专利名称：应用与乙酰水杨酸联合的可可矢车菊苷配质作为抗血小板疗法的制作方法
背景技术：
本申请涉及联合使用可可矢车菊苷配质和阿司匹林作为抗血小板疗法。
由一个含有至少一个羟基的芳环组成的化合物被称为单酚。因此，多酚由一个以上的芳环组成，每个环含有至少一个羟基。黄酮类化合物是具有二苯基丙烷(C6-C3-C6)骨架结构的多酚，它们在植物界中广泛存在。被称为原花色素的一类黄酮类化合物是黄烷-3-醇单体单位、最常见的以4→6或4→8连接的寡聚体。一类最常见的原花色素是矢车菊苷配质，它们是儿茶素和表儿茶素及其没食子酸酯的寡聚体。
已知经常食用食用多酚(通常存在于各种水果和蔬菜中)会使以下疾病的死亡率降低心血管疾病(CVD)，包括中风、心脏病和血管血栓形成。红酒、绿茶和可可都被鉴定为富含多酚，并且红酒和绿茶均显示与工业化国家的心脏病死亡呈负相关。
除降低动脉粥样化形成的危险外，食用多酚还显示具有各种各样的其它潜在有益的生物活性。例如，已经显示它们抑制病毒反转录酶、抑制HIVI体外复制、抑制溃疡形成，并且是抗突变剂、神经保护剂、消炎药、抗菌剂、降压药以及各种癌细胞类型的细胞毒性剂。
所述食用多酚发挥其生物功能的机制尚未完全了解，但是已经知道它们具有强有力的抗氧化特性并且对血小板活性有抑制效应。
阿司匹林(乙酰水杨酸)是原型非甾体消炎药。多年来，阿司匹林一直作为抗血小板治疗药物使用，以降低复发性一过性缺血发作或脑血管意外的危险。阿司匹林的作用机制已完全确立(Vane，J.，Nature，1971)。简而言之，它通过引起血小板前列腺素G/H合酶1的改变、引起其环加氧酶活性的不可逆丧失，从而抑制花生四烯酸途径。这导致花生四烯酸转变为前列腺素减少，而前列腺素是各种生理过程的极其有效的介质。它使这些前列腺素、尤其是血栓烷A2和前列腺素E2的形成减少，这解释了阿司匹林的构成其治疗用途基础的各种药理学作用。遗撼的是，相同的因素也引起大量记载的阿司匹林的毒性。
血小板缺乏合成新蛋白质的装置，这意味着由阿司匹林引起的损害在血小板的生命期间不可被修复。这意味着阿司匹林的重复日剂量的抑制效应是累积性的，最终在7-10天后导致几乎完全抑制血小板血栓烷的生物合成。生物化学、药理学和临床数据支持这样的理论正是由于血栓烷的抑制，导致防止依赖血栓烷的血小板活化，这解释了阿司匹林的抗血栓形成作用。
然而，通过花生四烯酸途径产生的各种其它前列腺素负责若干重要的稳态机制，例如胃酸分泌、原始体内稳态、血压的控制和肾功能。因此，长期阿司匹林治疗导致有害的作用。这些包括严重的胃肠道并发症(包括出血和穿孔)、出血并发症(例如引起出血事件)以及慢性肾病危险性增加。
在数年内，对长期阿司匹林治疗的正面和负面了解增加导致不大建议使用日剂量，有时与低强度口服抗凝药联合使用(在高危病人中)。
显然，不引起阿司匹林的危险副作用、并且可能在长期预防/治疗方案中用以代替阿司匹林，或可能与非常低剂量的阿司匹林联用的抗血小板药的发现，将使由于血小板功能障碍引起的任何疾病或障碍的治疗和预防向前迈出一大步。这一发现受到医生和有患这类疾病危险或希望预防发生这种疾病可能性的大众的普遍欢迎。
发明概述已经表明可可中存在的矢车菊苷配质在体外和体内都具有抗血小板效应。也说明所述抗血小板作用机制不是通过抑制所述花生四烯酸途径。另外，似乎与可可矢车菊苷配质联合的低剂量阿司匹林治疗导致抗血小板效应增强、超过两种单一疗法的抗血小板效应。因此，本发明提供一种可供选择的长期抗血小板治疗，而没有与阿司匹林相关的使人不愉快和危险的副作用。
附图描述
图1A-B代表在4种治疗中以两种时间间隔记录的比较的血栓烷和LT/PGI2比率水平阿司匹林，(+)-可可，阿司匹林与(+)-可可联合，阿司匹林与(-)-可可联合。
图2A-D代表在4种治疗中以两种时间间隔记录的比较的未经刺激的血小板IIb/IIIa受体表达阿司匹林，(+)-可可，阿司匹林与(+)-可可联合，阿司匹林与(-)-可可联合。
图3A-D代表在4种治疗中以两种时间间隔记录的比较的ADP刺激的血小板IIb/IIIa受体表达阿司匹林，(+)-可可，阿司匹林与(+)-可可联合，阿司匹林与(-)-可可联合。
图4A-D代表在4种治疗中以两种时间间隔记录的比较的肾上腺素刺激的血小板IIb/IIIa受体表达阿司匹林，(+)-可可，阿司匹林与(+)-可可联合，阿司匹林与(-)-可可联合。
详细描述本发明涉及可可矢车菊苷配质与阿司匹林联合应用作为抗血小板治疗药物以及包含可可矢车菊苷配质和阿司匹林(乙酰水杨酸)的组合物。
本文所用的“可可矢车菊苷配质”是表儿茶素和儿茶素的单体和/或寡聚体。术语“矢车菊苷配质”在本领域使用时具有更加有限的含义，即是指表儿茶素和儿茶素的寡聚体(而不是单体)。然而，为了简便起见，本文所用的所述术语包括单体以及寡聚体。
本发明涉及包含阿司匹林和可可矢车菊苷配质的组合物。所述组合物可以通过任何合适形式给予，但通常配制为药用组合物、食品、食物增补剂或食品添加剂。
在一个实施方案中，本发明提供适合于摄入的包含在生理可接受的载体中的阿司匹林和可可矢车菊苷配质的组合物。所述组合物可以通过任何合适形式给予，但通常配制为药用组合物、食品、食物增补剂或食品添加剂。
本发明也提供-应用阿司匹林和可可矢车菊苷配质生产用于治疗或预防由血小板功能障碍引起的疾病或障碍(例如与正常血小板活化相反的、导致凝血块形成的血小板病理性活化以及预防出血)的药物、食品、食物增补剂或食品添加剂；-应用阿司匹林生产与可可矢车菊苷配质一起使用以预防或治疗由血小板功能障碍引起的疾病或障碍的药物、食品、食物增补剂或食品添加剂；和-应用可可矢车菊苷配质生产与阿司匹林一起使用以预防或治疗由血小板功能障碍引起的疾病或障碍的药物、食品、食物增补剂或食品添加剂。
可可多酚包括可可矢车菊苷配质，它们是表儿茶素和儿茶素的单体和/或寡聚体。
矢车菊苷配质单体具有以下结构
矢车菊苷配质包括在得自以下植物的可可豆中发现的矢车菊苷配质可可(Theobroma cacao)和各种相关可可物种，以及Herrania属及其属间杂种和属内杂种。
矢车菊苷配质单体包括(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素及其相应的差向异构体(例如(-)-儿茶素和(+)-表儿茶素)。
以具有以下结构的合成直链和/或支链寡聚体为例说明所述可可矢车菊苷配质。
直链寡聚体，其中n为0-16的整数
支链寡聚体，其中A和B独立地为寡聚体1-15，(在最终寡聚体中它们总共为寡聚体3-18)。 在所述寡聚体中，n为2-18的整数、优选3-12的整数、更优选5-12的整数、最优选为5。所述寡聚体具有(4→6)和/或(4→8)的黄烷间(interflavan)键合。所述寡聚体可以由上述结构表示。对于直链寡聚体，当x为0时，所述寡聚体称为“二聚体”；当x为1时，所述寡聚体称为“三聚体”；当x为2时，所述寡聚体称为“四聚体”；当x为3时，所述寡聚体称为“五聚体”；对于具有x至多18并且包括18和更高的寡聚体，可以采用同样的叙述进行命名，这样，当x为18时，所述寡聚体称为“十八聚体”。对于所述支链寡聚体，当A或B为1时，所述寡聚体称为“三聚体”；采用同样的叙述例如有关所述直链寡聚体的描述以此类推。
所述可可矢车菊苷配质可以由可可成分、尤其是具有可可矢车菊苷配质含量增加的可可成分提供，或者可以采用合成法制备所述可可矢车菊苷配质。可可成分是可得自含有可可矢车菊苷配质的可可豆的任何物质，并且包括例如巧克力浆、可可脂、部分脱脂可可固体(cocoasolid)和/或全脱脂可可固体。所述可可矢车菊苷配质可以以可可成分的形式使用，或者它们可以从可可豆、可可碎仁或可可成分中提取，例如从上述成分中提取。
测定可可多酚含量的方法描述于美国专利第5,554,645号(1996年9月10日授予专利权)，该专利通过引用结合到本文中。剥开收获的可可豆荚，取出带有果肉的豆进行冷冻干燥。从冷冻干燥块中人工去除果肉，将所述豆进行以下操作。所述冷冻干燥可可豆首先人工去除果肉，用TEKMAR Mill将其磨碎成精细粉末块。然后将所得的粉末块使用重蒸馏的己烷作为溶剂通过Soxhlet提取法脱脂过夜。在环境温度下，通过真空从所述脱脂块中除去残留的溶剂。
可可多酚(包括可可矢车菊苷配质单体和/或寡聚体)也可以从含有高水平的可可多酚的新鲜可可豆、可可碎仁或可可碎仁部分中提取，最好是从未经发酵、发酵不足的可可豆中提取。它们也可以从最好具有高可可多酚含量的巧克力浆、部分脱脂可可固体和/或全脱脂可可固体中提取。使用溶解所述可可多酚(包括所述矢车菊苷配质)的溶剂。
因此，在本发明的一个方面，所述可可矢车菊苷配质是寡聚体、单体或它们的混合物，所述寡聚体、单体或混合物可通过以下方法获得(a)脱脂磨碎的可可碎仁、可可碎仁部分、巧克力浆、部分脱脂可可固体或全脱脂可可固体用可可矢车菊苷配质可溶于其中的溶剂一溶剂抽提；且(b)从所得的可可提取物中分离包含所述的或每种矢车菊苷配质单体、寡聚体或混合物的部分。
合适的溶剂包括水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯或它们的混合物。优选的溶剂是水和甲醇或丙酮的混合物。一种优选的提取方法是先用丙酮/水/乙酸(70％∶29.5％∶0.5％)提取两次，然后用甲醇∶水∶乙酸(70％∶29.5％∶0.5％)进行第三次提取。所述溶剂最好略呈酸性。在某些情况下，所述提取物例如通过除去咖啡因和/或可可碱而纯化，然后通过凝胶渗透层析和/或高压液相层析进一步纯化。在高压液相层析中，可以将所述提取物分级分离成含有至少50％(重量)单体或特定寡聚体的单体部分和寡聚体部分。当所述部分含有所述单体和低级寡聚体(至多并且包括四聚体)时，所述部分含有约90-95％(重量)的特定寡聚体部分。
在另一个实施方案中，可可多酚、通常是可可矢车菊苷配质单体和/或寡聚体存在于可可多酚水平增加或保持的可可成分中(例如如上所述)。增加水平的可可多酚可以通过将可可多酚、例如可可矢车菊苷配质单体、寡聚体和/或其混合物加入到所述可可成分中来实现。如下所述，由于当从发酵不足的可可豆或或其混合物中制备时，焙炒的(roasted)可可碎仁、巧克力浆和部分脱脂或无脂肪的可可固体的可可多酚含量、包括所述可可矢车菊苷配质含量较高，所以水平保持的可可多酚可以通过控制可可豆的发酵程度来实现。
水平保持的的可可多酚也可以在通过控制所述可可豆加工的条件来实现。因此，从可可豆生产具有水平保持的的可可多酚的可可脂和/或可可固体的方法采用不需要单独的可可豆焙炒或液体磨碎设备的独特的加工步骤的组合，使得可以任选加工可可豆，而无需将其暴露于严峻的热处理达延长的时间和/或应用的溶剂提取脂肪。与传统的可可加工法不同，该方法的好处在于增加多酚的保留，使得在未经加工的可可豆中存在的多酚的原始量与加工后可获得的多酚含量的比率小于或等于2。
可可多酚含量高的部分脱脂可可固体(包括高可可矢车菊苷配质含量)可以通过将可可豆直接加工成可可固体来获得，而无需可可豆或碎仁的焙炒步骤。该方法保留了可可多酚，因为它省去了传统的焙炒步骤。该方法基本上由以下步骤构成(a)将可可豆加热至恰好足以减少含水量至约3％(重量)、使可可壳裂开的可可豆内部温度；(b)从可可壳中风选可可碎仁；(c)螺杆压榨可可碎仁；和(d)回收含有可可多酚(包括可可矢车菊苷配质)的可可脂和部分脱脂可可固体。任选的是，在加热步骤之前，清洁可可豆，例如在空气流化床密度分离器中进行。所述风选也可以在空气流化床密度分离器中进行。优选将可可豆加热至约100℃至约110℃，更优选低于约105℃的内部温度，通常采用红外加热装置将其加热3-4分钟。如果需要，可以将所述可可固体碱化和/或磨成可可粉。
通过将可可豆(大约80-100粒可可豆)装入绝热容器例如保温瓶中，可测量可可豆内部温度(IBT)。然后将所述绝热容器适当密封，以保持其中所述样品的温度。将一支温度计插入到装入可可豆的绝热容器中，使所述温度计的温度与保温瓶中的可可豆的温度平衡。该温度读数就是可可豆的IBT温度。IBT也可以认为是可可豆的平衡质量温度。
可可豆可以依照其颜色分成4类主要为褐色(完全发酵的)、紫色/褐色、紫色和淡黑色(未发酵的)。如上所述，所述可可固体最好从发酵不足的可可豆来制备，它比已发酵的可可豆的可可多酚含量高。发酵不足的可可豆包括淡黑色可可豆、紫色可可豆、淡黑色可可豆和紫色可可豆的混合物、紫色可可豆和褐色可可豆的混合物或者淡黑色可可豆、紫色可可豆和褐色可可豆的混合物。更优选所述可可豆是淡黑色可可豆和/或紫色可可豆。发酵不足的可可豆通常的发酵系数为275或更低。
所述“发酵系数”采用表征可可豆发酵的梯度系统来测定。淡黑色定为1，紫色为2，紫色/褐色为3，褐色为4。属于每种类别的可可豆的百分率乘以加权数值。因而，100％褐色可可豆样品的“发酵系数(fermentation factor)”是100×4或400，而100％紫色可可豆样品的“发酵系数”是100×2或200，。50％淡黑色可可豆样品和50％紫色可可豆样品的发酵系数为150，即(50×1)+(50×2)。
在一个实施方案中，可可矢车菊苷配质的衍生物，例如没食子酸化和甲基化矢车菊苷配质，可以与阿司匹林联合使用。本文关于可可矢车菊苷配质及其用途的任何引述也适用于矢车菊苷配质衍生物。没食子酸化矢车菊苷配质可以依照国际专利申请第PCT/US98/21392号(公布号为WO99/19319)中所述来制备。甲基化矢车菊苷配质可以依照例如实施例6中所述来制备。
在本发明的一个方面，所述甲基化矢车菊苷配质单体或寡聚体是式(A)n，其中n为1-18，A是下式的单体单位 其中R1至R5以及R8至R10中的每个相同或不同，各自为H或CH3；R6和R7相同或不同，它们为H、CH3或与相邻单体单位的键合；条件是在至少一个单体单位中基团R1至R10中至少一个为CH3。所述单体可以例如通过环上4位、6位和8位中的任一个或两个通过上述黄烷间键合连接。
在本发明的另一方面，所述甲基化矢车菊苷配质单体或寡聚体具有式(A’)n结构，其中n为1-18，A’为下式的单体单位 其中R1至R5中的每个相同或不同，各自为H或CH3，条件是在至少一个单体单位中基团R1至R5中至少一个为CH3。所述单体可以例如通过环上4位、6位和8位中的任一个或两个通过上述黄烷间键合连接。例如，所述寡聚体可以是以下结构的直链寡聚体，其中n为1-16 其中R1至R5如上定义。
或者，或此外，所述寡聚体可以是以下结构的支链寡聚体，其中A和B独立地为寡聚体1-15，在最终寡聚体中它们总共为寡聚体3-18 其中R1至R5如上定义。
在另一个实施方案中，本发明提供矢车菊苷配质寡聚体或多种寡聚体的混合物，其中所述寡聚体或每种所述寡聚体是甲基化四聚体。
例如，所述甲基化四聚体是式(A)4化合物，其中A为下式的单体单位 其中R1至R5以及R8至R10中的每个相同或不同，各自为H或CH3；R6和R7相同或不同，它们为H、CH3或与与相邻单体单位的键合；条件是在至少一个单体单位中基团R1至R10中至少一个为CH3。所述单体可以例如通过环上4位、6位和8位中的任一个或两个通过上述黄烷间键合连接。
或者，所述甲基化四聚体可以是式(A’)4化合物，其中A为下式的单体单位 其中R1至R5中的每个相同或不同，各自为H或CH3，条件是在至少一个单体单位中基团R1至R5中至少一个为CH3。所述单体可以例如通过环上4位、6位和8位中的任一个或两个通过上述黄烷间键合连接。
本发明的甲基化可可矢车菊苷配质四聚体或四聚体的混合物可通过使含有矢车菊苷配质四聚体的可可提取物的分离部分或通过合成法制备的四聚体甲基化来获得。例如，所述四聚体可以为如上所述的式(A)4的四聚体。
在一个实施方案中，甲基化可可矢车菊苷配质四聚体或四聚体的混合物，其中所述四聚体或其混合物可通过以下方法获得(a)脱脂磨碎的可可碎仁、可可碎仁部分、巧克力浆、部分脱脂可可固体或全脱脂可可固体用可可矢车菊苷配质可溶于其中的溶剂萃取；(b)从所得的可可提取物中分离含有矢车菊苷配质四聚体的部分；和(c)将所述分离部分甲基化。
所述甲基化可可矢车菊苷配质寡聚体或寡聚体的混合物，其中所述寡聚体或其混合物也可通过以下方法获得(a)脱脂磨碎的可可碎仁、可可碎仁部分、巧克力浆、部分脱脂可可固体或全脱脂可可固体用可可矢车菊苷配质可溶于其中的溶剂萃取；(b)从所得的可可提取物中分离含有矢车菊苷配质寡聚体的部分；和(c)将所述分离部分甲基化。
本发明的组合物为适合于口服给药的形式，例如片剂、胶囊剂、丸剂、浓缩剂、粉剂、液体、溶液剂或混悬剂。最好配制为药用组合物、食品、食物增补剂或食品添加剂。也可以采用宠物食品成分的形式。所述组合物可以以单位剂型提供。
所述活性化合物可以配制用以速释或缓释。片剂可以包含有效量的可可多酚、可可矢车菊苷配质单体和/或寡聚体或含有可可多酚或可可矢车菊苷配质的组合物和有效量的阿司匹林以及任选的载体或释放系统。合成聚合物在配制具有控制释放的组合物中尤其有用。所述胶囊剂可以包含含有预定剂量的含有所述可可多酚和阿司匹林的组合物的明胶胶囊。口服给药制品也可以包含食用增补剂营养素，例如磷酸二钙、硬脂酸镁、硝酸钙、维生素和矿物质。所述可可矢车菊苷配质/阿司匹林组合的制剂和含有它们的组合物可以用制药领域、食品科学领域、医药领域和兽医学领域的技术人员众所周知的标准技术来制备。
配制所述组合物以传递联合有效剂量的所述可可矢车菊苷配质和阿司匹林。可以以单剂量，或者一日二次至三次给予有效量的所述可可矢车菊苷配质。人用的日有效量为至少50mg、优选100mg、更优选150mg的所述可可矢车菊苷配质。剂量上限没有限制。例如可以在约50至约1000mg、约100至约800mg、约300至约600mg的范围内，或使用这些剂量的下限而不采用剂量上限，例如至少50mg/ml、100mg/ml或300mg/ml，给予矢车菊苷配质。当用于兽医学的动物例如猫、马或狗时，本领域技术人员可以考虑例如动物体重根据上述剂量来确定有效量。矢车菊苷配质用量可以通过Adamson等所述方法(“用于对可可和巧克力样品中矢车菊苷配质定量的HPLC方法及与总抗氧化能力的关系(HPLC Method for the Quantification of Procyanidinsin Cocoa and Chocolate Samples and Correlation to Total AntioxidantCapacity)”J.Ag.Food Chem.，第710卷，4184-4188)来确定，该文献的有关部分通过引用结合到本文中。由于当与可可矢车菊苷配质联合给予时获得增强效应，所以阿司匹林可以以比当在抗血小板疗法时单独使用阿司匹林以达到心血管保护效应所需要的剂量(对于人而言，该剂量例如为80mg/天)低的剂量给予阿司匹林。因而，在本发明的方法和/或组合物中，阿司匹林可以以低于约80mg/天、例如约10mg/天至约80mg/天、最好是约20mg/天至约80mg/天的量使用。在另一个实施方案中，阿司匹林可以以约40mg/天至约80mg/天给予，或者当给予时以低于约70mg/天、约20mg/天至约70mg/天、或者约30mg/天至约70mg/天给予。
除了在一种可口服给药的组合物中联合外，所述可可矢车菊苷配质和阿司匹林可以配制成分开给药。因此，本发明还提供包含阿司匹林和可可矢车菊苷配质、用以分开、同时或顺序应用以治疗由血小板功能障碍引起的疾病和障碍的制品。当分开给予时，所述可可矢车菊苷配质和阿司匹林必须在确保它们以具有联合效应的足够浓度同时存在于所述哺乳动物体内的时间内给予。本领域技术人员可以根据可可矢车菊苷配质和阿司匹林的生物有效度的知识来确定该时间周期。例如可可矢车菊苷配质和阿司匹林应该相互在8小时内、优选相互在6小时内、更优选相互在2小时内给予所述哺乳动物。
所述可可多酚通常存在于例如如上所述获得的可可多酚水平增加或保持的可可成分中。因此，一方面，所述可可成分包括可通过以下方法获得的可可固体(a)将可可豆加热至恰好足以使含水量降低至3％(重量)和使可可壳裂开的可可豆内部温度；(b)从可可壳风选可可碎仁；(c)螺杆压榨所述可可碎仁；和(d)回收含有可可多酚的可可脂和部分脱脂可可固体。
在一个优选的实施方案中，可可多酚水平增加或保持的可可成分包含在饮料混合物中，以将其制成与有效量的阿司匹林共同给予的饮料。一种优选的饮料或饮料混合物包含高可可多酚固体和/或可可提取物；和任选的天然或人工甜味剂、天然或合成矫味剂和乳制品。所述饮料也可以是碳酸饮料。所述甜味剂可以是糖浆、固体或糖代用品。术语“糖代用品”包括填充剂、糖醇(即多元醇例如甘油)、高效甜味剂或其组合。甜度强度的程度不同的营养性糖类甜味剂可以是本领域通常使用的任何甜味剂，包括但不限于蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖浆干粉、玉米糖浆干粉、转化糖、水解乳糖、蜂蜜、槭糖、红糖、糖蜜等。糖代用品可以部分或全部代替营养性糖类甜味剂。高效糖代用品包括天冬甜素、环己基氨基磺酸盐、糖精、丁磺氨钾、新橙皮苷、二氢查耳酮、三氯半乳蔗糖、天门冬酰丙氨酸酯、甜菊甜味剂、甘草甜素、沙马汀等以及它们的混合物。示例性的糖醇包括本领域通常使用的那些糖醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、异麦芽、乳糖醇等。示例性的乳品成分是无脂肪乳固体、乳脂、甜性稀奶油、脱奶油乳和脱脂乳。
对于本申请的目的而言，下述定义使得能够更加清楚地了解公开和要求保护的内容本文所用的“食品”是基本上由蛋白质、碳水化合物和/或脂肪组成、用于生物体持续生长、修复和生命过程以及提供能量的物质。食品也可以含有补充的物质，例如矿物质、维生素和调味品。参见Merriam-Webster’s Collegiate Dictionary，第10版，1993。
本文所用的“药物(pharmaceutical)”或“药物(medicament)”是医学上的药物。参见Merriam-Webster’s Collegiate Dictionary，第10版，1993。
本文所用的“食品增补剂(food supplement)”或“食物增补剂(dietarysupplement)”是用于补充带有或含有一种或多种以下食物成分的膳食的制品(烟草除外)维生素、矿物质、草本植物或其它植物、氢基酸、人类通过增加全天摄食量用以来补充所述膳食的食用物质或浓缩物、代谢物、组分、提取物或这些成分的组合。参见Merriam-Webster’sCollegiate Dictionary，第10版，1993。
在食品标志上所用的“增补剂”通常是指以高于U.S.RDA 50％以上的用量添加的营养素(“Understanding Normal and Clinical Nutirition，第三版”，Whitney编著，Cataldoand Rolfes，第525页)。
为了治疗或预防由血小板功能障碍引起的任何障碍或疾病，可以根据本发明的公开内容和本领域已知的方法，由主治医师根据需要，单独或与其它治疗药物联合给予(人类或兽类动物例如宠物动物)可可矢车菊苷配质或可可矢车菊苷配质单体和/或寡聚体的混合物或包含可可矢车菊苷配质或可可矢车菊苷配质单体和/或寡聚体的组合物加上有效量的阿司匹林。例如，由主治医生根据需要，无需任何过多实验，可以在血小板功能障碍的体征或症状开始出现时或出现后立即给予包括共同给予阿司匹林和可可矢车菊苷配质的治疗。因此，本发明的组合物和治疗可以用于例如患有心血管疾病或有患心血管疾病危险的受治疗者，所述心血管疾病包括心脏病发作、中风和周围血管疾病、周围动脉疾病、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、动脉粥样硬化、再狭窄。
不需要过多实验，必要时，主治医师可以采用例如每月、每二个月、每二年、每年的方案或者采用某些其它方案，连续单独地或者与其它治疗药物一起共同给予可可矢车菊苷配质和阿司匹林或它们的组合物。
此外，在本发明的范围内，有包含食品、食物增补剂或药物和指示含量增加的可可多酚(包括可可矢车菊苷配质)与阿司匹林联合或者指出这些化合物有益特性的标签以及任选的使用说明的包装。本文所用的所述有益特性包括例如在心血管疾病和由于炎症引起的疾病和障碍的预防和治疗中抑制血小板功能障碍。
在以下非限制性的实施例中进一步描述了本发明。
实施例1可可矢车菊苷配质的定量分析方法根据聚合程度，使用下述分析方法对可可(Theobroma cacao)种子和巧克力的矢车菊苷配质组合物进行分离和定量。下述分析方法基于在以下文献中报道的工作Hammerston，J.F.，Lazarus，S.A.，Mitchell，A.E.，Rucker R.，Schmitz，H.H.，采用高效液相色谱/质谱鉴定可可(Theobroma cacao)和巧克力中的矢车菊苷配质(Identification ofProcyanidins in Cocoa(Theobroma cacao)and Chocolate Using High-Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry)，J.Ag.FoodChem.；1999；47(10)490-496。下述分析方法适用于定量研究据报道含有各种类型的原花色素的多种食品和饮料样品，如在以下文献中报道的工作Lazarus，S.A.，Adamson，G.E.，Hammerstone，J.F.，Schmitz，H.H.，食品和饮料中原花色素的高效液相色谱/质谱分析(High-performanceLiquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis of Proanthocyanidinsin Foods and Beverages)，J.Ag.Food Chem.；1999；47(9)3693-3701。因为荧光检测的高选择性和灵敏度，所以在Lazarus等(1999)中的分析报道采用荧光检测进行分析。
采用下述分析方法，如在以下文献中报道的分析方法Adamson，G.E.，Lazarus，S.A.，Mitchell，A.E.，Prior，R.L.，Cao，G.，Jacobs，P.H.，Kremers，B.G.，Hammerston，J.F.，Rucker，R.，Ritter，K.A.，Schmitz，H.H.，用于可可和巧克力和矢车菊苷配质定量的HPLC方法及与总抗氧化能力的关系(HPLC Method for the Quantification of Procyanidins in Cocoaand Chocolate Samples and Correlation to Total Antioxidant Capacity)，J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)4184-4188然后将样品与复合标准品进行比较，以准确确定矢车菊苷配质的水平。
提取将新鲜种子(来自巴西可可豆)在高速实验室研磨机中用液氮磨碎，直到颗粒大小减至约90微米为止。通过用1000毫升(ml)己烷提取三次，从220克(g)的磨碎种子中除去脂质。将不含脂质的固体风干，得到约100g无脂肪的物质。通过用1000ml 70％(体积)丙酮水溶液提取，获得含有矢车菊苷配质的部分。将悬浮液以1500g离心10分钟。通过带有玻璃棉的漏斗倾析丙酮层。然后用己烷(约75ml)再提取丙酮水溶液，以除去剩余脂质。弃去己烷层，丙酮水溶液在部分真空下于40℃旋转蒸发至终体积为200ml。将水性提取物冷冻干燥，得到约19g经丙酮提取的物质。
凝胶层析将约2g丙酮提取物(以上获得的)悬浮于10ml 70％甲醇水溶液中，然后以1500g离心。上清液在先前以流速3.5ml/min用甲醇平衡的Sephadex LH-20柱(70×3厘米)上半纯化。进样后2.5小时，每20分钟收集流分，通过HPLC分析流分中的可可碱和咖啡因。参见Clapperton，J.，Hammerstone，J.F.，Romanczyk，L.J.，Yow，S.，Lim，D.，Lockwood，R.，多酚和可可香料(Polyphenols and Cocoa Flavour)，Proceedings，16thInternational Conference of Groupe Ployphenols，Lisbon，Portugal，Groupe PolyphenolsNorbonne，France，1992；Tome II，第112-115页。一旦从所述柱子洗脱出可可碱和咖啡因(约3.5小时)，则收集其余的洗出物达另外的4.5小时，在部分真空下于40℃旋转蒸发，以除去有机溶剂。然后将该提取物悬浮于水中，并冷冻干燥。
通过制备型正相HPLC纯化矢车菊苷配质寡聚体将上述可可提取物(0.7g)溶于比率分别为70∶29.5∶0.5(体积)丙酮/水/乙酸的混合物(7ml)中。采用5μm Supelcosil LC柱(二氧化硅，100埃()；50×2cm)(Supelco，Inc.，Bellefonte，Pennsylvania)，于波长280纳米(nm)通过UV进行监测，使用线性梯度(下表中所示的)分离矢车菊苷配质流分。
在对应于寡聚体的峰之间的谷底收集流分。合并具有相同保留时间来自若干个制备分离的流分，在部分真空下旋转蒸发，然后冷冻干燥。
通过HPLC/MS分析纯化的流分为了测定各个寡聚体流分的纯度，如Lazarus等(1999)所述(参见上文)，采用结合在线质谱(MS)分析的正相高效层析(HPLC)方法，采用大气压电离电离喷雾(API-ES)室，进行分析。在配备一个自动注射器、四级HPLC泵、柱加热器、光电二极管阵列检测器和用于数据收集和处理的HP ChemStation的HP l000系列(Hewlett-Packard，Palo Alto，Califormia)上进行色谱分析。在Phenomenex(Torrance，California)Luna二氧化硅柱(25×4.6mm)上于37℃对所述矢车菊苷配质寡聚体进行正相分离。于波长280nm记录UV检测。所述三级流动相由(A)二氯甲烷、(B)甲醇和(C)乙酸和水(1∶1 v/v)组成。分离受以下因素影响(A)中B的一系列线性梯度，(C)恒定为4％，流速1ml/min，所述线性梯度如下从(A)中14％(B)开始洗脱；(A)中14-28.4％(B)，0-30min；(A)中28.4-50％(B)，30-60min；(A)中50-86％(B)，60-65min；65-70min等度洗脱。
采用如上所述的配备API-ES电离室并且与HP系列1100质谱选择性检测器(G1946A型)连接的HP 1100系列HPLC，对纯化流分进行HPLC/MS分析。缓冲试剂通过一个三通加入到临进入质谱仪的HPLC的洗出液流中，缓冲试剂用HP 1100系列HPLC泵传递，绕过脱气装置。以负离子模式分析的条件包括0.75M氢氧化铵作为缓冲剂，流速0.04ml/min，毛细管电压3kV，裂分电压75V，雾化压力25psig，于温度350℃干燥气体。采用扫描模式和选定离子监测(SIM)，在HPChemStation上收集数据。在质量范围m/z 100-3000内，以每周期1.96秒，对光谱扫描。在临进入MS之前，通过一个额外辅助泵，用氢氧化铵调节洗出物的pH至接近中性。该处理对抗由于在流动相中酸浓度升高所致的(-)-表儿茶素标准品负离子化的抑制。采用于波长280nm的UV检测，结合比较每类寡聚体的离子丰度比，通过峰面积测定每个流分的纯度。
可可和巧克力中矢车菊苷配质的定量使用市售(-)-表儿茶素，制备单体的复合标准品。通过上述方法，获得纯化状态的二聚体至十聚体。采用带有荧光检测的上述正相HPLC方法，激发波长和发射波长分别为276nm和316nm，分析使用这些化合物的标准品储备液。将峰分组，其面积相加，以包括来自任一类寡聚体的所有异构体，采用二次拟合(quadratic fit)，产生校准曲线。单体和小寡聚体的曲线几乎为线性，与前面应用线性回归产生基于单体和基于二聚体的校准曲线的应用相符。
然后用这些校准曲线计算如下制备的样品中的矢车菊苷配质浓度首先，采用三次己烷提取(各45ml)，将可可样品或巧克力样品(约8克)脱脂。接下来，用5ml丙酮/水/乙酸混合物(70∶29.5∶0.5v/v)，提取1克脱脂材料。然后通过将样品的HPLC数据与如上所述获得的校准曲线(使用纯化寡聚体)进行比较，确定脱脂材料中的矢车菊苷配质的量。根据the Association of Official Analytical Chemists(AOAC OfficialMethod 920.177)，采用标准化方法，测定样品的脂肪百分率(对于巧克力，使用1克样品规格；或者对于浆液，使用0.5克样品规格)。然后计算原始样品(含有脂肪)中总矢车菊苷配质水平的量。在每个样品色谱分离之前进行校准，以防止柱之间的变异。
实施例2临床研究募集16位受治疗者参加随机化临床试验，临床试验包括服用阿司匹林、高矢车菊苷配质饮料或者两者的组合。已知受治疗者无病、不吸烟，年龄在20-55岁之间。所述个体为随机化单位。
参加者被告知在所述试验前戒除非甾体消炎药至少4天、戒除酒精饮料至少2天、戒除含有咖啡因或可可碱的食物至少24小时，以及在试验当天戒除非甾体消炎药、酒精饮料和含有咖啡因或可可碱的食物。在所述研究的前一晚并且至空腹到第二天的10p.m.，指导所述受治疗者保持低植物化学品摄入。[植物化学品是植物的组成成分。具有高植物化学品含量的食品和饮料的实例包多种水果、咖啡、某些茶叶、青椒、大蒜、洋葱、酸乳酪、麦麸和十字花科蔬菜例如嫩茎花椰菜、卷心菜和花椰菜]。
在食用任何食物之前，抽取所述受治疗者的血液。在抽取原始血液之后，将所述受治疗者分成四组。第一组消耗81mg阿司匹林(乙酰水杨酸)(Bayer儿科阿司匹林)。第二组消耗高可可多酚饮料，该饮料由18.75g富含矢车菊苷配质的可可粉(来源于Sulawesi豆(含有51.1mg/g总矢车菊苷配质、11.2％脂肪、0.092％咖啡因、1.618％可可碱))和12.5g用300ml蒸馏水混合的蔗糖组成。第三组消耗高可可矢车菊苷配质饮料和81mg婴儿阿司匹林。最后一组消耗81mg婴儿阿司匹林和不含矢车菊苷配质的可可饮料，该可可饮料由18.75g可可粉(含有0.45mg/g总矢车菊苷配质、9.87％脂肪、2.063％可可碱、0.234％咖啡因)和12.5g用300ml蒸馏水混合的蔗糖组成。在试验期间，允许所述受治疗者喝水、无咖啡因汽水(diet soda)、过水面包圈(bagels)、低脂肪奶油干酪和香蕉。在消耗所述治疗药物后2小时和6小时，从每位受治疗者抽取血液。将静脉血抽取后置于装有0.5ml 3.2％缓冲柠檬酸钠溶液的抽空试管中。
采用血小板功能分析仪(PFA-100TM，Dade Behring International，Miami，Fla.)，按照生产商的说明，测量血小板聚集的抑制。该系统包括微处理机控制的仪器和装有生物活性膜的一次性试验药筒。该仪器在恒定真空下从样品贮库中通过毛细管和所述膜中刻出的显微孔抽吸血样。所述膜用胶原蛋白和肾上腺素包被。这些生物化学刺激物的存在、在标准化流动条件下产生的高剪切速度导致血小板附着、活化和聚集，在所述孔上慢慢地形成稳定的血小板栓。达到所述孔完全阻塞所需的以秒计的时间报告为“闭合时间(closure time)”(Kundu等，“介绍一种体外血小板功能分析仪一PFA-100(Description of an in vitroplatelet function analyzer-PFA-100)”Semin Thromb Hemost 21增刊2106-12，1995)。众所周知，阿司匹林治疗导致血小板聚集减少，进而引起根据PFA-100测量的闭合时间增加(Marshall等，“在健康自愿者中，比较阿司匹林对采用Simplate方法测量的出血时间和采用PFA-100测量的闭合时间的影响(A comparison of the effects ofaspirin on bleedingtime measured using the Simplate method and closure time measured usingthe PFA-100，in healthy volunteers)”，Br J Clin Pharmacol 44151-155，1997)。
结果表明，在2小时时间点，所有4种治疗均导致与基线水平相比的闭合时间增加(p＜0.05)。此外，阿司匹林治疗和可可加上阿司匹林治疗之间的比较表明，这两种治疗的闭合时间之间有差异(p＜0.08)。这证明阿司匹林与可可矢车菊苷配质寡聚体联合，增强阿司匹林抑制血小板活化的能力。单独用阿司匹林治疗以及用阿司匹林加上不含CP的可可治疗后的闭合时间之间没有差异，表明所述增强的效应依赖于可可中的矢车菊苷配质的存在。所述结果也证明，阿司匹林加上可可治疗以及阿司匹林加上不含CP的可可治疗在其闭合时间方面有显著性差异(p＜0.06)，证实所述可可/阿司匹林组合的增强效应依赖于所述矢车菊苷配质的存在。
也对所述血样中由于所述四种治疗方案引起的白三烯、前列环素和血栓烷水平的变化进行了分析。免疫测定法依照以下文献所述进行Westcott等，“大鼠肺中6-酮基PGF1α、5-HETE和LTC4的分析GM/MS，RIA和EIA的比较(Analysis Of 6-Keto PGF1 Alpha，5-HETE，And LTC4 In Rat LungComparison Of GM/MS，RIA and EIA)”，Prostaglandins32857-873，1986；Yakota等，“血液和尿液中的前列腺素类激素的酶免疫测定(Enzyme Immunoassay Of Prostanoids In Blood AndUrine)”，Adv.Prostgl.Thrombox.Leukot.Res.1533-34，1985；和Schramm等，“小分子量和大分子量植物化学品对内皮细胞类花生酸分泌的差别效应(D)ifferential Effects of Small and Large Molecular WeightPhytochemicals on Endothelial Cell Eicosanoid Secretion)”J Agric FoodChem 461900-1905，1998。前列环素(PGI2)代谢物6-酮基前列腺素F1-α用Cayman酶免疫测定#515211来测定，血栓烷(TXA2)代谢物TXB2用Cayman酶免疫测定519031来测定，而白三烯C4、D4和E4使用得自Oxford Biomedical Research的免疫测定EA-39来定量。运用成对样品T-检验计算P值。p＜0.05的数值被认为具有统计学显著性。类花生酸研究数据示于表1和图1中。无阿司匹林加上不含矢车菊苷配质的可可的所有治疗都导致致动脉粥样化性(atherogenic)与动脉粥样化抑制性(atherostatic)类花生酸的比率下降，表明所有治疗对于血管健康和预防缺血发作都是有益的，所述治疗得到的闭合时间的增加至少部分是由于所述类花生酸的调节所致。结果表明，富含CP的可可加上阿司匹林引起致动脉粥样化白三烯水平的降低，而引起动脉粥样化抑制性前列环素水平增加。相比之下，不含CP的可可加上阿司匹林治疗导致前列环素水平降低以及白三烯水平增加。这些结果表明，可可的动脉粥样化抑制效应依赖于所述矢车菊苷配质的存在。
有趣的是，这些结果表明，对于阿司匹林治疗和高可可矢车菊苷配质可可治疗，它们导致抗血小板活性的机制不同。阿司匹林的作用机制是通过抑制花生四烯酸途径(通过抑制前列腺素的产生)，进而导致血栓烷水平下降，从而预防依赖血栓烷的血小板活化。这解释了阿司匹林的抗血栓形成效应。正如表1中所观察到的，涉及阿司匹林的所有三种治疗都导致在消耗所述治疗药物后2小时和6小时时的血浆血栓烷水平显著降低，而高可可矢车菊苷配质可可治疗不改变血浆血栓烷水平。这被显示出高可可矢车菊苷配质和阿司匹林联合的治疗并不导致血栓烷水平降低单独的阿司匹林治疗达到的血浆血栓烷水平以下的结果所证实。与这些结果相反，PFA-100数据揭示，高可可矢车菊苷配质和阿司匹林的联合治疗导致比每种单一疗法的闭合时间增加，即增强所述治疗效应。
因此，看来可可矢车菊苷配质的抗血小板活性不依赖于花生四烯酸途径的抑制。这一事实有两种明显的暗示。首先，已记载的阿司匹林副作用，即由于抑制花生四烯酸途径引起的副作用，将不会由于用所述可可矢车菊苷配质治疗而引起。其次，用所述联合治疗可能导致协同的抗血小板作用，每种组分(阿司匹林和富含可可矢车菊苷配质的可可)通过不同的机制影响抗血小板活性。
总之，用阿司匹林和富含可可矢车菊苷配质的可可组合的疗法导致血小板活性降低，该作用是相加的且可能是协同的。也有证据说明，共同给予可可和阿司匹林增强阿司匹林的活性，使得可以应用低得多的剂量来达到类似的药效，而使阿司匹林的有害副作用减至最小。
实施例3消耗富含矢车菊苷配质的饮料并联合阿司匹林对血小板活性的影响研究了消耗有效量的可可饮料并联合阿司匹林对血小板活化的影响。
也让前项研究中所用的受治疗者参加表面蛋白表达研究。有关治疗方案和收集血液的方法与前述实施例中概述的方法相同。
在抽血后10分钟内，将全血在聚苯乙烯试管中在存在或不存在肽Arg-Gly-Ser(Sigma，St.Louis，MO)的情况下与10μM HEPES缓冲液(pH7.4，未经刺激的对照)、20或100μM ADP或20μM肾上腺素(BioData，Horsham，PA))在室温下孵育5分钟。5分钟后，将样品悬浮于1ml HEPES缓冲液中，然后将100μM样品转移到装有饱和浓度(20μM)的每种以下荧光标记的单克隆抗体的试管中PAC1-异硫氰酸荧光素(FITC)、抗CD62P-藻红蛋白(PE)和抗CD42a-PerCP。PAC1识别纤维蛋白原结合受体GPIIb-IIIa的活化构象，而抗CD62P识别存在于活化血小板表面的P-选择蛋白。抗CD42a识别存在于活化血小板和静息血小板两者表面的GP1b-1X。小鼠IgG、FITC和小鼠IgG、PE用作同种型对照。使用Arg-Gly-Asp-Ser-肽阻断所述PAC1抗体与血小板的结合，从而在流式细胞仪上设置阴性对照标记。抗体和同种型对照购自Becton Dickinson Immunocytometry Systems，Inc.，San Jose，CA。
在存在和不存在激动剂ADP和肾上腺素的情况下，将全血样品与单克隆抗体或同种型对照在室温下避光孵育20分钟。然后将样品在经过滤的1％低聚甲醛(pH7.2)中固定，于2-8℃避光保存。所有样品都在48小时内在FACScan流式细胞仪上运用LYSYS II软件进行分析。该流式细胞仪的性能使用1μm、2μm和10μm校准微珠(Becton DickinsonImmunocytometry Systems，Inc.，San Jose，CA和Flow Cytometry Systems，Research Triangle Park，NC)加以证实。以列表方式收集2万个事件的对数代码(in logarithmic code)的全光散射和荧光参数。基于光散射和CD42a表达门控血小板。活化血小板定义为共表达GPIIb-IIIa或P-选择蛋白活化构象的CD42a阳性事件百分率。血小板微粒定义为大小小于2μm的CD42a阳性事件百分率。
为了对结果进行统计学分析，运用秩的Friedman氏重复测量ANOVA(秩的RM ANOVA(RM ANOVA on rank))比较每个治疗组中的基线、2小时和6小时结果。对于post hoc多重比较运用Tukey氏所有成对比较。P值小于0.05被认为有显著性。也对治疗组中每个时间点即基线、2小时和6小时，分析血小板依赖性稳态数据的统计学差异。结果在有和无弱激动剂ADP和肾上腺素的刺激下，消耗可可和阿司匹林对离体表达GPIIb/IIIa血小板受体活化构象的影响示于图2、图3和图4。
在血小板活化后，GPIIb/IIIa受体经历了构象变化，使其能够结合纤维蛋白原和von Willebrand因子。通过配体与活化GPIIb/IIIa受体结合形成血小板间的桥对于血小板聚集和血栓形成是必需的。
参考图2B，与基线相比，(+)-可可消耗后6小时增加未经刺激的GPIIb/IIIa表达(P＜0.001)。其它治疗不明显影响未经刺激的GPIIb/IIIa表达。
参考图3C，与基线相比，ADP诱导的GPIIb/IIIa表达在消耗ASA+(+)-可可后6小时被抑制(P＝0.004)。相反，如图3D所示，与基线或2小时相比，消耗ASA+(-)-可可后6小时增加ADP诱导的GPIIb/IIIa表达(P＝0.005)。
如图4A所示，与基线相比，ASA消耗后6小时抑制肾上腺素诱导的GPIIb/IIIa表达(P＝0.003)。与基线相比，消耗(+)-可可后2小时抑制肾上腺素诱导的GPIIb/IIIa表达(P＝0.005；图4B)。与基线相比，联合消耗ASA+(+)-可可后2小时和6小时抑制肾上腺素诱导的GPIIb/IIIa表达(P＝0.006；图4C)。相反，在消耗ASA+(-)-可可后，肾上腺素诱导的GPIIb/IIIa表达没有显著变化(图4D)。
在有或无弱激动剂ADP和肾上腺素的刺激下，可可和阿司匹林消耗对P-选择蛋白的离体血小板表面表达(CD62)的影响示于表2。P-选择蛋白在活化血小板表面表达。所述治疗不显著影响未经刺激的P-选择蛋白表达。消耗ASA+(-)-可可是2小时时抑制ADP诱导的P-选择蛋白表达的唯一治疗(P＝0.001)。
与基线相比，消耗ASA后6小时抑制肾上腺素诱导的P-选择蛋白表达(P＝0.028)，而(+)-可可没有作用。与基线相比，联合消耗ASA+(+)-可可后2小时和6小时抑制肾上腺素诱导的P-选择蛋白表达(P＝0.014)。相反，联合消耗ASA+(-)-可可对肾上腺素诱导的P-选择蛋白表达不引起显著变化。
实施例4片剂制剂使用依照美国专利第6,015,913号中所述方法获得的高可可矢车菊苷配质可可固体制备片剂制剂，该专利通过引用结合到本文中。简而言之，该食用物质通过与其传统方法处理的可可中存在的水平相比增强天然存在的可可矢车菊苷配质的方法来制备，使得在未经加工的可可豆的可可矢车菊苷配质的原始含量与在加工后获得的含量的比率小于或等于2。为简便起见，本文将该可可固体材料称为CP-可可固体。
片剂组方剂(formula)包含以下组分(百分率以重量百分率表示)CP-可可固体 24.0％4-倍天然香草提取物(Bush Boake Allen) 1.5％硬脂酸镁(干燥润滑剂)(AerChem，Inc.) 0.5％Dipac制片用糖(Amstar Sugar Corp.)37.0％木糖醇(American Xyrofin，Inc.) 37.0％阿司匹林 50mg将CP-可可固体和香草提取物一起在食品加工机器中混合2分钟。将阿司匹林、糖和硬脂酸镁温和地混合在一起，然后在CP-可可固体/香草混合物中混合。使该材料在最大压力下通过Manesty压片机(B3B)，将其压缩以生产圆形片剂(15mm×5mm)，重1.5-1.8克。
或者，CP以含有总共约600mg的矢车菊苷配质单体和寡聚体的提取物形式使用。
本领域技术人员可以容易地制备如下的其它片剂组方剂包括各种食用香料、着色剂、赋形剂、维生素、矿物质、OTC药物、糖填充剂、UV防护剂(例如二氧化钛、着色剂等)、粘合剂、水凝胶等，但不包括聚乙烯吡咯烷酮，因为它会不可逆地结合所述可可矢车菊苷配质或组合的多种化合物。可以调整糖填充剂的用量以调控可可矢车菊苷配质或组合的多种化合物的剂量。
实施例5胶囊制剂实施例4中公开的片剂的一种变化，即包含与阿司匹林联合的可可矢车菊苷配质的口服剂型用由明胶制成的推入配合型(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂(例如甘油)制成的密封软胶囊制备。所述推入配合胶囊含有粉末形式的本发明化合物或多种化合物的组合或如实施例4中所述的CP-可可固体，该粉末形式可以任选地与诸如乳糖或蔗糖的填充剂混合，以控制所述可可矢车菊苷配质的剂量。在软胶囊中，将所述经分离的可可矢车菊苷配质或CP-可可固体悬浮于合适液体例如脂肪油或可可脂或其中的组合中。所述胶囊剂可以含有UV防护剂例如二氧化钛或合适的着色剂，以防止UV损害。所述胶囊剂也可以含有诸如实施例4中列举的那些填充剂。
实施例6甲基化矢车菊苷配质甲基化可可矢车菊苷配质对血管平滑肌的影响示于本实施例中。使用测量兔主动脉环中内皮依赖性松弛(EDR)的体外方法。可可多酚和矢车菊苷配质代谢物的制备通过将纯化可可矢车菊苷配质四聚体流分(依照Romanczyk等的美国专利第5,554,645号中所述分离的)与重氮甲烷试剂反应，制备甲基化四聚体。
为了制备所述重氮甲烷试剂，使用Diazald试剂盒重氮甲烷发生器(Diazald Kit Diazomethane Generator)(Aldrich Chemicals)。所述反应物由两种试剂组成。对于第一种试剂，将5g KOH溶于8ml水中，然后加入10ml MeOH。将所述试剂置于用作反应容器的圆底烧瓶中。将该反应容器与冷凝器和在冰浴中冷却的收集瓶连接。乙醚收集器位于侧臂。通过将5g Diazald溶于45ml重蒸馏的乙醚中制备第二种试剂。将该试剂置于所述反应容器上的分液漏斗中。使用水浴让反应容器温至65℃。以与蒸馏速率相等的速率将Diazald溶液滴加到所述KOH溶液中。当Diazald用完时，用10ml乙醚冲洗分液漏斗。
将100mg四聚体悬浮于3ml甲醇中。加入12ml重氮甲烷试剂。让混合物在室温下反应20分钟，然后让其在冷藏箱(-7℃)中反应过夜。通过加入2.5ml 10％乙酸的甲醇溶液终止反应。在氮气流下除去溶剂，固体真空干燥。
使用API-ES质谱以负离子模式监测所述反应。采用流速1ml/min注射10μl由8％ 10mM乙酸铵的甲醇和92％甲醇组成的溶液。使用3500V的毛细管电压以及100V的裂分电压实现电离。在质量范围为m/z 500-1000内对波谱扫描。质谱数据显示，在反应结束时，不存在未甲基化四聚体。大多数反应产物在14-18位的羟基被甲基化。某些四聚体在所有20个位置全部甲基化。内皮依赖性松弛雄性新西兰白兔(重2.5-3kg)用戊巴比妥(50mg/kg)外周麻醉(terminally ansesthetized)。切下胸主动脉，小心地清除粘连脂肪和结缔组织。然后将主动脉切成多个环(长3-4mm)，在常规20ml装有Krebs碳酸氢盐缓冲液的器官浴中固定，所述缓冲液的组成(m Mol/l)为NaCl116.0、KCl 5.4、CaCl21.2、NaHCO322.0、NaH2PO41.2、MgCl21.2和葡萄糖10.1，于37℃、pH7.4保持，然后连续通入95％O2--5％CO2混合物。将组织与力置换传感器(force displacement transducer)(GrassInstrument Co.，Quincy MA Model FT03C)连接，拉至基础张力为8g。
将所述环在器官浴中平衡90分钟，此后将它们用去甲肾上腺素(10-5M)预收缩。通过乙酰胆碱(10-5M)诱导40％或更高预收缩环的松弛能力，评价所有制备物中功能性内皮的存在。这些方法的细节先前已发表(Kappagoda，Cardiovascular Res.25270-82，1991)。具有功能性内皮的主动脉环用去甲肾上腺素(10-5M)预收缩。当收缩达到稳定状态时，以浓度10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和2.5×10-4，加入甲基化四聚体。结果示于表3中。4个独立主动脉环的结果表明，所述甲基化四聚体具有松弛效应。因此，这些衍生物在其保持血管健康和治疗血管疾病的能力方面与母体化合物一样有效的。表3.甲基化四聚体对4个独立兔主动脉环的剂量反应松弛
表12小时 阿司匹林可可可可+阿司匹林(-)-可可+阿司匹林前列环素 103 107104 95血栓烷 9199 9289白三烯 101 10097105LT/PG12比率 9993 94112TXB2/PG12比率8989 88956小时 阿司匹林可可可可+阿司匹林(-)-可可+阿司匹林前列环素 104 107 102 77血栓烷 89 99 9179白三烯 100 99 9994LT/PG12比率 100 93 96120TXB2/PG12比率86 89 8894
表权利要求
1.一种适合于摄入的组合物，所述组合物包含在生理可接受的载体中的阿司匹林和可可矢车菊苷配质。
2.一种权利要求1的组合物，所述组合物是一种药用组合物、食品、食物增补剂或食品添加剂。
3.一种权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述可可矢车菊苷配质是单体。
4.一种权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述可可矢车菊苷配质是二聚体。
5.一种权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述可可矢车菊苷配质是寡聚体。
6.一种权利要求5的组合物，其中所述寡聚体是可可矢车菊苷配质寡聚体2-18或它们的混合物。
7.一种前述权利要求中任一项的组合物，其中所述可可矢车菊苷配质是单体、寡聚体或它们的混合物，所述单体、寡聚体或混合物可通过以下方法获得(a)脱脂磨碎的可可碎仁、可可碎仁部分、巧克力浆、部分脱脂可可固体或全脱脂可可固体用可可矢车菊苷配质可溶于其中的溶剂萃取；且(b)从所得的可可提取物中分离包含所需矢车菊苷配质单体、寡聚体或混合物的部分。
8.阿司匹林和可可矢车菊苷配质在生产用来治疗或预防由血小板功能障碍引起的疾病或障碍的药物、食品、食物增补剂或食品添加剂方面的应用。
9.阿司匹林在生产与可可矢车菊苷配质一起使用以预防或治疗由血小板功能障碍引起的疾病或障碍的药物、食品、食物增补剂或食品添加剂方面的应用。
10.可可矢车菊苷配质在生产与阿司匹林一起使用以预防或治疗由血小板功能障碍引起的疾病或障碍的药物、食品、食物增补剂或食品添加剂方面的应用。
11.权利要求8-10中任一项的应用，其中所述可可矢车菊苷配质是单体。
12.权利要求8-10的应用，其中所述可可矢车菊苷配质是二聚体。
13.权利要求8-10的应用，其中所述可可矢车菊苷配质是寡聚体。
14.权利要求13的应用，其中所述寡聚体是可可矢车菊苷配质寡聚体2-18或它们的混合物。
15.权利要求8-14中任一项的应用，其中所述可可多酚是可可矢车菊苷配质寡聚体、单体或它们的混合物，所述单体、寡聚体或混合物可通过以下方法获得(a)脱脂磨碎的可可碎仁、可可碎仁部分、巧克力浆、部分脱脂可可固体或全脱脂可可固体用可可矢车菊苷配质可溶于其中的溶剂萃取；且(b)从所得的可可提取物中分离包含所述矢车菊苷配质寡聚体或每种矢车菊苷配质寡聚体的部分。
16.权利要求8-14中任一项的应用，其中所述药物、食品、食物增补剂或食品添加剂用来预防或治疗心血管疾病或炎性疾病或障碍。
17.一种包含可供分开、同时或顺序使用以治疗由血小板功能障碍引起的疾病或障碍的阿司匹林和可可矢车菊苷配质的制品。
18.一种权利要求17的制品，其中所述可可矢车菊苷配质存在于可可矢车菊苷配质水平增加或保持的可可成分中。
19.一种权利要求17或权利要求18的制品，其中所述可可成分得自发酵系数为275或275以下的可可豆。
20.一种权利要求18或权利要求19的制品，其中所述可可成分包含可通过以下方法获得的可可固体(a)将可可豆加热至恰好足以使含水量降低至约3％重量并使可可壳裂开的可可豆内部温度；(b)从可可壳风选可可碎仁；(c)螺杆压榨所述可可碎仁；和(d)回收含有可可矢车菊苷配质的可可脂和部分脱脂可可固体。
21.权利要求17-20中任一项的制品，其中所述可可成分是一种饮料混合剂。
22.联合应用以预防或治疗由血小板功能障碍引起的疾病或障碍的阿司匹林和可可矢车菊苷配质。
23.一种用来预防或治疗由血小板功能障碍引起的疾病或障碍的药物，所述药物包含阿司匹林和可可矢车菊苷配质。
24.一种药用组合物，所述药用组合物包含阿司匹林和可可矢车菊苷配质。
25.一种治疗或预防与血小板功能障碍相关的病症的方法，所述方法包括给予受治疗者治疗或预防所述血小板功能障碍联合有效量的可可矢车菊苷配质和阿司匹林。
26.权利要求25的方法，其中所述可可矢车菊苷配质是单体。
27.权利要求25的方法，其中所述可可矢车菊苷配质是二聚体。
28.权利要求25的方法，其中所述可可矢车菊苷配质是寡聚体。
29.权利要求25的方法，其中所述可可矢车菊苷配质和所述阿司匹林在同一组合物中给予。
30.权利要求25的方法，其中所述可可矢车菊苷配质和所述阿司匹林分开给予。
31.一种治疗或预防与血小板功能障碍相关的病症的方法，所述方法包括给予受治疗者治疗或预防所述血小板功能障碍联合有效量的可可矢车菊苷配质衍生物和阿司匹林。
32.权利要求31的方法，其中所述可可矢车菊苷配质衍生物是甲基化可可矢车菊苷配质。
33.权利要求31的方法，其中所述可可矢车菊苷配质衍生物是没食子酸化可可矢车菊苷配质。
全文摘要
本发明涉及应用与阿司匹林联合的可可矢车菊苷配质作为抗血小板治疗和包含可可矢车菊苷配质和阿司匹林(乙酰水杨酸)的组合物。
文档编号A61K31/353GK1450901SQ01809739
公开日2003年10月22日 申请日期2001年3月22日 优先权日2000年3月22日
发明者H·H·施密茨, L·J·小罗曼茨克 申请人:马尔斯公司