专利名称：预防神经组织损伤和治疗α－共核蛋白疾病的方法
本申请的基础是2000年7月7日提交的临时申请60/217,319和2001年3月28日提交的临时申请60/279,199，以其全文在此引作参考。
PD的特征是路易体的形成和多巴胺能神经元的死亡。[Adams D.等，Principles of Neurology，874-880，第3版，McGraw-Hill，NY，(1985)]。PD的神经病理学的检验标记是路易体。路易体是变性神经元中出现的胞质内的内含物，所述变性神经元由丝状和粒状物质的密集核组成，所述丝状和粒状物质的周围是直径具有10-20nm的基本导向的丝[Goedert，20 M.等，Curr.Op.Neurobio.8619-32(1999)]。总之，引起PD的原因是未知的，并且对遗传和环境因素的相对作用一直存在激烈的争论[Tanner，C.等，JAMA，281341-6(1999)]。与锰的接触促使了矿工中的帕金森氏病综合症，这些矿工还包括精神分裂症形式的行为。一些流行病学的研究已发现工业上接触铁与PD发病率之间的关系[Corell J.M等，Toxicol.Appl.Pharmacol.，80467-72，(1985)]、PD发病率和血汞浓度之间的关系[Ngim C.H.等，Neuroepi.，8(3)128-141(1989)]以及PD的死亡率和接近铁相关的工业加工有关系[Rybicki A.等，Mov Disord.，8(1)87-92(1993)]。
α-共核蛋白最初鉴定为斑马雀鸣鸟学唱歌的关键时期中向上调节与神经元分支相关的蛋白[George M.等，Neuron，15361(1995)]。α-共核蛋白是遍在蛋白，其与伴侣蛋白14-3-3共享显著的物理的和功能的同源性，并且在大脑中特别丰富[Ostrerova N.等，J.Neurosci.，195782(1990)；Clayton D.等，TINS 21249(1998)]。α-共核蛋白通常在第87和129位的丝氨酸上是磷酸化的[Okochi M.等，J.Biol.Chem.，275390(2000)]。近期的研究表明α-共核蛋白的突变可导致家族式PD以及α-共核蛋白在路易体中积累。这些发现暗示α-共核蛋白参与了PD的病理生理学[Spillantini M.等，Nature，388839(1997)；Spillantini M.等，PNAS USA，956469(1998)；Jenner P.等，Ann.Neurol.，44S72(1998)]。迄今为止只鉴定与家族PD相关的突变是α-共核蛋白基因中的A53T和A30P的突变[Goedert，M.等，Curr.Op.Neurobio.，8619-32(1999)；Papadimitriou，A.等，Neurology，52651-4(1999)；Polymeropoulos，M.等，Science，2761197-9(1997)]。然而，有许多环境证据牵涉到疾病的病原学中的氧化性应激反应[Jenner，P.等，Annual Neurol.，44S72-84(1998)]。
多种试验证据暗示路易体与α-共核蛋白相互作用。例如，免疫组织化学的研究表明路易体对α-共核蛋白和遍在蛋白有强的着色力[Jener，P.等，Annual Neurol.，44S72-84(1 998)；Markopoulou，K.等，Annual.Neurol.，46374-81(1999)；Spillantini，M.等，Nature，388839-40(1997)；和Spillantini，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，956469-73(1998)]。利用重组蛋白的体外试验提示与野生型α-共核蛋白比较，在A53T和A30P突变增加α-共核蛋白聚集[Conway，K.等，Nature Med.，41318-20(1998)；Giasson，B.等，J.Biol.Chem.，2747619-22(1999)；Hashimoto，M.等，Brain Res.，25 799301-6(1998)]。
关于α-共核蛋白聚集和路易体形成的重要问题之一是这些过程是否伤害细胞。路易体可能是对自由基损伤反应出现的惰性墓石标记，或者它们可能是损伤细胞的毒剂。两种情形的例子存在于文献中。聚集的淀粉状蛋白-β(Aβ)有毒于神经元，而脂褐素似乎对细胞无害[Behl，C.等，Cell 77817-27(1994)]。亨廷顿蛋白(Huntington’sProtein)呈现一个中间位置，其中与亨廷顿相关的毒性似乎在聚集之前，并且亨廷顿蛋白的聚集甚至可以是保护性的[Saudou，F.等，Cell9555-66(1998)]。我们自己以前的研究显示短暂的α-共核蛋白过表达对多种细胞是有毒的，包括两个神经元细胞系SK-N-SH和PC12[Ostrerova，N.等，Neurosci.，195782-91(1999)]。与此观测相一致，最近，Masliah及其同事已证明小鼠过表达α-共核蛋白显示多巴胺能末梢丧失和运动损害，与年龄相关，这可能是毒性的指征[Masliah，E.等，Science，2871265-1269(2000)]。这些发现暗示α-共核蛋白聚集速率的增加可有助于对PD和其他路易体病中神经的机制的探讨。
对转基因动物的最新研究还暗示α-共核蛋白的聚集对神经元是有害的。近来有报道多巴胺能功能障碍发生在表达野生型人α-共核蛋白的转基因小鼠中[Masliah，E.等，Science，2871265-1269(2000)]。进一步，有报道果蝇过表达α-共核蛋白，表现出多巴胺能功能障碍和多巴胺能神经元死亡与α-共核蛋白聚合体的发展有关[Feany，MB.等，Nature，404394-8(2000)]。证据提示神经元具有多巴胺形成α-共核蛋白聚合体以及随着这些聚合体的发展而变性。
近来，由铁和过氧化氢所产生的氧化性应激反应已显示诱导α-共核蛋白在体外形成淀粉样聚集[Hashimoto，M.等，NeuroReport，10717-21(1999)；Paik，S.等，Biochem.J.，340821-8(1990)]。据认为氧化性应激有助于PD，因为多巴胺是强的自由基发生剂，是黑质中神经递质的要素[Chiueh，C.等，Adv.Neurol.，60251-8(1993)；Jenner，P.等，Ann.Neurol.，2544S72-84(1998)]。此外，铁也刺激自由基生成，随着年龄的增长铁积累在黑质中[Jenner，P.等，Ann.Neurol.，44S72-84(1998)]。铁作为血铁黄素颗粒沉积在胞质中，以及充满铁蛋白颗粒的线粒体已在ventorlateral丘脑、尾状核和豆状核的神经元和神经胶质细胞以及帕金森氏病人大脑的黑质中观测到。[Earle M.等，J.Neuropathol.Exper.Neurol.，27(1)1-14，(1968)；Asenjo A.等，Rev.Neurologique，121(6)581-92，(1969)；Riederer P.等，J.Neurochem.，52(2)515-20，(1989)]。因此，存在于黑质中的氧化性条件可促进α-共核蛋白聚集。然而，在现有技术中，这些氧化性条件是否真正促进活神经元中α-共核蛋白聚集是未知的。
所以，需要存在抑制路易体形成的物质，该物质可用于治疗如PD疾病。同时，通过筛选分析寻找这些物质的途径也是本领域需要的。美国专利号6,184,351公开共核蛋白聚集可通过以高浓度连续振荡α-共核蛋白很长一段时间来诱导。然而，所需的高浓度和连续振荡既不是生理的也不利于筛选分析的开发。此外，‘351专利中所述的分析不直接测定α-共核蛋白聚集；但对可溶未聚集的蛋白进行测定。另外，‘351分析只是直接检测影响成核的药剂，而不检测由于其他机制会抑制聚集的药剂。所以，筛选用于抑制路易体形成的药物的更好方法将对本领域有益。
本发明的目的是提供鉴定、筛选和模拟能抑制α-共核蛋白的聚集途径的药剂。因此药剂例如是阳离子、小分子、肽、肽模拟化合物、核酸、合成糖，如肝素类似物，或它们的组合。
本发明的另一目的是设计、制备和使用抗α-共核蛋白聚集药物，用于治疗神经变性症状，如PD，阿尔茨海默氏病、弥漫性路易体病、混合AD-PD、多种系统萎缩症以及哈-斯二氏病。
A&B)BE-M17细胞过表达野生型A53T或A30Pα-共核蛋白，用不同剂量的FeCl2处理48小时，并利用MTT测定(A)或LDH分析(B)测定生存力。
C)BE-M17细胞过表达野生型A53T或A30Pα-共核蛋白，用不同剂量的H2O2处理48小时，并利用MTT测定测定生存力。*ANOVA分析p＜0.001，+，p＜0.01。
图2铁与α-共核蛋白结合A)FeCl2由α-共核蛋白中的酪氨酸猝灭荧光发射光谱(λex＝280nm)。高剂量的铁(＞10mM)会猝灭酪氨酸荧光，然而，结合铁的蛋白表现出在较低剂量时猝灭(推测是因为通过蛋白结合使铁放置于靠近酪氨酸的位置)。酪氨酸具有荧光发射光谱，所述光谱在280nm处受激发时，发射峰为310nm。
B)铁与野生型和ΔC1-113α-共核蛋白结合的剂量反应曲线以荧光发射为基础。缺失构建体缺少α-共核蛋白的最后27个氨基酸，并分析这种构建体的结合。α-共核蛋白ΔC1-113的C-末端缺失构建体显示与铁结合减少超过4倍，IC50＝726μM(p＜0.001)(图2B)。
图3镁保护共核蛋白聚集。
A)镁将α-共核蛋白转化成抗聚集的构象。
B)镁抑制α-共核蛋白聚集。a)镁(0.1mM)抑制铁诱导的重组野生型α-共核蛋白的聚集(4μM，24小时温育)。b)镁还诱导初级神经元中α-共核蛋白的聚集。需要较高的剂量，这是因为细胞膜给离子通道造成障碍。相似的结果见于BE-M17细胞过表达α-共核蛋白。
发明详述如许多参与神经变性疾病的其他蛋白一样，α-共核蛋白具有高度的寡聚/聚集倾向，形成大蛋白丝状体。沉积在路易体中α-共核蛋白在体外倾向于聚集3天以上的周期。该速率在α-共核蛋白的突变形A53T和A30P中增加2-3倍。金属离子、氧化性应激和其他环境因素也可增加聚集的速率(参见下文)。本发明针对能抑制α-共核蛋白寡聚并由此抑制路易体形成和神经变性的治疗剂的开发。容易鉴定这些药剂的方法也是本发明所考虑的。
因此，本发明的一个方面涉及测定药剂在缓解神经疾病症状中是否是有用的方法，作为途径的部分其包括α-共核蛋白聚集，所述方法测定药剂预防α-共核蛋白聚集的能力。一种这样的方法测定药剂是否能够抑制α-共核蛋白的聚集途径，以及包括在外源铁存在下将药剂加入到含有α-共核蛋白的样品中，以及使α-共核蛋白聚集，如果有聚集的α-共核蛋白存在，则测定α-共核蛋白聚集的量，然后将此量与没有药剂的对照样品所测定的量进行对比。聚集量的减少说明药剂能够抑制α-共核蛋白聚集，并由此显示该药剂在治疗疾病中将是有用的。外源铁的加入诱导聚集形成。铁浓度的范围是约0.1-1mM，优选0.1-1mM。
以上分析可在体外用α-共核蛋白来进行，或在细胞培养体系或动物模型中进行。对于体外分析，向α-共核蛋白的溶液中加入会加速聚集的成分，如外源铁或铜(例如，盐或金属蛋白质)，和/或自由基发生剂，例如多巴胺和过氧化氢。也可使用具有加速寡聚倾向的突变α-共核蛋白(A30P或A53T)。同时，加入待测药剂，以及允许有足够时间进行聚集。尽管需要较长一段时间方可观察到聚集，但通常约12小时。
有若干种检测任意聚集的α-共核蛋白的途径，因此本发明不仅限于此。本文举例的一种方法采用SDS-PAGE和免疫印迹。α-共核蛋白寡聚体已显示对SDS是稳定的，因此，寡聚体结合的模式可在印迹上鉴定。测定寡聚程度的第二种方法是用硫黄素-S(thioflavine-S)染色寡聚体并通过荧光显微镜观察丝状体的显现。硫黄素-S与寡聚后形成的β-折叠相结合。
对α-共核蛋白寡聚作用，人们还可使用新型荧光各向异性分析，其在较高通量的药物筛选中大有用途，并且这也是本发明的目的。荧光各向异性是测定溶液中荧光团的旋转扩散。小分子比大复合体旋转得更快，由此随着α-共核蛋白寡聚，相关荧光团的荧光各向异性预期会增加。α-共核蛋白可用胺活性荧光团在中性pH下特异标记在N-末端，这些活性荧光团例如可选自荧光素、芘和丹磺酰衍生物。通过监控各向异性的变化，人们可容易地测定能抑制聚集的化合物，这是因为它们预期会阻断各向异性的增加。参见Lakowicz，Joseph R.，Principles of Florescence Spectroscopy，第5章，第111-153页，PlenumPress(NY)(1986)，在此引作参考。
对于细胞培养分析，可使用成神经细胞瘤细胞，如BE-M17细胞，其可从ATCC中公开获得。为了诱导细胞中的α-共核蛋白聚合体，将细胞用表达α-共核蛋白的载体或其一种突变体(A30P或A53T)转染，由此向上调节α-共核蛋白的生产。该上调作用具有诱导聚集的效应，否则其将不发生。如采用以上的体外分析，将具有或没有自由基发生剂的Fe2+(如过氧化氢和多巴胺)加入到细胞培养物，并对细胞胞内寡聚作用监控12-96小时的周期。聚集的检测例如可通过使用硫磺素-S或标记抗-α-共核蛋白的抗体进行组织化学染色。或者，可收集细胞，使细胞溶解，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并用标记抗-α-共核蛋白抗体免疫印迹。检测聚集的α-共核蛋白的另一途径是使用电子显微镜。
优选的是将一种或多种自由基发生剂如多巴胺和过氧化氢与铁(Fe2+)一起加入到细胞培养分析中。最优选的是仅有Fe2+和过氧化氢作为聚集的诱导剂加入(但对于具有A53T突变的细胞，不需要自由基)。
术语“标记的”意思是用此类生化分析中通常所用的任何物质标记，并且包括例如放射性、酶、化学发光和荧光的标记。优选地，标记是酶，最优选地，标记是过氧化物酶。
在利用人BE-M17成神经细胞瘤细胞的细胞培养分析中，所述人BE-M17成神经细胞瘤细胞过表达野生型、A53T突变或A30P突变的α-共核蛋白，细胞中发生的聚集量依赖于所表达的α-共核蛋白的量和类型，α-共核蛋白聚集的量按序排为A53T＞A30P＞野生型＞未转化。除刺激聚集形成外，α-共核蛋白还似乎诱导毒性。BE-M17成神经细胞瘤细胞过量表达α-共核蛋白对由铁诱导的毒性易损性显示高达4倍的增加。易损性的排序与聚集相同。这些数据暗示α-共核蛋白起着与铁和多巴胺一致作用，以便诱导PD中路易体病理学的形成和PD中的细胞死亡。
本发明的另一方面是抑制α-共核蛋白聚合体形成的方法。更具体而言，该方法是治疗路易体疾病，如帕金森氏病，由此路易体形成通过抑制α-共核蛋白聚集受到控制(或减少)。即，本发明设想用于治疗包括路易体形成的神经变性疾病的方法，其包括给需要的患者施用一种或多种抑制α-共核蛋白聚合体形成的药剂，由此路易体保持原状，或更优选的是减少。这种治疗的细节依赖于所涉及的治疗剂、特定的疾病及其发展阶段以及其他因素如生物有效度等，这些是专业技术人员在确定剂量、施用途径和治疗周期时可考虑的所有因素，并且本发明不受此限制。
本发明的另一方面是用于治疗路易体病的治疗剂，它们已被本发明人发现。尤其是本发明人发现Mg2+抑制α-共核蛋白的聚集。更具体而言，本发明人发现铁和镁与α-共核蛋白结合，但是对α-共核蛋白聚集行使相反的作用。铁增加α-共核蛋白聚合体，而镁抑制α-共核蛋白聚合体。除了降低细胞培养物中的野生型α-共核蛋白聚集以外，镁还降低可见神经元内含物的形成以及防止神经毒性。这些数据是镁在治疗路易体病如PD中治疗作用的指征，其中疾病的进程至少可减慢并可能逆转。
已知PD患者的大脑中铁水平增加，而镁水平下降，但是这些金属在PD病理生理学中所起的作用从来未被阐述。参见例如，Durlach等，Magnes.Res.1125-42(1998)。现有技术没有暗示调节大脑中铁和镁的平衡会对如路易体形成或疾病的发展具有影响。Glick的美国专利号4,985,256；4,837,164和5,004,615公开施用镁来提高痴呆的记忆，其中提到了ALS-PD(“肌萎缩外侧硬化和帕金森氏病复合体”)。该病由Guam识别，并涉及那些受影响的大脑细胞中高水平的铝和低水平的镁。然而，症状不同于帕金森氏病，尤其是有关路易体的形成，其没有ALS-PD。此外，为此目的，Glick暗示补充镁是使丘脑中的镁升高至正常水平，而非干扰α-共核蛋白聚集。直至本发明才显示镁对α-共核蛋白聚集具有影响。
所以，作为优选的实施方案，将Mg2+给需要治疗路易体病的哺乳动物施用。Mg2+可以任何非毒性可药用形式。优选施用的镁如硫酸镁、磷酸镁、葡糖酸镁、氧化镁、氢氧化镁、氯化镁、碳酸镁或其组合施用。对于肠胃外施用，最优选的是硫酸镁。
如本文所用的术语“施用”是指把药物应用或传递到哺乳动物。该术语意在包括完成药物应用或传递的任何施用方法，但优选的是那些将镁靶向所涉及的大脑组织中的施用方法。该术语还旨在包括任何对完成这些施用所必需的方法，如糖装载程序以便使药物跨越血脑屏障，如果需要。
镁的剂量由专业技术人员例如通过参照用镁盐治疗其他症状的治疗方案来确定。镁的施用不应达到毒性水平。本发明人通过实验已发现体外抑制α-共核蛋白聚集所要求的镁是临床方案中使用镁的通常所采用的范围内(例如妊娠惊厥)，即0.5-2mM MgSO4。正常成人中血浆水平是每升1.5-2mEq，其中约三分之一与蛋白结合。在高镁血症中，其主要是由于肾不足，过量的镁导致中枢神经系统和周围神经肌肉连接的降低。当血浆水平开始超过每升4mEq时，深度腱反射变得降低或缺乏，在此点呼吸瘫痪是危险的。所以，根据本发明在用镁盐治疗时，对镁水平应进行适当的监控。
镁盐治疗性地用于人中已有多年。例如，许多抗酸剂由镁盐组成，具体是柠檬酸盐和硫酸盐。因此，如果通过胃肠道施用镁，预计这些盐是有用的。对于肠胃外(肌内或静脉内)施用，这在本发明中是优选的，因为可达到较高的全身性水平，所选择的盐是硫酸镁。这种施用已在治疗与妊娠惊厥相关的发作中采用多年，其中依据体重给定起始和维持剂量。对于妊娠血毒症的剂量计划，参见Flowers等，Obstet.Gyn.，19315-327(1962)，其内容在此引作参考。根据本发明，这个方案还适用于治疗路易体病，其血浆浓度也在3-6mg.％的范围内。然而，在进行性神经变性路易体病如PD的情况下，该方案可持续余下的生命。
本发明人还发现其他用于治疗路易体病和共核蛋白病(Synucleinopathies)(该病有α-共核蛋白参与它们途径，但不必是路易体)的药剂是肽或其衍生物，所述肽或其衍生物与α-共核蛋白结合并抑制其聚集。这些肽单独或其组合物可用于治疗具有神经变性疾病的个体，该神经变性疾病显示路易体病理学。当不被任何特定的理论所束缚时，据信肽与α-共核蛋白的结合以某种方式防止α-共核蛋白的聚集，也许是通过Fe2+的作用来干扰聚集。
例如利用噬菌体展示来筛选那些噬菌体在其表面上表达与α-共核蛋白结合的肽，可发现这些肽，并确定是什么肽。通过利用如那些在此公开或如美国专利号6,184,351中公开的分析，在此引作参考，由此而言也可测试该肽或任意肽的抑制效果从而确定其作为药剂治疗路易体病或共核蛋白病的有效性。根据这些肽与α-共核蛋白的C-末端(大约氨基酸第113-140位)和NAC部分(大约氨基酸第61-87位)结合的能力来筛选它们，这是因为该区域被认为参与了聚集过程。若干种与C-末端部分结合的肽如下(所有肽以5’-3’顺序给出)(1)WRQTRKD；(2)HYAKNPI；(3)ATINKSL；(4)RRRGMAI；(5)THRLPSR；以及(6)TKHGPRK。若干种与NAC部分结合的肽是(1)SLKRLPK；(2)RLRGRNQ；(3)WPFHHHR；(4)HLYHHKT；(5)THIHHPS；以及(6)MMMMMRL。选择NAC部分是因为已发现该段蛋白聚集在阿尔茨海默氏病的淀粉样噬菌体中。由于更强的结合特性，特别优选的是THRLPSR；SLKRLPK；THIHHPS和MMMMMRL。最优选的是肽SLKRLPK。
肽的制备采用肽合成技术领域中众所周知的方法进行，而且变体或类似物的制备也依据已建立的方法进行。例如，人们可期望增加肽的治疗功效，改变疏水性/亲水性或减少不需要的副作用。通过添加功能基团如将化合物靶向到受到特定路易体病影响的神经组织，可改变肽的结构。同样可制备肽的一种或多种氨基酸的替换，并且这些替换通常会涉及保守替换，即保持原始氨基酸如电荷等特性的替换。这些保守替换的例子是在(1)M、I、L和V；(2)F、Y和W；(3)K、R和H；(4)A和G；(5)S和T；(6)Q和N；以及(7)E和D之间进行。肽的变化不需是保守的；通过前述分析，总是测试对聚集抑制中的功效变更的肽。
优选的是肽抗蛋白水解消化。通过存在D-氨基酸或通过用非可水解的键取代敏感的肽键，这些肽可制备成蛋白酶抗性的。许多这样的键以及如何导入它们是本领域已知的。它们包括-psi[CH2NH]--(还原的酰胺肽键)；--psi[COCH2]--(酮亚甲基肽键)；--psi[CH(CN)NH]--((氰亚甲基)氨基肽键)；--psi[CH2CH(OH)]--(羟基乙烯基肽键)；--psi[CH2O]--(肽键)；--psi[CH2S]--(硫亚甲基肽键)。采用末端修饰也可构建这些肽，如C-末端的酰胺或N-末端的乙酰基团，这将使它们对蛋白水解的消化产生抗性。
非肽(肽模拟物)类似物是其中肽的一个或多个残基被非肽部分取代的化合物。非肽部分应该使肽保持其天然或更多生物活性的构象。对于非肽模拟化合物的制备方法，参见Nachman等，Regul.Pept.57359-370(1995)。
肽的修饰可使它们与化合物共轭来进行，所述化合物有助于它们的转运跨越血脑屏障。这些化合物例如可选自在WO 00/09073中公开的脂肪酸、阳离子化的抗体或白蛋白以及两性药物寡聚体共轭物，在此引作参考。或者，肽可与一种或多种化合物一起施用，所述一种或多种化合物有助于转运跨越血脑屏障，但它或它们不与肽共轭。对于这些化合物的例子，参见美国专利号5,112,596和5,268,164，两者皆在此引作参考。
术语“肽”意指任一种外源肽及其衍生物，并且不限制氨基酸的数目。因此，“肽”可包括多肽。
组合物尤其是药物组合物包括一种或多种肽，也形成本发明的部分。根据施用途径，治疗有效量的肽(一种会缓解疾病发展的肽)可与任意可药用和/或生理可接受的载体组合，如水溶液、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、填充剂、稀释剂以及其他已知物质。组合物的制备可以适合于所需的施用方式采取任意种形式进行。例如，药物组合物的制备形式可以是片剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气雾剂(如固体或在液体介质中)、软凝胶和硬凝胶胶囊、栓剂、无菌可注射液、无菌包装粉等。同样，载体或稀释剂可包括本领域中时间延迟或时间缓释的物质，如甘油单硬脂酸酯或单独的或与蜡状物、乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等组合的甘油二硬脂酸酯。对于注射，本发明的药剂也可制成水溶液，优选在生理相容的缓冲液中，如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。对于跨粘膜施用，适用于穿透障碍的渗透剂用于制剂中。这些渗透剂是本领域已知的。对于口服，通过将活性化合物与本领域已知的可药用载体组合，可容易地将化合物制成制剂。肽可被制成通过注射如通过大丸剂注射或连续灌输用于肠胃外施用的制剂。注射制剂与加入的防腐剂可以单位剂量形式例如安瓿或以多剂量容器呈现。组合物可采取如油状或水载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有制剂介质如悬浮、稳定和/或分散介质。对于制剂的详尽表，参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(1990)，在此以其全文引作参考。
根据专业人员各自采用和确定的常规方式，可将一种或多种肽给需要治疗路易体病的哺乳动物施用。优选地，肽的施用是注射或逐渐灌输一段时间。可使用的其他途径是口服、静脉内、颅内、腹膜内、肌内、腔内、呼吸道内、皮下、经皮或脂质体介导的传递。利用靶向传递方法也可完成特异针对受影响的神经元细胞的传递，这些传递方法包括与分子的共轭，所述分子选择性地与细胞或脂质体中的包膜结合，其含有会与受影响细胞结合的靶向分子。这些靶向方法是本领域众所周知的，例如美国专利号5,391,723，在此引作参考。此外，一些脂质体可从市场上获得。
在优选的实施方案中，预见的是将肽与如上所述的镁疗法同时施用。组合疗法可能会加速恢复，并达到更完全水平的恢复。一旦恢复已达到缺乏进一步临床功能丧失的阶段，则共施用镁可允许较低剂量的肽以用来维持。
治疗处理的受试对象可以是人或动物，如啮齿类、狗、猫、果蝇和C.elegans。这些动物可以是有用的人模型系统。
最后，本发明还设想了用于实施分析以测试各种物质对α-共核蛋白聚集影响的试剂盒。该测试包含最少的冷冻α-共核蛋白、铁或铜盐和缓冲液，如PBS或Tris缓冲液(生理pH下)。该试剂盒还可包含自由基发生剂，如多巴胺或过氧化氢。优选的是该试剂盒包含氯化铁。对于自由基发生剂，过氧化氢是优选的。
本发明以下列实施例来说明。这些实施例的提出意在帮助理解本发明，而不是意在和不应解释成以任何方式限制本发明，如附加的权利要求所述。
下列物质和方法用于本文的实施例中。α-共核蛋白的克隆、过表达和纯化将α-共核蛋白(野生型、A53T和A30P)克隆到pcDNA3的Notl位点中。各个构建体的序列由DNA测序得到确认。对于生产重组蛋白，将α-共核蛋白插入到Pro-Ex His6载体(GIBCO/BRL)的Ncol/Notl位点中。为了生成重组α-共核蛋白，采用BPer(Pierce)试剂使重组α-共核蛋白从IPTG-诱导的细菌裂解物中溶解出来，然后依据厂商的说明(GIBCO/BRL)将它们过镍琼脂糖亲和柱、冲洗并用咪唑洗脱。纯化后，将His-6标记用TEV蛋白酶切割，并过镍琼脂糖柱除去。所用抗体包括多克隆抗-α-共核蛋白抗体(SC1，1∶2000用于免疫印迹和1∶500用于抗人α-共核蛋白的免疫细胞化学，残基第116-131，序列＝MPVDPDNEAYEMPSEE)，单克隆抗-α-共核蛋白-1抗体(1∶1000，Transduction Labs)、多克隆兔抗遍在蛋白(1∶1000用于免疫印迹和1∶500用于免疫细胞化学，Dako)。
噬菌体展示温育噬菌体文库，所述噬菌体文库除7个氨基酸的序列以外全部相同，这7个氨基酸存在于外壳上并在噬菌体与噬菌体之间随机区别。将表达与α-共核蛋白特异性结合的序列的噬菌体分离、克隆，并进行DNA测序以确定氨基酸序列。然后合成7个氨基酸肽并直接测试。
细胞培养把细胞生长在OPTIMEM(Gibco/BRL)中，如需要，所述OPTIMEM补充有10％FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠和500μg/ml的G418。将G418用于筛选。
免疫印迹用SDS溶解液(2％SDS、10mM Tris、pH7.4、2mMβ-磷酸甘油、1μM AEBSF)收集细胞。采用BCA分析(Pierce)测定蛋白量，每泳道5-30mg在14％SDS聚丙酰胺凝胶上跑胶，并转移到硝酸纤维素(200mAmp，12小时)上。然后，将硝酸纤维素在5％牛奶/PBS中温育1小时，冲洗，在1°抗体中温育过夜，冲洗，然后在过氧化酶偶联的2°抗体中温育3小时，并用化学发光试剂(NEN)显影。
细胞分级分离对于细胞分级分离，将细胞收集在缓冲液中，其含有20mM Tris、pH7.4、2mM EDTA、0.25M蔗糖以及20μg/ml蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma)。将细胞裂解液超声并在4℃下以100,000×g离心1小时。
MTT和LDH毒性分析以5000细胞/孔100μl生长培养基将细胞铺在96孔碟中。对于MTT测定，药物处理48小时后，通过加入0.5mg/ml MTT(MTT，3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物)并在37℃下温育3小时，对生存力进行分析。然后加入溶解缓冲液(100μl的50％N，N-二甲基甲酰胺中的20％SDS)，24小时后，将板在540nm处读数。对于乳酸脱氢酶(LDH)分析，药物处理24后，根据厂商说明，利用MTS试剂和Cytox96试剂盒(Promega)对生存力进行分析。
硫磺素-S组织化学把细胞在4％低聚甲醛中固定30分钟。用PBS两次洗涤后，将细胞用0.5％硫磺素-S温育8分钟，以80％乙醇洗涤三次，以H2O洗涤一次，然后封固。
电子显微镜将细胞用刮刀分离开，朝下转动以及4℃下在2％戊二醛中固定2小时，然后4℃下在1％四氧化锇中固定1小时。将样品脱水，包埋在环氧树脂(Electron Microscopy Science，Fort Washington，PA)中，并切成70nm的切片用于显微镜。接着用5％乙酸双氧铀以及雷诺柠檬酸铅进行后染色。样品用Hitachi H-600透射电子显微镜在75kV下观测。
铁染色将细胞在4％低聚甲醛中固定30分钟，随后用PBS洗涤两次，根据厂商说明书(Sigma)利用Accustain铁染剂染色。
免疫组织化学对于光学显微镜术，将细胞用4％低聚甲醛固定，洗涤，通过用0.2％Triton-X100温育30分钟透化，用5％干牛奶/1％山羊血清/PBS封闭，洗涤，接着在1°抗体(1∶500)中温育过夜。根据厂商说明书(Vector，Burlingame，CA)用ABC试剂盒和3’，3’-二氨基联苯胺显影。
α-共核蛋白的聚合体在膜部分是明显的，而在胞质部分中不明显。用FeCl2处理A53T-表达细胞系，诱导剂量依赖的形成异源高分子量α-共核蛋白聚合体，其迁移在堆积胶中。大量的抗-α-共核蛋白免疫反应性在分离胶的上部也是明显的，范围在45-200kDa之间。因为这些条带显著地大于单聚α-共核蛋白，其分子量为19kDa，这些条带也可代表α-共核蛋白多聚体和聚合体。例如，38和57kDa处条带的大小与α-共核蛋白的二聚体和三聚体一致。利用不同抗体、多克隆抗-α-共核蛋白抗体的免疫印迹在相同条件下也显示了聚集产生。其他细胞系的处理(未转染、野生型和A30P)在所检查的48小时时限内不诱导α-共核蛋白聚合体。
为了测定在较低剂量的铁下增加与铁的接触期限对α-共核蛋白聚集的影响，将过表达A53T或野生型α-共核蛋白的BE-M17细胞与FeCl2接触4天。在这些条件下，在表达A53T α-共核蛋白的细胞中当剂量低至0.3μM的FeCl2产生可检测的α-共核蛋白聚集。有趣的是这些接触更长的条件也诱导野生型α-共核蛋白的聚集。相反，未观测到肌动蛋白的聚集，这暗示聚集对α-共核蛋白是选择性的。
为了测定BE-M17细胞中α-共核蛋白聚集的模式如何与发生在人脑中的模式比较，体外进行了人脑皮层匀浆(来自神经学正常的供体)中的α-共核蛋白对铁接触的反应。用500μM多巴胺、10mM FeCl2和蛋白酶抑制剂(多巴胺作为氧化剂加入，如下文所述)处理24小时后，脑皮层匀浆的膜部分中α-共核蛋白聚集模式与BE-M17细胞中见到的相似。这提示BE-M17细胞和人脑中的α-共核蛋白对铁的反应表现出相似的聚集模式，两者都具有聚集的强烈倾向。另外，观测到较高分子量α-共核蛋白免疫反应偶尔出现在α-共核蛋白细胞裂解液的免疫印迹的分离胶中，该α-共核蛋白细胞裂解液来自在基本条件下生长的细胞。然而，在堆积胶中迁移的聚合体仅发生在用铁处理之后，并在基本条件下从未在任一种细胞系中观测到。这支持了以前利用体外重组α-共核蛋白的工作，其显示α-共核蛋白的突变形式具有强烈的寡聚倾向[Conway，KA.等，PNAS USA，97571-576(2000)]。然而，堆积胶中聚合体的迁移比分离胶中的迁移可以有更严格的测试聚集形成。
研究表明通过Fenton反应增加自由基形成，铁可促进蛋白聚集[Wolozin，B.等，Arch.Neurol.，57793-796(2000)]。如果这样，添加自由基发生剂如过氧化氢或多巴胺，与铁一起可增加α-共核蛋白聚集的量。为了进一步测定氧化作用增强铁诱导的α-共核蛋白的聚集，将过表达A30P或野生型α-共核蛋白的BE-M17细胞用10mM FeCl2以及不同浓度的多巴胺(0.5、50和500μM)处理48小时。把细胞用于表达A30P或野生型α-共核蛋白48小时以上，这是因为与过表达A53Tα-共核蛋白的细胞不同，在这些条件下，它们不形成聚合体。正如所料，过表达A30P或野生型α-共核蛋白的BE-M17细胞用10mM FeCl2单独处理不诱导任何聚集。同样，用5、50或500μM多巴胺单独处理不诱导形成大的迁移在堆积胶中的α-共核蛋白聚合体。然而，将10mM FeCl2和50或500μM多巴胺组合诱导形成大的α-共核蛋白聚合体。这些数据显示氧化剂和铁的组合对α-共核蛋白聚集起增强的效应。
两个单独实验说明所观测的聚集是α-共核蛋白的普遍特性，而非由使用克隆细胞系产生的人为的现象。BE-M17细胞用A53Tα-共核蛋白cDNA短暂转染，然后用10mM FeCl2和100μM的H2O2处理72小时，形成了与稳定过表达α-共核蛋白的BE-M17细胞系中所见的那些相似的聚合体。此外，初级大鼠皮层神经元也显示了形成聚合体的强烈倾向，仅要求用0.1mM FeCl2和50μM多巴胺处理60小时以诱导聚合体的形成。因此，聚集是α-共核蛋白的生物物理特性的结果，而非是特异于特定克隆细胞系的人为现象。实施例2. A53T和A30Pα-共核蛋白聚合体含有遍在蛋白在PD中，路易体也已显示含有大量的遍在蛋白[Dickson，D.等，Brain Path.，9721-32(19990)；Gibb，W.等，J.Neurol.Neurosurg.andPsych.，51745-52(1988)]。为了测定遍在蛋白的聚集是否也与α-共核蛋白聚集一起发生，把裂解液(膜部分)从表达A30Pα-共核蛋白的BE-M17细胞中取出，所述BE-M17细胞已用FeCl2和多巴胺处理(参见实施例1，处理48小时)，并用抗遍在蛋白抗体免疫印迹。在这些条件下积累的遍在蛋白聚合体对遍在蛋白强烈染色。在单独用FeCl2、或用FeCl2加过氧化氢或FeCl2加多巴胺处理之后，表达A53Tα-共核蛋白或野生型α-共核蛋白的细胞中积累的聚合体也包含遍在蛋白。聚集的遍在蛋白的量一般平行于α-共核蛋白的量。聚合体中遍在蛋白的存在似乎不从增加的遍在蛋白表达中产生，因为总裂解液的免疫印迹显示遍在蛋白和肌动蛋白的总量在过表达α-共核蛋白的细胞系和对照细胞之间没有显著的区别。这些数据显示对铁处理起反应在神经元中形成的α-共核蛋白聚合体是遍在蛋白化作用。实施例3.α-共核蛋白聚合体形成凭借硫磺素-S组织化学和电子显微镜可见的明显的内含物硫磺素-S组织化学和电子显微镜用于检查在针对铁和过氧化氢处理的反应中形成的聚合体。将来自各个细胞系的细胞(BE-M17未转染、野生型、A30P和A53Tα-共核蛋白)用10mM FeCl2或10mM FeCl2加100μM H2O2处理72小时，以诱导形成α-共核蛋白阳性内含物。观测所形成的聚合体与硫磺素-S结合，这表明存在β-折叠结构。硫磺素-S阳性聚合体的大小和数目与免疫印迹中所见的结果相吻合。在用10mM FeCl2和100μM H2O2处理72小时之后，野生型、A30P和A53Tα-共核蛋白细胞各显示显著的蛋白聚合体的积累。相反，未转染的细胞系显示没有积累硫磺素-S阳性聚合体。当仅用10mM FeCl2处理细胞时，只在A53Tα-共核蛋白表达的细胞中观测到硫磺素-S阳性内含物。采用电子显微镜检查聚合体。将表达A53Tα-共核蛋白或表达空载体的细胞用10mM FeCl2和100μM H2O2处理72小时，然后制备用于电子显微镜。胞质内含物在A53T表达的细胞中是明显的，但在载体转染的细胞中不明显。内含物含有纤丝状和无定形物质的混合物。纤丝的直径大约10nm和长度达10μm。尽管用10mM FeCl2和100μMH2O2处理对许多细胞是毒性的，但一些含有聚合体的细胞它有纤丝沉积物和完整的细胞器官，这提示聚集可发生在活的细胞中。聚合体中纤丝状和无定形物质的存在已在过表达α-共核蛋白的转基因动物中存在的聚合体中观测到[Feany，MB.等，Nature，404394-8(2000)；Masliah，E.等，Science，2871265-1269(2000)]。实施例4.α-共核蛋白聚合体形成凭借免疫组织化学可见的明显的内含物通过免疫细胞化学测试内含物形成。将表达A53Tα-共核蛋白的细胞用10mM FeCl2和100μM H2O2处理72小时，固定，然后采用过氧化物酶免疫组织化学，以针对遍在蛋白的抗体和α-共核蛋白进行检查。使用过氧化物酶染色，这是因为由于铁处理，荧光生色剂如FITC或若丹明表现出强烈的与细胞的非特异结合。利用抗-α-共核蛋白和抗-遍在蛋白抗体的免疫组织化学通过细胞的胞质在基本条件下显示出均匀的染色。在用10mM FeCl2加100μM H2O2处理72小时之后，染色变得不均匀。用抗-α-共核蛋白抗体染色的各个细胞中经常展示若干大的暗染色的反应病灶和多种小的斑点病灶。用遍在蛋白染色也是存在的，但是每个细胞显示较少的病灶。用免疫前的兔血清替代初级抗体进行的免疫细胞化学显示在基本条件或处理条件下没有反应性。实施例5.α-共核蛋白聚集出现在活细胞中为了确定FeCl2对细胞的毒性作用，在存在高和低浓度的FeCl2下，实施了α-共核蛋白聚集和细胞死亡、聚合体形成和细胞生存力之间的关系。如上所述(实施例3和4)，用10mM FeCl2加100μM H2O2处理72小时，在大多数非转染的细胞中诱导了α-共核蛋白聚合体的形成。因此，这些条件也杀死了大多数的细胞(＞90％的细胞死亡)。
相反，A53T-表达的BE-M17细胞用0.3mM FeCl2加100μM H2O2处理96小时后，表现出更少的毒性，但仍形成了α-共核蛋白聚合体。将平行组的细胞与针对α-共核蛋白(SC1)和遍在蛋白的抗体进行免疫细胞化学处理，或利用台盼蓝排阻分析来测定生存力。未处理的细胞显示几乎没有毒性，对台盼蓝有3.7±1.0％可渗透性。有少量的细胞死亡也许是由用于移出细胞的胰蛋白酶消化/研磨步骤所导致的。用0.3mM FeCl2和100μM H2O2处理杀死一些细胞(12.1±2.3％台盼蓝阳性)，但大多数细胞(87.9％)保持存活。采用抗-α-共核蛋白抗体的免疫细胞化学显示21.0±3.5％的细胞具有可见的聚合体。采用抗-遍在蛋白抗体的免疫细胞化学提示聚合体可包含遍在蛋白，以及提示聚合体包含具有用硫磺素-S染色的β-折叠结构的物质。有趣的是，弥漫的硫磺素-S反应在这些细胞中也是明显的，暗示分散的α-共核蛋白的“微聚合体”在温和条件下也可形成。
因此，在温和条件下所形成的α-共核蛋白聚合体与同样的抗体反应，并如在更严厉条件下所形成的聚合体染色。此外，表现α-共核蛋白聚合体的细胞的百分数比表现死亡证据的细胞的百分数更大，这一观测提示许多形成α-共核蛋白聚合体的细胞是存活的。
α-共核蛋白的聚集可出现在存活细胞中，这个观测也暗示α-共核蛋白聚集发生在细胞死亡之前。实施例6.α-共核蛋白的过表达增加自由基介导的毒性虽然α-共核蛋白聚合体可在活的细胞中形成的事实存在，α-共核蛋白聚集在毒性诱导中可出现在起始步骤是可能的。以前的结果显示α-共核蛋白对一些短暂过量表达的细胞是毒性的[Ostrerova，N.等，J.Neurosci.，195782-91(1999)]。然而，α-共核蛋白并非对所有细胞都是急性毒性的，如BE-M1 7细胞。α-共核蛋白的良好耐受性足以允许在转基因动物中过表达[Feany，MB等，Nature，404394-8(2000)；Masliah，E.等，Science，2871265-1269(2000)]。尽管α-共核蛋白在基本条件下对BE-M17细胞不是急性毒性的，但α-共核蛋白在其他条件下如与聚合体形成相连接的条件可能是毒性的。
为了确定生产α-共核蛋白聚集的条件是否也产生毒性，测定了各个细胞系对铁和/或过氧化氢介导的毒性的易损性。各个细胞系(未转染、野生型、A53T和A30Pα-共核蛋白)用不同剂量的FeCl2、H2O2或FeCl2+H2O2处理，并通过MTT测定确定毒性的量。BE-M17细胞过表达所有形式的α-共核蛋白显示对铁介导的毒性增加易损性(
图1A)。A53Tα-共核蛋白的过表达对毒性具有最大的作用，降低FeCl2的LD5075％以上(图1A)。虽然在A30P表达的细胞对低水平铁反应中所见的毒性量一般大于用野生型α-共核蛋白所见的毒性，但是A30P或野生型α-共核蛋白构建体的过表达降低了LD50值约50％(图1A)。为了确认α-共核蛋白的过表达增加了成神经细胞瘤细胞对铁的易损性，利用LDH分析对铁诱导的毒性进行了测试(图1B)。LDH分析确认了α-共核蛋白构建体的过表达增加铁诱导的毒性(图1B)。
对过表达α-共核蛋白细胞系(野生型、A53T或A30P)进行MTT测定，也揭示出用FeCl2+H2O2处理后毒性增加了(图1C，深灰色棒)。有趣的是过表达α-共核蛋白(野生型、A53T或A30P)没有增加对H2O2单独的易损性，并赋予成神经细胞瘤细胞适度的保护作用(图1C)。这些数据证实不论是野生型还是突变α-共核蛋白的水平的增加在选择性条件下对生长在细胞培养物中的神经元可以是毒性的。数据还提示α-共核蛋白尤其使细胞对铁介导的毒性的易损性。对铁的选择性易损性可在α-共核蛋白聚合体中产生α-共核蛋白螯合铁的倾向。
未转染的或A53T-α-共核蛋白表达的BE-M17细胞用10mM FeCl2和100μM H2O2处理48小时，然后固定并对铁染色。处理后，表达A53Tα-共核蛋白的细胞比未转染的细胞具有更高的铁含量。由于α-共核蛋白，铁的螯合通过Fenton反应会增加自由基的产生，尤其在与自由基发生剂如过氧化氢或多巴胺接触的细胞中。然而，在没有铁的情况下，不发生Fenton反应，并且α-共核蛋白是无害的。实施例7.铁与α-共核蛋白的结合由于铁与其他形成聚合体的蛋白结合以及已知铁在帕金森氏病中积累，所以铁可直接与α-共核蛋白结合。为确认这种假设，利用酪氨酸荧光作为铁结合的指示剂来测试铁与α-共核蛋白的相互作用。高剂量的铁(＞10mM)会猝灭酪氨酸荧光，然而与铁结合的蛋白在更低剂量表现出猝灭(假设是因为蛋白结合的铁接近酪氨酸)。酪氨酸的荧光已用于监控金属与β-淀粉状蛋白的结合[Garzon-Rodriguez W.等，Bioorg.Med.Chem.Let.，92243-2248(1999)，在此引作参考]。采取相似的方法来分析铁与α-共核蛋白的结合。酪氨酸具有荧光发射光谱，当其在280nm处受激发时，峰发射为310nm(图2A)。观测到铁的结合减少了α-共核蛋白中酪氨酸的荧光。结果证实其原因是与α-共核蛋白的特异结合，因为游离酪氨酸与相似剂量的FeCl2温育不产生猝灭。利用Prism程序(GraphPad，San Diego，CA)来分析结合曲线，我们观测到数据属于S曲线，IC50＝173μM。Hill系数是1.0(R2＝1.0，P＜0.0001)，这说明铁的一个结合位点没有协同性(图2A和B)。对α-共核蛋白与其他金属的结合也进行了测试，包括CuCl2、ZnCl2和MgCl2。由于α-共核蛋白的C-末端具有7个谷氨酸和4个天门冬氨酸的区域，它们一起可螯合铁，我们创建了缺失构建体，其缺乏α-共核蛋白最后27个氨基酸，并分析这个构建体的结合。α-共核蛋白ΔC1-113的C-末端缺失构建体在铁结合方面显示4倍以上的减少，IC50＝726μM(P＜0.001)(图2B)。这提示α-共核蛋白与铁结合，以及提示C-末端有助于铁结合，但对铁结合不是必须的。实施例8.镁保护共核蛋白聚集为了监控Fe(II)和Mg(II)与α-共核蛋白的体外结合图，我们采用了酪氨酸荧光的变化。酪氨酸荧光用作蛋白构象或金属结合变化的指示物。酪氨酸在280nm处的激发引发荧光，其峰对单体酪氨酸为310nm，而对酪氨酸酯(tyrosinate)或二聚酪氨酸为350-400nm。α-共核蛋白的萤光谱产生的萤光峰在310nm和400nm。400nm处的峰由于α-共核蛋白二聚产生的，不能解释为二聚产生的酪氨酸的存在，因为α-共核蛋白二聚降低400nm处的荧光，并且倾向于消除400nm的峰。此外，α-共核蛋白的凝胶电泳和质谱显示α-共核蛋白是单体的。这时，暗示400nm处的峰是由于酪氨酸酯产生，其可产自从酚羟基到天门冬氨酸或谷氨酸蛋白受体的质子转移。α-共核蛋白与增加剂量的Fe(II)的温育快速降低了α-共核蛋白中的酪氨酸在310nm和400nm处荧光。对荧光猝灭作图表现出S曲线，IC50＝173μM以及Hill系数是1.0(R2＝1.0，P＜0.0001)，这说明一个结合位点或多种结合位点具有同样的亲和性和没有协同性。铁对α-共核蛋白真正的亲和性可低于173μM，这是因为酪氨酸荧光与绝对亲和性比较是更好的构象变化指示物。
镁对α-共核蛋白的影响显著区别于铁的作用。镁增加了400nm处的荧光，但不影响310nm处的荧光。镁与α-共核蛋白的结合也是显著的，因为酪氨酸荧光显示在镁的60和80μM之间急剧的逐步的增加，这说明镁有协同性结合。酪氨酸荧光具体在400nm处的协同性调节暗示镁导致α-共核蛋白中的构象变化，区别于由铁所诱导的构象变化。将镁与铁共温育不阻止铁诱导的α-共核蛋白酪氨酸荧光的猝灭，暗示铁和镁结合在α-共核蛋白不同的位点上。
我们还检查了人α-共核蛋白中的A53T突变是如何影响铁和镁的结合的。A53T突变不改变铁对α-共核蛋白表观的亲和性，但的确完全破坏了镁和α-共核蛋白之间的作用。以前的研究已显示A53T突变由于增加其螺旋含量而改变α-共核蛋白构象的变化(Polymeropoulos等，Science，2762045-7(1997))。这些构象的变化也可减少镁与α-共核蛋白的结合。
了解了镁和铁诱导α-共核蛋白酪氨酸荧光中相反的变化，认为也许通过防止β折叠形成，镁的结合可将α-共核蛋白转变成抗聚集的构象。为了测试此现象，将野生型重组α-共核蛋白与0-3mM FeCl2和0或100μM MgCl237℃温育24小时，然后对α-共核蛋白进行免疫印迹以及通过视频光密度测定法对聚集进行定量分析。我们在除最高剂量的铁以外的所有剂量中观测到了显著减少形成高分子量的α-共核蛋白聚合体(n＝3，P＜0.0001)。利用硫磺素-S测定重组α-共核蛋白聚集的分析也显示在相似条件下由铁诱导的α-共核蛋白聚集及由镁诱导的抑制聚集。在独立的实验中，我们观测到了镁还抑制α-共核蛋白的自发聚集。
由于利用酪氨酸荧光我们没有观测到镁和A53Tα-共核蛋白之间的相互作用，我们测试了重组A53Tα-共核蛋白的聚集对镁是否也是不灵敏的。我们将重组A53Tα-共核蛋白与0-3mM FeCl2和0或100μMMgCl2温育24小时，然后对α-共核蛋白进行免疫印迹以及通过视频光密度测定法对聚集进行定量分析。我们观测到了镁不能抑制铁诱导的A53Tα-共核蛋白的聚集。镁不能抑制A53Tα-共核蛋白的聚集与酪氨酸荧光数据是一致的，提示镁不与A53Tα-共核蛋白相互作用。
镁体外抑制野生型α-共核蛋白聚集的能力提示镁在活的神经元中也能抑制聚集。为了测试此现象，本发明人检查了镁在细胞培养中生长的初级皮层神经元中抑制α-共核蛋白聚集的能力。将初级皮层神经元用1mM FeCl2加0-1.5mM MgCl2处理3天，对α-共核蛋白进行免疫印迹以及通过视频光密度测定法对聚合体的量进行测定。随着镁剂量从0.2到1.5mM增加进行处理，在高分子量的α-共核蛋白聚合体形成中产生了剂量依赖而减少。镁剂量低至0.5mM在α-共核蛋白形成阳性聚合体中产生了统计学上显著的减少。镁对过表达野生型α-共核蛋白的BE-M17成神经细胞瘤细胞行使了相似的抑制聚集作用。相反，在表达人53Tα-共核蛋白cDNA的BE-M17细胞中，镁不能抑制聚合体的形成，这与镁通过与α-共核蛋白的结合包括构象变化而抑制α-共核蛋白聚集的假设一致。
本发明人利用针对遍在蛋白的抗体还检查了存在的聚合体的量。如前所述，高分子量遍在蛋白加合物的积累与α-共核蛋白聚合体的形成相关。初级皮层神经元如上所述处理，聚合体用抗-α-共核蛋白抗体免疫沉淀，并用抗遍在蛋白抗体免疫印迹。在用0.3mM铁和50μM多巴胺处理3天后，观测到了α-共核蛋白的遍在蛋白化作用的增加。然而，以剂量低至0.5mM的镁处理细胞在遍在蛋白免疫反应中产生了统计学上显著降低(n＝3，P＜0.0001)。因此，在初级神经元中镁抑制遍在蛋白阳性α-共核蛋白聚合体的形成。
接着，研究了镁是否还防止稳定过表达野生型α-共核蛋白的BE-M1 7神经元中的α-共核蛋白阳性内含物的形成。神经元用1Mm FeCl2加50μM多巴胺加0或1mM MgCl2处理3天，然后利用抗α-共核蛋白和抗遍在蛋白的抗体通过免疫细胞化学检查。用铁和多巴胺处理的神经元显示丰度的α-共核蛋白阳性内含物，而用铁、多巴胺和镁一起处理的神经元显示几乎没有积累α-共核蛋白阳性内含物。
镁诱导的抑制α-共核蛋白聚集也与神经保护相关，如MTT测定所测定。将稳定转染有载体或野生型α-共核蛋白的BE-M17成神经细胞瘤细胞用FeCl2加多巴胺加0或0.8mM MgCl2处理2天，然后通过MTT测定对生存力进行分析(选择剂量以使MTT测定时光密度最佳)。过表达野生型α-共核蛋白的细胞系显示了在对铁/多巴胺处理的反应中毒性增加，这与以上观测结果一致。在野生型细胞系中再用镁处理细胞存活增加了2.4倍，而在对照细胞系中仅增加了1.3倍(与单独用Fe2+/多巴胺处理的细胞中的存活细胞比较)。这提示具有更多α-共核蛋白相关毒性的细胞系得到镁的对应的更多保护。
还检查了镁如何影响来自中枢神经系统的神经元。皮层神经元的初级培养物用0.3mM FeCl2加50μM多巴胺加0-2mM MgCl2处理3天(采用相对低剂量的铁使得神经元突起能够进行定量)。为了对由镁提供的神经保护的量进行定量分析，测定了突起长于100μm的百分数作为细胞生存力的特征。用铁加多巴胺处理导致神经突起的钝化，减少100μm以上的神经元突起数约60％(n＝5，P＜0.001)。在这些神经元中还形成内含物。然而，用铁、多巴胺和1-2mM镁处理的神经元显示突起仅有20％的损失，并且不显示形成任何α-共核蛋白阳性内含物。这些结果与以前的研究一致，说明镁是有细胞保护作用的(Beal，M.F.，Ann.Neurol.31119-30(1992))。此外，这些结果说明镁可预防中枢神经系统的神经元以及神经元细胞系中的α-共核蛋白聚集。
总之，镁既抑制了自发的聚集也抑制了铁诱导的聚集(图3)。这种现象的发生是因为镁与α-共核蛋白的结合将α-共核蛋白转变成抗聚集的构象(图3B)。
有趣的是，镁抗聚集效应的剂量相似于用来治疗例如前惊厥的治疗剂量。镁的这些剂量是可作成治疗剂量。这种现象的发生是因为镁与α-共核蛋白的结合将α-共核蛋白转变成抗聚集的构象(图3B)。实施例9.抗-α-共核蛋白肽的鉴定利用噬菌体展示(噬菌体展示试剂盒来自New England Biolabs(Beverly，MA))来特异性地选择可抑制铁结合的肽。从文库中鉴定噬菌体，该文库与α-共核蛋白第121-131位的氨基酸和第61-87位的氨基酸结合并部分抑制铁诱导的α-共核蛋白聚集。利用α-共核蛋白第121-131和第61-87位的肽作为诱饵来选择肽。一种这样的肽具有序列SLKRLPK。
为了证实肽SLKRLPK结合α-共核蛋白，将α-共核蛋白吸附到塑料孔中，以1∶10、1∶100和1∶1000的稀释度加入噬菌体，温育1小时并洗涤5次。通过加入过氧化物酶偶联的抗噬菌体抗体来检测结合的噬菌体，温育1小时，洗涤5次，并采用过氧化物酶底物ABTS来检测信号。结合的噬菌体产生暗绿色的信号，其用分光光度法测定光密度。使用这些条件，含有SLKRLPK肽的噬菌体在1∶10、1∶100和1∶1000的稀释度处分别产生的OD为0.882、0.844和0.480。相反，另一不结合的噬菌体分别产生的OD为0.019、-0.027和-0.554。
还对该肽体外抑制铁诱导的α-共核蛋白聚集进行了测试。10倍过量的肽能抑制α-共核蛋白聚集38％，如光密度测定法定量所测定。该抑制水平是极其显著的，假如将此转化到体内38％的减少，则其可减慢PD发展若干年。
该肽具有序列“SLKRLPK”，并对应于由噬菌体表达的序列，通过ELISA其显示特别强的与α-共核蛋白的结合。该序列不含有酪氨酸或色氨酸，这些氨基酸可添加荧光并使分析复杂化。在我们理解铁对α-共核蛋白生物化学的重要性之前该噬菌体就产生了(因此，对铁结合不是特异性地靶向结合位点)。即使如此，将10倍过量的肽与α-共核蛋白温育减少铁诱导的α-共核蛋白聚集38％。
序列表<110> 万能药制药公司(Panacea Pharmaceuticals，Inc.)本亚明·沃洛申(Beniamin WOLOZIN)纳塔莉·奥斯特列托瓦—戈尔茨(Natalie OSTRETOVA-GOLTS)迈克尔·勒博威驰(Michael LEBOWITZ)<120> 预防神经组织损伤和治疗α-共核蛋白疾病的方法(Methods for Preventung Neural Tissue Damage andfor the Treatment of Alpha-Synuclein Diseases)<130> SCT022984-09<140> US60/279,199<141> 2001-03-28<150> US60/279,199<151> 2001-03-28<150> US60/217,319<151> 2000-07-07<160> 12<170> PatentIn version3.0<210> 1<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 1Trp Arg Gln Thr Arg Lys Asp1 5<210> 2<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 2His Tyr Ala Lys Asn Pro Ile1 5<210> 3<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 3Ala Thr Ile Asn Lys Ser Leu1 5<210> 4<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 4Arg Arg Arg Gly Met Ala Ile1 5<210> 5<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 5Thr His Arg Leu Pro Ser Arg1 5<210> 6<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 6Thr Lys His Gly Pro Arg Lys1 5<210> 7<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 7Ser Leu Lys Arg Leu Pro Lys1 5<210> 8<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 8Arg Leu Arg Gly Arg Asn Gln1 5<210> 9<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 9Trp Pro Phe His His His Arg1 5<210> 10<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 10His Leu Tyr His His Lys Thr1 5<210> 11<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 11Thr His Ile His His Pro Ser1 5<210> 12<211> 7<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 12Met Met Met Met Met Arg Leu1 权利要求
1.一种测定药剂是否能抑制α-共核蛋白聚集的方法，其包括(a)在外源铁或铜存在下将所述药剂加入到含有α-共核蛋白的样品中，并使α-共核蛋白聚集；(b)如果有聚集的α-共核蛋白存在，测定聚集的α-共核蛋白的量；以及(c)将来自步骤(b)的量与其中没有所述药剂的对照样品中所测定的量比较，其中聚集的α-共核蛋白量的降低显示该药剂能够抑制α-共核蛋白的聚集。
2.权利要求1所述的方法，其中将一种或几种自由基发生剂加入到步骤(a)的样品中以便促进α-共核蛋白的聚集。
3.权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中加入外源铁。
4.权利要求2所述的方法，其中所述自由基发生剂是多巴胺或过氧化氢。
5.权利要求1所述的方法，其中所述样品由过表达α-共核蛋白的细胞组成。
6.权利要求5所述的方法，其中所述细胞属于神经元起源。
7.权利要求1所述的方法，其中所述聚集的量由蛋白分离测定，由此聚集的物质比未聚集的α-共核蛋白显示更高的分子量。
8.权利要求7所述的方法，其中所述蛋白分离由凝胶电泳来完成。
9.权利要求1所述的方法，其中所述聚集的量通过加入标记的抗-α-共核蛋白抗体和测定结合的标记来测定。
10.权利要求9所述的方法，其中所述标记是过氧化物酶。
11.权利要求1所述的方法，其中所述聚集的量通过与硫磺素-S结合来测定。
12.一种测试物质对α-共核蛋白聚集影响的试剂盒，其包括冻干的α-共核蛋白、铁或铜盐以及缓冲液。
13.权利要求12所述的试剂盒，其包括氯化铁。
14.权利要求12所述的试剂盒，其进一步包括自由基发生剂。
15.权利要求14所述的试剂盒，其中所述自由基发生剂是过氧化氢。
16.一种治疗涉及形成路易体的神经变性疾病的方法，其包括给需要的患者施用一种或多种抑制形成α-共核蛋白聚合体的药剂，由此呈现的路易体维持原状或减少。
17.权利要求16所述的方法，其中所述药剂是Mg2+。
18.权利要求17所述的方法，其中所述药剂是MgSO4。
19.权利要求16所述的方法，其中所述药剂是与α-共核蛋白结合并抑制其聚集的肽。
20.权利要求19所述的方法，其中所述肽与α-共核蛋白的C-末端第113-140位氨基酸或NAC(非-淀粉状-β蛋白成分)部分的任意部分结合。
21.权利要求20所述的方法，其中所述肽选自WRQTRKD、HYAKNPI、ATINKSL、RRRGMAI、THRLPSR、TKHGPRK、SLKRLPK、RLRGRNQ、WPFHHHR、HLYHHKT、THIHHPS以及MMMMMRL。
22.权利要求21所述的方法，其中所述肽选自THRLPSR、SLKRLPK、THIHHPS以及MMMMMRL。
23.权利要求22所述的方法，其中所述肽是SLKRLPK。
24.权利要求16所述的方法，其中所述药剂是含有Mg2+与肽组合的组合物。
25.权利要求24所述的方法，其中所述药剂选自WRQTRKD、HYAKNPI、ATINKSL、RRRGMAI、THRLPSR、TKHGPRK、SLKRLPK、RLRGRNQ、WPFHHHR、HLYHHKT、THIHHP S以及MMMMMRL。
26.权利要求25所述的方法，其中所述药剂选自THRLPSR、SLKRLPK、THIHHPS以及MMMMMRL。
27.权利要求26所述的方法，其中所述肽是SLKRLPK。
28.权利要求16所述的方法，其中所述神经变性疾病是帕金森氏病、阿尔茨海默氏病弥漫性路易体病、混合的AD-PD、多系统萎缩和哈-施二氏病(Hallervorden-Spatz病)。
29.权利要求28所述的方法，其中神经变性疾病是帕金森氏病。
30.一种抑制形成α-共核蛋白聚合体的方法，其包括用含有Mg2+的物质处理α-共核蛋白。
31.一种抑制形成α-共核蛋白聚合体的方法，其包括用与α-共核蛋白结合并抑制其聚集的肽处理α-共核蛋白。
32.权利要求30所述的方法，其中所述物质进一步包括至少一种与α-共核蛋白结合并抑制其聚集的肽。
33.一种组合物，其包括Mg2+和至少一种与α-共核蛋白结合并抑制其聚集的肽。
34.权利要求33所述的组合物，其中所述肽与α-共核蛋白的C-末端或NAC部分结合。
35.权利要求34所述的组合物，其中所述肽选自WRQTRKD、HYAKNPI、ATINKSL、RRRGMAI、THRLPSR、TKHGPRK、SLKRLPK、RLRGRNQ、WPFHHHR、HLYHHKT、THIHHPS以及MMMMMRL。
36.权利要求35所述的组合物，其中所述肽选自THRLPSR、SLKRLPK、THIHHPS以及MMMMMRL。
37.权利要求36所述的组合物，其中所述肽是SLKRLPK。
38.权利要求33所述的组合物，其中所述Mg2+是MgSO4。
39.一种肽，其会与α-共核蛋白结合并抑制其聚集。
40.权利要求39所述的肽，其中所述肽包括选自WRQTRKD、HYAKNPI、ATINKSL、RRRGMAI、THRLPSR、TKHGPRK、SLKRLPK、RLRGRNQ、WPFHHHR、HLYHHKT、THIHHPS以及MMMMMRL的序列。
41.权利要求40所述的肽，其中所述肽包括选自THRLPSR、SLKRLPK、THIHHPS以及MMMMMRL的序列。
42.权利要求41所述的肽，其包括序列SLKRLPK。
43.一种组合物，其包括权利要求39所述的肽以及可药用载体。
44.权利要求43所述的组合物，其包括含有序列的肽，所述序列选自WRQTRKD、HYAKNPI、ATINKSL、RRRGMAI、THRLPSR、TKHGPRK、SLKRLPK、RLRGRNQ、WPFHHHR、HLYHHKT、THIHHPS以及MMMMMRL。
45.权利要求44所述的组合物，其包括含有序列的肽，所述序列选自THRLPSR、SLKRLPK、THIHHPS以及MMMMMRL。
46.权利要求45所述的组合物，其包括含有序列SLKRLPK的肽。
47.一种鉴定肽的方法，所述肽对抑制α-共核蛋白的聚集是有用的，所述方法包括(a)将α-共核蛋白C-末端或NAC部分肽与固相底物结合；(b)加入随机肽的噬菌体展示文库，并使其与α-共核蛋白发生结合；(c)检测任何结合的噬菌体；以及(d)测定哪个肽显示在结合的噬菌体上，由此这样的肽对抑制α-共核蛋白的聚集是有用的。
48.权利要求47所述的方法，其中所述α-共核蛋白肽含有α-共核蛋白第121-131位的氨基酸。
49.权利要求47所述的方法，其中所述α-共核蛋白肽含有α-共核蛋白第61-87位的氨基酸。
50.权利要求47所述的方法，其中所述噬菌体展示文库的肽长度是7个氨基酸。
51.一种测定药剂是否能够抑制α-共核蛋白的聚集的方法，其包括(a)用荧光标记标记α-共核蛋白，在含有怀疑是抑制α-共核蛋白聚集的药剂的溶液中混合标记和未标记的α-共核蛋白，并使α-共核蛋白聚集；(b)通过观测溶液的极化变化来监控溶液各向异性的变化，如果有聚集的α-共核蛋白存在，测定α-共核蛋白聚集的量；以及(c)将来自步骤(b)的量与其中没有所述药剂的对照样品所测定的量比较，其中极化变化显示聚集已发生，以及其中在药剂存在下所观测的聚集量的降低显示该药剂能够抑制α-共核蛋白的聚集。
全文摘要
本发明提供测定α－共核蛋白的聚集的方法，它们是路易体病如帕金森氏病的标记。本发明还公开聚集的抑制剂，包括镁和α－共核蛋白结合肽。这些抑制剂用于治疗路易体病。
文档编号A61K38/00GK1440420SQ01812433
公开日2003年9月3日 申请日期2001年7月6日 优先权日2000年7月7日
发明者本亚明·沃洛申, 纳塔莉·奥斯特列托瓦－戈尔茨, 迈克尔·S·勒博威驰 申请人:万能药制药公司