专利名称：制备病原体灭活的低免疫原性红细胞溶液的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于降低与个体间输送细胞成分相关的风险的组合物和方法，具体地说是涉及降低因输血过程中免疫应答所致并发症的风险，以及涉及降低输血期间传染病风险的组合物和方法。本发明主要涉及在输送红细胞成分过程中降低免疫反应风险以及疾病传播的风险。
背景技术：
在处理贫血症、创伤、手术失血和某些遗传病症病人的过程中，输血是一种必要的措施。接受红细胞输血的病人要冒以下风险溶血性输血反应、发烧、非溶血性输血反应、输血相关的急性肺损伤、异源免疫(alloimmunization)、移植物抗宿主病，以及血液制品可能存在的病毒和细菌所致的传染。
溶血性输血反应可能是由于受血者抗体与供血者红细胞中抗原的反应所致，这常常是因为在输血中人为错误地使用了不匹配的红细胞。占输血反应90％的发烧、非溶血性输血反应，是由受血者抗体与供血者白细胞中的抗原反应所致。据信，输血相关的肺损伤是由于供血者红细胞中白细胞抗体导致受血者白细胞的凝集而引起的。
对需要长期红细胞输血的病人来说，异源免疫是其所面临的最大风险，异源免疫是由于病人对红细胞中的次要(minor)群抗原形成了抗体，它在后来的输血中会引起反应(异源致敏(allosensitization))。当供血者白细胞移入受血者体内并增殖，进而反应对抗宿主组织抗原时，会发生移植物抗宿主病。
应采取精细的识别和检验体系，以确保输入正确匹配的红细胞。然而，由于人的工作效率是该体系运行的一个因素，错误难免发生。有关纽约州的输血错误报道表明，33,000单位中1例ABO不相容性输血导致3起死亡事故[Linden等，Transfusion 32601(1992)]。在英国也有类似的错误率报道[McClelland等，BMJ 3081205(1994)]。
对血液进行适当的实验处理可以排除配血的必要，所述处理包括经酶去除端基糖抗原，将A或B型红细胞转变成O型红细胞[Lenny等，Transfusion 34209(1994)，Lenny等，Biotechnology of blood，Goldstein，J.(编辑)，75-100页(1991)]。可能将红细胞输给同种免疫性病人的另一方法，是通过将可变形的长链亲水性分子例如聚乙二醇结合到红细胞表面上而掩蔽(mask)红细胞抗原，形成基本上非免疫原性的红细胞[Scott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 947566(1997)，PCT公开99/16318]。但是，并不知道上述处理对发烧、非溶血性输血反应、输血相关的肺损伤和移植物抗宿主病的作用。然而，通过对红细胞制品进行白细胞过滤(leukofiltration)，可以降低这3个反应的风险。
输入病毒(例如HIV，肝炎)或细菌(例如小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica))污染的血液是主要的问题。红细胞于4℃贮藏时，很少发生细菌污染现象，喜欢在寒冷条件下生长的细菌(嗜冷细菌，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，是与红细胞输血后细菌性脓毒症相关的最常见污染物[Gottlieb，Anaesth.Intens.Care 2120(1993)]。为了降低细菌所致的发病率，需要在输血制品中加入某些物质，因为受血者的免疫系统存在着以补体为基础和以吞噬作用为基础的防御机制。这些机制取决于细菌的免疫原性、受血者的体质以及血液制品的特性(例如，高或低血浆水平，白细胞过滤等)。细菌性脓毒症部分地是由于细菌释放的内毒素所致。嗜冷细菌在4℃生长缓慢，但贮存1-3周即可产生足以引起严重输血反应的细菌或内毒素。
对血液制品进行病原体灭活是一种改善输血安全性的重要手段。进行病毒(例如乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)和人免疫缺陷病毒(HIV))筛查是常规的，检验并不能100％检测出被传染血液制品，人为错误导致的输入被传染血液制品的可能性与AB0不匹配输血相似。另外，未知的病原体会因无法检测而被引入血液供应品，例如HIV在能被识别和检验之前就会出现这种情况。目前并没有检验血液中的其他病原体例如细菌或原生动物。寄生虫例如克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、微小巴贝虫(Babesia microti)和杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)，会通过输血传染。克氏锥虫是中美洲和南美洲的地方流行病。微小巴贝虫美国的地方流行病，尤其是在研究这种寄生虫的实验室周围区域可发现传染。在美国，由于没有针对这些原生动物的检验方法，唯一的保护手段是对供血者进行筛查。
上述提到的用于掩蔽红细胞抗原的PEG化(pegylation)方法，可能是灭活某些病原体的有效方法。PCT公开99/00145论述了通过聚乙二醇修饰来灭活病毒颗粒。但是，尚不清楚这些抗原掩蔽方法将会对其他病原体例如细菌或原生动物产生何种影响。具体地说，并未教导抗原掩蔽方法对红细胞中存在的细菌的作用。有可能细菌表面上的反应基团也被聚乙二醇修饰了，形成了免疫原性较低的细菌(即不再引起宿主免疫系统的注意)。但是尚不知这种细菌是否还能分裂，事实上，如果这种被修饰的细菌能生长，则可推测在经过充分的分裂而淡化聚乙二醇修饰作用之前，其后代也应具有较低的免疫原性并且不会再被宿主免疫系统所发现。经过充分分裂后，细菌可能达到一定的水平，即不再受宿主免疫系统的控制，或者这些细菌的分裂已产生足以引起感染性休克的内毒素。与未修饰的细菌相比，该方案所形成的“鞘细菌”可能带来更大的风险。这表明对该系统中病原体进行灭活的需要超出了对已存在的病原体进行灭活的需要。
已有几种灭活红细胞中病原体的方法。已证实可以使用酞菁或噻嗪染料和可见光[US5,232,844和5,827,644，其公开内容在此引入作为参考]。PCT公开96/39818和98/30545(分别对应于US171,177B1和6,093,725)，描述了含有可与核酸反应的核酸结合配体和基团的化合物的用途，其公开内容在此引入作为参考。PCT公开97/07674和US6,136,586和6,093,564描述了聚阴离子选择性吖丙啶化合物，其公开内容在此引入作为参考。这些方法有一定的缺点，即可能会因与细胞膜和血浆成分间的副反应而形成新抗原。这种风险或许很小，但是重复使用这种病原体灭活的制品可导致异源致敏。
人们一直在寻求低疾病传播风险和非免疫原性血液代用品[Ketcham等，Annals of Emergency Medicine 333326-337页(1999)]。虽然上述方法证实各种红细胞组合物处理手段对血液制品没有不良影响，但是对于大多数应用中所用的血液代用品而言，能提供被传染风险及免疫原性均显著降低的全功能红细胞制品的方法才是有益、独特和更可取的。与大多数其他血液代用品相比，经这种方法处理后的红细胞应具有更佳的氧转运性能和更长的体内存活时间。这种红细胞制品尤其适于同种免疫性病人和在没时间进行交叉配血的情况下使用。
发明简述本发明涉及适于体内使用的含红细胞的组合物，所述红细胞的被传染性和免疫原性均显著降低。本发明的一个优选实施方案涉及包括被怀疑含有病原体的红细胞组合物，所述红细胞组合物经处理后其中的病原体基本上被灭活，这样就显著地降低被传染的风险，并且其中的红细胞抗原也基本上被掩蔽，因此与输入未处理的红细胞组合物产生的免疫反应相比，将处理后的红细胞输给抗原不匹配的个体时，可降低免疫反应，所述经处理的红细胞组合物适于体内使用。另外，本发明涉及生产此类红细胞组合物的方法，其中污染性病原体已基本上被灭活，因此红细胞组合物被传染的风险显著降低，并且其中的红细胞抗原也基本上被掩蔽，这样就适当地降低了与这类抗原免疫应答相关的输血反应风险。
本发明还涉及生产上述红细胞组合物的方法。在一个优选实施方案中，所述方法包括以下步骤1)处理细胞组合物，使红细胞组合物中可能存在的病原体基本上被灭活，和2)接着处理红细胞组合物，以基本上掩蔽抗原，使红细胞组合物的免疫原性显著降低，所得的处理后红细胞组合物可保持其预期功能(例如用于输血)。在另一实施方案中，操作可按步骤1至步骤2进行，而不用对试样进行另外处理(即无需稀释、冲洗、加入缓冲液等)。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低处理过程中不想要的试剂或这些试剂的副产物水平，或者降低该方法中产生的不想要的副产物水平。
在另一实施方案中，所述方法包括以下步骤1)处理红细胞组合物，以基本上掩蔽抗原，使红细胞组合物的免疫原性显著降低，和2)接着处理红细胞组合物，使红细胞组合物中可能存在的病原体基本上被灭活，所得的处理后红细胞组合物可保持其预期功能(例如用于输血)。在另一实施方案中，操作可按步骤1至步骤2进行，而不用对试样进行另外处理(即无需稀释、冲洗、加入缓冲液等)。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低处理过程中不想要的试剂或这些试剂的副产物水平，或者降低该方法中产生的不想要的副产物水平。
在另一实施方案中，所述方法包括对红细胞组合物进行处理以基本上掩蔽抗原，使红细胞组合物的免疫原性显著降低，同时对红细胞组合物进行处理使红细胞组合物中可能存在的病原体基本上被灭活，这样处理后红细胞组合物可保持其预期功能(例如用于输血)。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低处理过程中不想要的试剂的水平或这些试剂的副产物，或者降低该方法中产生的不想要的副产物水平。
在另一实施方案中，本发明涉及对被怀疑含有病原体的红细胞组合物进行离体处理的方法，即在可使病原体基本上灭活的条件下，以任何顺序，将红细胞组合物与能灭活病原体的化合物接触，和将红细胞组合物与另一化合物接触，所述化合物能结合到红细胞上并基本上掩蔽红细胞抗原以显著降低红细胞的免疫原性，与未处理的红细胞组合物产生免疫反应相比，上述经处理的红细胞组合物输给抗原不匹配的动物时，可降低免疫反应，其中所得的红细胞组合物适于体内使用。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低处理过程中不想要的试剂的水平或这些试剂的副产物，或者降低该方法中产生的不想要的副产物水平。
附图描述附
图1是经MPEG修饰的红细胞的总体最大荧光示意图(流式细胞分析仪测得)。
最佳实施方式本发明涉及包含红细胞的新组合物，该组合物显著降低了被传染的风险，并且其免疫原性显著降低，所述组合物适于体内使用(例如用于输血)。本发明还涉及体外或离体处理包含所述红细胞组合物的方法，该方法所得的含有处理后红细胞的组合物适于体内使用，其被传染的风险和免疫原性均显著降低，并保持了其功能。按照本发明，第一种化合物具有可与核酸反应的核酸结合配体和基团，它可选择性地用于处理可能被含核酸的有机体(包括致病病毒、细菌和寄生虫)污染的红细胞组合物，而第二种化合物包括具有适宜反应性偶合基团的非免疫原性基团，它可选择性地用来共价结合于红细胞的表面而掩蔽红细胞抗原，形成免疫原性显著降低的红细胞组合物。在一些实施方案中，淬灭剂可有效地与过量的本发明病原体灭活化合物和反应性抗原掩蔽化合物反应。另外，本发明还涉及除去任何过量化合物的方法，这些过量化合物例如是与淬灭剂化合物反应的过量产物、处理过程中的副产物和过量淬灭剂。
“含有核酸的病原体”定义为包含核酸为遗传物质的能导致人、其他哺乳动物或脊椎动物产生疾病的任何物质。其示例包括微生物例如单细胞或多细胞微生物。示例性病原体为能导致人、其他哺乳动物或脊椎动物产生疾病的细菌、病毒、原虫、真菌、酵母菌、霉和支原体属。病原体的遗传物质可以是DNA和/或RNA，并且遗传物质可以呈单链或双链核酸及其混合物形式。病原体的核酸可以处于溶液中、细胞内、胞外或与细胞结合。
“病原体的灭活”定义为使材料中的病原体不能繁殖。以剩余的能繁殖病原体分数的负对数表示灭活。例如，如果某一浓度的化合物可使材料中90％的病原体不能繁殖，则还有10％或1/10(0.1)的病原体仍保持繁殖能力。0.1的负对数为1，则该浓度的化合物灭活了1log的病原体，即该浓度的化合物具有1log杀死力。log灭活也可看作对照样品中病原体滴度与经处理试样中病原体滴度的比较值，即以对照品滴度与灭活后剩余滴度之比的log值表示“log灭活”。例如，如果测得对照品的滴度为107(即溶液经107稀释后未检测到病原体，而经106稀释后检测到病原体)，和经处理样品的滴度为102(即溶液经102稀释后未检测到病原体，而经101稀释后检测到病原体)，则所得的灭活水平为5log。
“材料或化合物的体内使用”定义为将所述材料或化合物引入活的个体。例如，将血液制品输血给需要输血的个体。即可认为是体内使用血液制品。在此定义的个体是脊椎动物，优选为哺乳动物，包括家养动物、运动(sport)动物、和灵长类包括人。
“材料或化合物的体外使用”定义为在活的个体体外使用所述材料或化合物，其中典型地是不将材料或化合物输给活的个体。“化合物的离体使用”定义为采用化合物在活的个体体外处理生物材料，其中所处理的生物材料打算用于活的个体体内。例如，取人血，然后向其中引入化合物对病原体进行灭活，如果经处理的血液重新输给个体或输给他人，则上述操作可定义为化合物的离体使用。将血液重新输给个体或输给他人属于血液的体内使用，而对于化合物而言则适于离体使用。如果重新输给人的血液仍含有该化合物，则该化合物除了其离体使用外，还包括其体内使用。
如果本发明组合物的某些体外和体内性能与未经本发明方法处理的样品的性能相似，则认为该组合物保持了其原有功能。另外，本发明组合物还必须满足某些血库标准。组合物还必须表现出较低毒性水平以适于体内使用，毒性的测定可采用例如基因毒性、动物研究和Ames诱变性试验。
本发明涉及对红细胞的抗原掩蔽或免疫掩蔽。红细胞的表面包括几种可引起免疫应答的抗原决定簇。例如，红细胞输血受血者的免疫系统会将某些输入红细胞上的抗原识别为异物，并对红细胞产生免疫应答。对这些抗原的掩蔽包括修饰或隐藏这些抗原，这样它们就不再受影响或被受血者的免疫系统识别。可将某些化合物连接到红细胞表面上，这样化合物就隐藏或掩蔽了红细胞表面上的抗原。另外，这些可连接到红细胞表面上的化合物具有不易被免疫系统识别的结构，即这些化合物是非免疫原性或非抗原性的。通过这种方式掩蔽抗原，输入的红细胞不再引发受血者的免疫应答。与未处理的红细胞比较，如果经处理的红细胞对抗体(可结合特定红细胞抗原)的反应性显著降低，则可认为该红细胞的抗原基本上被掩蔽。采用体外抗体结合分析或体外测定对红细胞的修饰量，即可容易地测知这种降低的免疫原性。
本发明还涉及被怀疑含有病原体(例如细菌或寄生虫)红细胞。在掩蔽红细胞抗原的过程中，也可能掩蔽细菌或寄生虫上的抗原。这些抗原对个体免疫系统识别并消除这种病原体而言是重要的。在这些条件下，经掩蔽红细胞抗原处理的红细胞组合物输给个体可导致污染，因为这些细菌或寄生虫不能被个体的免疫系统所识别。就细菌而言，如果个体不对细菌产生免疫应答，该细菌会产生内毒素或接着进入个体的血流并达到对个体健康造成极大危险的水平，与未经掩蔽抗原处理的红细胞组合物相比，其被细菌传染的风险增大。就寄生虫而言，取决于其所处的生命周期，掩蔽抗原可能对个体的免疫系统隐藏了寄生虫，与未经掩蔽抗原处理的寄生虫相比，隐藏的寄生虫将导致更大的健康风险。
“淬灭剂”在此是指能与本发明病原体灭活化合物和/或反应性免疫掩蔽化合物反应的化合物。本发明病原体灭活化合物靶向于病原体的核酸。当该反应有利时，也可能发生其他不想要的反应。淬灭剂的目的是为病原体灭活化合物提供另一途径(即优先于不想要的副反应)，这样大多数病原体灭活化合物就可与预期的核酸靶或者淬灭剂反应。在另一实施方案中，当化合物与预期靶进行了充分的反应后，淬灭剂可用来与过量的任何材料(无论是病原体灭活化合物还是反应免疫掩蔽化合物)反应。
在此所用的化合物降低(reduction)设备是指用于除去不想要的化合物的设备，所述不想要的化合物例如未反应的病原体灭活或抗原掩蔽化合物或者病原体灭活和抗原掩蔽方法的副产物，例如化合物与淬灭剂或内源性材料反应的产物。这类降低设备包括置于适宜基质中的吸附材料，其中吸附剂选自可与不想要的化合物结合的物质，所述吸附剂不与保持红细胞适当功能所需的必要成分结合。
在此所用的烷基是指包含碳和氢的环状、支链或直链化学基团，例如甲基、戊基和金刚烷基。烷基基团是未取代的或者被一种或更多取代基取代，所述取代基例如卤素、烷氧基，酰氧基，氨基，羟基，硫醇，羧基，苄氧基，苯基，苄基或其他官能团。烷基基团在其一个或几个位置可以是饱和或不饱和(例如，包含-C＝C-或C≡C-亚基)。除非另有所指，烷基基团通常包括1-12个碳原子，优选为1-10个碳原子，和更优选为1-8个碳原子。
在此所用的杂烷基是指链中引入一或更多杂原子的烷基链。杂原子包括N、O、S和P。杂原子也包括杂原子N、S和P的氧化形式。示例性杂烷基基团包括(但不限于)甲氧基，乙氧基和其他烷氧基基团；包含醚的基团；包含酰胺的基团，例如多肽链；环系，例如哌啶基、内酰胺和内酯；和可将杂原子引入链碳之中的其他基团。除非另有所指，除了含有杂原子以外，杂烷基典型地包括1-12个碳原子、优选为1-10个碳原子和更优选为1-8个碳原子。
芳基或Ar是指具有单环(例如，苯基)或多个稠环(例如，萘基或蒽基)的不饱和芳族碳环基团，它可任选取代或未取代的，取代基例如氨基、羟基、烷基(例如C1-8烷基)、烷氧基、卤素、硫醇和其他取代基。
杂芳基基团是具有单环(例如，吡啶基或呋喃基)或多个稠环(例如，吖啶基、吲哚基或苯并噻吩基)的不饱和芳族碳环基团，并且在其至少一个环中至少具有一个杂原子(例如N、O、或S)。所述环任选为取代或未取代的，取代基例如氨基、羟基、烷基、烷氧基、卤素、硫醇、酰氧基、羧基、苄氧基、苯基、苄基和其他取代基。I.用于灭活红细胞组合物中病原体的化合物本发明涉及用化合物处理包含红细胞的组合物，所述化合物能灭活该组合物中的病原体，所述红细胞的血细胞比容约为1％-65％或更高。理想的化合物应在几分钟至几小时的时间内灭活红细胞中的病原体，具体的时间取决于化合物。本发明所用的化合物包括本领域已知的用于灭活红细胞病原体的那些化合物，例如酞菁或噻嗪染料(例如亚甲蓝及其相关染料)、核黄素及其相关化合物、和吖丙啶低聚体及其相关化合物。相对于红细胞组合物中的其他成分(例如蛋白质和细胞膜)，优选化合物优先与核酸反应。本发明某些化合物(例如光活化化合物，例如亚甲蓝和核黄素)与核酸的反应需要附加的活化能(例如用适宜波长光源照射)。病原体灭活定义为使材料中的病原体不能繁殖。不需要全部灭活(即不需所有病原体都不能繁殖)，基本上灭活所有病原体即可，余量的病原体不足以引起正常个体疾病。正常个体是指疾病或免疫抑制治疗未产生病理性免疫抑制的个体。病原体灭活处理优选导致1log的病原体灭活，更优选为2log灭活，甚至更优选为3log灭活，在许多情况下为4log或更高(包括6log)病原体灭活。
本发明期望不受任何特定机理所限，相对于红细胞组合物中的其他成分，病原体灭活化合物优先与核酸反应。通常，优选的化合物具有两种共同的特征。首先，它们对核酸有亲和性，例如与核酸的非共价结合。其次，它们通过与核酸反应而使核酸不能再复制。在一个实施方案中，灭活化合物包含对核酸有亲和性的部分，该部分同与核酸反应的部分无明显区别。在另一实施方案中，化合物可包含对核酸有亲和性的部分和与核酸反应的部分。此类合物包含对核酸有亲和性(即能与核酸非共价结合)的固定子(anchor)部分，该部分连接着能与核酸形成共价结合的效应子部分(即效应子部分经反应与核酸共价结合)。在灭活化合物的另一实施方案中，结合固定子的非共价核酸部分通过连接子(linker)连接到核酸反应性效应子部分上，所述连接子可因被水解而不再链接着固定子部分与效应子部分。后一类型的连接子称为“脆性连接子”。
具有固定子-效应子基团的化合物1.非共价核酸结合性固定子基团可与核酸结合的化合物具有“核酸结合配体”，在此定义为对核酸有亲和性并且可与核酸非共价结合的基团。与核酸结合的方式有几种。下列任何方式之一或其组合方式、或者以其他方式结合的化合物，可认为是核酸结合配体，并可用作固定子部分。一些示例性核酸结合配体包括(本发明不限于下列化合物)a)嵌入剂，例如吖啶，吖啶酮，硫酸原黄素，吖啶黄素，放线菌素，蒽环素酮(anthracyclinone)，紫红霉素，柔红霉素(daunamycin)，噻吨酮(thiaxanthenones)，盐酸胺甲硫蒽酮，安曲霉素，丝裂霉素，棘霉素，醌霉素，三骨菌素，二吖啶，椭圆玫瑰树碱(包括二聚物，三聚物和类似物)，norphilin A，芴和芴酮，芴二胺(fluorenodiamine)，阿的平，苯并吖啶，吩嗪，菲啶，吩噻嗪，氯丙嗪，吩噁嗪，苯并噻唑，咕吨和噻吨类，蒽醌，蒽吡唑，苯并硫代吡喃吲哚类(benzothiopyranoindoles)，3，4-苯并芘，苯并芘二醇环氧化物，1-芘基环氧烷(1-pyrenyloxirane)，苯并蒽，苯并二吡喃酮类(benzodipyrones)，苯并噻唑，喹啉(例如氯奎，奎宁，氨甲酰基苯基喹啉)，呋喃并香豆素(例如补骨脂素和异补骨脂素)，乙啡啶(ethidium)，丙锭嗡盐(propidium)，coralyne，椭圆玫瑰树碱阳离子和衍生物，多环芳香烃及其环氧乙烷衍生物；b)小沟结合剂，例如偏端霉素、纺锤菌素、其他lexitropsin、Hoechst 33258和其他Hoechst染料，DAPI(4’，6’-二脒-2-苯基吲哚，重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐和三芳基甲烷染料；c)大沟结合剂，例如黄曲霉毒素；d)通过静电作用结合的分子(磷酸主链结合剂)，例如精胺，亚精胺和其他聚胺；e)可通过序列特异性相互作用(例如三链螺旋形成、D-环形成、以及与单链靶的直接碱基配对)而结合的核酸或类似物。上述化合物的衍生物也是核酸结合配体的非限定性示例，其中化合物的衍生物包括但不限于在其任何位置上具有一种或更多任意类型取代基的化合物，以及所述化合物的氧化或还原产物等。2.核酸反应性效应基团核酸反应性效应基团是指经反应而对核酸进行共价修饰的基团。在一个优选实施方案中，核酸反应性效应基团为芥基团，在此定义为包括单或二-(卤代乙基)胺基团，和单卤代乙硫醚基团。在另一实施方案中，可能的效应基团包括芥等价物，其定义为以类似于芥类的机理反应的基团(即通过形成反应中间体例如吖丙啶嗡或吖丙啶络合物和这些络合物的硫类似物)。示例性的芥等价物包括吖丙啶衍生物、单或二-(磺酰基乙基)胺基团、单磺酰基乙基硫醚基团、单或二甲苯磺酰基乙基胺基基团和单甲苯磺酰基乙硫醚基团。本发明并不局限于芥和芥等价物。其他示例性效应子包括但不限于环氧化物、醛、醛合成子(synthon)、和其他烷化剂和交联剂。醛合成子定义为在水性溶液可降解为醛的任何化合物。用于病原体灭活的化合物不受任何特定机理所限，其效应基团是或者是能形成亲电子基团(例如芥基团)应能与核酸反应并形成共价结合。
包含核酸结合固定子基团和烷化效应基团的示例化合物是奎吖因芥(quinacrine mustard)(Aldrich Chemial公司)，其结构显示如下 B.具有脆性连接基团的固定子-效应子用来连接固定子与效应子基团的具有不稳定键(指脆性连接子)的示例性连接子，包括但不限于具有以下官能团的化合物例如，酯或硫酯(其中所述酯或硫酯的羰基碳介于固定子和该酯或硫酯的sp3氧或硫之间时称为(正向酯)，或者当该酯或硫酯的sp3氧或硫介于固定子和酯或硫酯的羰基碳之间时称为(反向酯)，正向和反向硫羰酯(thionoester)，正向和反向二硫代酸，硫酸酯，正向和反向磺酸酯，磷酸酯，和正向和反向膦酸酯基团。其中硫酯是指-C(＝O)-S-基团，硫羰酯是指-C(＝S)-O-基团二硫代酸是指-C(S＝)-S-基团。脆性连接子也包括酰胺，其中酰胺的羰基碳介于固定子和酰胺的氮之间(称为正向酰胺)，或酰胺的氮介于固定子与酰胺的羰基碳之间(称为反向酰胺)。所谓正向的功能连接子基团，是指其水解之后所得酸性官能团能与固定子部分共价连接，并且所得的醇、胺或硫醇官能团可与效应子部分共价连接。所谓反向的功能连接子基团，是指其水解之后所得酸性官能团能与效应子部分共价连接，并且所得的醇、胺或硫醇官能团可与固定子部分共价连接。在酶促降解条件下，脆性连接子也能被加到红细胞组合物中的内源性酶或者加到材料中的酶所降解。
优选另外包含脆性连接基团的实施方案示例性地具有如下所示的结构
包含脆性连接子的其他病原体灭活化合物的另外的实施方案，可参见PCT公开98/30545(对应于US6,093,725)的描述。II.用于掩蔽红细胞免疫原性的化合物本发明还涉及对包括血细胞比容约为1％-65％或更高的红细胞的组合物进行处理，该处理采用一种化合物共价结合到红细胞的表面上并基本上掩蔽了细胞上的任何抗原。这种抗原掩蔽化合物与包含红细胞的组合物的反应条件，可与病原体灭活的反应条件相一致。在另一实施方案中，此类化合物与含红细胞的组合物的反应条件，可与病原体灭活的反应条件相一致，还可在与红细胞共价结合之前或之后进一步调节反应条件。在一个优选实施方案中，为了降低对红细胞抗原掩蔽水平有影响的竞争性过程，可在用抗原掩蔽化合物处理之前，冲洗红细胞组合物以降低血浆蛋白质的水平。除了能除去蛋白质以外，用适当pH的缓冲液冲洗红细胞可消除(淬灭)红细胞中血红蛋白的缓冲容量。冲洗红细胞可防止pH值从高于生理学pH值的最佳pH值(约8-9)逐渐变为生理学pH值(约7)。降低或缓冲pH值，可降低活化抗原掩蔽化合物与红细血胞表面的反应速率，并会在活化抗原掩蔽化合物缓分解之前降低修饰程度。
本发明期望不受任何特定机理所限，用于与红细胞共价结合以掩蔽抗原的化合物包括非免疫原性基团和偶合基团。在一个实施方案中，非免疫原性基团通过偶合基团部分而连接靶分子。在另一实施方案中，非免疫原性基团直接连接到靶分子上，而偶合基团部分不保留在上面。
在一个实施方案中，化合物的非免疫原性部分是聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇衍生物。PCT公开95/06058全面地论述了采用聚乙二醇的技术，在此引入作为参考。适于本发明的其他化合物包括通过共价连接到红细血胞表面后能阻断红细胞表面上抗原识别的其他非免疫原性基团。这类非免疫原性基团包括但不限于聚亚烷基二醇(例如PEG，聚丙二醇，聚丙烯-聚乙二醇混合物)，聚亚烷基二醇衍生物(例如甲氧基聚乙二醇，MPEG)，多糖(例如，右葡聚糖、纤维素、Ficoll和阿拉伯半乳聚糖)，和亲水性、合成聚合物例如聚氨酯。
优选化合物包括聚乙二醇和连接有适宜偶合基团的聚乙二醇衍生物。这种聚乙二醇化合物也指活化的聚乙二醇化合物和通式为Cp-(OCH2CH2)n-OH的化合物，其中n大于或等于3，和Cp表示通过与红细胞表面上端基硫醇或胺基团反应而将非免疫原性基团共价连接到红细胞上的偶合基团。分子量可约200,000或在更高的范围内变化。优选的衍生物的分子量为150-10,000，更优选为500-10,000，最优选为2,000-8,000。其端基被修饰的衍生物包括但不限于PEG醚(例如Cp-(OCH2CH2)n-OR，例如Cp-(OCH2CH2)n-OCH3(MPEG))，PEG酯(例如Cp-(OCH2CH2)n-OOCR，例如Cp-(OCH2CH2)n-OOC(CH2)14CH3)，PEG酰胺(例如Cp-(OCH2CH2)n-OOC(CH2)7CONHR)，PEG胺(例如Cp-(OCH2CH2)n-NH2，)，PEG酸(例如Cp-(OCH2CH2)n-OCH2COOH)，PEG醛(例如H(OCH2CH2)n-OCH2CHO)，和亲电衍生物例如卤化的PEG(例如H(OCH2CH2)n-Br。本发明的优选衍生物是那些MPEG衍生物。本发明的另一实施方案涉及支链PEG和支链PEG衍生物，其中PEG桥臂连接而形成多臂支链分子。本发明的另一实施方案涉及两种或更多上述类型化合物的混合物。另一实施方案涉及两种或更多这些类型的活化PEG和PEG衍生物化合物的混合物，其中偶合基团靶向于红细血胞表面上的不同亲核试剂。例如，可采用活化MPEGs的混合物，其中一种MPEG用优选与胺基反应的偶合基团而活化，而另一种MPEG用优选与硫醇基团反应的偶合基团而活化。
在一个实施方案中，用来将非免疫原性基团连接到红细胞上的偶合基团，包括可在红细血胞表面上与端基硫醇或胺基团反应的反应基团。其示例包括但不限于磺酸酯，取代的三嗪，N-羟基琥珀酰亚胺基酯，酐，取代的O-苯基碳酸酯，氧碳酰咪唑，马来酰亚胺，醛，乙二醛，羧化物，乙烯砜，环氧化物，芥，芥等价物，异氰酸酯，二硫化物，丙烯酸酯，烯丙醚，硅烷和氰酸酯。“芥”在此定义为包括一或二-(卤代乙基)胺基团和单卤代乙基硫醚基团。“芥等价物”在此定义为以类似于芥类的机理反应的基团(即通过形成反应中间体例如吖丙啶嗡或吖丙啶络合物和这些络合物的硫类似物)。示例性芥等价物包括吖丙啶衍生物，一或二-(磺酰基乙基)胺基团，单磺酰基乙基硫醚基团，一或二甲苯磺酰基乙基基团，并单甲苯磺酰基乙基硫醚基团。其他可能的偶合基团选自2，2，2-三氟乙磺酸酯，五氟苯磺酸酯，氟磺酸酯，2，4，5-三氟苯磺酸酯，2，4-二氟苯磺酸酯，2氯-4-氟苯磺酸酯，3-氯-4-氟苯磺酸酯，4-氨基-3-氯苯磺酸酯，4-氨基-3-氟苯磺酸酯，o-三氟苯磺酸甲酯，间三氟苯磺酸甲酯，2-三氟甲氧基苯磺酸酯，4-三氟甲氧基苯磺酸酯，5-氟-2-苯磺酸甲酯，4，6-三氯三嗪，6-氯三嗪，N-羟琥珀酰亚胺基琥珀酸酯，N-羟琥珀酰亚胺基戊二酸酯，N-羟琥珀酰亚胺基琥珀酰胺，N-羟琥珀酰亚胺基链烷二酰胺(alkanedioicamide)，羧甲基化聚合物的N-羟琥珀酰亚胺基衍生物，氨基酸的N-羟琥珀酰亚胺基酯，琥珀酰亚胺基碳酸酯，琥珀混合酐，琥珀酐，2，4，5-三氯苯酚，三氯苯基碳酸酯，硝基苯基碳酸酯，4-硝基苯酚，氰尿酰氯，马来酰亚胺，N-取代的马来酰亚胺，乙醛，丙醛和化学等价物的硫类似物，乙二醛，苯乙二醛，丙烯酸酯和异丁烯酸酯。在另一实施方案中，偶合基团为卤原子，优选为碘化物、溴化物或氯化物。
活化的非免疫原性化合物的优选实施方案为2，2，2-三氟乙磺酸基单甲氧基聚乙二醇(Tresyl MPEG，或TMPEG)。在其他优选实施方案中，活化的非免疫原性化合物为MPEG的N-羟琥珀酰亚胺基丙酸(SPA)和N-羟琥珀酰亚胺基丁酸(SBA)衍生物，其结构如下所示，其中n大于或等于1，优选大于或等于3。 III.用于淬灭不想要的副反应的化合物本发明还涉及用淬灭剂降低病原体灭活化合物和免疫掩蔽化合物的不想要的副反应。在另一实施方案中，淬灭剂化合物可单独或联用。可在加入病原体灭活化合物或免疫掩蔽化合物之前、同时或之后，将淬灭剂或淬灭剂组合加到红细胞组合物中。在另一实施方案中，采用一种特定的淬灭剂与病原体灭活化合物反应，而采用另一淬灭剂与免疫掩蔽化合物反应。在这种情况下，可在加入灭活化合物之前、同时或之后加入用于淬灭灭活化合物的淬灭剂，而在加入免疫掩蔽化合物之前、同时或之后加入用于淬灭免疫掩蔽化合物的淬灭剂。在另一实施方案中，如果在加入免疫掩蔽化合物之前，将灭活化合物加到红细胞组合物中并进行淬灭，则可以在加入免疫掩蔽化合物之前降低淬灭剂的量。经冲洗红细胞或采用能选择性除去不想要材料(例如淬灭剂和灭活方法中未反应的或副产物)的设备处理，可减少淬灭剂。同样地，如果在加入灭活化合物之前，将免疫掩蔽化合物加到红细胞组合物中并进行淬灭，则可以在加入灭活化合物之前降低淬灭剂的量。经冲洗红细胞或采用能选择性除去不想要材料(例如淬灭剂和免疫掩蔽方法中未反应的或副产物)的设备处理，可减少淬灭剂。可在每一方法之后除去淬灭剂，但是在除去淬灭剂之前应完成其他操作(即使每一方法所用的淬灭剂是相同的化合物)。
优选淬灭剂包括能与病原体灭活化合物或免疫掩蔽化合物中亲电子基团反应的亲核基团。示例性亲核基团包括但不限于硫醇，硫代酸，二硫代酸，硫代氨基甲酸，二硫代氨基甲酸，胺，磷酸和硫代磷酸基团。另外，亲核基团可以是氨基基团、聚氨基基团，或硫醇与氨基基团的组合，它们能淬灭未反应的病原体灭活化合物和未反应的抗原掩蔽化合物。淬灭剂可以是或者包含氮杂环(例如吡啶)。淬灭剂可以是包含磷酸的化合物，例如葡糖-6-磷酸。淬灭剂也可是包含硫醇的化合物，包括但不限于谷光甘肽，半胱氨酸，N-酰基半胱氨酸，巯基乙醇，二巯基丙醇，硫醇，巯基乙烷磺酸及其盐(例如MESNA)，同型半胱氨酸，氨基乙烷硫醇，二甲基氨基乙烷硫醇，二硫苏糖醇，以及其他含硫醇的化合物。淬灭剂也可以是盐形式，例如钠盐或盐酸盐。
含硫醇的其他化合物包括但不限于巯基乙醇酸甲酯，硫羟乳酸，苯硫酚，2-巯基吡啶，3-巯基-2-丁醇，2-巯基苯并噻唑，硫代水杨酸和硫辛酸。示例性芳族硫醇化合物包括2-巯基苯并咪唑磺酸，2-巯基-烟酸，萘硫酚，喹啉硫酚，4-硝基-苯硫酚和苯硫酚。其他淬灭剂包括但不限于硝基苄基吡啶，无机亲核试剂例如硒化盐或有机硒化物例如硒基半胱氨酸、硫代硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、硫代磷酸盐、焦磷酸盐、氢硫化物和连二亚硫酸。淬灭剂也可以是包含亲核基团的肽化合物。例如，淬灭剂可以是含胱氨酸的化合物，例如，二肽，如GlyCys，或三肽如谷光甘肽，或者是含胺的化合物例如多熔素。淬灭剂中可能包含不同的亲核基团，每一基团均能进行淬灭，例如谷光甘肽的胺和硫醇基团。IV.用于降低红细胞组合物中不想要的化合物的设备本发明还涉及用于从红细胞组合物中除去不想要的化合物的设备和方法。这些化合物包括未反应的灭活和抗原掩蔽化合物，这些化合物的不想要的副产物，这些化合物与淬灭剂反应的副产物，过量淬灭剂和淬灭剂的副产物，和方法中不想要的副产物。本发明所用的除去设备包括置于适宜基质中的吸附材料，它可特定和选择性降低不想要的化合物的浓度，而没有明显影响红细胞组合物的体外或体内性能。PCT公开号WO 98/30327详细论述可用于降低的设备和方法(其中也适用于本发明某些化合物)，在此引入作为参考。作为一种实施方案，是在所有的反应完成之后采用这种化合物降低设备，但是本发明对何时在方法中采用所述降低步骤并不作限制。本发明对降低步骤的数量或这些步骤中所用化合物降低设备的数量也不作限制。在本发明的一个实施方案中，用于灭活化合物的化合物降低设备的组成，与用于抗原掩蔽化合物组合物的化合物降低设备的组成不同。可在加入灭活化合物之后、在加入抗原掩蔽化合物之前采用该化合物降低步骤，并任选在抗原掩蔽化合物反应之后再采用降低步骤。同样地，可在加入抗原掩蔽化合物之后、在加入灭活化合物之前采用该化合物降低步骤，并任选在灭活化合物反应之后再采用降低步骤。V.具有低传染风险和低免疫原性的红细胞组合物及其制备方法本发明组合物包括一种红细胞组合物，该组合物经处理后基本上灭活了其中可能存在的病原体，并提供一种经处理后基本上掩蔽抗原的红细胞，该红细胞输给受血者时其免疫原性显著降低。在另一实施方案中，红细胞组合物包括被怀疑含有病原体的红细胞，所述红细胞组合物经核酸亲和性化合物(具有能与核酸反应而共价结合的效应基团)处理后，病原体基本上被灭活，并且所述红细胞组合物经与抗原掩蔽化合物反应而基本上掩蔽了红细胞抗原，这样与未处理的红细胞组合物产生免疫反应相比，上述经处理的红细胞组合物输给抗原不匹配性动物时，可降低免疫反应，其中处理后的红细胞组合物适于体内使用。与未处理的红细胞组合物相比，处理后的红细胞组合物的功能并未显著降低。具体地说，该组合物适于体内使用，即其体内功能并未显著低于未处理的组合物。本发明的另一实施方案涉及包括被怀疑含有病原体的红细胞的药物，所述红细胞组合物经处理后病原体基本上被灭活，并且其中的红细胞抗原也基本上掩蔽，这样与未处理的红细胞组合物产生免疫反应相比，上述经处理的红细胞组合物输给抗原不匹配性动物时，可降低免疫反应。
适应性参数是本领域技术人员已知的，其中包括但不限于体内存活和用于评价红细胞功能的某些体外参数。例如，处理后红细胞组合物应保持以下功能输血后循环24小时之后红细胞的体内存活率约高于40％、优选为50％和更优选为75％；在其他实施方案中，处理后的红细胞在输血24小时后，其体内存活率约为40％、优选为50％和更优选为70％，所述红细胞在输血前已于4℃贮藏7天、14天、21天、35天和42天。另外，用于评价经处理的红细胞组合物活力的某些重要体外参数包括但不限于红细胞的氧转运活性(测定与氧的亲和性)，胞内腺苷5’-三磷酸(ATP)水平，胞内2，3-二磷酸甘油酯(2，3-DPG)水平，胞外钾水平，红细胞的溶血或囊泡形成(vesiculation)，pH值，血细胞比容，游离血红蛋白水平，红细胞的渗透性脆性，红细胞变形(ektacytometry测量)，离子体内平衡(Na+，K和SO4-流量)，活性阳离子转运(ouabain敏感性Na+转运，bemetanide敏感性Na+、K+转运)，葡萄糖耗量和乳酸生成。
可采用已知技术测定ATP、2，3-DPG、葡萄糖、血红蛋白、溶血和钾。例如可参见Davey等，Transfusion，32525-528(1992)，其公开内容在此引入作为参考。用于测定红细胞功能的方法参见Greenwalt等，Vox Sang，5894-99(1990)；Hogman等，Vox Sang，65271-278(1993)；Beutler等，Blood，卷59(1982)；和Beutler，红细胞的新陈代谢，第3版，Grune & Stratton出版社(1984)中的描述，其公开内容在此引入作为参考。胞外钠和钾水平的测定可采用CibaCorning 614型K+/Na+分析仪(Ciba Coming Diagnostics公司，Medford，MA)。PH值的测定可采用Ciba Coming 238型血气分析仪(Ciba Corning Diagnostics公司)。
将这些测量结果与未处理的对照红细胞组合物比较，以确定处理后组合物的功能是否显著降低。在一个实施方案中，处理1天后对低传染风险和低免疫原性的红细胞组合物进行了测量，测得其胞外钾的水平至多是未处理的对照红细胞组合物的3倍，和更优选至多为2倍。在另一实施方案中，经处理的红细胞组合物在处理后和于4℃贮存42天后，测得其溶血低于5％。在另一实施方案中，处理后的红细胞组合物经于4℃贮存28天之后测得其溶血低于3％，优选贮存35天之后低于2％，更优选贮存35天(更优选42天)之后其溶血约低于或等于0.8％。在另一实施方案中，经处理的红细胞组合物在处理后、优选于4℃贮存28天之后、更优选贮存42天之后，其细胞内ATP水平低于未处理的对照组合物的50％，更优选低于25％和更优选低于10％。在另一实施方案中，经处理的红细胞组合物在处理后、优选于4℃贮存7天之后，其细胞内2，3-DPG水平低于未处理的对照组合物的90％，优选低于50％和更优选低于25％。
与未处理的红细胞对照或者仅进行病原体灭活处理的红细胞相比，本发明另一实施方案中处理后的红细胞表现出显著降低的免疫原性(即免疫反应降低)。可采用本领域技术人员已知的某些体外分析方法，来评价经处理的红细胞相对于未处理对照品的免疫原性。体外分析方法包括但不限于ABO反应性凝集，测定红细胞聚集作为结合到组合物中抗体的函数，与次要抗原的反应性，ELISA分析以测定与抗体的直接结合，和分析结合的荧光抗体以评价被免疫掩蔽化合物修饰的水平(例如实施例9)。
作为ABO反应性评价的一个示例，将包含处理后红细胞的组合物与含有适宜抗体的血清反应(例如，将处理后的A型红细胞与含抗-A抗体的血清反应)，并观察红细胞的凝集。取含抗体的血清的连续稀释等分试样，重复上述反应直至观察不到凝集。在本发明的一个实施方案中，就不出现凝集所需抗血清的稀释度而言，处理后红细胞组合物比未处理的对照红细胞组合物至少低23倍，优选为至少低25倍，更优选为至少低27倍。另一实施例是ELISA分析，该法采用与碱性磷酸酶缀合的抗-人IgG，测定了抗体与红细胞抗原的结合。本发明的另一实施方案涉及呈Rh阳性的经处理的红细胞组合物(即具有D抗原)，与未处理的Rh阳性红细胞对照品相比，经ELISA分析测定其中处理后红细胞与抗-D抗体的结合至少降低了75％，优选至少为90％，更优选至少为95％和最优选高于99％。也可经体外试验，测定通常与异源免疫有关的次要抗原的免疫原性。公认的体系将反应分为0-4+级，其中0表示无反应，4+表示出现最高水平的凝集[Walker等，AABB技术手册，第10版，528-537页(1990)]。与异源免疫有关的次要抗原包括Jka、E、K、Bg、Lua、P1、D、Sda、Fya、M、Yka、A1、Lea、Kpa、C、e和I[Heddle等，Brit.J.Hemat.911000-5(1995)]。本发明的另一实施方案涉及包含处理后红细胞的组合物，分析测得抗-D、抗-Jka、抗-E、抗-C、抗-e或抗-K的体外反应性以这种O-4+分级标准，低于或等于2+，优选为低于或等于1+，最优选为0。
在本发明的一个实施方案中，处理后的红细胞表现出降低的免疫原性，因此在输给ABO不匹配受血者(例如，将处理后的供者A型红细胞输给B型受血者)时，不会产生急性溶血反应。在另一实施方案中，将处理后的供血者红细胞输给异源致敏性受血者(即对未处理的供血者红细胞中的次要抗原形成了抗体，或病原体灭活处理产生的抗原)时，不会引起对异型抗原的免疫反应，也不会导致红细胞的快速清除。也可以采用某些体内分析方法来评价处理后红细胞相对于未处理对照品的免疫原性。可进行体内存活率研究来评价免疫原性，例如通过测定处理后的绵羊红细胞在小鼠体内的存活，或者优选测定输入的红细胞在模型动物(例如犬)体内的存活，而未处理的红细胞在这种条件下均会引起免疫应答(即抗原不匹配红细胞)。在本发明的一个实施方案中，从抗原不匹配性供血者处受血后，经处理的狗红细胞的体内存活大大高于未处理的狗红细胞。通常，经处理后免疫原性降低的红细胞，其存活约是未处理红细胞对照品的2倍、优选为5倍和更优选为10倍。
本发明还涉及包括上述组合物和药物的使用方法。该方法的一个示例包括将所述组合物或药物给予需要红细胞输血的个体。另一实施方案涉及一种红细胞处理系统，其中包括上述组合物或药物和用于贮藏红细胞组合物的适宜容器，所述红细胞组合物适宜给予个体。在一个优选实施方案中，所述容器为血袋。
本发明还涉及生产低传染风险和低免疫原性红细胞组合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括步骤1)处理红细胞组合物，使红细胞组合物中可能存在的病原体基本上被灭活，和2)接着处理红细胞组合物，以基本上掩蔽抗原，从而显著降低红细胞组合物的免疫原性，这样处理后红细胞组合物保持了其预期用途(例如体内使用)的功能。在另一实施方案中，操作可按步骤1至步骤2进行，而不用对试样进行另外处理(即无需稀释、冲洗、加入缓冲液、淬灭反应、除去化合物等)。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低处理过程中不想要的试剂或这些试剂的副产物水平，或者降低该方法中不想要的副产物水平。
在另一实施方案中，本发明包括离体处理红细胞组合物的方法，包括在可基本上灭活病原体(如果存在的话)的条件下，将红细胞组合物与能基本上灭活组合物中可能存在的病原体的化合物接触；和在显著降低红细胞免疫原性的条件下，将红细胞组合物与能结合到红细胞上并基本上掩蔽红细胞抗原的化合物接触，与未处理的红细胞组合物相比，经这样处理的红细胞组合物输给抗原不匹配动物时，所引起的免疫反应较低。
在另一实施方案中，所述方法包括步骤1)在灭活化合物能与红细胞组合物中可能存在的病原体反应并基本上灭活病原体的条件下，向红细胞组合物中加入灭活化合物，和2)在显著降低组合物中红细胞免疫原性的条件下，接着向红细胞组合物中加入非免疫原性化合物，该化合物能与组合物中的红细胞共价结合并由此而掩蔽抗原，所得的经处理的红细胞组合物保持了其预期用途(例如用于输血)的功能。在另一实施方案中，操作可按步骤1至步骤2进行，而不用对试样进行另外处理(即无需稀释、冲洗、加入缓冲液等)。在一个优选实施方案中，在加入能与红细胞共价结合的非免疫原性化合物之前，先用适宜缓冲液冲洗红细胞，使胞外pH值达到利于非免疫原性化合物与红细胞反应的最佳状态。缓冲液优选是使胞外pH值约为8-9并能在该pH下保持其缓冲容量的缓冲液。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低任何未反应的灭活化合物或抗原掩蔽化合物或这些试剂的副产物水平，或者降低该方法中不想要的副产物水平。应当理解，灭活化合物与病原体的反应需借助于外界能源(例如用适宜波长光源照射)。
如果红细胞组合物含有细菌，则和未与抗原掩蔽化合物反应的细菌相比，与抗原掩蔽化合物反应的细菌更具传染性(即细菌的免疫原性较低并由此对个体更有害)。因此，另一实施方案中，所述方法包括基本上灭活细菌的条件下，将被怀疑含有细菌的红细胞组合物与基本上灭活组合物中细菌的化合物接触；和在可显著降低红细胞免疫原性的条件下，将红细胞组合物与足量的抗原掩蔽化合物接触，使抗原掩蔽化合物结合到红细胞上并基本上掩蔽红细胞抗原，与未处理的红细胞组合物相比，经这样处理的红细胞组合物输给抗原不匹配动物时，所引起的免疫反应较低，所述红细胞适于体内使用。
在另一实施方案中，所述方法包括将具有核酸结合配体和核酸反应性效应基团的化合物加到被怀疑含有病原体的红细胞组合物中形成一混合物，所述化合物的最终浓度足以基本上灭活所有病原体，将混合物温育直至基本上所有病原体被灭活，再加入具有连接到偶合基团上的聚乙二醇基团的化合物，形成另一混合物，然后在与红细胞共价连接的聚乙二醇基团水平足以基本上掩蔽异源免疫系统识别红细胞抗原的条件下，温育所述合物而形成温育的混合物，经上述方法处理的红细胞组合物的传染风险和免疫原性均显著降低，保持了其功能并适于体内使用。在该方法的一个实施方案中，一部分偶合基团保持在聚乙二醇基团和红细胞之间，而在另一实施方案中，则除去了偶合基团，使聚乙烯基团与红细胞直接连接。在另一实施方案中，聚乙二醇基团的加入，不用对试样进行另外处理(即无需稀释、冲洗、加入缓冲液等)。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低任何未反应的核酸结合性芥或聚乙二醇化合物或这些试剂的副产物水平，或者降低该方法中不想要的副产物水平。
在另一实施方案中，所述方法包括步骤1)处理红细胞组合物，以基本上掩蔽抗原，使红细胞组合物的免疫原性显著降低，和2)接着处理红细胞组合物，使红细胞组合物中可能存在的病原体基本上被灭活，这样处理后红细胞组合物保持了其功能，并适于体内使用。在另一实施方案中，操作可按步骤1至步骤2进行，而不用对试样进行另外处理(即无需稀释、冲洗、加入缓冲液等)。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低处理过程中不想要的试剂或这些试剂的副产物水平，或者降低该方法中不想要的副产物水平。
在另一实施方案中，所述方法包括步骤1)在显著降低组合物中红细胞免疫原性的条件下，向红细胞组合物中加入非免疫原性化合物，该化合物能与组合物中的红细胞共价结合并由此而掩蔽抗原，和2)接着在灭活化合物能与红细胞组合物中可能存在的病原体反应并基本上灭活病原体的条件下，向红细胞组合物中加入灭活化合物，这样处理后的红细胞组合物保持了其功能并适于体内使用。在另一实施方案中，操作可按步骤1至步骤2进行，而不用对试样进行另外处理(即无需稀释、冲洗、加入缓冲液等)。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低任何未反应的灭活化合物或抗原掩蔽化合物或这些试剂的副产物水平，或者降低该方法中不想要的副产物水平。在一个优选实施方案中，在加入能与红细胞共价结合的非免疫原性化合物之前，先用适宜缓冲液冲洗红细胞，使胞外pH值达到利于非免疫原性化合物与红细胞反应的最佳状态。缓冲液优选是使胞外pH值约为8-9并能在该pH下保持其缓冲容量的缓冲液。应当理解，灭活化合物与病原体的反应需借助于外界能源(例如用适宜波长光源照射)。
在另一实施方案中，所述方法包括向被怀疑含有病原体的红细胞组合物中，加入具有连接到偶合基团上的聚乙二醇基团的化合物，形成一混合物，然后在与红细胞共价连接的聚乙二醇基团水平足以基本上掩蔽异源免疫系统识别红细胞抗原的条件下，温育所述合物而形成温育的混合物，然后加入具有核酸结合配体和核酸反应性效应基团的化合物，形成一混合物，所述化合物的最终浓度足以基本上灭活所有病原体，将混合物温育直至基本上所有病原体被灭活，经上述方法处理的红细胞组合物的传染风险和免疫原性均显著降低，保持了其功能并适于体内使用。在该方法的一个实施方案中，一部分偶合基团保持在聚乙二醇基团和红细胞之间，而在另一实施方案中，则除去了偶合基团，使聚乙烯基团与红细胞直接连接。在另一实施方案中，核酸反应性效应基团为芥基团，核酸结合芥化合物的加入，不用对试样进行另外处理(即无需稀释、冲洗、加入缓冲液等)。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低任何未反应的核酸结合性芥或聚乙二醇化合物或这些试剂的副产物水平，或者降低该方法中不想要的副产物水平。
在另一实施方案中，所述方法包括在基本上掩蔽抗原使红细胞组合物的免疫原性显著降低和基本上灭活其中可能存在的病原体的条件下，用上述试剂同时处理红细胞组合物，这样处理后的红细胞组合物保持了其功能和适于体内使用。在另一实施方案中，可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低处理过程中不想要的试剂的水平或这些试剂的副产物，或者降低该方法中不想要的副产物水平。
在另一实施方案中，所述方法包括同时进行以下处理在显著降低组合物中红细胞免疫原性的条件下，向红细胞组合物中加入非免疫原性化合物，该化合物能与组合物中的红细胞共价结合并由此而掩蔽抗原，和同时在灭活化合物能与组合物中可能存在的病原体反应并基本上灭活病原体的条件下，向红细胞组合物中加入灭活化合物，这样处理后的红细胞组合物保持了其预期用途(例如用于输血)的功能。可对处理后的红细胞组合物再进行冲洗或处理，以降低任何未反应的灭活化合物或非免疫原性化合物或这些试剂的副产物水平，或者降低该方法中不想要的副产物水平。应当理解，在不干扰同时进行的非免疫原性化合物掩蔽抗原的条件下，灭活化合物与病原体的反应可借助于外界能源(例如用适当光源照射)。
在本发明方法的一些实施方案中，一部分偶合基团保持在聚乙二醇基团和红细胞之间，而在另一实施方案中，则除去了偶合基团，使聚乙烯基团与红细胞直接连接。
可以理解，可对灭活病原体和掩蔽抗原反应中的一个或多个步骤实施淬灭，以降低上述实施方案中所有反应的不想要的副产物，并且所述淬灭不限于一个步骤。在一个实施方案中，病原体灭活步骤可与不想要的副产物的淬灭处理组合进行，即可在病原体灭活处理之前、同时或之后，加入淬灭剂。在另一实施方案中，抗原掩蔽步骤可与不想要的副产物的淬灭处理组合进行，即可在降低红细胞免疫原性的处理之前、同时或之后，加入淬灭剂。可以理解，对病原体灭活步骤和抗原掩蔽步骤的淬灭处理，可以相同或不同，这视上述步骤的需要而定，或者并行地进行处理。在本发明的另一实施方案中，可在进行有效淬灭处理的任何时间内对两个步骤淬灭，或者并行地进行处理。
可以理解，上述所有实施方案中讨论的有关降低不想要试剂或副产物水平的处理，并不限于所述方法的任何特定步骤，也不限于单一步骤。在一个实施方案中，在灭活病原体和掩蔽抗原的一个或多个步骤之后，可采用化合物降低设备来降低不想要的化合物的水平。在其他实施方案中，可在每个步骤之后使用化合物降低设备降低不想要的化合物水平，每一步骤之后使用的化合物降低设备可以是不同的组成。
可以理解，在上述所有实施方案中，在进行掩蔽红细胞抗原的处理之前，可对红细胞组合物进行处理(例如冲洗)，以除去过量生物液(其中包含可能与红细胞竞争免疫掩蔽化合物的蛋白质和其他大分子)。这对于确保免疫掩蔽化合物与红细胞间的均匀反应来说是必要的，这样可重现性地生产出免疫原性充分降低的红细胞组合物。IV.选择用于灭活病原体和制备非免疫原性红细胞的化合物和方法为了评价化合物和方法是否适用于本发明，应考虑以下3个重要的性能化合物和方法灭活病原体的能力，化合物和方法对红细胞免疫原性的影响，和化合物和方法对红细胞组合物预期用途的功能的影响。用来测定这些参数的筛查技术是本领域技术人员已知的。
用以评价本发明化合物的灭活病原体能力的筛查技术是噬菌体筛查；取决于待试化合物与核酸的结合的分析。这种类型的筛查技术-R17筛查，可参见实施例1中的详述。据信，R17噬菌体筛查可用来预测对HIV的灭活效力，以及化合物抗其他病毒的效力。类似的筛查分析也可以采用MS2噬菌体。评价本发明化合物和方法的另一灭活研究如实施例2-3所述。
用于细胞免疫原性的筛查技术包括那些利用抗体识别细胞表面抗原的方法。例如，用于评价本发明化合物降低红细胞免疫原性的能力的筛查技术，可采用抗-A、抗-B和抗-D抗体进行分离凝集试验；该分析法可测定红细胞的免疫原性。这种类型的筛查技术，可参见实施例4中的详述。采用该分析法，可使本发明特定化合物和方法在最大化地降低A、B和D抗原的免疫原性方面得到优化。就不出现凝集所需抗-A或抗-B抗血清的稀释度而言，比未处理的对照红细胞组合物至少低23倍的那些化合物和方法，以及导致抗-D抗血清1+级或更低反应的那些化合物和方法，均可用作制备本发明红细胞组合物的合理候选者。
其他筛查技术可利用检测标记的(例如放射性或荧光标记)化合物。在这类分析中，采用分离和分析红细胞膜(红细胞影)或其他分离测量红细胞的方法，可直接测定红细胞表面上的经适当标记的PEG的量。另外，采用流式细胞仪，也可直接测定红细胞表面上的荧光标记的PEG的量。荧光信号可以所用荧光PEG的相对量，并与标准曲线比较来校正，标准曲线是采用包含已知量荧光标记分子的小珠制作的。有关测量PEG对红细胞的修饰的密度的实施例，可参见实施例11。
用来评价本发明红细胞组合物和方法的筛查技术包括但不限于胞内ATP，胞内2，3-DPG，胞外钾，溶血，渗透性脆性和氧转运活性，这些参数的测定可参见下面的实施例。那些未使处理后试样的参数相对于未处理的对照试样发生显著变化(即在当前标准血库操作可接受的范围内)的化合物和方法，可作为用来制备本发明红细胞组合物的合理候选者。
实验部分实施例1测定本发明化合物和方法对R17的灭活该实施例描述了用于测定本发明化合物和方法灭活噬菌体R17的方法。该法用来测定本发明化合物在不同处理步骤中的灭活效力。具体地说，对灭活用的化合物和方法、掩蔽红细胞免疫原性用的化合物和方法分别进行分析。也对产生较低传染性和较低免疫原性的红细胞组合物的所有方法进行分析。由于在掩蔽红细胞免疫原性的同时也可能掩蔽了R17的免疫原性，因此分别进行评价是重要的。该实施例的目的是确定本发明化合物和方法是否也灭活了R17。
该分析法测定了噬菌体传染细菌并抑制它们生长的能力。噬菌体在Hrf 3000细菌中生长(R17和Hrf 3000来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，华盛顿特区)。首先，将R17贮备病毒在Adsol中1∶20稀释(R17-Adsol)(约10.9log/ml在LB肉汤中)。然后，从全血(Sacramento血液中心，CPDA-1保藏)高速旋转出红细胞，将3.5mL红细胞团再悬浮于7.0ml R17-Adsol中，配成在R17-Adsol混合物中30％血细胞比容的红细胞浓缩物。可采用F800型Sysmex细胞计数器(Toa Medical Electronics公司，神户，日本)测定血细胞比容。取混合物1ml等分试样供灭活化合物的分析。视需要，可调节体积或红细胞小球和R17-Adsol。将病原体灭活化合物试样溶于DMSO或Adsol中，形成所需的浓度，将50μl或更低量的等分试样加到30％血细胞比容的红细胞组合物等分试样中，配成所需的最终浓度。另外，可加入适当体积的DMSO或Adsol，使总体积(化合物+加入的DMSO或Adsol)达到50μl。将50μl DMSO或Adsol加到红细胞组合物中，作为阳性对照。然后于室温下放置至少1小时。对于需要外界活化能(例如照射)的灭活化合物，将采用适当的活化来代替1小时的温育。然后，将0.1ml噬菌体溶液无菌稀释至0.4mL LB肉汤中，用R17噬菌体分析法滴定试样。然后用0.5mL LB肉汤(1∶25)稀释成0.02ml，接着连续稀释(1∶25)到LB肉汤中。向每一稀释试样中，加入过夜培养的0.05mL Hrf 3000细菌和3mL融化的LB上层琼脂。将混合物倾入LB肉汤平板中，待上层琼脂变硬后置于37℃恒温箱中。过夜温育之后，对噬斑进行计数，以稀释因子为基础计算剩余噬菌体的滴度。
为了验证掩蔽红细胞免疫原性化合物的效力以及制备经处理后红细胞组合物的整个方法的效力，对R17-Adsol溶液进行适当的处理，并接着按上述铺板。向适宜对照品中加入适当溶液(不含灭活或抗原掩蔽化合物)，进行上述操作以评价灭活的滴度。该分析法也可以其他添加溶液代替Adsol。实施例2测定本发明化合物和方法对HIV的灭活将TC培养基质中的与HIV感染的细胞(Popovic等，Science，224497(1984)H9-IIIb细胞悬浮在组织培养物介质中，得到一种以噬斑形成单位/mL测定滴定度的悬浮液。在15mL锥形试管中向2mL试验介质等分试样中加入足量的病原体灭活化合物溶液，以得到所需浓度的活性物质。通过完全抽吸数次将悬浮液立刻混合，然后快速涡流。试样在环境温度下温育2-4小时，然后离心(对于需要外界活化能(例如照射)的灭活化合物，可以适当活化代替2-4小时温育)。将沉淀再悬浮于1mL噬斑测定稀释剂中，然后于-80℃快速冷冻。并通过微噬斑测定滴定度。(Hanson等，J.Clin.Micro.，282030(1990))。
包装红细胞(PRBC)中与HIV感染的细胞为了在PRBC中进行测定，取已测定血细胞比容的全血细胞(Sacramento血液中心，CPDA-1保藏)，制备包装细胞，并于3800rpm(4097×g)离心6分钟。除去上层清液血浆并测定除去的体积。将Adsol溶液加到红细胞中，得到60％血细胞比容的PRBC。该制剂中血浆浓度为15-20％。在稀释离心的细胞之前，将HIV9-IIIb细胞加到Adsol中。通过完全抽吸所有的材料(包括足量的病原体灭活化合物溶液)来混合所得的悬浮液。在完成待试化合物的温育或外界活化之时，利用包含5mL肝素的3mL血浆∶DMEM(1∶1)溶液稀释样品。然后利用ficol-hypaque梯度分离感染的细胞，再悬浮于1mL稀释剂中，并冷冻供以后滴定。
PRBC中无细胞的HIV方法类似于上文所述，只是在制备之后将不含细胞的HIV直接加入PRBC中。温育之后，离心介质，并冷冻上层液供以后滴定。
为了验证掩蔽红细胞免疫原性的化合物的效力，以及制备经处理红细胞组合物的整个方法的效力，对HIV溶液进行适当的处理，并接着按上述滴定。向适宜对照品中加入适当溶液(不含灭活或抗原掩蔽化合物)，进行上述操作以评价灭活的滴度。该分析法也可以其他添加溶液代替Adsol。实施例3测定本发明化合物和方法对小肠结肠炎耶尔森菌的灭活于37℃下，将小肠结肠炎耶尔森菌(California Department ofHealth Services，微生物疾病实验室，伯克利，CA)于LB-肉汤中置于180rpm震动器上过夜培养。为了测定滴度，测量在Adsol中稀释1∶100的光密度(108细菌/mL处的OD610＝0.2)。然后，细菌贮备液以1∶100稀释至盐水或PRBC中，得到试验培养基，将该培养基等分(1ml)装入2mL无菌O-环试管中。按实施例2方法配制PRBC。
向每一试管中加入足量的病原体灭活溶液，得到适当浓度的待试化合物。通过完全抽吸数次混合物，将每一样品快速混合。然后在环境温度下温育2小时或进行外界活化处理，然后置于开始含100μL样品的LB-琼脂盘上，开始时其稀释度为10-1，然后继续稀释至10-8。该板于37℃下温育过夜并对菌落计数。通过未处理的试验介质的滴定度和处理的样品滴定度之间的差额，可以计算该浓度时化合物的log杀伤。检测限为10细菌/mL，但是通过测定10板/试样，可将该限度降至1细菌/mL。
为了验证掩蔽红细胞免疫原性的化合物的效力，以及制备经处理红细胞组合物的整个方法的效力，对耶尔森菌溶液进行适当的处理，并接着按上述铺板。向适宜对照品中加入适当溶液(不含灭活或抗原掩蔽化合物)，进行上述操作以评价灭活的滴度。该分析法也可以其他添加溶液代替Adsol。实施例4测定本发明红细胞与抗-A、抗-B和抗-D抗血清的凝集反应在适宜条件下，对CPDA-1保藏的红细胞进行病原体灭活和抗原掩蔽处理。聚乙二醇衍生物可购自Shearwater Polymer公司(Huntsville，Al.)。采用标准技术，例如Walker等，AABB技术手册，第10版，528-537(1990)，测定处理后红细胞的凝集反应。取连续稀释的试样进行凝集反应。记录不再观察到处理后红细胞凝集的稀释水平，并与未处理红细胞比较。该分析法中采用了A型红细胞和抗-A抗体或者B型红细胞和抗-B抗体。该分析法可部分地使对红细胞抗原的掩蔽处理最优化。
类似的分析方法可采用Rh阳性红细胞和抗-D抗血清。在该分析法中，可按AABB技术手册所述对凝集评分。将处理后的红细胞与未处理的对照样品比较，以评价该方法掩蔽D抗原的能力。实施例5体外评价处理后红细胞的功能经本发明化合物和方法处理后的红细胞，可很容易评价其胞内腺苷-5’-三磷酸(ATP)、胞内2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)、胞外钾和溶血水平。将结果与未处理的对照试样比较，以评价处理后的红细胞是否适于其预期用途(例如输血)。采用Sigma ATP试剂盒或2，3-DPG试剂盒(Sigma公司，St.Louis，Mo.)，分别测定胞内ATP和2，3-DPG。按Sigma操作No.366-UV使用ATP试剂盒，在此引入作为参考。可采用Ciba Corning 614 K+/Na+分析仪(Ciba Coming Diagnostics公司，Medfield，Ma.)测定胞外钾水平。分析仪可对适宜的红细胞组合物直接取样。实施例6评价处理后的红细胞对氧的亲和性用本发明化合物和方法处理红细胞后，用Hemox分析仪测定红细胞样品的氧亲和性。于37℃预平衡Hemox分析仪。在移至Hemox分析仪比色杯中之前，将50μL红细胞样品与3.97mL Hemox缓冲液(TCSScientific公司，New Hope，PA)混合，其中包含20μL 20％牛血清白蛋白(TCS Scientific公司)和10μL消泡剂(TCS Scientific公司)。将稀释样品加入比色杯之后，将混合物于37℃搅拌8分钟以平衡其温度。接着，将稀释样品暴露于空气中充分氧合8分钟。校准仪器的分压示度和每一试样血红蛋白饱和度。Y-轴记录溶液在560nm吸收与570nm吸收的Log比值，而X-轴记录Clark电极的氧分压(pO2)。将100％氮和100％空气设定为当天0和最大计算出的pO2，以校准X-轴。将分别在氮或氧下平衡的血红蛋白设定为0和1，以校准Y-轴。向液体试样的上部空间引入氮，降低pO2，得到每一样品的氧亲和性曲线，并测定血红蛋白氧饱和度的百分比。采用计算机程序Kaleidagraph 3.0.5(Synergy Software，Reading，PA)，将以数字表示的转化成氧亲和性曲线图，并从该曲线的半高点求出P50。分别测定处理后的试样和未处理的对照品试样，并进行相互比较。实施例7评价处理后的红细胞的渗透性脆性测定了本发明化合物和方法处理的红细胞试样的渗透性脆性，并与未处理对照试样进行比较。配制0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.75的试剂，和0.9％PBS(1.0％PBS含9gNaCl、1.365g Na2HPO4和0.186g NaH2PO4，在水中的终体积为1升)。向每份上述溶液(1.0mL)中加入10μL等分红细胞样品，温和混合并于室温温育30分钟。温育之后，将试样温和地混合并离心(2,000×g)2分钟。用水将分光光度计调零，于540nm测定试样上层清液的吸光度。采用下列公式计算％溶胞(lysis)，其中以0.9％PBS样品为本底溶胞，以0.1％PBS样品为100％溶胞。
％溶胞＝(A540-0.9％A540)/(0.1％A540％-0.9％A540)×100以％溶胞对％PBS作图，将处理后红细胞的图与未处理的对照红细胞图比较。实施例8合成脆性β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯步骤A.β-丙氨酸，N-(叔丁氧基羰基)，2-[二(2-羟乙基)氨基]乙酯于-15℃N2下，向无水THF(200mL)中的N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸(20.3g，107mmol)和4-甲基吗啉(13.0mL，12.0g，119mmol)搅拌溶液中加入氯甲酸异丁酯(13.9mL，14.6g，107mmol)，立即形成一白色沉淀(4-甲基吗啉HCl)。反应混合物于-15℃搅拌5分钟，然后移至包含在无水THF(150mL)中三乙醇胺(48.3g，324mmol)搅拌溶液的烧瓶中(-15℃)。将反应混合物加热至23℃并再搅拌1.5小时，然后经真空过滤除去沉淀物。然后，从滤液中真空除去THF，将剩余的粘性黄色油状物分配于水(500mL)和EtOAc(5×150mL)之中。合并有机层经Na2SO4干燥。真空除去溶剂，得到25.8g(75％)所需的产物β-丙氨酸，N-(叔丁氧基羰基)，2-[二(2羟乙基)氨基]乙酯，为一灰黄色油状物。1H NMRd5.32(br s，1H)，4.18(t，J＝5.4Hz，2H)，3.58(t，J＝5.1Hz，4H)，3.37-3.23(m，2H)，2.80(t，J＝5.4Hz，2H)，2.69(t，J＝5.1Hz，4H)，2.51(t，J＝6.0Hz，2H)，1.41(s，9H)。未观察到羟质子。13C NMRd173.0，156.4，79.8，63.3，60.2，57.3，54.1，36.7，35.3，28.8.步骤B.β-丙氨酸，N-(叔丁氧基羰基)，2-[二(2-叔丁基二甲基甲硅氧基乙基)氨基]乙酯N2下，将步骤A的β-丙氨酸，N-(叔丁氧基羰基)，2-[二(2-羟乙基)氨基]乙酯(22.7g，70.9mmol)和咪唑(11.1g，163mmol)在乙腈(70mL)中的搅拌溶液冷却至0℃。然后，加入叔丁基二甲基硅烷基氯(534mg，3.54mmol)，并将反应混合物于0℃再搅拌5分钟。反应混合物加热至23℃，并搅拌2小时，然后真空过滤除去生成的白色沉淀(咪唑HCl)。真空下从滤液中除去乙腈，将剩余物分配于饱和盐水(600mL)和EtOAc(3×200mL)之中。合并有机层经Na2SO4干燥。真空除去溶剂，得到35.2g(90％)所需的产物β-丙氨酸，N-(叔丁氧基羰基)，2-[二(2-叔丁基二甲基甲硅氧基乙基)氨基]乙酯，为一黄色油状物。1H NMRd5.29(br s，1H)，4.14(t，J＝6.0Hz，2H)，3.65(t，J＝6.3Hz，4H)，3.37(表观q，2H)，2.85(t，J＝6.0Hz，2H)，2.71(t，J＝6.3Hz，4H)，2.49(t，J＝5.9Hz，2H)，1.42(s，9H)，0.88(s，18H)，0.03(s，12H)；13C NMRd172.7，156.3，79.7，63.3，62.4，57.7，54.3，36.7，35.3，28.9，26.4，18.7，-4.9.步骤C.β-丙氨酸，2-[二(2-叔丁基二甲基甲硅氧基乙基)氨基]乙酯向包含步骤B所得的β-丙氨酸，N-(叔丁氧基羰基)，2-[二(2-叔丁基二甲基甲硅氧基乙基)氨基]乙酯(3.01g，5.48mmol)的烧瓶中加入无水三氟醋酸(5mL)，导致CO2气体放出。反应混合物搅拌5分钟，并真空除去三氟醋酸。剩余物分配于饱和NaHCO3(100mL)和EtOAc(3×30mL)之中。合并有机层经Na2SO4干燥。真空除去溶剂得到2.45g(100％)所需的产物β-丙氨酸，2-[二(2-叔丁基二甲基甲硅氧基乙基)氨基]乙酯，为一灰黄色油状物。1H NMRd4.12(t，J＝6.0Hz，2H)，3.63(t，J＝6.4Hz，4H)，2.96(t，J＝6.2Hz，2H)，2.84(t，J＝6.0Hz，2H)，2.69(t，J＝6.4Hz，4H)，2.44(t，J＝6.2Hz，2H)，0.86(s，18H)，0.03(s，12H)。未观察到胺质子。13C NMR(CDCl3)d173.0，63.4，62.6，57.9，54.4，38.4，38.1，26.4，18.7，-4.9.步骤D.β-丙氨酸，N-(2-甲氧甲酰基吖啶-9-基)，2-[二(2-羟乙基)氨基]乙酯搅拌10mL CHCl3中的β-丙氨酸，2-[二(2-叔丁基二甲基甲硅氧基乙基)氨基]乙酯(736mg，1.64mmol)和甲基9-甲氧基吖啶-2-羧化物(669mg，2.50mmol)，使它们于室温反应12.5小时。然后过滤沉淀物(吖啶酮)，将滤液分配于饱和水性NaHCO3(100mL)和CHCl3(3×35mL)之中。合并有机层经Na2SO4干燥，经真空浓缩得到1.61g粘性褐色油状物。在N2下，将粗中间体溶于3.0mL THF中，冷却至0℃并用HF/吡啶(1.0mL)处理，从而实现对所得二醇的脱保护。搅拌1小时，将溶液加热至室温。真空除去挥发物，将残余物分配于饱和水性NaHCO3(100mL)和CHCl3(3×35mL)之中。合并有机层经干燥和浓缩，得到649mg棕黄色固体。经制备TLC法(C-18，CH3CN)，得到产率为20％的所需二醇β-丙氨酸，N-(2-甲氧甲酰基吖啶-9-基)，2-[二(2-羟乙基)氨基]乙酯(＞80％纯，HPLC)。1H NMRd8.82(s，1H)，8.21-7.94(m，2H)，7.94-7.72(m，2H)，7.59(表观t，1H)，7.23(表观t，1H)，4.30-4.18(m，2H)，4.18-4.05(m，2H)，3.89(s，3H)，3.69-3.50(m，4H)，2.92-2.73(m，4H)，2.73-2.55(m，4H)未观察到胺和羟质子。步骤E.β-丙氨酸，N-(2-甲氧甲酰基吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐采用类似于Peck等(J Am.Chem.Soc.1959，813984)的方法，将β-丙氨酸，N-(2-甲氧甲酰基吖啶-9-基)，2-[二(2-羟乙基)氨基]乙酯转化成二氯化合物。于室温，将在无水SOCl2(6mL)中的步骤D产物的黄色溶液(41mg，0.090mmol)搅拌20小时。然后真空除去SOCl2，得到黄色固体(二盐酸盐)。然后，将材料分配于饱和NaHCO3(50mL)和CH2Cl2(3×20mL)之中。合并有机层经Na2SO4干燥。真空除去溶剂，得到35.4mg二氯化合物游离碱，为橙色胶状物。1H NMRd8.82(s，1H)，8.20-7.83(m，4H)，7.5(表观t，1H)，7.25(表观t，1H)，4.36-4.15(m，4H)，3.93(s，3H)，3.48(t，J＝6.9Hz，4H)，3.06-2.77(m，4H)，2.86(t，J＝6.9Hz，4H)。未观察到胺质子。13C NMRd172.3，166.6，155.2，146.5，144.6，133.1，131.6，128.7，124.6，124.3，116.1，114.3，63.7，57.2，53.5，52.9，46.3，42.5，35.2。未观察到其他碳。加入在醚中的1M HCl，将HCl盐从CH2Cl2中沉淀出来，得到β-丙氨酸，N-(2-甲氧甲酰基吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐(化合物IV)，为一黄色固体(81％纯，HPLC)。
按类似方法制备β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐(化合物V)。用9-甲氧基吖啶代替步骤D中的甲基9-甲氧基吖啶-2-羧化物，得到中间体二醇(7.1％)，为一黄色油状物(74％纯，HPLC)。1H NMRd8.14(d，J＝7.5Hz，2H)，7.93(d，J＝8.6Hz，2H)，7.52(表观t，2H)，7.23(表观t，2H)，4.36-4.08(m，4H)，3.76-3.5(m，4H)，3.08-2.60(m，8H)。未观察到胺和羟质子。
于23℃，将中间体二醇(37.3mg，0.0793mmol)在亚硫酰氯(4.0mL)中的溶液搅拌7.5小时。真空除去亚硫酰氯，得到黄色油状物。材料溶于乙醇(约4mL)中，并真空除去溶剂。然后将材料溶于CH2Cl2(4mL)中，并真空除去溶剂；该步骤重复两次。然后，用己烷(3×4mL)研磨材料，得到40.0mg产物，为一黄色吸湿性玻璃状固体(42％纯，HPLC)。可将一些材料转化成供分析用的游离胺将材料分配于饱和NaHCO3和CH2Cl2之中，然后经Na2SO4干燥合并有机层，并真空除去溶剂。1H NMRd8.21-8.00(m，4H)，7.66(表观t，2H)，7.38(表观t，2H)，4.26-4.12(m，2H)，4.12-3.98(m，2H)，3.43(t，J＝6.9Hz，4H)，2.96-2.68(m，8H)。未观察到胺质子。
用N-(叔丁氧基羰基)-4-氨基丁酸代替N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸，按上述步骤可制得4-氨基丁酸N[(2-甲氧甲酰基吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐，化合物VI(78％纯，HPLC)。1HNMRd8.89(s，1)，8.12(表观t，2)，7.93-7.80(m，2)，7.59(表观q，1)，7.36-7.20(m，1)，4.16(t，2，J＝5.7Hz)，4.07-3.92(m，2)，3.97(s，3)，3.46(t，4，J＝6.9Hz)，2.93-2.80(m，6)，2.60(t，2，J＝6.5Hz)，2.29-2.12(m，2)。未观察到胺质子。实施例9流式细胞分析红细胞以评价聚乙二醇修饰的水平按标准血库方法，将1单位的ABO型全血(Sacramento血液中心，CA)进行白细胞过滤。红细胞用磷酸盐缓冲的盐水(PBS，包括150mM磷酸盐pH＝9.2)冲洗3-4次，以除去血浆蛋白质并将胞外pH值调至反应所需的水平。用PBS将悬浮液体积调至40％HCT。在PBS中配制氰尿酰氯活化的MPEGA溶液(2.3mL，4.3mM)，并将1mL等分红细胞悬浮液加到该溶液中。用试管倒相器将溶液混合1小时，然后于室温温育16-24小时。室温温育后，该溶液用血库盐水冲洗3次，以除去任何过量的MPEG和任何其他反应副产物。冲洗后，加入AdsolTM(包括154mM NaCl，2.0mM腺嘌呤，41.2mM甘露醇和111.0mM葡萄糖，BaxterHealthcare公司，IL)，使最终HCT为40％。所得红细胞悬浮液于4℃贮藏。
采用FACScanTM(Becton，Dickinson and Co.，NJ)，用流式细胞分析方法分析修饰后的细胞与荧光标记抗体的结合能力。取等分细胞离心，并弃去上层清液。于室温，将50μL一份的红细胞(约1×106细胞)与5μL适当的贮备抗体溶液(即将与非MPEG修饰的红细胞结合的抗体，例如抗-A FITC偶联BRIC-145、抗-B FITC偶联BGRL1或抗-D FITC偶联BRAD-3，取决于血型，国际血型标准实验室，英国)温育1小时。接着冲洗细胞，以除去过量的抗体，并用流式细胞分析法分析细胞与荧光抗体的结合。将结合荧光抗体的水平与非MPEG修饰的细胞(阳性对照)或未与FITC抗体细胞温育的细胞(阴性对照)进行比较。用总体最大荧光的比值(待试物-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照)，可以测定PEG化的相对程度。在附图1中以A2/A1表示。实施例10包含Tresyl MPEG或SPA MPEG的红细胞组合物与β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯反应经白细胞过滤的包装红细胞(PRBC，60％血细胞比容)与20mL包含30mg β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2[二(2-氯乙基)氨基]乙酯和184mg谷光甘肽的4.5％葡萄糖一水合物溶液混合，所述红细胞中包含适宜的添加溶液，例如Erythrosol(0.782g/100mL枸橼酸钠二水合物，0.073g/100mL磷酸二氢钠二水合物，0.303g/100mL磷酸氢二钠二水合物，0.022g/100mL腺嘌呤和0.774g/100mL甘露醇)。将所得溶液移至一反应容器中，并于19-25℃温育12-20小时。然后，将该溶液高速旋转成80-90％血细胞比容，用pH＝8的Hepes缓冲液(150mM Hepes，50mM NaCl，75mM葡萄糖)冲洗两次，接着稀释成血细胞比容为40％，进入到含有适当浓度Tresyl MPEG或SPA MPEG的Hepes缓冲液中。溶液充分混合后，于室温或低于室温下温育。经适宜的温育之后，将红细胞高速旋转，并适当添加溶液将其血细胞比容调至60％。将最终溶液任选移至血袋中(其中包含用于降低过量试剂和副产物水平的吸附介质)。然后，按前述实施例方法，对最终溶液进行有关红细胞功能和红细胞免疫原性方面的评价。采用下面的实施例11方法，可测定MPEG修饰的量(MPEG/红细胞)。实施例11测定PEG化RBC的修饰密度按实施例10制备供PEG化的RBC。在PEG化步骤中，用活化MPEG与FITC标记的同类活化MPEG的混合物，代替活化MPEG，在其另一端基上带有荧光标记。另外，可用其他可检测的标记(例如放射性同位素)修饰活化MPEG。该实验采用50∶50的混合物。反应于RT(室温)进行2小时，接着冲洗细胞以除去反应副产物。接着，用冷却的低渗溶胞缓冲液(1600μL)(7.5mM磷酸钠，1mM NaEDTA，pH7.5)，将红细胞浓缩物(200μL)控制溶胞成红细胞影膜。所得红细胞影经离心(14000×g，2分钟)分离，并用冷却的溶胞缓冲液冲洗4次，然后用相同缓冲液将体积调至250μL。将SDS加到悬浮液中(最终[SDS]＝1％)，使膜完全溶解。将所得溶液在溶胞缓冲液中进一步稀释5倍，然后进行荧光分析(λexc＝490nm，λemm＝525nm)。通过标准曲线(在相同介质中加入特定量的FITC MPEG)，计算荧光标记的量。在红细胞影上的FITC MPEG浓度(或另一适宜标记的浓度)和制备红细胞影的细胞数量的基础上，可计算出给定实验中每个细胞上的MPEG量(膜修饰密度)。
利用FPEG法测量红细胞PEG化的另一方法，是采用FACScan设备经流式细胞分析法测定PEG化的RBC。可用商用设备直接对RBC进行荧光强度分析。连接到RBC表面上的PEG分子数量，与活化PEG中活化FPEG的百分率成比例。通过上述方法或通过与包含已知量荧光分子的小珠比较所得的PEG化标准曲线，评价FACScan强度与PEG含量的关系。FACScan设备可采用市售小珠，可按产品说明书(BangsLaboratories)制备这种小珠。
对PEG分子进行定量的另一方法是使用放射性标记的活化MPEG(通过与3H、14C或其他适当放射性原子共价连接而进行标记)。PEG化之后冲洗红细胞，然后对冲洗后的RBC进行溶胞、脱色，并通过液闪测定放射性含量。以放射标记的活化MPEG的特异性活性，计算PEG化程度。实施例12PEG化对细菌的生物效应为了评价PEG化对细菌的影响，将小肠结肠炎耶尔森菌的过夜培养物置于LB肉汤中生长。以0.1×O.D.读数0.15-0.2为基础，估计过夜培养物的滴度约为9log cfu/ml。细菌贮备液用HEPES缓冲液(150mM HEPES+50mM NaCl+75mM葡萄糖pH8.0)冲洗两次，然后以3800rpm(约4200×g)离心6分钟，并用HEPES缓冲液调至最初体积。细菌溶液用HEPES缓冲液1∶1000稀释，达到6log cfu/mL细菌。称取SPA PEG(330mg)，并经剧烈涡流完全溶于HEPES缓冲液(2700mL)中。将小肠结肠炎耶尔森菌(6log cfu/mL悬浮液300μL)直接加到PEG溶液中，使反应中的最终计数达到5log cfu/mL细菌。对照品(不含PEG)的反应在分液试管中进行，将小肠结肠炎耶尔森菌(6logcfu/mL悬浮液300μL)加入HEPES缓冲液(2700mL)。试管于RT温育2小时。温育后，两个试管中的试样用Adsol冲洗两次。每一试管取等分试样(0.5mL)(于t＝0小时、t＝2小时和Adsol冲洗后)。将等分试样稀释、铺板，然后于37℃过夜温育。温育后，观察平板中细菌的生长。尽管与未处理的细菌相比，用SPA PEG处理的细菌的菌落形成需要更长的温育期且菌落大小变化较大，但是这种处理后的细胞依然保持活力。与未处理的细菌相比，经SPA PEG处理后细菌的菌落形态基本相同，并且二者的滴度基本上相同(处理的细菌为4.8，而未处理的细菌为5.4，均经Adsol冲洗)。
可对细菌进行分析，来评价其抗体与特定细菌抗原(抗体为市售产品，例如Research Diagnostics公司，Flanders，NJ)的结合能力。这样，可确定细菌是否能在输血中掩蔽个体免疫系统的识别。抗原结合是细菌生长的函数，测定抗原结合可评价掩蔽的细菌是否会在一定水平的细胞分裂之后接着与抗体结合。可同样用荧光或放射标记PEG对细菌进行处理，以评价细菌上PEG量随着细菌生长时间的变化，从而确定掩蔽细菌抗原所需的PEG修饰水平，以及确定掩蔽的细菌需生长到什么水平才能变得不再掩蔽个体的免疫应答。用FACS对荧光PEG处理的细菌进行分析，可说明PEG对细菌的修饰。实施例13缓冲液冲洗对pH值和红细胞PEG化程度的影响按标准血库方法，对1单位的ABO型全血(Sacramento血液中心，CA)进行白细胞过滤处理。红细胞(RBC)经高速旋转(3800rpm(4097×g)下6分钟)并除去血浆。然后取细胞等分加入3个不同的试管中红细胞用14×体积的缓冲液冲洗4次，红细胞用1×体积的缓冲液冲洗2次或者红细胞不经缓冲液冲洗，来研究冲洗对胞外pH和PEG化程度的影响。
在第一种处理中，红细胞(2mL，约85％HCT)用14×体积的HEPES缓冲液(150mM HEPES，50mM NaCl，pH＝8.0)冲洗4次。称取SPA PEG(221mg)，并经剧烈涡流完全溶于HEPES缓冲液(1.3mL)中。将溶解的PEG直接加到冲洗后的红细胞中并混合。对照品(不含PEG)的反应同样在分液容器中进行。
在第二种处理中，红细胞(7.5mL，约85％HCT)用等于RBC体积的HEPES缓冲液冲洗2次。称取SPA PEG(825mg)，并经剧烈涡流完全溶于HEPES缓冲液(7.5mL)中。将溶解的PEG直接加到冲洗后的红细胞并混合。同样在分液容器中进行对照品(不含PEG)的反应。在试管3，采用未冲洗的红细胞(7.5mL)。称取SPA PEG(825mg)，并经剧烈涡流完全溶解于HEPES缓冲液(7.5mL)中。将溶解的PEG直接加到红细胞并混合。对照品(不含PEG)的反应同样在分液试管中进行。
反应在3个试管中RT进行1小时，接着用2×体积的血库盐水冲洗细胞，除去反应副产物。
每一试管冲洗之后，从每一试管中取等分试样，测定pH和PEG化程度。用标准标定的pH计测量。对照实验表明，PEG的存在对测定的pH值无影响。
胞外pH值如下表所示
红细胞用14×体积缓冲液冲洗4次和用1×体积缓冲液冲洗2次后，其pH值约恒定为pH8。结果表明，与未冲洗的试样相比，红细胞与PEG(或不含PEG的对照品)温育之后其pH较高。同时还观察到，含有PEG的试样的pH值低于对照品的pH值，这表明需对PEG化过程中的pH进行更好的控制。对这些试样进行的PEG化结果定量地表明，冲洗体积的高或低对PEG化无影响。然而，未经冲洗的红细胞会明显降低PEG化的速度和程度。
权利要求
1.一种红细胞组合物，其中包括被怀疑含有病原体的红细胞，所述红细胞组合物经处理已基本上灭活了病原体并基本上掩蔽了红细胞抗原，与未处理的红细胞组合物产生免疫反应相比，经这样处理的红细胞组合物输给抗原不匹配动物时，所引起的免疫反应降低，所述处理后的红细胞组合物适于体内使用。
2.如权利要求1的组合物，其中红细胞在输血后循环24小时的体内存活率高于75％。
3.如权利要求2的组合物，其中红细胞于4℃贮存14天后的体内存活率高于75％。
4.如权利要求2的组合物，其中红细胞于4℃贮存35天后的体内存活率高于75％。
5.如权利要求的组合物2，其中红细胞于4℃贮存42天后的体内存活率高于75％。
6.如权利要求1的组合物，所述基本上被掩蔽的红细胞抗原是次要抗原。
7.如权利要求1的组合物，其中当红细胞呈Rh阳性时，与未处理的红细胞相比，处理后的红细胞与抗-D抗体的体外结合至少降低了90％。
8.如权利要求1的组合物，其中当红细胞呈Rh阳性时，与未处理的红细胞相比，处理后的红细胞与抗-D抗体的体外结合至少降低了95％。
9.如权利要求1的组合物，其中当红细胞呈Rh阳性时，与未处理的红细胞相比，处理后的红细胞与抗-D抗体的体外结合至少降低了99％。
10.如权利要求1的组合物，其中当存在病原体时，至少3log的所述病原体被灭活。
11.如权利要求10的组合物，其中病原体是细菌。
12.一种红细胞组合物，其中包括被怀疑含有病原体的红细胞，所述红细胞组合物经核酸亲和性化合物处理已基本上灭活了病原体，所述化合物具有经反应而与核酸共价结合的效应基团，并且所述红细胞组合物经与抗原掩蔽化合物反应而基本上掩蔽了红细胞抗原，与未处理的红细胞组合物产生免疫反应相比，经这样处理的红细胞组合物输给抗原不匹配性动物时，可降低免疫反应，其中处理后的红细胞组合物适于体内使用。
13.如权利要求12的组合物，其中对核酸具有亲和性的化合物包含核酸结合配体。
14.如权利要求13的组合物，其中效应基团选自芥基团和芥基团等价物。
15.如权利要求14的组合物，其中抗原掩蔽化合物包括聚乙二醇。
16.如权利要求14的组合物，其中抗原掩蔽化合物包括聚乙二醇衍生物。
17.如权利要求14的组合物，其中抗原掩蔽化合物选自活化聚乙二醇和活化聚乙二醇衍生物。
18.如权利要求12的组合物，其中对核酸具有亲和性的化合物选自奎吖因芥和β-丙氨酸，N(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯，和其中抗原掩蔽化合物选自2，2，2-三氟乙磺酸基单甲氧基聚乙二醇、N-羟琥珀酰亚胺基丙酸单甲氧基聚乙二醇和N-羟琥珀酰亚胺基丁酸单甲氧基聚乙二醇。
19.如权利要求18的组合物，其中对核酸具有亲和性的化合物是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。
20.离体处理红细胞组合物的方法，包括(a)在可基本上灭活病原体的条件下，将红细胞组合物与能基本上灭活组合物中可能存在的病原体的化合物接触；和(b)在显著降低红细胞免疫原性的条件下，将红细胞组合物与能结合到红细胞上并基本上掩蔽红细胞抗原的化合物接触，与未处理的红细胞组合物相比，经这样处理的红细胞组合物输给抗原不匹配动物时，所引起的免疫反应降低。
21.如权利要求20的方法，其中病原体灭活化合物对核酸有亲和性。
22.如权利要求21的方法，其中病原体灭活化合物包括经反应与核酸共价结合的效应基团。
23.如权利要求22的方法，其中病原体灭活化合物包含核酸结合配体。
24.如权利要求23的方法，其中效应基团选自芥基团和芥基团等价物。
25.如权利要求20的方法，其中与红细胞结合的化合物包括聚乙二醇。
26.如权利要求20的方法，其中与红细胞结合的化合物包括聚乙二醇衍生物。
27.如权利要求20的方法，其中与红细胞结合的化合物选自活化聚乙二醇和活化聚乙二醇衍生物。
28.权利要求1中组合物的使用方法，包括将所述组合物输给需要红细胞输血的个体。
29.权利要求2中组合物的使用方法，包括将所述组合物输给需要红细胞输血的个体。
30.权利要求7中组合物的使用方法，包括将所述组合物输给需要红细胞输血的个体。
31.权利要求10中组合物的使用方法，包括将所述组合物输给需要红细胞输血的个体。
32.权利要求11中组合物的使用方法，包括将所述组合物输给需要红细胞输血的个体。
33.权利要求12中组合物的使用方法，包括将所述组合物输给需要红细胞输血的个体。
34.权利要求14中组合物的使用方法，包括将所述组合物输给需要红细胞输血的个体。
35.权利要求17中组合物的使用方法，包括将所述组合物输给需要红细胞输血的个体。
36.权利要求18中组合物的使用方法，包括将所述组合物输给需要红细胞输血的个体。
37.权利要求19中组合物的使用方法，包括将所述组合物输给需要红细胞输血的个体。
38.离体处理红细胞组合物的方法，包括(a)提供一种被怀疑含有细菌的红细胞组合物，其中可能存在的细菌与抗原掩蔽化合物反应后比未与抗原掩蔽化合物反应的细菌更具传染性，(b)在基本上灭活细菌的条件下，将所述红细胞组合物与基本上灭活组合物中细菌的化合物接触；和(c)在可显著降低红细胞免疫原性的条件下，将所述红细胞组合物与足量的抗原掩蔽化合物接触，使抗原掩蔽化合物结合到红细胞上并基本上掩蔽红细胞抗原，与未处理的红细胞组合物相比，经这样处理的红细胞组合物输给抗原不匹配动物时，所引起的免疫反应降低。
39.如权利要求38的方法，其中细菌灭活化合物对核酸有亲和性。
40.如权利要求39的方法，其中细菌灭活化合物包括经反应与核酸共价结合的效应基团。
41.如权利要求40的方法，其中细菌灭活化合物包含核酸结合配体。
42.如权利要求的方法41，其中效应基团选自芥基团和芥基团等价物。
43.如权利要求38的方法，其中抗原掩蔽化合物包括聚乙二醇。
44.如权利要求38的方法，其中抗原掩蔽化合物包括聚乙二醇衍生物。
45.如权利要求38的方法，其中抗原掩蔽化合物选自活化聚乙二醇和活化聚乙二醇衍生物。
46.一种红细胞处理系统，包括a)包含被怀疑含有病原体的红细胞组合物，其中红细胞组合物经处理已基本上灭活了病原体并基本上掩蔽了红细胞抗原，与未处理的红细胞组合物产生免疫反应相比，经这样处理的红细胞组合物输给抗原不匹配动物时，所引起的免疫反应降低，和b)包含红细胞组合物的血袋，其中红细胞组合物适于输送给个体。
47.如权利要求46的系统，其中红细胞在输血后循环24小时的体内存活率高于75％。
48.如权利要求47的系统，其中红细胞于4℃贮存14天后的体内存活率高于75％。
49.如权利要求47的系统，其中红细胞于4℃贮存35天后的体内存活率高于75％。
50.如权利要求47的组合物，其中红细胞于4℃贮存42天后的体内存活率高于75％。
51.如权利要求46的系统，其中当红细胞呈Rh阳性时，与未处理的红细胞相比，处理后的红细胞与抗-D抗体的体外结合至少降低了90％。
52.如权利要求46的系统，其中当红细胞呈Rh阳性时，与未处理的红细胞相比，处理后的红细胞与抗-D抗体的体外结合至少降低了95％。
53.如权利要求46的系统，其中当红细胞呈Rh阳性时，与未处理的红细胞相比，处理后的红细胞与抗-D抗体的体外结合至少降低了99％。
54.如权利要求46的系统，其中当存在病原体时，至少3log的所述病原体被灭活。
55.如权利要求54的系统，其中病原体是细菌。
56.一种药物，包括被怀疑含有病原体的红细胞，其中红细胞组合物经处理已基本上灭活了病原体并基本上掩蔽了红细胞抗原，与未处理的红细胞组合物产生免疫反应相比，经这样处理的红细胞组合物输给抗原不匹配动物时，所引起的免疫反应降低。
57.如权利要求56的药物，其中红细胞在输血后循环24小时的体内存活率高于75％。
58.如权利要求57的药物，其中红细胞于4℃贮存14天后的体内存活率高于75％。
59.如权利要求57的药物，其中红细胞于4℃贮存35天后的体内存活率高于75％。
60.如权利要求57的药物，其中红细胞于4℃贮存42天后的体内存活率高于75％。
61.如权利要求56的药物，其中当红细胞呈Rh阳性时，与未处理的红细胞相比，处理后的红细胞与抗-D抗体的体外结合至少降低了90％。
62.如权利要求56的药物，其中当红细胞呈Rh阳性时，与未处理的红细胞相比，处理后的红细胞与抗-D抗体的体外结合至少降低了95％。
63.如权利要求56的药物，其中当红细胞呈Rh阳性时，与未处理的红细胞相比，处理后的红细胞与抗-D抗体的体外结合至少降低了99％。
64.如权利要求56的药物，其中当存在病原体时，至少3log的所述病原体被灭活。
65.如权利要求64的药物，其中病原体是细菌。
全文摘要
本发明提供了用于制备红细胞组合物的化合物和方法，所述红细胞组合物经处理后显著降低了抗原性，并且其中任何可能的病原体污染物也已基本上被灭活。该红细胞组合物特别适于输给免疫反应的可能性高的个体(例如，异源免疫的受血者或在输入不匹配血的可能性较高的创伤处境下)。本发明红细胞组合物明显降低与输血有关的疾病传播的风险，并明显降低与输血有关的免疫反应的风险。
文档编号A61P31/04GK1436083SQ01810485
公开日2003年8月13日 申请日期2001年5月31日 优先权日2000年5月31日
发明者A·斯塔西诺普洛斯 申请人:塞鲁斯公司