制备维生素k-依赖性蛋白的方法

专利名称：制备维生素k-依赖性蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及制备维生素K-依赖性蛋白质尤其是凝血因子VII(FVII)的新方法。此外，本发明涉及用于该改进的、制备维生素K-依赖性蛋白质方法中的共-转染真核宿主细胞和重组载体。
背景技术：
维生素K-依赖性蛋白质的生物合成，包括在获得成熟功能蛋白之前的数个翻译后加工步骤。
维生素K是这些维生素K-依赖性蛋白质中的谷氨酸残基γ-羧基化必需的辅因子，所述维生素K-依赖性蛋白质包括凝血原(procoagulant)因子凝血酶、凝血因子VII、IX和X；抗凝蛋白C和蛋白质S；及其它蛋白如骨钙蛋白(骨Gla蛋白)、基质Gla蛋白和富含脯氨酸的Gla蛋白1。羧基化是正常止血所需要的，因为它启动钙结合以及凝血原和抗凝剂向磷脂的附着。
γ-谷氨酰羧化酶是位于粗面内质网的完整膜微粒体酶。它羧化位于维生素K-依赖性蛋白质Gla结构域的谷氨酸残基。最近，已经分离出人γ-谷氨酰羧化酶cDNA并且进行了测序(Wu SM et al.Science2541634，1991)。在BHK和CHO细胞进行的生物合成维生素K-依赖性蛋白质的研究表明，在内质网(ER)和高尔基复合体上均有羧化酶存在，而且含有羧化酶识别位点的前肽在完成γ-羧化后才发生裂解。
已做了前肽是否可以促进羧化酶活性的推测(Sigiura，I.et al.(1997)Proc.NatI.Acad.Sci.，9，9069-9074，Knobloch and Suttie(1987)J.BioI.Chem.262，15334-15337，Furie et al(1999)Blood，93，1798-1808)。
血液凝固，是由各种血液组分或因子进行复杂的相互作用最终导致纤维蛋白凝块形成的过程。通常，参与称为凝血“级联”反应的血液成分，是在激活剂(本身是活化的凝血因子)的作用下转变为蛋白水解酶的酶学无活性蛋白质(酶原(pro-enzymess或者zymogens))。已经历这种转变的凝血因子泛指“活性因子”，并在凝血因子名称后添加小写字母“a”尾标来命名(例如，活化的凝血因子VII(FVIIa))。
凝血酶原转化为凝血酶需要活化的凝血因子X(FXa)，然后，凝血酶将纤维蛋白原转化为作为形成纤维蛋白凝块最后阶段的纤维蛋白。有两个系统或途径促进FX活化。“内源性途径”，是指通过利用仅在血浆中存在的因子导致凝血酶形成的那些反应。一系列蛋白酶-介导的活化作用最终产生因子IXa，其与因子VIIIa联合，将FX裂解成FXa。在血液凝固的“外源性路径”中，类似的蛋白水解由FVIIa和其辅因子(组织因子)进行。组织因子是一种膜结合蛋白，通常不在血浆中循环。然而，一旦血管破裂，在有Ca++和磷脂存在的情况下，辅因子可以与FVIIa复合以催化FX活化或者凝血因子IX活化。虽然两个凝血途径在止血中的相对重要性尚不清楚，但近年来，业已发现FVII和组织因子在调节血液凝固中起至关重要的作用。
FVII是以单链酶原形式在血液中循环的痕量血浆糖蛋白。此酶原无凝固活性。单链FVII可以在体外被FXa、因子XIIa、因子IXa、或凝血酶转变为双链FVIIa。认为FXa是FVII的主要生理性激活剂。象其它几种参与止血过程的血浆蛋白一样，FVII的生物合成依赖于维生素K，这是簇集在蛋白质氨基末端附近的10g个谷氨酸残基的γ-羧化作用所需要的。FVII的胞内翻译后加工过程在内质网(ER)和高尔基复合体中进行。除了维生素K-依赖性γ-羧化外，FVII接受限制性蛋白水解以去除N-末端前肽，和天门冬酰胺-145和-322及丝氨酸-52和-60位的糖基化(

图1)。
这些γ-羧化的谷氨酸(Gla)残基是金属离子-相关的FVII与磷脂相互作用所需要的。
在组织因子、磷脂和钙离子的存在下，双链FVIIa通过限制性蛋白水解迅速地激活凝血因子FX或凝血因子IX。
蛋白C是通过使凝血级联反应的因子Va和VIIIa失活而在调节体内平衡中发挥作用的丝氨酸蛋白酶和天然存在的抗凝剂。作为461个氨基酸的单链多肽的人蛋白C主要在体内肝脏制造。这些单链前体分子经历多次翻译后修饰(包括9个谷氨酸残基的羧化)产生9个Gla残基。
在体外凝固测定中，蛋白S也显示出抗凝活性。蛋白S表现出对于活化的蛋白C的抗凝辅因子活性。也已证明，在缺乏活化的蛋白C的情况下，蛋白S是一种抗凝血因子，因为，在不含活化的蛋白C的测定中，蛋白S可以抑制凝血酶原酶(prothrombinase)活性，以及在没有活化的蛋白C时，蛋白S与因子Va或因子Xa结合并起抗凝剂的作用。
既然遗传或获得性蛋白S缺乏与静脉和动脉血栓性疾病有关，那么蛋白S就是生理学上非常重要的抗血栓形成因子。已有描述称，某些患有血栓性疾病的患者具有正常水平总蛋白S但缺乏游离蛋白S。
它常常是患者体内选择性地阻断凝血级联反应所必需的。在肾脏透析期间，或者为了治疗深静脉血栓形成、弥漫性血管内凝血(DIC)、有发生急性血栓形成风险的患者、蛋白S缺乏、败血症、炎症、癌、接受手术和许多其它医学病症，可以使用抗凝剂如蛋白C或蛋白S。
骨钙蛋白由49个氨基酸残基组成，其中包括3个Gla残基。认为该蛋白的功能将被过度的矿化所抑制。骨钙蛋白是由成骨细胞分泌的骨-特异性蛋白质。新合成骨钙蛋白的一小部分释放入血流，血流中的浓度与成骨活性和骨形成率的指数相关。在人，已经证明，循环中骨钙蛋白水平的变化与代谢性骨疾病如骨质疏松症和甲状旁腺机能亢进有关。
基质Gla蛋白(MGP)由79个氨基酸组成，其中包括5个Gla残基。该蛋白通常在脱矿质基质中发现，据信，其在引发骨形成方面具有一定的功能。
本领域仍然需要改进的制备重组维生素K-依赖性蛋白质尤其是重组凝血因子的系统。本发明通过提供赋予更高效、更快生产和/或更高产率重组维生素K-依赖性蛋白尤其是FVII的方法而满足了这种需求。
发明描述本发明涉及制备维生素K-依赖性蛋白质尤其是凝血因子VII(FVII)的新方法。
如同本发明人用FVII举例说明的那样，业已证明，维生素K-依赖性蛋白质的谷氨酸残基的N-末端加工步骤，特别是γ-羧化，是该蛋白生物合成中的限速步骤。提高γ-羧化的方法已经显示出提高重组维生素K-依赖性蛋白质的表达。
维生素K-依赖性蛋白质的前肽，对于与羧化酶的结合而言是必不可少的，而且它必须共价附着于维生素K依赖性蛋白，以便使Glu残基被羧基化，所述Glu残基变成后来的成熟蛋白的N-末端。我们推测，游离前肽起变构调节分子的作用，在这个意义上，游离前肽的浓度增高，γ-羧化加工的活性也提高。
通过游离前肽自身的共表达，可以直接增加游离前肽的浓度。这可以通过如下过程完成在一个或多个拷贝中，用编码游离前肽的多核苷酸(有或者没有突变和截短)转染，并与编码维生素K-依赖性蛋白的多核苷酸一起共表达。除通常与维生素K-依赖性蛋白质相连的，后者可以含有另一前肽序列。通过把目的基因转染入细胞中，或者通过活化(即打开)编码维生素K-依赖性蛋白质的内源性基因，可以实现编码该维生素K-依赖性蛋白质的多核苷酸的表达，所述内源性基因已经存在于脊椎动物来源的初级、二级或无限增殖化细胞中，但在通常情况下不进行表达或者在获得的细胞中不表达到生理学显著水平。为了活化目的基因，同源重组可用于取代通常与细胞中基因有关的调节区或者使之失活，如得到引发要表达的基因比在相应的未转染细胞中显然更高水平表达的调节序列，或者表现为调节或诱导显然不同于相应的未转染细胞的方式(pattern)。
第一方面，本发明涉及在第一表达单元表达编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸和在第二表达单元表达编码第二游离前肽的第二多核苷酸的真核宿主细胞。应当懂得，第一多核苷酸位于第一表达单元，而第二多核苷酸位于第二表达单元，其中第一和第二表达单元不同。
第二方面，本发明涉及用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染的真核宿主细胞。应当懂得，第一多核苷酸位于第一表达单元，而第二多核苷酸位于第二表达单元，其中第一和第二表达单元不同。由于转染的实际级数(order)不合规定的(off course)很小，所以，可以首先用第二多核苷酸转染宿主细胞，或者反之亦然。使用术语“第一前肽”和“第二前肽”仅仅是出于方便考虑，因此，第一和第二前肽可以相同或不同。
本文所用术语“真核宿主细胞”代表在其中可以表达异源DNA的任何细胞，包括杂交细胞。代表性的宿主细胞包括但不局限于昆虫细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞(包括人细胞)，如BHK、CHO、HEK和COS细胞。在本发明实践中，培养的宿主细胞优选哺乳动物细胞，更优选已建立的哺乳动物细胞系，包括但不限于CHO(例如ATCC CCL 61)、COS-1(例如ATCC CRL1650)、幼仓鼠肾脏(BHK)和HEK293(例如ATCC CRL；Graham et al.，J.Gen.ViroL 3659-72，1977)细胞系。
优选的BHK细胞系是tk-tsl3 BHK细胞系(Waechter and Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 791106-1110，1982)，以下简称BHK 570细胞。BHK 570细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD 20852，ATCC登记号码为CRL 10314。tk-tsl3 BHK细胞系也购自ATCC，登记号为CRL 1632。
其它适宜的细胞系包括但不限于，Rat HepI(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL1600)、Rat Hep II(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)和DUKX细胞(Urlaub andChasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，1980)。也适用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤细胞和骨髓瘤与其它细胞的融合细胞。
术语“多核苷酸”，是指从5′读起到3′端的单链-或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并可以从天然来源分离、体外人工合成，或者从天然和合成分子联合体中制得。本文中多核苷酸分子的长度用核苷酸(缩写“nt”)或碱基对(缩写“bp”)表示。只要文章内容允许，术语“核苷酸”既用于指单链-分子，也用于指双链分子。在术语用于指双链分子的时候，它表示全长，应当理解为相当于术语“碱基对”。本领域技术人员能够理解，双链多核苷酸的两条链在长度上可以稍微不同，由于酶裂解的结果，两条链的末端可以参差；因此，双链多核苷酸分子内的所有核苷酸未必都成对。这种不成对的末端在长度上总的来说不超过20nt。
本文所用术语“前肽”，代表可以结合γ-谷氨酰羧化酶的任何氨基酸序列。发现引导维生素K-依赖性蛋白质γ羧化的代表性前肽在维生素K-依赖蛋白质的N-末端，起着为了与γ-谷氨酰羧化酶相互作用的对接位点或识别序列的作用，其羧化物谷氨酸残基通常位于维生素K-依赖性蛋白质的Gla结构域。在一个前肽中，有一个以上的γ-谷氨酰羧化酶结合位点，即γ-谷氨酰羧化酶识别序列。于是，该定义的前肽的一个实例是FVII的天然前肽序列。该定义的前肽的另一实例是在相同氨基酸序列内连接到凝血因子IX天然前肽序列的FVII的天然前肽序列。
本文所用术语“游离前肽”是指没有与要被γ-羧化的维生素K-依赖性蛋白质相连接的前肽。于是，游离前肽的一个实例是没有与FVII的氨基酸序列相连的FVII的前肽。
本文所用术语“因子VII”或“FVII”，是指由未激活型(因子VII)组成的产物。本文所用术语“因子VIIa”或“FVIIa”是指由活化型(因子VIIa)组成的产物。包括那些具有天然人因子FVII或FVIIa的1-406氨基酸序列的蛋白。它也包括具有稍微修饰的氨基酸序列的蛋白，例如修饰N-末端，包括N-末端氨基酸缺失或增加，只要蛋白基本上保持FVIIa的活性即可。上述定义的“FVII”或“FVIIa”也包括那些可能存在和发生的由一个变为另一个的天然等位基因变体。同时，糖基化程度和位置或其它翻译后修饰可能依选择的宿主细胞和宿主细胞环境的性质不同而异。
本文所用术语“变体”，旨在命名其亲本蛋白中的一个或多个氨基酸残基已被另一氨基酸残基取代，和/或其亲本蛋白中的一个或多个氨基酸残基已被删除，和/或一个或多个氨基酸残基已被添加到亲本蛋白中的FVII。此添加可以发生在亲本蛋白的N-末端或C-末端或者同时发生在N-末端和C-末端。
本文所用术语“表达单元”，是指包括下列可操作地连接元件的多核苷酸(a)转录启动子；(b)编码氨基酸序列的多核苷酸序列；和(c)转录终止子。因此，表达单元的一个实例是包括下列连接元件的DNA载体(a)转录启动子，(b)编码游离前肽的cDNA序列，和(c)转录终止子。
本文所用术语“载体”，是指能够在宿主细胞中扩增的任何核酸实体(entity)。因此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形态存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是在被引入宿主细胞时整合入宿主细胞基因组并与其已整合入的染色体一起复制的载体。载体的选择常常取决于其要引入的宿主细胞。载体包括但不局限于质粒载体、噬菌体载体、病毒或粘粒载体。载体通常包括复制起点和至少一个可选择的基因，即编码容易检测得到的产物或者产物的存在对于细胞生长是必不可少的基因。
术语“启动子”是指包括为结合RNA聚合酶和启动转录提供DNA序列的部分基因。启动子序列通常是但不总是在基因的5′非编码区。
第三方面，本发明涉及在第一表达单元表达编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸和在第二表达单元表达编码第二游离前肽的第二多核苷酸的真核宿主细胞。
再一方面，本发明涉及用在第一表达单元编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白的第一多核苷酸和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染的真核宿主细胞。
本文所用术语“维生素K-依赖性蛋白质”，是指在谷氨酸残基γ-羧化的任何蛋白。代表性的维生素K-依赖性蛋白质包括但不局限于凝血酶原因子凝血酶、凝血因子VII、IX和X；抗凝蛋白C和蛋白S；及其它蛋白如骨钙蛋白(骨Gla蛋白)、基质Gla蛋白和富含脯氨酸的Gla蛋白1。
另一方面，本发明涉及生产FVII或其变体的方法，包括a)在真核细胞中，在第一表达单元表达编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和在第二表达单元表达编码第二游离前肽的第二多核苷酸，以产生共-表达真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-表达真核宿主细胞。
另一方面，本发明涉及生产FVII或其变体的方法，包括a)在真核细胞中，在第一表达单元表达编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和在第二表达单元表达编码第二游离前肽的第二多核苷酸，以产生共-表达真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-表达真核宿主细胞，和c)从培养基中分离FVII或其变体。
另一方面，本发明涉及生产FVII或其变体的方法，包括a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞。
另一方面，本发明涉及生产FVII或其变体的方法，包括a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞，和c)从培养基中分离FVII或其变体。
另一方面，本发明涉及生产FVIIa或其变体的方法，包括a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞，和c)从培养基中分离并活化FVII或其变体。
再一方面，本发明涉及重组载体，其中所述载体包括在表达单元中编码游离前肽的多核苷酸。下述涉及第二多核苷酸、第二游离前肽和第二表达单元的实施方案，分别地或者联合代表包含在重组载体之内的多核苷酸、游离前肽和表达单元的实施方案。
再一方面，本发明涉及重组载体，其中所述载体包括在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸和在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸。
再一方面，本发明涉及重组载体，其中所述载体包括在第一表达单元编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸和在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸。
再一方面，本发明涉及制备生产FVII的真核宿主细胞的方法，包括a)在真核宿主细胞中，活化在第一表达单元中编码FVII的18至406氨基酸序列和其前肽的第一多核苷酸的基因，和b)用在第二表达单元编码第二游离多肽的第二多核苷酸转染。在这方面，氨基酸序列-18至-1与定义为SEQID NO7的FVII的前肽是相同的。
再一方面，本发明涉及制备生产FVII或其变体的真核宿主细胞的方法，包括a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸转染真核宿主细胞，和b)用在第二表达单元编码第二游离多肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞。
另一方面，本发明涉及生产维生素K-依赖性蛋白质的方法，包括a)在真核宿主细胞中，在第一表达单元表达编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸，和在第二表达单元表达编码第二游离前肽的第二多核苷酸，以产生共-表达真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-表达真核宿主细胞。
另一方面，本发明涉及生产维生素K-依赖性蛋白质的方法，包括a)在真核宿主细胞中，在第一表达单元表达编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸，和在第二表达单元表达编码第二游离前肽的第二多核苷酸，以产生共-表达真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-表达真核宿主细胞；和c)从培养基中分离维生素K-依赖性蛋白质。
另一方面，本发明涉及生产维生素K-依赖性蛋白质的方法，包括a)用在第一表达单元编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞。
另一方面，本发明涉及生产维生素K-依赖性蛋白质的方法，包括a)用在第一表达单元编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞；和c)从培养基中分离维生素K-依赖性蛋白质。
另一方面，本发明涉及通过下述方法获得的重组FVII或其变体a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞。
另一方面，本发明涉及通过下述方法获得的重组FVII或其变体a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞；和c)从培养基中分离FVII或其变体。
另一方面，本发明涉及通过下述方法获得的重组FVIIa或其变体a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞；和c)从培养基中分离并活化FVII或其变体。
另一方面，本发明涉及通过下述方法获得的重组维生素K-依赖性蛋白质a)用在第一表达单元编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞。
另一方面，本发明涉及通过下述方法获得的重组维生素K-依赖性蛋白质a)用在第一表达单元编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞；和c)从培养基中分离维生素K-依赖性蛋白质。
第一前肽可以是那些通常与维生素K-依赖性蛋白质相连的前肽，或者是任何其它前肽，如通常与不同维生素K-依赖性蛋白质相连的前肽。
在一实施方案中，第一前肽包括适合于γ-谷氨酰羧化酶的一个结合序列。在另一实施方案中，第一前肽包括适合于γ-谷氨酰羧化酶的两个或更多个结合序列。因此，第一前肽的实例是通常与FVII结合(associated)并共价附着于同一表达单元的凝血酶原的前肽。
在另一实施方案中，第二游离前肽包括适合于γ-谷氨酰羧化酶的一个结合序列。在另一实施方案中，第二游离前肽包括适合于γ-谷氨酰羧化酶的两个或更多个结合序列。因此，第二游离前肽的实例是通常与FVII结合并共价附着于同一表达单元的凝血酶原的前肽。
在本发明的另一实施方案中，真核宿主细胞在第一表达单元表达编码第一前肽和FVII的第一多核苷酸，和在第二表达单元表达编码第二游离前肽的第二多核苷酸。在一特定实施方案中，FVII是人FVII。
在本发明的另一实施方案中，用在第一表达单元编码第一前肽和FVII的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞。在一特定实施方案中，FVII是人FVII。
在本发明另一实施方案中，维生素K-依赖性蛋白质独立地选自凝血酶原、凝血因子IX、FVII、凝血因子X、蛋白C、蛋白S、骨钙蛋白、富含脯氨酸的Gla蛋白1或基质Gla蛋白。应当懂得，这些蛋白中的任一项构成本发明供选择的实施方案。
在本发明的另一实施方案中，用表达单元中的编码γ-谷氨酰羧化酶的多核苷酸进一步转染真核宿主细胞。该表达单元可以是不同于第一或第二表达单元的表达单元，或者，该编码γ-谷氨酰羧化酶的多核苷酸位于第一或第二表达单元。γ-谷氨酰羧化酶的实例选自重组人、大鼠、果蝇、小家鼠或仓鼠γ-谷氨酰羧化酶。
在本发明的另一实施方案中，第一前肽包括下式的氨基酸序列X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17其中X1、X4、X5、X6、X7、X9、X10和X13独立地选自G，P，A，V，L，I，M，C，F，Y，W，H，K，R，Q，N，E，D，S和T，和其中X2、X3、X11和X12独立地选自V，L，P，N，A，I，S，F，M，W，Q，T和Y，和其中X8独立地选自G和A，和其中X14，X15，X16和X17独立地选自R，H，A，T，W，L，I，V，Q，K，Y，P，或不存在。
在第一前肽的一实施方案中，X1选自A、S、N、R、T和H。
在第一前肽的另一实施方案中，X2选自V、L、P、N和A。
在第一前肽的另一实施方案中，X3选自L、I、V和S。
在第一前肽的另一实施方案中，X4选自S、R、N、T、D和A。
在第一前肽的另一实施方案中，X5选自R、Q、K、G、H、S和P。
在第一前肽的另一实施方案中，X6选自E、R和Q。
在第一前肽的另一实施方案中，X7选自Q、N、E、K和R。
在第一前肽的另一实施方案中，X8选自A和G。
在第一前肽的另一实施方案中，X9选自N、H、S和R。
在第一前肽的另一实施方案中，X10选自Q、N、T、G、S、K和E。
在第一前肽的另一实施方案中，X11选自V、I、F和L。
在第一前肽的另一实施方案中，X12选自L、I和V。
在第一前肽的另一实施方案中，X13选自Q、A、S、H、V、K、N和R。
在第一前肽的另一实施方案中，X14选自R、H、K、I和P，或者不存在。
在第一前肽的另一实施方案中，X15选自R、H、K、Q、V、Y、P、A、T、W和L，或者不存在。
在第一前肽的另一实施方案中，X16选自R、H、T、Q、K、Y和P，或者不存在。
在第一前肽的另一实施方案中，X17选自R、H和K，或者不存在。
在第一前肽的另一实施方案中，X17是R。
在本说明书中，使用如表1所示的IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature委员会(CBN)批准的缩写符号表示氨基酸残基。关于氨基酸和具有异构体的氨基酸，用下列缩写表示其天然L-型。此外，除非另作说明，否则肽中氨基酸序列的左侧和右侧末端分别是N-和C末端。
在本发明的另一实施方案中，第一前肽包括抑制常数(inhibitionconstant)(Ki)小于1mM的氨基酸序列。在另一实施方案中，氨基酸序列的Ki小于0.5mM。在另一实施方案中，氨基酸序列的Ki为0.1nM-0.5mM。
在本发明的另一实施方案中，第一前肽包括与独立地选自下组的序列具有至少30％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在本发明的另一实施方案中，第一前肽包括与独立地选自下组的序列具有至少40％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在另一实施方案中，第一前肽包括与独立地选自下组的序列具有至少50％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在本发明的另一实施方案中，第一前肽包括Ki小于1mM并与独立地选自下组的氨基酸具有至少30％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在本发明的另一实施方案中，第一前肽包括与独立地选自下组的具体氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在本发明的另一实施方案中，第二游离前肽包括下式的氨基酸序列X1X1FX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17其中X1、X4、X5、X6、X7、X9、X10和X13独立地选自G，P，A，V，L，I，M，C，F，Y，W，H，K，R，Q，N，E，D，S和T，和其中X2、X3、X11和X12独立地选自V、L、P、N、A、I、S、F、M、W、Q、T和Y，
和其中X8独立地选自G和A，和其中X14X15X16和X17独立地选自R、H、A、T、W、L、I、V、Q、K、Y、P，或者不存在。
在第二游离前肽的一实施方案中，X1选自A、S、N、R、T和H。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X2选自V、L、P、N和A。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X3选自L、I、V和S。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X4选自S、R、N、T、D和A。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X5选自R、Q、K、G、H、S和P。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X6选自E、R和Q。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X7选自Q、N、E、K和R。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X8选自A和G。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X9选自N、H、S和R。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X10选自Q、N、T、G、S、K和E。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X11选自V、I、F和L。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X12选自L、I和V。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X13选自Q、A、S、H、V、K、N和R。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X14选自R、H、K、I和P，或者不存在。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X15选自R、H、K、Q、V、Y、P、A、T、W和L，或者不存在。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X16选自R、H、T、Q、K、Y和P，或者不存在。
在第二游离前肽的另一实施方案中，X17选自R、H、T、Q、K、Y和P，或者不存在。
在本发明的另一实施方案中，第二游离前肽包括Ki小于1mM的氨基酸序列。在另一实施方案中，氨基酸序列的Ki小于0.5mM。在另一实施方案中，氨基酸序列的Ki为0.1nM-0.5mM。
在本发明的另一实施方案中，第二前肽包括与独立地选自下组的序列具有至少30％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在本发明的另一实施方案中，第二前肽包括与独立地选自下组的序列具有至少40％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在本发明的另一实施方案中，第二前肽包括与独立地选自下组的序列具有至少50％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在本发明的另一实施方案中，第二游离前肽包括Ki小于1mM并与独立地选自下组的特定序列具有至少30％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在本发明的另一实施方案中，第二游离前肽包括独立地选自下组的具体氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
在本发明的另一实施方案中，真核宿主细胞是酵母细胞。
在本发明的另一实施方案中，真核宿主细胞是昆虫细胞。
在本发明的另一实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物细胞。
在本发明的另一实施方案中，真核宿主细胞是人细胞。
在本发明的另一实施方案中，真核宿主细胞独立地选自BHK细胞、HEK细胞、COS细胞或CHO细胞。
在本发明的另一实施方案中，第一多核苷酸是DNA。
在本发明的另一实施方案中，第二多核苷酸是DNA。
在本发明的另一实施方案中，第一多核苷酸是RNA。
在本发明的另一实施方案中，第二多核苷酸是RNA。
在本发明的另一实施方案中，第一表达单元存在于第一载体上，而第二表达单元存在于分开的第二载体上。
在本发明的另一实施方案中，第一表达单元和第二表达单元存在于同一载体上。
在本发明的另一实施方案中，第一载体是质粒载体。
在本发明的另一实施方案中，第二载体是质粒载体。在本发明的另一实施方案中，第一载体是噬菌体载体。
在本发明的另一实施方案中，第二载体是噬菌体载体。
在本发明的另一实施方案中，是不含血清的培养基。
在本发明的另一实施方案中，第一多核苷酸是质粒DNA。
在本发明的另一实施方案中，第二多核苷酸是质粒DNA。
本文所用术语“适合于γ-谷氨酰羧化酶的结合序列”，是指序列(即识别序列)内对于结合或对接γ-谷氨酰羧化酶或者与γ-谷氨酰羧化酶相互作用所必要的氨基酸残基。
在本发明的另一实施方案中，第一前肽比第二游离前肽对于羧化酶具有更高的亲和力(用抑制常数(Ki)测得)。前提是，维生素K-依赖性蛋白质的前肽对于羧化酶有分别两个功能(separable functions)，底物结合和活性调节，共价附着的前肽和游离前肽的不同亲和力和浓度，可以影响细胞生产羧化的重组维生素K-依赖性蛋白质的总量。共表达的游离前肽和共价附着的前肽以及它们的结合物可以提高功能性重组FVII(r FVII)的生产量。为了不抑制新人工合成的含有Glu的维生素K-依赖性蛋白质的羧化，第二游离前肽最好比共价附着于要被γ-羧化的维生素K-依赖性蛋白质的前肽具有更低的亲和力。
按照Stanley et al(Biochemistry，38，15681-15687(1999)和J.Biol.Chem274，16940-16944.)的方法测定游离前肽的Ki。
在另一实施方案中，要与维生素K-依赖性蛋白质共表达的游离前肽优先选自表2和表3中所列的那些
表1氨基酸残基的缩写
表2来自维生素K-依赖性蛋白质的前肽和共有前肽的氨基酸序列
Stanley et al(1999)Biochemistry，38，15681-15687和J.Biol.Chem.274，16940-16944表3与维生素K-依赖性蛋白质共-表达的游离前肽的实例
本发明也涉及制备上述维生素K-依赖性蛋白质的方法。维生素K-依赖性蛋白质优选通过重组DNA技术生产。为此目的，通过下列步骤可以分离出编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA序列制备基因组或cDNA文库，并按照标准技术使用合成寡核苷酸探针进行杂交来筛选编码全部或部分所述蛋白的DNA序列(参见Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989)。为此目的，编码该蛋白的DNA序列优选是人来源的，即来源于人基因组DNA或cDNA文库。
本发明也涉及活化(即打开)编码维生素K-依赖性蛋白质的基因的方法，所述基因已经存在于脊椎动物来源的初级、二级或无限增殖化细胞中，但在通常情况下不进行表达或者在得到的细胞中不表达到生理学显著水平。同源重组可用于取代通常与细胞中基因有关的调节区或者使之失活，如得到引起要表达的基因比在相应的未转染细胞中显然更高水平表达的调节序列，或者表现为调节或诱导显然不同于相应的未转染细胞的特征(pattern)。因此，本发明也涉及通过打开或活化在转染的初级、二级或无限增殖化细胞中的编码维生素K-依赖性蛋白质的内源性基因而制备维生素K-依赖性蛋白质的方法。内源性基因的活化，可以按照US 5,968,502描述的那样进行。编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA序列也可通过已经建立的标准方法经合成制备，例如用Beaucage and Caruthers，Tetrahedron Letters22(1981)，1859-1869描述的磷酰胺方法，或者用Matthes等EMBO Journal 3(1984)，801-805描述的方法。根据磷酰胺方法，人工合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成器中合成，纯化、退火、连接并在适宜载体中克隆。
使用特异的引物，例如US4,683,202、Saiki等，Science 239(1988)，487-491或Sambrook等(出处同上)所描述的那样，也可通过聚合酶链式反应制备DNA序列。
通常可以把编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA序列插入到重组载体中，所述重组载体可以是任何载体，它可方便地接受重组DNA操作，而载体的选择常常取决于将要引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形态存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是在被引入宿主细胞时整合入宿主细胞基因组并与其已整合入的染色体一起复制的载体。
载体优选是表达载体，其中编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA序列可操作地与DNA转录所需的其它片段相连接。一般来说，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或者包含二者的元件。术语“可操作地连接”，是指为了意欲的目的，片段进行便于协调一致发挥功能的排列，所述目的例如引发启动子的转录和通过编码多肽的DNA序列进行转录。
启动子可以是在挑选的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以来源于编码与该宿主细胞同源或异源的蛋白的基因。
引导编码哺乳动物细胞维生素K-依赖性蛋白质的DNA转录的适宜启动子的实例是SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1(1981)，854-864)，MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等，Science 222(1983)，809-814)，CMV启动子(Boshart等，Cell 41521-530，1985)或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman and Sharp，Mol.Cell.Biol，21304-1319，1982)。
供昆虫细胞用的适宜启动子的实例是多角体蛋白启动子(US 4,745,051；Vasuvedan等，FEBS Lett.311.(1992)7-11)、P10启动子(J.M.Vlak等，J.Gen.Virology 69，1988，765-776页)、Autographa californica多角体病毒碱性蛋白启动子(EP 397 485)、杆状病毒立即早期基因1启动子(US5,155,037；US 5,162,222)、或杆状病毒39K延迟-早期基因启动子(US5,155,037；US 5,162,222)。
供酵母宿主细胞用的适宜启动子的实例，包括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255(1980)，12073-12080；Alber and Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)或乙醇脱氢酶基因(Young等，inGenetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender et al，eds.)，Plenum Press，New York，1982)的启动子，或者TPI1(US 4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，Nature 304(1983)，652-654)启动子。
供丝状真菌宿主细胞用的适宜启动子的实例是例如，ADH3启动子(McKnight等，The EMBO J.4(1985)，2093-2099)或者tpiA启动子。其它有用的启动子的实例是那些来源于编码下列酶的基因米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉(A.niger)酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或者A.awamori glucoamylase(gluA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或者构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶。优选TAKA-淀粉酶和gluA启动子。适宜的启动子在例如EP 238 023和EP 383 779中提及。
如有必要，编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA序列也可以可操作地与适宜的终止子连接，如人生长激素终止子(Palmiter et al.，Science 222.1983，pp.809-814)或TPI1(Alber and Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1.1982，pp.419-434)或ADH3(McKnight et al.，The EMBO J.4.1985，pp.2093-2099)终止子。表达载体也可含有一套位于启动子下游和FVII序列自身插入位点上游的RNA剪接位点。优选的RNA剪接位点可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因中获得。表达载体也含有位于插入位点下游的聚腺苷酸化信号。特别优选的聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信号(Kaufmanand Sharp，出处同上)，来自腺病毒5 Elb区的聚腺苷酸化信号，人生长激素基因终止子(DeNoto et al.Nucl.Acids Res.93719-3730，1981)或来自人FVII基因或牛FVII基因的聚腺苷酸化信号。表达载体也可包括位于启动子和RNA剪接位点之间的非编码性病毒前导序列，如腺病毒2三联前导序列；和增强子序列，如SV40增强子。
重组载体可进一步包括使得载体能在正被讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)的一个实例是SV40复制起点。
当宿主细胞是酵母细胞时，能够使载体复制的适宜序列是酵母质粒2μ复制基因REP 1-3和复制起点。
载体也可包括选择性标志物，例如其产物弥补了宿主细胞中的缺陷的基因，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或者裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)pombe TPI基因(P.R.Russell，Gene 40，1985，pp.125-130)，或者赋予药物抗性的基因，所述药物例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或者氨甲喋呤。对于丝状真菌，选择性标志物包括amdS、pyrG、argB、niaD或者sC。
为了引导本发明维生素K-依赖性蛋白质进入宿主细胞的分泌途径，可在该重组载体中提供分泌信号序列(亦称前导序列、前原(prepro)序列或者前(pre)序列。分泌信号序列与正确阅读框架中的编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA序列相连。分泌信号序列通常位于编码该肽的DNA序列的5′端。分泌信号序列可以是那些通常与该蛋白结合的信号序列，或者是来源于编码另一分泌性蛋白质的基因的信号序列。
对于由酵母细胞的分泌，分泌信号序列可以编码确保高效引导表达的维生素K-依赖性蛋白质进入细胞分泌途径的任何信号肽。信号肽可以是天然存在的信号肽或其功能部分，或者是合成肽。业已发现，适宜的信号肽是α-因子信号肽，(参见US 4,870,008)、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(参见0.Hagenbuchle et al.Nature 289，1981，643-646页)、修饰的羧肽酶信号肽(参见L.A.Vails等，Cell 48，1987，887-897页)、酵母BAR1信号肽(参见WO 87/02670)、或者酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitaniet al.Yeast 6.1990，127-137页)。
为了在酵母的高效分泌，也可将编码前导肽的序列插入信号序列的下游和编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA序列的上游。前导肽的功能是使得表达的肽直接从内质网到达高尔基体并且进一步到达分泌小泡以分泌进入培养基中(即维生素K-依赖性蛋白质穿越细胞壁转运，或者至少穿过细胞膜进入酵母细胞的周质间隙)。前导肽可以是酵母á-因子前导肽(其应用描述在例如US4,546,082、US 4,870,008、EP 16 201、EP 123 294、EP 123 544和EP 163 529中)。或者，前导肽可以是合成的前导肽，也就是说在自然界未发现的前导肽。合成的前导肽可以是例如在WO 89/02463或者WO 92/11378中所描述的构建物。
为了用于丝状真菌，信号肽可以方便地起源于编码曲霉类淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，编码米赫根毛属脂肪酶或蛋白酶或腐殖菌属盖满绒毛的(lanuginosa)脂肪酶的基因。信号肽优选来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸-稳定的淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。适宜的信号肽公开在例如EP 238 023和EP 215 594中。
为了用于昆虫细胞，信号肽可以方便地得自于昆虫基因(参见WO90/05783)，如鳞翅目(lepidopteran)Manduca sexta脂肪酸释放激素前体信号肽(参见US 5,023,328)。
用于分别连接编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列，以及将它们插入到包含复制所需信息的适宜载体中的方法，为本领域技术人员所熟知(参见例如，Sambrook et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor，New York，1989)。
转染哺乳动物细胞并在引入的细胞中表达DNA序列的方法，描述在例如下列文献中Kaufman and Sharp，J.Mol.Biol.159(1982)，601-621；Southern and Berg.J.Mol.Appl.Genet.1(1982).327-341；Loyter etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(1982)，422-426；Wigler et al.，Cell14(1978)，725；Corsaro and Pearson，Somatic CellGenetics 7(1981)，603，Graham and van der Eb，Virology 52(1973)，456；和Neumann et al.，EMBOJ.1(1982)，841-845。
选择性标志物可以与在不同质粒上的目的基因同时转入细胞，也可以在同一质粒上转入。如果在同一质粒上，选择性标志物和目的基因可以在不同启动子或相同启动子的控制下，后一情形产生双顺反子(dicistronic)信息。此类构建物为本领域所已知(例如，Levinson and Simonsen，美国专利4,713,339)。向待引入细胞的混合物中添加另外的DNA(称为“载体DNA”)也是有益的。
细胞吸收该DNA后，在合适的生长培养基中生长，通常1-2天，以开始表达目的基因。本文所用术语“合适的生长培养基”，是指含有细胞生长和表达目的维生素K-依赖性蛋白质所需要的营养素和其它组分的培养基。培养基一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖、维生素、盐、磷脂、蛋白和生长因子。为产生γ-羧化的蛋白，培养基将含有维生素K，优选浓度约0.1μg/ml至约5μg/ml。然后，药物筛选用于挑选生长的、以稳定方式表达选择性标志物的细胞。对于已用可扩增的选择性标志物转染的细胞，可以提高药物浓度以挑选高拷贝数的克隆序列，从而提高表达水平。然后，筛选用于表达目的维生素K-依赖性蛋白质的稳定地转染的细胞克隆。
把将要编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA序列引入其中的宿主细胞，可以是能够产生翻译后加工修饰的维生素K-依赖性蛋白质的任何细胞，包括酵母、真菌和高等真核细胞。
用于本发明的哺乳动物细胞系的实例是COS-1(ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)和293(ATCC CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.3659-72，1977)细胞系。优选的BHK细胞系是tk.sup.tk.sup.-ts13 BHK细胞系(Waechterand Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 791106-1110，在此引入作为参考)，以下简称BHK 570细胞。BHK 570细胞系已经保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，12301 Parklawn Dr.，Rockville，MD 20852，ATCC登记号码为CRL 10314。tk.sup.-ts13 BHK细胞系也可得自ATCC，登记号为CRL 1632。另外，本发明可以使用大量其它细胞系，包括Rat HepI(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)、Rat Hep II(大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)、CHO(ATCC CCL 61)和DUKX细胞(Urlaub andChasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，1980)。
适宜酵母细胞的实例包括Saccharomyces spp.或Schizosac-charomycesspp.，特别是特定的酿酒酵母株或Saccharomyces kluyveri。用异源DNA转化酵母细胞和产生异源多肽的方法，描述在例如US 4,599,311、US 4,931,373、US 4,870,008、5,037,743和US 4,845,075中，所有这些文献均在此引入作为参考。通过用选择性标志物，通常是药物抗性或者能够在缺乏特定营养素例如亮氨酸的条件下生长的能力，测定的表型来筛选转化的细胞。供酵母用的优选载体是在US 4,931,373中公开的POT1载体。编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA序列，可以由信号序列和任选地前导序列领先引导，例如如上所述的那样。适宜酵母细胞的其它实例是克卢费氏酵母属(Kluyveromyces)株如K.lactis、汉逊酵母属(Hansenula)如H.polymorpha、或毕赤氏酵母属(Pichia)如P.pastoris(参见Gleeson et al.J.Gen.Microbiol.132.1986，pp.3459-3465；US 4,882,279)。
其它真菌细胞的实例是丝状真菌细胞，如曲霉类、脉孢菌类(Neurosporaspp.)、镰孢属spp.(Fusarium spp.)或木霉属spp.(Trichoderma spp.)，特别是米曲霉、构巢曲霉或黑曲霉株。利用曲霉spp.表达蛋白，描述在例如EP 272277、EP 238 023、EP 184 438中。可以例如按照Malardier等1989，Gene 78147-156中描述的那样，进行尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的转化。木霉属spp.的转化可以例如按照EP 244 234描述的那样进行。
当丝状真菌用作宿主细胞时，可以用本发明的构建物进行转化，通过方便地把DNA构建物整合入宿主染色体而获得重组宿主细胞。一般认为此种整合具有优越性，因为DNA序列更可能稳定地保持在该细胞中。根据惯常方法，例如通过同源或异源重组，可以完成把DNA构建物整合入宿主染色体中。
按照US 4,745,051、US 4,879,236、US 5,155,037、5,162,222、EP397,485(所有这些文献在此引入作为参考)描述的那样，完成昆虫细胞的转化和异源多肽在其中的生产。用作宿主的昆虫细胞系可以适宜地是鳞翅目细胞系，例如Spodoptera frugiperda细胞或Trichoplusia ni细胞(参见US5,077,214)。适宜的培养条件是例如WO 89/01029或WO 89/01028或前述任一项参考文献所描述的那样。
然后，在容许维生素K-依赖性蛋白质表达的条件下，在适宜的营养培养基中培养上述转化或转染的宿主细胞，之后，从培养基中回收产生的所有或部分肽。用于培养细胞的培养基可以是适于宿主细胞生长的任何传统的培养基，如含有合适补充物的基本或复合培养基。适宜的培养基可以商购得到，或者按照出版物(例如美国典型培养物保藏中心产品目录)公开的方法制备。接下来，通过常规方法，从培养基中回收由细胞产生的维生素K-依赖性蛋白质，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，用盐例如硫酸铵沉淀上清液或滤液的蛋白质成分，用各种色谱层析法例如离子交换色谱法、凝胶过滤层析法、亲和层析法等等(取决于所讨论的多肽种类)进行纯化。
为了制备重组人FVII或其变体，使用克隆的野生型FVII DNA序列。可以修饰该序列以编码所需的FVII蛋白或其变体。然后，将该修饰的序列插入到表达载体中，后者反过来转化或转染入宿主细胞。高等真核细胞，特别是培养的哺乳动物细胞，优选作为宿主细胞。人VII的完整核苷酸和氨基酸序列是已知的，参见美国专利4,784,950，该文献在此引入作为参考，其中描述了重组人因子VII的克隆和表达。牛的FVII序列描述在Takeya等，J.Biol.Chem，26314868-14872(1988)中，该文献在此引入作为参考。
通过各种技术可以实现氨基酸序列改变。通过定位诱变可以进行DNA序列的修饰。定位诱变技术为本领域技术人员所熟知，并描述在例如Zoller和Smith(DNA 3479-488，1984)中。因此，使用FVII的核苷酸和氨基酸序列，人们可以引入选择的改变。
用于本发明的DNA序列通常编码位于FVII蛋白氨基末端的前肽原(pre-pro peptide)以得到正确的翻译后加工过程(例如谷氨酸残基的γ-羧基化)并由宿主细胞分泌。前肽原可以是FVII或其它维生素K-依赖性血浆蛋白，如凝血因子IX、凝血因子X、凝血酶原、蛋白C或蛋白S。如本领域技术人员所要知晓的那样，在VII的氨基酸序列中可进行其它的修饰，这些修饰不会显著地削弱此蛋白作为凝固因子的能力。例如，按照美国专利5,288,629(在此引入作为参考)一般描述的那样，也可在活化裂解位点修饰FVII从而抑制酶原FVII转化成为活化的双链形式。
在本发明中，可以使用转基因动物技术生产维生素K-依赖性蛋白质。优选在宿主雌性哺乳动物的乳腺内生产蛋白质。在乳腺表达之后，将目的蛋白质分泌到乳汁中，克服了分离源自其它来源的蛋白质遇到的许多困难。乳汁很容易收集，便于大批量获得，而且生物化学表征好。此外，乳汁中的主要蛋白为高浓度(通常约1至15g/l)。从商业观点出发，显然优选那些具有大的产乳量的种类作为宿主。虽然可以使用较小的动物如小鼠和大鼠(而且在原理的证明期(at the proof of principle stage)是优选的)，但是优选使用家畜类哺乳动物，包括但不限于猪、山羊、绵羊和牛。由于下列这些因素，使得绵羊成为特别优选在该物种进行转基因的早期历史、产乳量、价格和用于收集绵羊奶的方便易得的设备。关于影响所选宿主种类的因素的比较，请参见WIPO公开文本WO 88/00239。一般期望挑选那些已被培育为日用的宿主动物育种，如East Friesland绵羊，或者在晚些时候通过繁殖转基因系而引入乳畜。无论如何，应该使用巳知健康状况良好的动物。
为了获得在乳腺的表达，使用来自乳蛋白基因的转录启动子。乳蛋白基因包括那些编码酪蛋白(参见美国专利5,304,489，在此引入作为参考)、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和乳清酸性蛋白的基因。优选β-乳球蛋白(BLG)启动子。在绵羊β-乳球蛋白基因情况下，一般使用该基因序列5′侧翼的至少约406bp序列区域，虽然优选长达约5kbp的更长部分，如包括β-乳球蛋白基因的5′侧翼启动子和非-编码部分的约4.25kbp DNA片段。见Whitelaw等人，Biochem.J.28631-39(1992)。来自其它物种的启动子DNA的类似片段也是适宜的。
也可将β-乳球蛋白基因的其它区域整合入构建物中，这可以是待表达基因的基因组区域。本领域一般认为，例如，缺乏内含子的构建物与含有该DNA序列的构建物相比表达较差(见Brinster et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85836-840(1988)；Palmiter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88478-482(1991)；Whitelaw et al.，Transgenic Res.13-13(1991)；WO 89/01343；和WO 91/02318，每一篇文献均在此引入作为参考)。在这方面，可能情况下一般优选使用包含编码目标蛋白质或多肽的基因的所有或部分天然内含子的基因组序列，因此，优选进一步包含至少一些源自例如β-乳球蛋白基因的内含子。一种这样的区域是提供用于内含子剪接和从绵羊β-乳球蛋白基因的3′非编码区RNA聚腺苷酸化的DNA片段。当取代基因的天然3′非编码序列时，该绵羊的β-乳球蛋白片段便可同时提高和稳定目的蛋白质或多肽的表达水平。其它实施方案中，编码维生素K-依赖性蛋白质序列的起始ATG的周围区域被源自乳特异性蛋白质基因的相应序列所取代。该种取代提供了推测的组织特异性起始环境以提高表达。虽然可以取代较小的区域，但用例如BLG基因取代维生素K-依赖性蛋白质的整个前原序列和5′非编码序列是方便的。
为了在转基因动物中表达维生素K-依赖性蛋白质，将编码维生素K-依赖性蛋白质的DNA片段可操作地连接到其表达所必需的DNA片段上以产生表达单元。这种其它片段包括上述提到的启动子，以及用于提供转录终止和mRNA聚腺苷酸化的序列。表达单元进一步包括可操作地连接到编码维生素K-依赖性蛋白质的片段上的分泌性信号序列的DNA片段。分泌性信号序列，可以是维生素K-依赖性蛋白质的天然分泌性信号序列，或者可以是另一种蛋白质如乳蛋白的分泌性信号序列。参见例如，von Heijne，Nucl.Acids Res.144683-4690(1986)；和Meade et al.，美国专利4,873,316，在此引入作为参考。
通过把编码维生素K-依赖性蛋白质的序列插入含有其它DNA片段的质粒或噬菌体载体中，可以很方便地完成用于转基因动物的表达单元的构建，尽管实质上可以通过任何序列的连接而构建表达单元。特别方便的是，提供含有编码乳蛋白的DNA片段的载体，和用维生素K-依赖性蛋白质的编码序列取代乳蛋白的编码序列，从而产生包括该乳蛋白基因的表达控制序列的融合基因。无论如何，质粒或其它载体中的表达单元的克隆有利于维生素K-依赖性蛋白质的扩增。扩增可在细菌(例如大肠杆菌)宿主细胞中方便地进行，因此，载体通常包括复制起点和在细菌宿主细胞中有功能的选择性标志物。
然后，把表达单元引入所挑选的宿主物种的受精卵(包括早期胚)中。可通过数种方式中的一个完成异源DNA的引入，所述方式包括显微注射(如美国专利4,873,191)，逆转录病毒感染(Jaeni sch，Science 2401468-1474(1988))或使用利用胚胎干(ES)细胞进行定点整合(由Bradley等综述，Bio/Technology 10534-539(1992))。然后，将受精卵植入假妊娠的雌性动物的输卵管或子宫中，使之发育足月。在其胚系中携带引入的DNA的子代将该DNA以正常孟德尔方式传入其子代，由此发展为转基因种群。
用于生产转基因动物的一般程序为本领域已知。参见例如，Hogan et al.，Manipulatin-g the Mouse EmbryoA Laboratory Manual，Cold Sprin-gHarbor Laboratory，1986；Simons et al.，Bio/Technology 6179-183(1988)；Wall et al.，Biol.Reprod.32645-651(1985)；Buhler et al.，Bio/Technologv 8140-143(1990)；Ebert et al.，Bio/Technologv 9835-838(1991)；Krimpenfort et al.，Bio/Technoloay 9844-847(1991)；Wall et al.，J.Cell.Biochem.49113-120(1992)；美国专利4,873,191；美国专利4,873,316；WO 88/00239，WO 90/05188，WO 92/11757；和GB87/00458，所有这些文献在此引入作为参考。用于将外源DNA序列引入哺乳动物和其胚系细胞的技术最初是在小鼠中发展来的。参见例如，Gordon etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 777380-7384(1980)；Gordon and Ruddle，Science 2141244-1246(1981)；Palmiter and Brinster，Cell 41343-345(1985)；Brinster et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824438-4442(1985)；和Hogan et al.(出处同上)。这些技术随后被修改以适用于较大的动物，包括家畜类(参见例如，WIPO公开文本WO 88/00239、WO 90/05188和WO 92/11757；以及Simons et al.，Bio/Technoloqv 6179-183(1988))。总之，在迄今产生转基因小鼠或家畜的最有效途径中，按照已建立的技术将数百个线型目的DNA分子注射入受精卵的核原(pro-nuclei)中。也可将DNA注射入受精卵的胞质中。也可以采用在转基因植物中生产。表达可以是广泛的或者是定向于特定器官如块茎。参见Hiatt，Nature 344469-479(1990)；Edelbaum et al.，J.Interferon Res.12449-453(1992)；Sijmons et al.，Bio/Technology 8217-221(1990)；和欧洲专利局公开文本EP 255,378。
本发明生产的FVII可以在抗-FVII抗体柱上通过亲和层析进行纯化。优选的是包括高-特异性单克隆抗体的免疫吸附柱。特别优选使用钙-依赖型单克隆抗体，如Wakabayashi等J.Biol.Chem，26111097-11108，(1986)和Thim等，Biochem.277785-7793，(1988)所述，这些文献在此引入作为参考。可以通过传统的化学纯化手段如高效液相色谱法完成进一步的纯化。其它为本领域所已知的纯化方法，包括钡柠檬酸盐沉淀法，可以用于纯化本文所述的FVII(一般参见，Scopes，R.Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.，1982)。基本上纯的FVII优选至少约90-95％同质，最优选98-99％或更高同质，以用于药学用途。一旦纯化，如所期望的那样部分同质或达到同质，FVII就可以在治疗学上使用。
如Hednerand Kisiel(1983，J.Clin.Invest.711836-1841)描述的那样，使用因子XIIa或者其它具有胰蛋白酶-样特异性的蛋白酶(Kisieland Fujikawa，Behring Inst.Mitt.7329-42，1983)，可以实现把单链FVII转化为双链FVIIa。或者，使FVII通过一个离子交换层析柱例如monoQ.RTM.(Pharmacia Fire Chemicals)等而被活化(Bjoern et al.，1986，Research Disclosures 269564-565)。本发明FVII分子及其药物组合物对于施用于人来治疗涉及血管内凝血的各种病况特别有用。
本发明的维生素K-依赖性蛋白质可用于治疗某些类型的血友病。血友病A的特征是缺乏活性凝血因子VIII-因子VIIIa，或者存在凝血因子VIII的抑制剂。血友病B的特征是缺乏活性凝血因子IX-因子IXa。FVII缺乏尽管罕见，但是对于施用凝血因子VII非常有效(Bauer，K.A.，1996，Haemostasis，26155-158，suppl.1)。由于在某些患者出现高-滴度抑制性因子VIII抗体，所以凝血因子VIII的替代疗法受到限制。或者，FVIIa可用于治疗血友病A和血友病B。因子IXa和因子VIIIa活化凝血因子X。因子VIIa通过直接活化因子X而消除了对因子IX和VIII的需求，并且几乎没有(few)免疫学后果而可以克服凝血因子IX和VIII缺陷的问题。
附图简述参照下列附图，在实施例中进一步详细描述本发明，其中图1是正确加工的具有γ羧化Glu-残基(γ)和糖基化(*)修饰的人凝血因子FVII氨基酸1-406的结构。氨基酸残基152处的箭头表示单链FVII被裂解为活化型双链FVII(FVIIa)的位点。
图2是表达游离前肽和表达带有连接前肽的重组人FVII的质粒构建物。质粒pLN171和pLN174表达与FVII结合的带有天然连接的前肽的人FVII。质粒pLN329具有在前肽天然地与FVII结合之后插入到编码FVII的cDNA中的终止密码子，从而仅表达游离前肽。
图3比较CHO-K1细胞(对照)的FVII表达、细胞共表达FVII和游离FVII前肽(FVII前肽(FVII pro-peptide))。结果用每细胞每日表达的pg FVII来表示。
通过下列实施例进一步描述本发明，然而，实施例不是为了限定保护范围。上文描述的和在下文实施例中公开的特征，无论分别地还是其任意联合，均是为了认识不同形式的本发明的素材。
实施例实施例1FVII和FVII前肽在CHO-K1细胞的共表达表达人FVII的质粒载体pLN174已有描述(Persson and Nielsen.1996.FEES Lett.385241-243)。简要讲，它携带编码包括前肽在内的、为了转录所插入的cDNA而在小鼠金属-硫蛋白启动子控制下的人FVII的cDNA核苷酸序列，和在用作选择性标志物的SV40早期启动子控制下的小鼠二氢叶酸还原酶cDNA。
为了构建编码γ-羧化识别序列的质粒载体，使用包含编码包括前肽在内的FVII的eDNA的克隆载体pBluescript II KS+(Stratagene)(pLN171)。(Persson et al.1997.J.Biol.Chem.27219919-19924)。通过在克隆载体上进行反向PCR-介导的诱变，在FVII的前肽之后把编码终止密码子的核苷酸序列插入到编码FVII的cDNA中。经NaOH处理使模板质粒变性，接着使用下列引物用Pwo(Boehringer-Mannheim)和Taq(Perkin-EImer)聚合酶进行PCRa)5′-AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3′(SEQ IDNO19)b)5′-CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTGCGG CC-3′(SEQ ID NO20)用Dpnl消化产生的混合物以消化剩余的模板DNA，并用PCR产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)。通过测序筛选存在突变的克隆。取正确克隆的cDNA以BamHI-EcoRI片段转移到表达质粒pcDNA3(Invitrogen)上。产生的质粒命名为pLN329。
使用Fugene6方法(Boehriner-Mannheim)，用等量pLN174和pLN329转染CHO K1细胞(ATCC CC161)。通过加入1uM氨甲喋呤和0.45mg/mlG-418，来筛选转染物。通过有限稀释对合并的转染物进行克隆，并测定该克隆的FVII表达。
对高产量的克隆做进一步的亚克隆，在含有10％胎牛血清的Dulbecco-修饰的伊格尔培养基中筛选出具有2.4pg/细胞/天特异FVII表达的克隆E11。该克隆适应在商购的CHO培养基(JRH Bioscience)中无血清悬浮培养。
在旋动培养瓶中连续地传代该适应性细胞，随着细胞数量增加，通过加入新的培养介质而使得体积逐渐增加。
25天后，把6l旋动培养物接种到50-升生物反应器中。在生物反应器中连续地传代细胞，随着细胞数量增加，通过加入新的培养介质而使得体积逐渐增加。
最终，50l种子培养物接种到包含大孔性Cytopore 1载体(Pharmacia)的500l生产型生物反应器中，此后悬浮细胞就固定在其中的载体上。培养基保持在36℃，pH 7.0-7.1，并且溶解氧压(DOT)为50％饱和度。随着细胞数量增加，通过加入新的培养介质而使生物反应器中的体积逐渐增加。当细胞密度达到大约10-12×105细胞/ml时，开始生产阶段，并且每24小时更换培养介质停止摇动，使含有细胞的载体沉降，然后收获80％的培养上清液，并替换为新的培养介质。过滤收获的培养上清液，以除去未截留的细胞(即细胞未固定在载体上)和细胞碎片，然后进行进一步的加工。
在生产阶段，细胞达到2-3×107细胞/ml，滴度达到8mg因子VII/升。
实施例2表达FVII的CKO-K1细胞和共表达FVII与游离FVII前肽的细胞的比较。
按照实例1描述的那样，用pLN174和，1)空的pcDNA3.1+载体，或2)在pcDNA3.1+中的FVII前肽转染CKO-K1细胞。分析合并的转染物，了解FVII表达和细胞数量情况。每个细胞每24小时的FVII产量示于图3。结果表明，FVII前肽的共表达使FVII产量从大约1pg/细胞/天提高到4pg/细胞/天。结果示于图3。
序列清单SEQ ID NO1AVFLSREQANQVLQRRRRSEQ ID NO2SLFIRREQANNILARVTRSEQ ID NO3NPFINRRNANTFISPQQRSEQ ID NO4ANFLSKQQASQVLVRKRRSEQ ID NO5RVFLTGEKANSILKRYPRSEQ ID NO6HVFLAPQQARSLLQRVRRSEQ ID NO7AVFVTQEEAHGVLHRRRRSEQ ID NO8TVFLDHENANKILNRPKRSEQ ID NO9SVFSSSERAHQVLRIRKRSEQ ID NO10AAFVSKQEASEVLKRPRRSEQ ID NO11AVFVTQEEGHGVLHRRRRSEQ ID NO12AVFVTQEEARGVLHRRRRSEQ ID NO13AVFVTQEEAKGVLHRRRRSEQ ID NO14AVFVTQEEALGVLHRRRRSEQ ID NO15AVFSTQEEAHGVLHRRRRSEQ ID NO16AVFVTQEEAHGVLHSEQ ID NO17TVFLDHENANKILNSEQ ID NO18SVFSSSERAHQVLRSEQ ID NO195′-AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3′SEQ ID NO205′-CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC-3′
序列表<110> 诺沃挪第克公司(Novo Nordisk A/S)<120> 制备维生素K-依赖性蛋白的方法<130> 6270-WO<160> 20<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 18<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 1Ala Val Phe Leu Ser Arg Glu Gln Ala Asn Gln Val Leu Gln Arg Arg1 5 10 15Arg Arg<210> 2<211> 18<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 2Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gin Ala Asn Asn Ile Leu Ala Arg Val1 5 10 15Thr Arg<210> 3<211> 18<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 3Asn Pro Phe Ile Asn Arg Arg Asn Ala Asn Thr Phe Ile Ser Pro Gln1 5 10 15Gln Arg<210> 4<211> 18<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 4Ala Asn Phe Leu Ser Lys Gln Gln Ala Ser Gln Val Leu Val Arg Lys1 5 10 15Arg Arg<210> 5<211> 18<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 5Arg Val Phe Leu Thr Gly Glu Lys Ala Asn Ser Ile Leu Lys Arg Tyr1 5 10 15Pro Arg<210> 6<211> 18<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 6His Val Phe Leu Ala Pro Gln Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val1 5 10 15Arg Arg<210> 7<211> 18<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 7Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg1 5 10 15Arg Arg<210> 8<211> 18<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 8Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro1 5 10 15Lys Arg<210> 9<211> 18<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 9Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg1 5 10 15Lys Arg<210> 10<211> 18<212> PRT<213> 人工的<400> 10Ala Ala Phe Val Ser Lys Gln Glu Ala Ser Glu Val Leu Lys Arg Pro1 5 10 15Arg Arg<210> 11<211> 18<212> PRT<213> 人工的<400> 11Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Gly His Gly Val Leu His Arg Arg1 5 10 15Arg Arg<210> 12<211> 18<212> PRT<213> 人工的<400> 12Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala Arg Gly Val Leu His Arg Arg1 5 10 15Arg Arg<210> 13<211> 18<212> PRT<213> 人工的<400> 13Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala Lys Gly Val Leu His Arg Arg1 5 10 15Arg Arg<210> 14<211> 18<212> PRT<213> 人工的<400> 14Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala Leu Gly Val Leu His Arg Arg1 5 10 15Arg Arg<210> 15<211> 18<212> PRT<213> 人工的<400> 15Ala Val Phe Ser Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg1 5 10 15Arg Arg<210> 16<211> 14<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 16Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val Leu His1 5 10<210> 17<211> 14<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 17Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn1 5 10<210> 18<211> 14<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 18Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg Ala His Gln Val Leu Arg1 5 10<210> 19<211> 30<212> DNA<213> 人工的<400> 19agcgttttag cgccggcgcc ggtgcaggac 30<210> 20<211> 38<212> DNA<213> 人工的<400> 20cgccggcgct aaaacgcttt cctggaggag ctgcggcc38
权利要求
1.一种真核宿主细胞，其在第一表达单元表达编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸和在第二表达单元表达编码第二游离前肽的第二多核苷酸。
2.转染的真核宿主细胞，其是用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染的。
3.权利要求1-2任一项的真核宿主细胞，其中所述的第一多核苷酸编码第一前肽和人FVII。
4.一种真核宿主细胞，其在第一表达单元表达编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸和在第二表达单元表达编码第二游离前肽的第二多核苷酸。
5.转染的真核宿主细胞，其是用在第一表达单元编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染的。
6.权利要求4-5任一项的真核宿主细胞，其中所述第一多核苷酸编码独立地选自下组的维生素K-依赖性蛋白质凝血酶原、凝血因子IX、FVII、凝血因子X、蛋白C、蛋白S、骨钙蛋白、富含脯氨酸的Gla蛋白1或基质Gla蛋白。
7.权利要求1-6任一项的真核宿主细胞，其中所述宿主细胞是用在一个表达单元中的其它编码γ-谷氨酰羧化酶的多核苷酸转染的。
8.权利要求1-7任一项的真核宿主细胞，其中所述第一前肽包括下式的氨基酸序列X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17其中X1，X4，X5，X6，X7，X9，X10和X13，独立地选自G，P，A，V，L，I，M，C，F，Y，W，H，K，R，Q，N，E，D，S和T，和其中X2，X3，X11和X12独立地选自V，L，P，N，A，I，S，F，M，W，Q，T，和Y，和其中X8独立地选自G和A，和其中X14，X15，X16和X17独立地选自R，H，A，T，W，L，I，V，Q，K，Y，P，或者不存在。
9.权利要求1-7任一项的真核宿主细胞，其中所述第一前肽包括Ki小于1mM并与独立地选自下组的序列具有至少30％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、1 3、14、15、16、17和18。
10.权利要求1-9任一项的真核宿主细胞，其中所述第一前肽包括独立地选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
11.权利要求1-10任一项的真核宿主细胞，其中所述第二游离前肽包括下式的氨基酸序列X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17其中X1，X4，X5，X6，X7，X9，X10和X13独立地选自G，P，A，V，L，I，M，C，F，Y，W，H，K，R，Q，N，E，D，S和T，和其中X2，X3，X11和X12独立地选自V，L，P，N，A，I，S，F，M，W，Q，T，和Y，和其中X8独立地选自G和A，和其中X14，X15，X16和X17独立地选自R，H，A，T，W，L，I，V，Q，K，Y，P，或者不存在。
12.权利要求1-10任一项的真核宿主细胞，其中所述第二游离前肽包括Ki小于1mM并与独立地选自下组的氨基酸具有至少30％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
13.权利要求1-12任一项的真核宿主细胞，其中所述第二游离前肽包括独立地选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
14.权利要求1-13任一项的真核宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
15.权利要求14的真核宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
16.权利要求14的真核宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞独立地选自BHK细胞、HEK细胞、COS细胞或CHO细胞。
17.权利要求1-16任一项的真核宿主细胞，其中所述第一和第二多核苷酸是DNA。
18.权利要求1-16任一项的真核宿主细胞，其中所述第一和第二多核苷酸是RNA。
19.生产FVII或其变体的方法，包括a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞，和c)从培养基中分离FVII或其变体。
20.生产FVII或其变体的方法，包括a)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸可以表达的条件下，在适宜培养基中培养权利要求1-3、7-18中任一项的真核宿主细胞；和b)从培养基中分离FVII或其变体。
21.生产FVIIa或其变体的方法，包括a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸可以表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞，和c)从培养基中分离并活化FVII或其变体。
22.生产FVIIa或其变体的方法，包括a)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸可以表达的条件下，在适宜培养基中培养权利要求1-3、7-18中任一项的真核宿主细胞；和b)从培养基中分离并活化FVII或其变体。
23.权利要求19-22任一项的方法，其中所述的第一多核苷酸编码第一前肽和人FVII。
24.生产维生素K-依赖性蛋白质的方法，包括a)用在第一表达单元编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸可以表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞；和c)从培养基中分离维生素K-依赖性蛋白质。
25.生产维生素K-依赖性蛋白质的方法，包括a)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸可以得到表达的条件下，在适宜培养基中培养权利要求4-18中任一项的真核宿主细胞；和b)从培养基中分离维生素K-依赖性蛋白质。
26.权利要求24-25任一项的方法，其中所述第一多核苷酸编码第一前肽和独立地选自下组的维生素K-依赖性蛋白质凝血酶原、凝血因子IX、FVII、凝血因子X、蛋白C、蛋白S、骨钙蛋白、富含脯氨酸的Gla蛋白1或基质Gla蛋白。
27.权利要求19-26任一项的方法，其中所述第一表达单元存在于第一载体上，和所述第二表达单元存在于分离的第二载体上。
28.权利要求19-26任一项的方法，其中所述第一表达单元和所述第二表达单元存在于同一载体上。
29.权利要求19-28任一项的方法，其中所述第一前肽包括下式的氨基酸序列X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17其中X1，X4，X5，X6，X7，X9，X10和X13独立地选自G，P，A，V，L，I，M，C，F，Y，W，H，K，R，Q，N，E，D，S和T，其中X2，X3，X11和X12独立地选自V，L，P，N，A，I，S，F，M，W，Q，T和Y，和其中X8独立地选自G和A，和其中X14，X15，X16和X17独立地选自R，H，A，T，W，L，I，V，Q，K，Y，P，或者不存在。
30.权利要求19-28任一项的方法，其中所述第一前肽包括Ki小于1mM并与独立地选自下组的氨基酸具有至少30％同源性的氨基酸序列SEQ IDNO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
31.权利要求19-30任一项的方法，其中所述第一前肽包括独立地选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
32.权利要求19-31任一项的方法，其中所述第二游离前肽包括下式的氨基酸序列X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17，其中X1，X4，X5，X6，X7，X9，X10和X13独立地选自G，P，A，V，L，I，M，C，F，Y，W，H，K，R，Q，N，E，D，S和T，其中X2，X3，X11和X12独立地选自V，L，P，N，A，I，S，F，M，W，Q，T和Y，和其中X8独立地选自G和A，和其中X14，X15，X16和X17独立地选自R，H，A，T，W，L，I，V，Q，K，Y，P，或者不存在。
33.权利要求19-31任一项的方法，其中所述第二游离前肽包括Ki小于1mM并与独立地选自下组的序列具有至少30％同源性的氨基酸序列SEQID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
34.权利要求19-33任一项的方法，其中所述第二游离前肽包括独立地选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
35.权利要求19-34任一项的方法，其中所述培养基是不含血清的培养基。
36.权利要求19-35任一项的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
37.权利要求36的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
38.权利要求36的方法，其中所述哺乳动物细胞独立地选自BHK细胞、HEK细胞、COS细胞或CHO细胞。
39.权利要求19-38任一项的方法，其中所述第一和第二多核苷酸是DNA。
40.权利要求19-38任一项的方法，其中所述第一和第二多核苷酸是RNA。
41.重组载体，其中所述载体包括在表达单元中编码游离前肽的多核苷酸。
42.重组载体，其中所述载体包括在第一表达单元表达编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和在第二表达单元表达编码第二游离前肽的第二多核苷酸。
43.权利要求42的重组载体，其中所述第一多核苷酸编码前肽和人FVII。
44.重组载体，其中所述载体包括在第一表达单元编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白质的第一多核苷酸，和在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸。
45.权利要求44的重组载体，其中所述第一多核苷酸编码第一前肽和独立地选自下组的维生素K-依赖性蛋白质凝血酶原、凝血因子IX、FVII、凝血因子X、蛋白C、蛋白S、骨钙蛋白、富含脯氨酸的Gla蛋白1，或基质Gla蛋白。
46.权利要求41-45任一项的重组载体，其中所述第一前肽包括下式的氨基酸序列X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17，其中X1，X4，X5，X6，X7，X9，X10和X13独立地选自G，P，A，V，L，I，M，C，F，Y，W，H，K，R，Q，N，E，D，S和T，其中X2，X3，X11和X12独立地选自V，L，P，N，A，I，S，F，M，W，Q，T和Y，和其中X8独立地选自G和A，和其中X14，X15，X16和X17独立地选自R，H，A，T，W，L，I，V，Q，K，Y，P，或者不存在。
47.权利要求41-45任一项的重组载体，其中所述第一前肽包括Ki小于1mM并与独立地选自下组的序列具有至少30％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
48.权利要求41-47任一项的重组载体，其中所述第一前肽包括独立地选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
49.权利要求41-48任一项的重组载体，其中所述第二游离前肽包括下式的氨基酸序列X1X2FX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17，其中X1，X4，X5，X6，X7，X9，X10和X13独立地选自G，P，A，V，L，I，M，C，F，Y，W，H，K，R，Q，N，E，D，S和T，其中X2，X3，X11和X12独立地选自V，L，P，N，A，I，S，F，M，W，Q，T和Y，和其中X8独立地选自G和A，和其中X14，X15，X16和X17独立地选自R，H，A，T，W，L，I，V，Q，K，Y，P，或者不存在。
50.权利要求41-48任一项的重组载体，其中所述第二游离前肽包括Ki小于1mM并与独立地选自下组的序列具有至少30％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
51.权利要求41-50任一项的重组载体，其中所述第二游离前肽包括独立地选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18。
52.权利要求41-51任一项的重组载体，其中所述第一和第二多核苷酸是DNA。
53.权利要求41-51任一项的重组载体，其中所述第一和第二多核苷酸是RNA。
54.制备生产FVII或其类似物的真核宿主细胞方法，包括a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸转染真核宿主细胞，和b)用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染。
55.权利要求54的方法，其中所述宿主细胞进一步被编码γ-谷氨酰羧化酶的多核苷酸所转染。
56.权利要求54-55任一项的方法，其中所述多核苷酸是权利要求41-43、46-53任一项所述的载体。
57.重组FVII或其变体，可由包括下列步骤的方法获得a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞，和c)从培养基中分离FVII或其变体。
58.重组FVII或其变体，可通过包括下述步骤的方法获得a)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸得到表达的条件下，在适宜培养基中培养权利要求1-3、7-18中任一项的真核宿主细胞；和b)从培养基中分离FVII或其变体。
59.重组FVIIa或其变体，可由包括下述步骤的方法获得a)用在第一表达单元编码第一前肽和FVII或其变体的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞，和c)从培养基中分离并活化FVII或其变体。
60.重组FVIIa或其变体，可通过包括下述步骤的方法获得a)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸得到表达的条件下，在适宜培养基中培养权利要求1-3、7-18中任一项的真核宿主细胞；和b)从培养基中分离并活化FVII或其变体。
61.权利要求57-60任一项的重组FVII或其变体，其中所述的第一多核苷酸编码第一前肽和人FVII。
62.重组维生素K-依赖性蛋白质，可通过包括下列步骤的方法获得a)用在第一表达单元编码第一前肽和维生素K-依赖性蛋白的第一多核苷酸，和用在第二表达单元编码第二游离前肽的第二多核苷酸转染真核宿主细胞，以产生共-转染的真核宿主细胞；b)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸表达的条件下，在适宜培养基中培养共-转染的真核宿主细胞；和c)从培养基中分离维生素K-依赖性蛋白质。
63.重组维生素K-依赖性蛋白质，可由包括下列步骤的方法获得a)在使得第一多核苷酸和第二多核苷酸得到表达的条件下，在适宜培养基中培养权利要求4-18中任一项的真核宿主细胞；和b)从培养基中分离维生素K-依赖性蛋白质。
64.权利要求62-63任一项的重组维生素K-依赖性蛋白质，其中所述第一多核苷酸编码第一前肽和独立地选自下组的维生素K-依赖性蛋白质凝血酶原、凝血因子IX、FVII、凝血因子X、蛋白C、蛋白S、骨钙蛋白、富含脯氨酸的Gla蛋白1或基质Gla蛋白。
65.权利要求57-58、61中任一项的重组FVII或其变体，其中所述方法是权利要求19-21、23、27-40任一项的方法。
66.权利要求62-64任一项的重组维生素K-依赖性蛋白质，其中所述方法是权利要求24-40任一项的方法。
全文摘要
本发明涉及制备维生素K－依赖性蛋白质的新方法。另外，本发明涉及用于该改进的、制备维生素K－依赖性蛋白质方法中的新的共－转染真核宿主细胞和重组载体。
文档编号A61K38/48GK1481438SQ01816642
公开日2004年3月10日 申请日期2001年10月2日 优先权日2000年10月2日
发明者埃尔斯·M·尼古莱森, 埃尔斯 M 尼古莱森, S 尼尔森, 拉斯·S·尼尔森 申请人:诺沃挪第克键康护理股份公司