专利名称：增强细胞保护的方法
技术领域：
本发明涉及一种增强细胞保护的新方法，该方法是给予葡萄(Vitisvinifera)和番茄(Lycopersicon esculentum)的提取物以及维生素C、E、β胡萝卜素和硒的组合物，还涉及这种组合物用于治疗或预防与自由基产生过量有关的病理变化如衰老、动脉粥样硬化和癌症的应用。
背景技术：
抗氧化剂用作身体抵抗自由基损伤的保护成分[Harman D.；Holiday R.和M.Meydany-编辑，“为了延长健康的寿命”，《纽约科学会年刊》(Annals ofthe New York Academy of Sciences)，Vol.854，1998，New York；Stalin H.B.，“抗氧化剂对衰老和晚年的慢性疾病的影响”，《国际维生素营养研究杂志》(Int.J.Vitamin.Nutr.Res.)69，146-149，1999]。
一些流行病学研究支持这一观察结果即抗氧化剂摄入增加限制了冠状动脉疾病和一些肿瘤的临床表达[Comstock GW；Alberg AJ；Huang HY，WuK.；Burke AE；Hoffman SC；Norkus EP；Gross M.；Cutler RG；Morris JS；SpateVL；Helzlsouer KJ，“与血液中的抗氧化剂抗坏血酸、类胡萝卜素、α-生育酚、硒和总的过氧自由基的吸收量相关的进展性肺癌的危险性”，CancerEpidemiol Biomarkers Prev 6，907-916，1997]。高抗氧化剂饮食摄入的个体的平均寿命较长。
由环境和营养因素导致的个体疾病、环境压力和氧化压力对具有不同的防卫能力的个体产生广泛影响。
通常，具有极好的平衡防卫机制的个体将不患慢性疾病，但最终摆脱不了全身的衰老进程。
然而，更可能的是这种情况关键系统未得到足够的保护而受到损伤。这一过程的结果在临床上被诊断为慢性疾病。
抗氧化剂是身体防御氧化压力的一个重要要素，因此它具有一般的抗衰老性能和特异性的预防疾病的功能。
由于慢性疾病的结果是老年丧失能力的最主要原因之一，因此因充分抗氧化防卫所致的初级预防不仅具有抗衰老功能，而且更重要的是具有特异性的预防慢性疾病的作用。
但是，大家都清楚，这是一个重要的终生预防机制对与年龄相关的慢性疾病的初级保护必须在生命中早日启动，并且需要在整个生命期限延续不断。
抗氧化剂与慢性疾病之间的关系可能在心血管疾病中得到最佳研究。目前已证实了冠心病的血浆抗氧化剂浓度、发病率和死亡率之间的很强的反比关系。对数据的分析可以量化不同的抗氧化剂维生素的贡献作用。根据这些结果，足够的维生素E的摄入是最重要的，其次是维生素C和胡萝卜素的摄入。在对具有很好的全身维生素E状态的人口的分析中，观察到维生素C和β-胡萝卜素的作用很强。众所周知，没有维生素功能、起源于食物的其它抗氧化剂，例如类黄酮、多酚或番茄红素，具有非常重要的抗氧化功能[Fuhrman B.；Ben-Yaish L.；Attias J.；Hayek T.；Avaram M.，“番茄红素和β-胡萝卜素抑制低密度脂蛋白氧化并且这一作用依赖于脂蛋白维生素E含量”，《心血管疾病的营养代谢》(Nutr Metab Cardiovasc Dis)7，433-443，1997；FastenM.；Pfander H.；Boscoboinik D.；Azzi A.，“与番茄红素与α生育酚联合抑制前列腺癌细胞增殖的生理浓度”，Biochem Biophys Res Commun 250(3)，582-585，1998；Boehm F.；Edge R.；McGarvey DJ；Truscott TG，“β-胡萝卜素与维生素E和C提供对抗氧化氮的协同细胞保护”，FEBS Lett 436，387-389，1998；Watkins T.R.-Editor，“葡萄酒，营养和治疗的益处”，美国化学会系列讨论会(American Chemical Society Symposium Series)661，1997，Washington DC]。
在成年后期和老年早期，癌症是过早死亡的最主要原因。毫无疑问，大多数癌症是由于环境因素攻击那些处于增殖失调的高危险性中的组织的特殊遗传能力所致。流行病学数据清楚地证实了水果和蔬菜摄入少以及低血浆抗氧化性维生素浓度与显著上升的癌症发病率和死亡率相关。这适用于胃肠道癌和肺癌，也适用于前列腺癌和乳腺癌。
此肿瘤形成过程非常复杂。许多潜在的危险突变在不断产生。一旦这些遗传变化摆脱了最初的防卫和修复机制，这些发生变化的细胞必定会通过其它防卫机制被消除。一个重要的机制是细胞凋亡的过程。或许，在增殖阶段的定型细胞通过抗氧化剂对抗身体的自身免疫和凋亡防卫机制而得以保护。这可解释为什么在乳腺癌组织中抗氧化剂的浓度较高。毫无疑问，终生摄入富含水果和蔬菜的饮食并且各种抗氧化剂水平高可充分且显著降低生命后期的恶性疾病的危险性。
原发性脑部退行性疾病和与小脑血管受损相关的疾病是老年能力丧失的最主要原因。脑功能障碍的结果是失去自我调节、对个人和社会的依赖和社会成本增加。令人难忘的个体平均寿命的延长因老年的智力功能丧失而逊色。因此，预防和治疗导致精神损伤的疾病已成为现代卫生保健体制的主要挑战。如前面的例子中，正对导致慢性疾病、由循环系统或某些神经系统失调而并发的年龄相关性的联合功能改变进行观察。
由于在保持细胞完整性和细胞功能中抗氧化剂的重要性，抗氧化剂(维生素E、胡萝卜素、维生素C)和食物中其它的微量营养素，例如多酚、类黄酮、番茄红素，可降低血管疾病的危险性、保护神经元对抗氧化性压力、从而维持神经元的功能。对年逾中年的人的一些流行病学研究揭示了抗氧化剂与认知行为之间的相互关系。
其它流行病学数据表明，红葡萄酒可降低心脏疾病的死亡率，所谓的“法国论”。对1978-1983年法国东部的34014名男性进行的分析显示，适度摄入葡萄酒(2-5杯葡萄酒)使各种原因的死亡率减少24-31％[Renaud S.C.等，“酒精和法国东部的中年男性的死亡率”，《流行病学》9，184-188，1998]。
虽然已经用单一抗氧化剂化合物进行了许多研究，但从未研究联合给予天然来源的抗氧化剂物质如葡萄、番茄的植物提取物以及维生素C、E、β-胡萝卜素和硒的药理学作用。
以色列专利申请IL 121112(1997/06/19)描述了含番茄红素和维生素E的协同混合物，以及其用于预防LDL氧化的用途。该申请还公开了科学论文中的结果，该论文描述了番茄红素的LDL保护超过了β-胡萝卜素的保护。然而，这种作用仅选择具有高维生素E含量的LDL类，并且当类胡萝卜素与维生素E联合存在时该作用增强[Fuhrman B.；Ben-Yaish L.；Attias J.；HayekT.；Avaram M.，loc.cit.]。
美国专利5,648,377(1997/07/15)涉及番茄红素和葡萄提取物的组合物，提示这种组合物具有协同的抗氧化作用。
发明概述本发明的主题是这一意外发现给予葡萄和番茄的提取物以及维生素C、维生素E、β胡萝卜素和可任意选择的硒的组合物可显著地协同增强对细胞的保护。从上述实验所得到的结果表明，上述物质联合用药所产生的细胞保护在统计学上强于葡萄提取物和番茄红素联合用药的细胞保护(美国专利5,648,377)或维生素E和番茄红素联合用药的细胞保护(以色列专利申请121112)。
本发明因此涉及一种改进的保护细胞不出现因自由基产生过量而致疾病的方法，所述的方法包括给予保护性的或治疗有效量的组合物，该组合物包含协同量的亲脂性抗氧化剂和亲水性抗氧化剂以及任选的可接受的载体，此改进在于所述的亲脂性抗氧化剂是基本上由维生素E、β胡萝卜素和番茄提取物组成的混合物，所述的亲水性抗氧化剂是基本上由维生素C和葡萄提取物组成的混合物。
另一方面，本发明提供一种对疾病患者进行治疗的方法，所述的疾病是由自由基产生过量所致，该方法包括给予治疗有效量的本发明的组合物。
还有一方面，本发明提供一种对患有炎症的患者进行治疗的方法。
另一方面，本发明的方法可适用于对动脉粥样硬化患者进行治疗。
另一方面，本发明提供一种防止患者体内因自由基而产生的诱变活性的方法。
还有一方面，本发明的方法用于对患有肿瘤的患者进行治疗。
发明详述在优选的实施方式中，本发明的方法包括给予维生素E、β胡萝卜素、番茄提取物、维生素C、葡萄提取物和硒化合物。优选的硒化合物为亚硒酸钠或硒酵母。
用于上文或下文的术语“番茄提取物”包括番茄红素的稀释组合物。所述的番茄红素可通过从植物、藻类、真菌或遗传修饰的生物体提取得到，或者通过合成得到。优选直接利用番茄的干皮提取物。
用于上文或下文的术语“葡萄提取物”包括procyandolic寡聚物的稀释组合物。优选直接利用红葡萄种子的提取物。
在另一优选的实施方式中，本发明的方法包括给予(a)5-20份、优选7.5-15份维生素E，尤其是维生素E醋酸酯或维生素E琥珀酸酯；(b)1-15份、优选2-10份β胡罗卜素；(c)1-4份、优选1.5-3份从番茄干皮提取的番茄提取物；(d)2-60份、优选5-50份维生素C，尤其是其钠盐；和(e)1-30份、优选1.1-25份葡萄提取物，尤其是从红葡萄种子中得到的提取物。
优选在药学上可接受的载体存在时给予亲脂性抗氧化剂和亲水性抗氧化剂。适合的赋形剂在Remington《制药科学和实践》(the science and practiceof pharmacy)第19版，EastonMack Publ.，1995中进行了举例说明。
最优选的载体选自天然植物油、完全或部分氢化的植物油、尤其是豆油、全部或部分氢化的豆油、菜籽油、花生油，卵磷脂、尤其是大豆卵磷脂、蛋卵磷脂，植物磷脂、尤其是大豆磷脂，和天然蜡、尤其是蜂蜡。
所述组合物可配制成固体或溶液。固体制剂可用于制备注射用的溶液。优选，本发明的药物组合物以软胶囊或硬胶囊、片剂、包衣片、栓剂或经皮形式给药。根据以下因素对剂量进行调节，例如患者的体重和健康状态、潜在疾病的特性、所使用的化合物的治疗窗(window)、溶解性等。适当调节剂量不超出专业人员的知识范围。
因此，本发明的另一方面是本发明的组合物用于制备治疗疾病的药物组合物的应用，所述疾病至少部分是因为自由基产生过量所致，例如衰老、炎症、动脉粥样硬化或癌症。另外，本发明一个方面是预防和/或治疗炎症、动脉粥样硬化或癌症的方法，包括对患者给予有效量的本发明药物组合物。
本研究的目的在于首先评价在大鼠红细胞中，给予葡萄和番茄的提取物与维生素C、维生素E、和β胡萝卜素的混合物对UVB诱导的损伤的保护作用，以及该混合物各组分之间存在的相互协同作用，然后评价在角化细胞系中硒增强内源酶性抗氧化防卫的能力。
具体是已进行了下列研究a)葡萄提取物、番茄提取物、维生素C、维生素E和β胡萝卜素的组合物，此后本文中叫做“活性成分的组合物”，在预防由大剂量UVB(1.5-7.0J/cm2)诱导的溶血时的剂量依赖式能力；b)亲脂性抗氧化剂的混合物(番茄提取物、β胡萝卜素+维生素E醋酸酯)抑制红细胞膜中的溶血和脂过氧化反应的剂量依赖式能力；
c)亲水性抗氧化剂的混合物(葡萄提取物和维生素C)抑制红细胞膜中的溶血和脂过氧化反应的剂量依赖式能力；d)通过联合使用上述亲脂性抗氧化剂和亲水性抗氧化剂对红细胞膜中的溶血和脂过氧化反应的保护作用；e)硒酵母在细胞系统(角化细胞)中释放硒的能力谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性的诱导和对物理的(UVB)或化学的(氢过氧化枯烯)细胞毒制剂所诱导的氧化压力的细胞学抗性。
图1表示活性成分的组合物对UVB诱导的溶血的剂量依赖性保护作用(实施例1)图2表示活性成分的组合物的亲脂性组分对UVB诱导的溶血的剂量依赖性保护作用(实施例2)图3表示活性成分的组合物的亲水性组分对UVB诱导的溶血的剂量依赖性保护作用(实施例2)图4表示UVB诱导的溶血活性成分的组合物的亲脂性组分和亲水性组分之间的相互协同抗氧化剂作用(实施例3)图5表示活性成分的组合物对120分钟照射所诱导的RBC溶血的保护作用(实施例3)图6表示添加硒酵母和亚硒酸钠对角化细胞成活力的影响(实施例4)图7表示添加硒酵母和亚硒酸钠对角化细胞谷胱甘肽过氧化酶活性的作用(实施例5)图8表示添加硒酵母和亚硒酸钠对暴露于UVB照射(50mJ/cm2)的角化细胞中谷胱甘肽过氧化酶活性的作用(实施例5)图9表示添加硒酵母和亚硒酸钠对氢过氧化枯烯(CuOOH)诱导的细胞死亡的作用(实施例6)图10表示添加硒酵母和亚硒酸钠对氢过氧化枯烯(CuOOH)诱导的细胞内氧化压力(DCF形成)的作用(实施例7)在图7-10中使用了下列缩写酵母(L) 硒酵母(3.95μg/ml)50nM Se
酵母(H) 硒酵母(39.5μg/ml)500nM Se亚硒酸盐(L) Na2SeO350nM亚硒酸盐(H) Na2SeO3500nM本领域技术人员知道，虽然在下列实施例中叙述了特殊的试剂和反应条件，但可以进行改进，此改进应包含在本发明范围内。因此，下列实施例是为了进一步对本发明进行举例说明、而不是限定本发明。
实施例材料和方法化学制剂所使用有机溶剂为分析级(Carlo Erba，米兰，意大利)。活性成分(葡萄提取物、番茄提取物、β-胡萝卜素、番茄红素、d，1-α生育酚醋酸酯、抗坏血酸、硒酵母)由瑞士的Pharmaton SA，CH 6934 Bioggio供应。氢过氧化枯烯(CuOOH)、硫代巴比妥酸(TBA)、EDTA、亚硒酸钠(Na2SeO3)、叠氮钠(NaN3)、丙酮酸钠、2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、DMEM(Dulbecco改进型Eagle培养基)、不含酚红的DMEM、L-谷氨酰胺、青霉素链霉素溶液从Sigma(Trimital，米兰，意大利)购得；胎牛血清和磷酸盐缓冲液(PBS)购自Hyclone(Belbio，米兰，意大利)；H202(30％v/v)购自Fluka(Trimital，米兰，意大利)；NADH、NADPH、GSH和GSH-还原酶购自Boehringer Mannheim Italy(米兰，意大利)。
装置在与计算机相连的Perkin Elmer Lambda 16分光光度计以及与计算机相连的Perkin Elmer LS50B发光分光计(Perkin Elmer，Monza，Italy)上进行分光光度测定和荧光测定。
红细胞(RBC)的UVB照射将雄性Wistar大鼠(Charles River，Calco，Italy)的红细胞从白细胞和血小板分离并洗涤，悬浮在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水[125mM NaCl和10mM磷酸钠缓冲液(PBS)]中，在4℃贮存，4天内使用。为了实验，从贮备液中取出等分红细胞悬浮液、以1000×g离心5分钟、并用PBS将0.1ml沉淀稀释至50ml，得到1％红细胞悬浮液(约15×107细胞/ml)。将50ml等分RBC悬浮液置于能透过波长大于290nm的激发光的Pyrex玻璃皿(直径14cm)中、并以不同的时间间隔接受UBV照射。在RBC悬浮液中加入抑制剂、于37℃预培养30分钟。在平行的两个Philips TL20W/12荧光管(Saras.r.l.，Castellanza，Italy)中进行UVB照射，该荧光管发射280-320nm的连续光谱、且峰发射在312nm。经Vilber Lourmat VLX-3W放射计(UVB探针，312nm)测定，在细胞照射点(距UVB源25cm)的流量率为0.85mW/cm2、所使用的UVB剂量范围为1.5-7.0J/cm2(暴露时间30-150分钟)。
UVB-诱导的溶血照射后，用缓冲盐水将2ml等分RBC悬浮液按1∶5稀释，在710nm每隔30分钟对溶血进行浊度测定，共180分钟。测定溶血百分比、设为100％溶血，RBC悬浮液在50％功率下超声处理5秒，测定溶液的吸光值。5次测定的平均值用于计算。
角化细胞将NCTC 2544人角化细胞系(Flow实验室，Irvine，UK)于37℃在添加有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和抗生素(100 U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)的DMEM中进行培养。使培养物维持在37℃的5％CO2的潮湿空气中。为了实验，在5×104/cm2的密度下接种该细胞、并在2cm2细胞塑料培养皿中培养、直至80-90％汇合。通过台盼蓝排除试验和通过测定LDH泄漏来测定细胞成活力。采用改进的Lowry方法、以牛血清白蛋白为标准进行蛋白质测定。
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性用亚硒酸钠(50,500nM)或硒酵母(3.95或39.5μg/ml、与50和500nMSe相对应)处理成熟细胞并培养至90％汇合(48h)。照射前，用预加温的PBS洗涤单层细胞三次、并在PBS存在下暴露于UVB(50mJ/cm2)。照射后，用不含血清-酚红的DMEM(K-DMEM)代替PBS，培养24小时(使安慰剂对照细胞进行不暴露于UV的同样过程)。去除培养基、将细胞轻轻刮入1ml 50mM Tris-HCl缓冲液中、超声破碎。通过以下方法分析细胞悬浮液(0.1ml等份)的GPX活性，即在恒温(37℃)分光光度计中监测340nm时的吸光率减少、以确定NADPH的消失速率。用6.22×103cm-1m-1的NADPH摩尔消光系数计算GPX活性，表示为mU/mg蛋白质，其中将1U酶活性定义为37℃时每分钟所消耗的底物或所产生的产物的μmol数。
CUOOH诱导的氧化压力通过使用氧化敏感性荧光探针DCF来测定细胞成活力和过氧化物含量，从而确定CuOOH诱导的细胞内的氧化压力和硒酵母产生的保护作用。用亚硒酸钠(50,500nM)或硒酵母(3.95或39.5μg/ml、与50和500nM Se相对应)处理成熟细胞并培养至90％汇合(48h)。制备DCFH-DA(3.34mM)在乙醇中的贮备溶液、用氮净化、并按500μl等份在-20℃贮藏。用预加温的PBS洗涤细胞单层、并于37℃与10μM DCFH-DA的PBS溶液培养30分钟。然后去除培养基、并用预加温的PBS洗涤单层细胞三次以去除未掺入的DCFH-DA、然后用含0.5mM CuOOH的K-DMEM培养。对安慰剂对照细胞进行没有CuOOH暴露的同样过程。培养24小时后，去掉培养基、将细胞轻轻刮入3ml PBS中。然后将该细胞悬浮液转移至装有磁力搅拌器的1ml恒温荧光小玻璃管(25℃)中、并记录探针(λexs 502nm；λem 520nm；带宽5nm)的荧光强度的增加。所有观察时间点的荧光强度值与蛋白质含量相关(6次测定的平均值±S.D.)、且表示为相对于对照(安慰剂对照细胞)的荧光增加％。
统计学分析将结果表示为5次单独测定的平均值±S.D.。数据通过一步式(one-way)方差分析(ANOVA)进行分析、然后采用Tukey检验分析组间的统计学显著性，用Student t检验(双侧)分析不配对样本。当p＜0.05时认为差异有显著性。采用Prism软件包(GraphPad软件公司，San Diego CA，USA)进行统计学分析。
实施例1作为细胞模型的红细胞活性成分组合物的保护作用大鼠RBC暴露于不断增加剂量的UVB，产生图1所述的典型溶血曲线溶血过程从照射60分钟开始、此时与约3J/cm2(8.5±3.2％)的UVB剂量相应，在90分钟(87.2±6.3％)-120分钟(98.7±4.4％)达到稳定。通过与PBS混合制备活性成分组合物的样品并涡旋；将所得到的均匀悬浮液在PBS中进一步稀释以使最终浓度为0.1-10μg/ml。当在活性成分组合物存在下在氧气条件下培养未经照射的RBC时、3小时内未见显著的溶血。照射前将活性成分的组合物加入到RBC悬浮液中，明显地以剂量依赖方式保护RBC不产生UVB-诱导的溶血(图1)，最小的有效浓度为0.1μg/ml。5μg/ml时溶血过程延迟了30分钟，照射120分钟后，溶血百分比仅为34.5±5.5％，最大浓度(10μg/ml)时、RBC保持完整直至UVB照射150分钟(7J/cm2)。120分钟时计算的IC50值为4μg/ml。
实施例2亲脂性抗氧化剂和亲水性抗氧化剂组合物的保护作用为了更好地理解活性成分组合物对UVB-诱导的溶血的保护作用，我们研究了亲脂性抗氧化剂(维生素E醋酸酯+β胡萝卜素+番茄提取物)和亲水性抗氧化剂(维生素C+葡萄提取物)的组合物的自由基捕获能力。
在THF中在N2条件下制备维生素E醋酸酯、β胡萝卜素和番茄提取物的贮备溶液，用红光防止自我氧化，并贮藏在-20℃达1周。每天用UV光谱检测每一抗氧化剂的稳定性。为了保持活性成分组合物中的抗氧化剂之间的相同配给量，通过用THF稀释来制备7.04mg/ml维生素E醋酸酯、1.64mg/ml β胡萝卜素和与0.88mg/ml番茄红素相应的番茄提取物的混合贮备溶液。制备连续稀释液得到混合的亲脂性抗氧化剂工作溶液、最终浓度占RBC悬浮液的1.2、2.4、4.8、9.6μg/ml(全部亲脂性抗氧化剂)。在所有实验中，THF浓度始终为0.1％(v/v)。
亲水性抗氧化剂采用同样的方法制备维生素C(6.72mg/ml)和葡萄提取物(2.8mg/ml)在PBS中的混合贮备溶液，制备连续稀释液得到混合的亲水性抗氧化剂工作溶液、最终浓度占RBC悬浮液的0.58、1.16、2.32、4.64、9.28μg/ml(全部亲水性抗氧化剂)。
如图2和3所示，活性成分组合物的亲脂性部分和亲水性部分都能以剂量依赖的方式防止UVB-诱导的溶血，但力度不同。亲水性混合物的活性较强主要是由于有葡萄提取物，已证实，在不同体外实验模型中，它在整个再循环过程(氢传递反应)中，是有效的断链抗氧化剂(Maffei Facino R.；Carini M.；Aldini G.；Bombardelli E.；Morazzoni P.；Morelli R.；从葡萄中得到的葡花色素(Procyanidines)的自由基捕获作用和抗酶活性---其毛细管保护作用的机制；Arzneim.Forsch.《药物研究》，44，592-601，1994)、并减少UVB诱导的内源性维生素E消耗。
实施例3组合物中亲脂性抗氧化剂和亲水性抗氧化剂之间的协同抗氧化作用使用在照射120分钟时产生约20-30％抑制的每一混合工作溶液的以下浓度，来研究组合物中亲脂性抗氧化剂和亲水性抗氧化剂之间的协同抗氧化作用2.4μg/ml亲脂性抗氧化剂(维生素E醋酸酯1.76μg/ml，β胡萝卜素0.41μg/ml，番茄红素0.22μg/ml)和0.58μg/ml亲水性抗氧化剂(维生素C0.4μg/ml，葡萄提取物0.18μg/ml)。结果如图4和5所示。在这些条件下，两种混合物的溶血速率相似，亲水性溶液活性稍强于亲脂性溶液(120分钟时20％对比14％抑制)。当混合抗氧化剂时，溶血速率显著减慢、RBC的完整性保持达90分钟。在120分钟时，抑制百分比(55±2.5％)远低于用单个抗氧化剂混合物的抑制总百分比(计算值33.8％)，表明具有协同作用。亲水/亲脂性抗氧化剂(葡萄提取物+番茄红素)的典型混合物所产生的保护作用与亲水成分的混合物的保护作用没有明显不同(图5)；相反，维生素E(1.76μg/ml)和番茄红素(0.22μg/ml)结合产生显著低于亲脂性成分混合所得到的溶血抑制百分比(7.1％比14％)(图5)。
实施例4添加硒酵母对细胞生长和细胞成活力的作用在培养的角化细胞中，亚硒酸钠或硒酵母没有明显的刺激生长活性。在50和500nM Se剂量时，细胞的成活力、确定的LDH泄漏(图6)总是在95％以上，与安慰剂对照细胞没有显著不同。
实施例5添加硒酵母对GSH-PX活性的作用图7表示对照细胞中添加硒酵母或亚硒酸钠(等摩尔Se剂量)的作用在50nM时发现亚硒酸钠对GSH PX活性有最大的诱导作用(与对照相比增加3.365倍；91.44±10.37对28.31±5.87mU/mg蛋白质)，500nM浓度时未观察到进一步增加。在较低浓度时硒酵母对GSH-PX的诱导效力弱(增加2.44倍；63.05±5.51mU/mg蛋白质)，但在浓度为39.5μg/ml(与500nM Se相当)时酶活性的增加与等摩尔量的亚硒酸钠所得到的相当(90.11±10.35mU/mg蛋白质)。这些结果清楚地表明，硒酵母以剂量依赖方式释放用于酶激活的硒。
在暴露于UVB照射(50mJ/cm2)的角化细胞中还检测了GSH-PX活性，与对照细胞相比、硒酵母或亚硒酸钠对酶的诱导程度显著增强(图8)，因此表明在氧化剂失调情况下、硒仍然有活性。
实施例6添加硒酵母对CuOOH诱导的细胞死亡的作用氢过氧化枯烯是自由基反应的强效促进剂，暴露2小时后，用500μMCuOOH培养的角化细胞有80％以上的细胞死亡(图9)。在添加硒酵母的细胞中，细胞死亡显著地以剂量依赖的方式减少，最低剂量(3.95μg/ml)时细胞成活力为64±1.3％、与最高Se剂量(39.5μg/ml≈500nM Se)时的对照细胞(90±1.2％)无显著差异。50nM亚硒酸钠所产生的保护作用稍强，因为细胞成活力几乎完全恢复。
实施例7添加硒酵母对细胞内CuOOH-诱导的氧化压力的作用通过灵敏型荧光DCF测定法测定细胞内的氧化状态。该测定是根据非极性的、非荧光DCFH-DA穿过细胞膜的扩散能力和被胞质酯酶去乙酰化形成极性的非荧光二氯二氢荧光素(DCFH)的能力。后者被吸收(trapped)在细胞溶质中，其通过与CuOOH产生的反应性氧物质反应，形成荧光衍生物二氯荧光素(DCF)。
用500μM CuOOH培养的角化细胞，产生显著的DCF蓄积(24小时后最高；增加7倍以上)，证实在胞质空间中的氧化爆发物的扩散(图10)。用硒酵母对细胞预处理可阻碍氧化损伤，因为在较低剂量(3.95μg/ml)观察到DCF的形成减少60％、而在39.5μg/ml(550nM Se)时几乎完全保护。亚硒酸钠早已在最低剂量(50nM)时就完全阻止DCF形成。
这些实施例的结果表明，正是亲脂性抗氧化剂和亲水性抗氧化剂之间的联合使用(即本发明的主题)提供了最佳的对抗UVB氧化问题的细胞保护。换言之，在抗氧化剂中存在一种协同的相互作用、它说明了由活性成分组合物所获得的高度保护。
由于在脂类和细胞含水空间都产生自由基和反应性氧物质(ROS)，因此可分配在脂类和含水环境中的活性成分组合物中的抗氧化剂防卫系统(即本发明的主题)极适于细胞保护。
权利要求
1.一种改进的保护细胞不出现因自由基产生过量而致疾病的方法，所述的方法包括给予保护性的或治疗有效量的组合物，该组合物包含协同量的亲脂性抗氧化剂和亲水性抗氧化剂以及任选的可接受的载体，此改进在于，所述的亲脂性抗氧化剂是基本上由维生素E、β胡萝卜素和番茄提取物组成的混合物，所述的亲水性抗氧化剂是基本上由维生素C和葡萄提取物组成的混合物。
2.根据权利要求1的方法，其中组合物还包括硒。
3.根据权利要求1的方法，其中亲脂性抗氧化剂包括(f)5-20份维生素E；(g)1-15份β胡罗卜素；和(h)1-4份番茄红素，为番茄提取物的形式。
4.根据权利要求1的方法，其中亲水性抗氧化剂包括(i)2-60份维生素C；和(j)1-30份葡萄提取物。
5.根据权利要求1的方法，其中亲脂性抗氧化剂包括维生素E醋酸酯或维生素E琥珀酸酯。
6.根据权利要求1的方法，其中亲水性抗氧化剂包括维生素C的钠盐。
7.根据权利要求2的方法，其中该组合物包括亚硒酸钠或硒酵母。
8.根据权利要求1的方法，其中所述的载体选自天然植物油、全部或部分氢化的植物油、卵磷脂、植物磷脂和天然蜡。
9.根据权利要求8的方法，其中所述的载体选自豆油、全部或部分氢化的豆油、菜籽油、花生油、大豆卵磷脂、大豆磷脂、蛋卵磷脂和蜂蜡。
10.根据权利要求1的方法，其中该组合物是以软胶囊或硬胶囊、片剂、包衣片、栓剂或经皮形式给药。
11.一种改进的防止主体患病的方法或对患有某一疾病的主体进行治疗的方法，所述的疾病是由自由基产生过量所致，该方法包括给予保护性的或治疗有效量的组合物，该组合物包含协同量的亲脂性抗氧化剂和亲水性抗氧化剂以及任选的可接受的载体，此改进在于，所述的亲脂性抗氧化剂是基本上由维生素E、β胡罗卜素和番茄提取物组成的混合物，所述的亲水性抗氧化剂是基本上由维生素C和葡萄提取物组成的混合物。
12.根据权利要求11的方法，其中所述的主体具有至少部分与自由基产生过量有关的病理变化，如衰老、炎症、动脉粥样硬化或癌症。
全文摘要
本发明涉及一种增强细胞保护的方法，该方法包括给予植物葡萄和番茄的提取物以及维生素C、E、β胡萝卜素和可选择的硒的组合物。所述的组合物可用于预防部分与自由基产生过量有关的病理变化如衰老、动脉粥样硬化和癌症。
文档编号A61K36/55GK1450905SQ01810075
公开日2003年10月22日 申请日期2001年5月22日 优先权日2000年5月25日
发明者费比奥·索尔达蒂 申请人:法马顿股份有限公司