物由于协同效应显示出级好的治疗作用。因此，优选两种植物的比率在2∶5-5∶2重量范围内。认为当这两种植物的提取物在上述重量比内混合时，本发明的抗病毒作用，硬变治疗作用和免疫佐剂作用是最佳的。
本发明的组合物可理解为最优化的治疗剂的一种，因为除了具有直接的抗HBV作用，它通过增强与T细胞有关的免疫系统实现了在治疗乙型肝炎过程中极大的效力，并显示出具有很低的毒性的再生纤维化肝细胞的作用。
按照本发明的另一个方面，提供了一种制备药物组合物的方法，该方法包含用含水溶剂提取黄柏和败酱属的混合物并过滤提取物；在提高的压力下饱和滤液并通过离心去除得到的凝蛋白的沉淀；和向滤液中加入有机溶剂以去除可溶解在有机溶剂中物质，然后分离并干燥含水层的步骤。
在本发明的一个优选实施方案中，通过混合并研磨1∶1重量比的败酱属和黄柏，使用tab水(tab water)或蒸馏水，在提高的压力下热提取混合物，通过离心提取物去除沉淀，在提高的压力下再次煮沸提取物以凝固随后通过过滤去除的残余蛋白获得败酱属和黄柏的结合提取物。用蒸汽再次饱和滤液以凝固残余蛋白，离心以去除沉淀，然后再次过滤。向滤液中加入溶剂如氯仿或己烷以去除可被该溶剂萃取的任何提取成分，包括树脂或溶解在滤液中的纤维状物质。其后，使用滑石或类似物纯化含水层并冻干以提供混合的提取物粉末。
如上述制备的本发明的混合提取物可单独或与药用载体一起配制成适当的药物组合物，然后通过口服给药或注射用作治疗乙型肝炎和肝硬化的治疗剂。
依据期望的效果可改变本发明的混合提取物的治疗有效量。通常，对于成年患者口服给药，每天每千克体重的有效剂量可在5-50mg范围内，优选10-40mg。如果合适，本发明的混合提取物也可与其它药物如适于肝炎的治疗剂，抗炎剂，和抗病毒剂结合使用。可与本发明的组合物结合使用的药物包括二苯基二甲基二羧酸酯，大蒜油，干草甜素，和水飞蓟素。
附图简述

图1a是表示临床实施例1的治疗作用的图表(HBe抗原和抗体)。
图1b是表示临床实施例1的治疗作用的图表(HBs抗原和抗体)。
图2a是表示临床实施例2的治疗作用的图表(HBe抗原和抗体)。
图2b是表示临床实施例2的治疗作用的图表(HBs抗原和抗体)。
图3a是表示临床实施例3的治疗作用的图表(HBe抗原和抗体)。
图3b是表示临床实施例3的治疗作用的图表(HBs抗原和抗体)。
图4a-4d是表示对分别接受对照，DMN，DMN+150mg/kg本发明组合物，和DMN+500mg/kg本发明组合物的各组的肝硬化的治疗作用的图片。
图5表示获自败酱属提取物的紫外光谱。
图6表示获自黄柏提取物的紫外线光谱。
图7表示获自按照本发明败酱属和黄柏的混合提取物的紫外光谱。
图8表示获自败酱属提取物的HPLC色谱。
图9表示获自按照本发明败酱属和黄柏的混合提取物的HPLC色谱。
图10表示获自黄柏提取物的HPLC色谱。
图11表示获自按照本发明败酱属和黄柏的混合提取物的HPLC色谱。
上述临床实施例证明本发明组合物对治疗乙型肝炎具有极好的疗效。试验实施例1对肝硬化的治疗作用为检验本发明组合物对肝硬化的作用，通过给大鼠单独注射N-亚硝基二甲胺(DMN)(40mg/kg，i.p.)诱导肝硬化。DMN导致组织变更，其与在人肝硬化中发现的那些极其相似，因此，常常用于肝硬化动物试验。
将24只鼠分成4组每组6只，第一组用作对照，第二组仅接受40mg/kgDMN，第三组接受40mg/kgDMN，接着以150mg/kg的剂量给药本发明组合物2周，第四组接受40mg/kgDMN，接着以500mg/kg的剂量给药本发明组合物2周。在对第三组和第四组给药本发明组合物时，对第一组和第二组给药生理盐水。
2周后，为了采血样和切除肝组织在4％甲醛溶液中固定处死所有动物。从血样确定这些指数如ALT，AST，胆红素，清蛋白等。为观察依据病变发展的组织形态学，用染色病理产物如透明素退化和血纤蛋白的AZAN染料染色肝组织，并在光学显微镜下检验。
通过将组织浸到媒染剂(10％含水重铬酸钾(k2Cr2O7)50ml+10％含水三氯乙酸(CCl3COOH)5ml)中，然后在提高的温度下浸到偶氮胭脂红溶液中进行AZAN(偶氮胭脂红)染色。染色后，连续在苯胺-醇中进行分化，直至胞核被另人满意地染色而组织的其余部分被脱色，并用乙酸-醇固定染色剂。然后，用苯胺蓝-橘黄G溶液处理组织，并用100％乙醇分化，排液并密封，以提供制成的载玻片。
图4表示在显微镜下检验的结果。在图4a中，正常的肝组织显示中央静脉清晰可见。在图4b中，蓝色区域可被鉴定为在DNA诱导的肝硬化中的纤维化组织。在图4c中，当给药150mg/kg本发明组合物时，硬变被改善，这从蓝色染色区域的减少可以看出。在图4d中，当给药500mg/kg剂量的本发明组合物时，可以看出纤维化区域恢复成几乎正常的水平。中央静脉也显示出表示逐步恢复的型式。
上述结果证明按照本发明的组合物具有再生纤维化肝脏的能力，并对肝硬化具有治疗作用。试验实施例2比较本发明组合物和黄柏和败酱属的各自提取物之间免疫佐剂作用(在体内增强依赖T细胞的抗体产生的作用)
将25只Balb/c鼠(体重17-20g)分成5组，每组5只。将绵羊红细胞(SRBC)移植至腹膜内。然后，对鼠口服给药每种黄柏和败酱属的各自提取物，其为本发明组合物的成分，和溶解在水中的本发明组合物，给药剂量为3-100mg/kg体重，从移植日开始给药3天(0天，1天，2天)。
对于对照组，按同样的给药途径给药生理盐水。4天后，处死动物并无菌分离它们的脾脏。剪碎组织，用筛眼分离脾细胞，并在含3ml HBSS(Hank’s平衡的盐溶液)的培养皿中用注射器的柱塞分离脾细胞。
将得到的细胞悬液移至15ml圆锥管中，并静置5分钟。去除2ml的上清液并1200rpm离心10分钟。去除上清液，将细胞重悬于2ml EBSS中，在EBSS中稀释30倍，以100(μl)等分试样用于空斑形成细胞分析。用EBSS(25μl，靶细胞)洗涤SRBC，将在EBSS(25μl)中稀释2倍的豚鼠补体和琼脂糖(在EBSS中含0.85％，350μl)混合，并倾注到培养皿中以凝固，然后允许在37℃的CO2培养箱中放置约1小时。按照改良的Jerne噬菌斑测定确定抗体形成细胞数。以抗体形成细胞数/106细胞的形式记数并记录噬菌斑和细胞。
结果，就本发明组合物而言，抗体形成细胞数明显大于给药各自成分提取物的抗体形成细胞数，表明在本发明中获得了更强烈的免疫佐剂效应。这在下表1中得到证实。表1.本发明组合物对依赖T细胞的抗体生产的影响

试验实施例3本发明组合物对T细胞激活的影响用混合免疫细胞反应方法确定本发明组合物对T细胞激活的影响。当混合分离自两种具有不同MHC类别抗原的鼠的免疫细胞时，识别其它种类鼠细胞上的抗原的T细胞增殖。
来自两个品系的鼠，B6C3F1(H-2k)和BDF1(H-2d)，其相互具有不同的MHC类别抗原，无菌分离脾并释放脾细胞。将得到的分离的免疫细胞调整至2.5×106细胞/ml，并以100μl/孔的量分至96孔培养板中，并制成200μl。
向其中加入本发明组合物至0.01-100μg/ml的浓度，将培养板置于37℃CO2培养箱中培育3天。在培育终止前18小时，加入1μCi/孔[3H]-胸腺嘧啶核苷。使用自动细胞收集器收获细胞，并通过测量[3H]-胸苷摄取确定免疫细胞增殖的程度。
在下表2中列举的结果指出以依靠本发明组合物的含量的方式增强了T细胞的增殖。表2.本发明组合物对T细胞增殖的影响

试验实施例4急性毒性试验将30只正常雌性ICR鼠(体重19±1g)分成5组，每组6只。用Behrens-Karber法确定口服给药混合提取物的鼠中本发明的混合提取物的口服半数致死量(LD50p.o.)，给药剂量为A组3g/kg体重，B组6g/kg，C组9g/kg，D组12g/kg，E组15g/kg。半数致死量是表示药物急性毒性指标的有效值。它指示本发明组合物的安全性。
在下表3中列举的结果表示没有鼠死亡，即使是在给药15g/kg体重混合提取物的组中，从而不能确定半数致死量值。因此，本发明混合提取物的口服半数致死量高于15g/kg体重，这证实本发明混合提取物对于人体是非常安全的。换句话说，很明显，本发明的混合提取物可被安全地给药而无显著毒性。
如下进行尸体解剖和组织病理学分析。在试验的结尾，用乙醚麻醉所有的存活动物并通过放血处死。分离器官并用肉眼检查畸形。为进行组织病理学分析，将器官在10％中性甲醛溶液中固定至少10天，脱水，然后包埋到石蜡包埋中心(Fisher，Histomatic组织信息处理机，166A)，并用转轮切片机(AO转轮切片机)切割成5μl薄切片，其用苏木精-伊红染色后，随后被检查。
来自每组中所有动物的解剖和镜检的组织病理学发现如下。当对鼠给药本发明的混合提取物至15g/kg体重时，在肝组织中无由于给药产生的异常发现。在肾，心肌细胞，胃肠道，胰，肺，脾，肾上腺，脑，睾丸，卵巢，骨髓等也未观察到异常发现。因此可以推断，当以15g/kg体重的最大剂量对鼠给药时，本发明的混合提取物未显示出由于它对任何一种器官的急性毒性而产生的副作用。表3.通过口服给药混合提取物的致死剂量(LD50)

注*Z来自两个连续的剂量的死亡动物数的半值**d两个连续的剂量间的差异试验实施例5通过UV吸收光谱表征混合提取物使用紫外分光光度计(发玛西亚，Ultrospec2000)和HPLC(HP1090)检验按照本发明的败酱属和黄柏的混合提取物。图5是败酱属提取物(0.5mg/ml)的紫外吸收光谱结果，表示在282nm处吸收增加。图6是黄柏提取物(0.25mg/ml)的紫外吸收光谱结果，其在278nm和325nm处吸收增加。图7是按照本发明败酱属和黄柏的混合提取物(0.5mg/ml)的紫外吸收光谱结果，表示在281nm和316nm处吸收增加。试验实施例6通过HPLC表征混合提取物为用HPLC离析，将本发明的混合提取物和败酱属或黄柏单独的提取物分别溶解在水中，至浓度为10mg/ml。从溶解的提取物溶液中取10μl等分试样，并用于HPLC(HP1090)分析。
(分析条件)柱Luna 5u C18；4.6mm i.d.×250mmL(Phenomenex)流动相2％乙酸和甲醇的梯度体系流速率1ml/分检测在254nm处用光二极管矩阵检测器检测在重复试验中，观测各自提取物的峰特征。图8表示败酱属提取物的HPLC分布图。在上述操作参数下，在10.245，12.772，14.104，17.087，18.769分钟出现特征峰。其中，在10.952分钟的峰表示3，4-二羟苯甲酸，并表示含量为0.022％。在17.087分钟的峰表示绿原酸，并且它的含量为0.238％。在18.769分钟的峰表示咖啡酸(caffeine acid)，并且它的含量为0.107％。当在与上述相同的条件下通过HPLC分析本发明的混合提取物时，如同从图9中可以看出，显示含有衍生自败酱属的上述三种物质，含量为0.020％的3，4-二羟苯甲酸，0.270％的绿原酸，和0.044％的咖啡酸。另外的特征峰在17.299，22.048和22.449分钟出现。
为分析小檗碱和巴马亭，黄柏提取物中最丰富的生物碱，使用下列条件。
(分析条件)柱Luna 5u C18；4.6mm i.d.×250mmL(Phenomenex)流动相乙睛∶水∶KH2PO4∶SDS＝500∶500∶3.4∶1.7流速率1ml/分检测在254nm处用光二极管矩阵检测器检测在黄柏提取物的HPLC分析中，如图10所示，在10.629分钟检测巴马亭，含量为0.988％，在11.314分钟检测小檗碱，含量为1.963％。然而，在本发明的混合提取物中，在11.751分钟检测巴马亭，含量为0.229％，在12.650分钟检测小檗碱，含量为0.405％，这相当于混合提取物中减少的产率的倾向(图11)。
工业适用性按照本发明的组合物具有抑制乙型肝炎病毒和再生肝硬化中纤维化肝细胞的作用。特别地，由于它未显示不利的副作用或诱导药物抗性，可长期给药该组合物。该组合物还具有在延长的给药期间保持组合物活性的优点。因此，本发明的组合物可有利地用于治疗乙型肝炎和肝硬化。
权利要求
1.一种治疗乙型肝炎的药物组合物，其包含治疗有效量的黄柏和败酱的混合提取物。
2.一种治疗肝硬化的药物组合物，其包含治疗有效量的黄柏和败酱属的混合提取物。
3.如同在权利要求1或2中要求的药物组合物，其中所述混合提取物已通过提取在干重基础上具有1∶0.2-1∶5重量比的黄柏和败酱属的混合物来制备。
4.如同在权利要求1或2中要求的药物组合物，其中所述混合提取物已通过以1∶0.2-1∶5重量比混合黄柏提取物和败酱属提取物来制备。
5.如同在权利要求1或2中要求的药物组合物，其中所述混合提取物是以10-50mg/kg体重的剂量对成年人给药。
6.如同在权利要求1或2中要求的药物组合物，其已被配制成添加药用赋形剂的片剂，胶囊，溶液，悬浮液，糖浆，或饮料的形式。
全文摘要
本发明提供了一种黄柏和败酱属的混合提取物，其对乙型肝炎和肝硬化具有治疗作用。
文档编号A61P29/00GK1427723SQ01808972
公开日2003年7月2日 申请日期2001年5月2日 优先权日2000年5月2日
发明者洪恩卿, 郑英信 申请人:美得维尔株式会社