专利名称：抗血栓形成的组合物的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及抑制或预防凝血酶形成或活性的组合物及方法。
硫酸皮肤素(DS)，一种在实验动物(6-9)和人体(10-13)中具有抗血栓形成活性的硫酸化糖胺聚糖，通过仅催化肝素辅因子II(HCII)而用作抗凝剂。由于凝血酶是HCII在血浆内的专一靶体，因此DS被认为是凝血酶的选择性抑制剂(14)。尽管结合于纤维蛋白的凝血酶能够防护肝素-HCII复合体避免致失活作用(15)，血浆系统中进行的间接研究提示结合于纤维蛋白的凝血酶对DS-HCII复合体的致失活作用是敏感的(16)。然而，由于其低特异性的生物学活性以及高粘度使硫酸皮肤素的临床应用受到限制。
商业上可获得的低分子量肝素(无论是伊诺肝素还是替地肝素)中添加硫酸皮肤素在体外对血栓具有加和的抑制作用(17)。然而，实验性联合用药没有临床价值，因为它对结合于纤维蛋白的凝血酶无效，并且DS效价低且溶解度小。
本发明简述已经证实，将从肝素获得的寡糖级分(oligosaccharide fraction)(本文也称之为“肝素寡糖级分”)与从硫酸皮肤素获得的寡糖级分(本文也称之为“硫酸皮肤素寡糖级分”)联合使用对于流体相和结合于纤维蛋白的凝血酶都能够产生良好的抑制作用。肝素寡糖级分和皮肤素寡糖级分的选择性联合使用产生超出预见的远大于加和的抑制作用，即协同性抑制作用。本发明的新概念是在不增加出血的危险下联合使用寡糖级分以确保肝素和硫酸皮肤素的最大的抗凝活性。
期望联合治疗中的各寡糖级分通过不同的机理抑制凝血酶。在希望不受理论上的作用机理束缚下，肝素寡糖级分可以通过激活抗凝血酶而抑制结合于纤维蛋白的凝血酶以及流体相凝血酶，并且它可通过抗凝血酶催化Xa因子失活而抑制凝血酶生成。硫酸皮肤素寡糖级分可以通过激活HCII而抑制结合于纤维蛋白的凝血酶。在其活化的构象中，HCII的氨基端结构域与外切位点I(exosite)结合。由于凝血酶通过外切位点I结合于纤维蛋白，活化的HCII与纤维蛋白竞争结合凝血酶并从纤维蛋白上置换出凝血酶。而后被置换出的凝血酶被肝素/HCII、硫酸皮肤素/HCII或肝素/抗凝血酶灭活。
通过不同机理达到抑制凝血酶最大效果的联合治疗，将改善对治疗的耐受性，并且使得在单一治疗时高剂量和长期使用这些药物可引起的不利毒性作用的危险降低。因此，本发明的联合治疗能够使所采用的各组分的剂量降低(例如，如实施例2所述至少使剂量降低5-10倍)，并降低各组分的不利的毒性作用。与各组分作为单一药物使用的安全范围相比，较低的剂量能够使安全范围扩大。此外，当向患者提供方便的单一的联合用药剂量单位时，它一般能够被接受，因为便利性提高导致依从性提高，并且使患者通常与药物的多种单位剂量形式有关的精神错乱的可能性减少。
大致说来，本发明涉及抑制或预防患者凝血酶生成或活性的联合治疗，包括使患者服用有效剂量的(a)至少一种肝素寡糖级分；及(b)一种硫酸皮肤素寡糖级分。本发明的一个方面是提供协同活性的联合治疗。另一个方面是提供抑制或预防患者凝血酶生成或活性的方法，包括对有需要的患者联合给予有效量(优选产生协同作用的有效量)的至少一种肝素寡糖级分，以及至少一种硫酸皮肤素寡糖级分。
“联合治疗”或“联合给予”意思是将活性成分同时给予所治疗的患者。当联合给药时，各组分可以在同一时间或以任何顺序相继给药、以及在不同的时间点给药。因此，各组分可以分别给药，但时间应充分接近以获得所希望的作用(优选协同作用)。
本发明还提供包括联合使用的(a)至少一种肝素寡糖级分；和(b)至少一种硫酸皮肤素寡糖级分，以及任选的药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物的组合物。本发明还构思了在分开的容器中以及适于同时或顺序给药目的的药用组合物，它包括肝素寡糖级分和硫酸皮肤素寡糖级分，两者都任选与药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物混合在一起。
在另一种实施方案中，本发明提供一种药用组合物，它包括一个单位剂量的至少一种肝素寡糖级分；以及一个单位剂量的硫酸皮肤素寡糖级分，以及任选的药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物。
上述组合物还包括肝素寡糖及硫酸皮肤素寡糖级分的药学上可接受的盐，例如钠、钾、铵、镁及钙盐。
根据它的一个方面，所提供的药用组合物包括在预防或抑制凝血酶生成或活性中存在有效的协同作用的(a)至少一种肝素寡糖级分；及(b)至少一种硫酸皮肤素寡糖级分的组合。该方法还提供药用组合物，它包括以产生协同作用的有效量的至少一种肝素寡糖级分与至少一种硫酸皮肤素寡糖级分，及药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物的组合。
在优选的实施方案中，该药用组合物所包括的肝素寡糖级分及硫酸皮肤素寡糖级分的剂量至少比各自级分在预防或抑制患者凝血酶生成或活性中所需的剂量低5至10倍。
另一个方面本发明涉及包括(a)至少一种肝素寡糖级分与(b)至少一种硫酸皮肤素寡糖级分的组合的组合物在用于预防或抑制凝血酶生成或活性的药物制备中的用途。另一方面本发明涉及产生协同作用的有效量的至少一种肝素寡糖级分，与至少一种硫酸皮肤素寡糖级分在用于抑制或预防患者凝血酶生成或活性的药用组合物的制备中的用途。
由于本发明涉及的治疗方法包括可以分别给予活性药物的组合，因此本发明还涉及以试剂盒形式组合的分别含活性成分的组合物。
本发明还涉及本发明的寡糖级分，以及如本文一般描述的采用这些级分的组合物和治疗方法。
本发明还构思了本发明的组合物或本发明的联合疗法在预防，和/或改善与过量的凝血酶生成或活性有关的疾病的严重性、疾病症状，和/或疾病复发周期中的用途。
本领域的技术人员应当能够从下文附图及详细描述中容易地理解本发明的这些和其它方面、特征及优点。
图的描述参照附图可以更好地理解本发明，其中
图1表示可溶性纤维蛋白(Fm)对DS催化(图A)的或肝素催化的(图B)HCII抑制凝血酶的二级速率常数的影响。在有或无Fm存在下DS-或肝素-催化的100nM HCII对10hM凝血酶抑制的二级速率常数在准一级(pseudo first-order)条件下测定。各个点代表四次测定的平均值，而短线代表标准误。
图2的柱形图表示在由肝素酶诱导的分子量递增的肝素寡糖级分存在下4μM纤维蛋白单体对凝血酶的抗凝血酶(AT)抑制作用的影响。
图3表示肝素和DS对凝血酶与纤维蛋白结合的影响。在浓度递增的肝素(·)或DS(o)存在下测定凝血酶与纤维蛋白凝块的结合。各个点代表两次测定的平均值而条线(bars)代表标准误。
图4的曲线图表示肝素或由肝素酶诱导的级分对凝血酶与纤维蛋白凝块结合的影响。
图5是表示在DS或标准肝素(SH)存在下HCII从纤维蛋白凝块上置换凝血酶的曲线图。
图6A是表示在兔动脉血栓形成预防模型中联合使用的肝素寡糖级分∶硫酸皮肤素寡糖级分(5∶1)与单用肝素寡糖级分对累计血管开放(patency)的影响的图。
图6B是表示在兔动脉血栓形成模型中联合使用的肝素寡糖级分∶硫酸皮肤素寡糖级分(5∶1)与单用肝素寡糖级分对累计失血的影响的图。
图7是表示肝素、LMWH、肝素寡糖级分及水蛭素对血管开放的影响(图A)以及对失血的影响(图B)的比较图。
图8是表示肝素寡糖级分对狒狒动脉血栓形成模型中血小板沉降至血管移植物的影响的图。
图9是表示硫酸皮肤素寡糖级分对狒狒动脉血栓形成模型中血小板沉降至血管移植物的影响的图。
图10是表示肝素寡糖级分与硫酸皮肤素寡糖级分联合使用对狒狒动脉血栓形成模型中血小板沉降至血管移植物的影响的图。
发明详述肝素寡糖级分“得自肝素的寡糖级分”或“肝素寡糖级分”是指以体外具有抗凝血酶和HCII相关的抗凝血活性为特征的来源于肝素的寡糖的混合物。这些级分所包含的肝素链太短而不能桥接凝血酶与纤维蛋白，但是其长度足以桥接抗凝血酶或HCII与凝血酶。
这些级分可包含衍生自肝素的寡糖混合物，其特征在于具有下列一、二、三、四、五、六，或七或更多项特征(a)具有体外抗凝血酶和肝素辅因子II(HCII)相关的抗凝血活性；(b)这些寡糖由于太短而不能桥接凝血酶和纤维蛋白，但是其长度足以桥接抗凝血酶或HCII与凝血酶；(c)有至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的寡糖具有一个或一个以上的五糖序列；(d)富含分子量范围从约6000至约12000、6000至11000，或6000至10000的寡糖；(e)这些寡糖具有约7000至10000、7500至9700，或8000至9000的峰分子量；(f)至少有30％、35％、40％、45％、50％或55％的寡糖具有大于或等于6000道尔顿的分子量；(g)至少有20％、25％、30％、35％或40％，具有大于或等于8000道尔顿的分子量；(h)多分散性为1.1至1.8，优选1.2至1.7；以及(i)具有类似抗Xa因子和抗IIa因子的活性，优选抗Xa因子活性与抗IIa因子活性的比值从约2∶1至约1∶1。
根据本发明的一个方面，本发明所采用的级分具有特征(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(d)、(c)、(h)和(i)；(b)、(c)、(d)和(h)；(b)、(e)、(h)和(i)；(b)、(e)、(f)、(h)和(i)；(b)、(e)、(g)、(h)和(i)；或(a)至(i)。
“富含寡糖”是指在所定义或限定的分子量范围内包含至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的寡糖的级分。
“五糖序列”是指由三个D-葡萄糖胺和两个糖醛酸残基组成的肝素的关键结构单位(见下图结构)。中心D-葡萄糖胺残基含有独特的3-O-硫酸根部分。 该五糖序列代表对抗凝血酶具有高度亲和性的肝素最小结构(Choay，J.等，Biochem Biophys Res Comm 1983；116492-499)。肝素通过该五糖序列结合抗凝血酶导致活性中心环的构象改变而使抗凝血酶由缓慢转变为快速抑制剂。
肝素寡糖级分所包括的肝素序列太短而不能桥接凝血酶与纤维蛋白，但其长度足以使抗凝血酶与凝血酶桥接。因此，本发明所选用的级分能够通过催化抗凝血酶而抑制与纤维蛋白结合的凝血酶以及流体相中凝血酶，并且通过抗凝血酶催化的Xa因子失活而抑制凝血酶生成。优选用于本发明的级分为能够同等抑制结合于纤维蛋白的凝血酶及流体相中的凝血酶的片段。
表1和表2列举了可以被本发明采用的合适的肝素寡糖级分的特征。
本发明所采用的肝素寡糖级分可能具有类似的抗Xa因子和抗IIa因子的活性。在一种实施方案中，抗Xa因子活性与抗IIa因子活性的比例范围从约2∶1至约1∶1。在优选实施方案中，抗Xa因子活性范围从约80IU/mg至约155IU/mg，优选90IU/mg至约140IU/mg。在优选实施方案中，抗IIa因子的活性范围从约20IU/mg至约150IU/mg；更优选从40IU/mg至约130IU/mg。
本发明的组合物、方法和试剂盒可以用于改进PCT/CA98/00548(WO98/55515，1998年12月10日公布)、1999年6月30日递交的美国专利申请序列号60/141865的，或1999年9月17日递交的美国专利申请序列号60/154744所描述的肝素组合物，这些文献均通过参考结合于本说明书。
应该理解，有可能制备具有更多的特殊特征的本发明所用的肝素寡糖级分，这些特征在上述(d)、(e)、(h)及(i)所确立的范围内。例如，这些级分所具有的分子量范围可以从约7000至10000；7500至10000；7800至10000；7800至9800；7800至9600；7800至9000；7800至8800；7800至8600；7800至8500；或8000至8500。采用具有7800至10000；7800至9800；7800至9600；7800至9000；7800至8800；7800至8600；7800至8500；或8000至8500的峰分子量的肝素寡糖级分也是可能的。可以开发用于本发明组合物或方法的具有1.3-1.6的多分散性的级分。此外，开发用于本发明组合物或方法的级分可以具有下列一项或一项以上的特殊特征(i)抗Xa因子活性对抗IIa因子活性的比例范围从约1.5∶1至约1∶1；(ii)从约95IU/mg至约120IU/mg或从约100至110IU/mg的抗Xa因子活性；(iii)从约80IU/mg至约100IU/mg或从约90至110IU/mg的抗IIa因子活性。
在本发明的一种实施方案中，肝素寡糖级分具有下列一项或一项以上的特征(a)富含分子量范围从6000至10000道尔顿，且平均值约为8500的寡糖；(b)白色至黄白色的结晶固体；(c)室温下稳定；以及(d)约1.2至1.5，优选1.5的多分散性。
用于本发明的肝素寡糖级分可以用制备这些肝素寡糖的常规方法从组织中获得，或者也可以合成它。特别地，肝素寡糖级分可以由未分级分离的肝素，或者，由低分子量肝素(LMWH)制备。
举例来说，通过首先使未分级分离的肝素解聚产生低分子量肝素，并且分开或分离出所需的肝素寡糖级分可由未分级分离的肝素获得肝素寡糖级分。未分级分离的肝素既可以是药用质量的商业肝素制品，也可以是粗制肝素制品，例如从哺乳动物组织或器官提取活性肝素获得。商业肝素产品(美国药典肝素)可以从数种来源(例如，SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri)获得，通常是作为碱金属或碱土金属盐(最常见的是肝素钠)。此外，未分级分离的肝素可以采用本领域技术人员所知的各种方法(参见，例如，Coyne，Erwin，Chemistry and Biology of Heparin(《肝素化学和生物学》)(Lundblad，R.L.等(主编)，9-17页，Elsevier/North-Holland，纽约(1981))，从哺乳动物，例如，牛、猪和羊的组织或器官，特别是从小肠粘膜或肺中提取。在一种优选实施方案中，未分级分离的肝素是猪小肠肝素。
已知有多种肝素解聚的方法，而且它们通常以化学或酶反应为基础。举例来说，通过苄基化继而以强碱解聚；亚硝酸解聚；用肝素酶进行酶促解聚；过氧化解聚等，可以从标准的、未分级分离的肝素制备本发明之肝素寡糖级分。尤其是，可以采用PCT/CA98/00548(WO98/55515)所述的亚硝酸解聚法或高碘酸氧化水解法制备肝素寡糖级分。
在一种实施方案中，采用肝素酶解聚反应(例见，U.S.3766167，及U.S.4396762)而从未分级分离的肝素制备肝素寡糖级分。在优选的实施方案中通过控制肝素酶解聚反应制备肝素寡糖级分。硫酸皮肤素寡糖级分“得自硫酸皮肤素的寡糖级分”或“硫酸皮肤素寡糖级分”是指以体外具有很少甚或没有抗凝血酶相关活性、但具有HCII相关抗凝血活性为特征的衍生自硫酸皮肤素的寡糖混合物。硫酸皮肤素由交替的糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖残基组成。许多葡萄糖醛酸残基在C-5位出现差向异构而产生艾杜糖醛酸。因此，O-硫酸化可能发生在GalNAc的C-4或C-6位或IdoA的C-2位。本发明所采用的这些级分比未分级分离的天然硫酸皮肤素显示出对HCII的更高的亲和性。
选用于本发明的硫酸皮肤素寡糖级分具有下列一项或一项以上的，优选全部的特征(a)6.0％至10.0％(w/w)的硫含量；例如从6.0％至8.0％(w/w)，优选6.5％至8％(w/w)；(b)1.2至2.5的硫酸根/羧基比率，例如从1.2至2.0，例如从1.3至1.8，优选从1.3-1.6；(c)20％至60％(w/w)的焦硫酸化(disulfated)二糖含量，优选30％至60％(w/w)的单硫酸化二糖含量；(d)肝素辅因子II介导的抗凝血酶活性在20-60IU/mg范围内，优选30-60IU/mg。
在本发明的一种实施方案中，被选择的硫酸皮肤素寡糖级分所包括的硫酸皮肤素寡糖混合物中有90％或以上的分子量范围在约1600至约20000道尔顿之间并且峰分子量从约4500至约8000道尔顿。
在本发明的一种优选实施方案中，硫酸皮肤素寡糖级分具有下列一项或一项以上的特征(a)富含分子量范围从5000至8000道尔顿的寡糖；(b)白色至黄白色的结晶固体；(c)室温下稳定；以及(d)磺化重量大于6.2％。
硫酸皮肤素寡糖级分可以用制备这些寡糖的常规方法从组织中的未分级分离的硫酸皮肤素获得，或者它也可以从相关的单糖从头开始合成。优选采用保护未分级分离的硫酸皮肤素之高电荷区并使之易于分离的解聚方法以提供用于本发明的级分，其溶解性和效价比未分级分离的硫酸皮肤素有改善。例如，可以按照下列步骤制备硫酸皮肤素寡糖级分硫酸皮肤素用高碘酸氧化反应氧化和解聚，氢硼化物还原，酸水解，以及离子交换层析。
可以用于制备这些级分的硫酸皮肤素来源包括哺乳动物组织，例如哺乳动物皮肤，包括来源于猪或牛的血管化组织和皮肤。优选采用肠粘膜作为硫酸皮肤素来源。
本发明的组合物、方法及试剂盒优选采用硫酸皮肤素寡糖混合物，以及制备这些混合物的方法，它描述于PCT/EP98/03007(1998年12月10日公开的WO98/55514)，它通过参考结合于本文中。
测定寡糖级分的性质用于本发明的肝素和皮肤素寡糖级分的分子量特征可以采用本领域内技术人员熟悉和采用的标准技术测定。这些技术包括，例如，GPC-HPLC、粘度测量、光散射、解聚过程中形成的功能基团的化学或物理化学测定等。在优选实施方案中，寡糖级分的分子量特征通过高效分子排阻层析(high performance size exclusive chromatography)测定。
特别地，可以采用下列方法确认用于本发明的肝素或皮肤素寡糖级分的性质和特征(a)按照Dedem，Pharmeuropa，3，202-218，1991的方法以GPS-HPLC测定分子量；(b)按照欧洲药典，第2版，V.3.5.3.测定硫含量；(c)硫酸盐/羧酸盐比例按照欧洲药典，19970828测定；(d)以国际肝素标准4(编码号82/502)为标准在游离血浆系统中通过显色分析法(Diagnostica Stago，法国)测定HCII介导的抗凝血酶活性；(e)按照欧洲药典1997:0828测定抗Xa因子与抗IIa因子，两种方法均采用斜率比分析的统计学方法校正。
组合物和方法本发明的组合物和方法在预防或治疗以过量的凝血酶生成或活性和/或过强的补体激活为特征的症状或疾病的临床应用中是有益的。这些症状在受到过创伤的患者，例如接受手术的患者中经常发生。伤口或手术所致的创伤导致血管损伤以及继发性的血液凝固激活。这些不良作用可发生于常规及矫形手术、妇科手术、心脏或血管手术，或其它手术过程中。凝血酶过量还可能使正常疾病的发展恶化例如动脉粥样硬化，它可以导致心脏病发作、中风或肢端坏疽。因此，本发明的组合物和方法可以用于治疗、预防，或抑制多种重要的心血管并发症，包括不稳定型心绞痛、急性心肌梗塞(心脏病发作)、脑血管意外(中风)、肺栓塞、深静脉血栓形成、动脉血栓形成等。本发明的组合物和方法还可以用于减少或预防透析过程中的凝血及减少或预防开胸心脏手术过程中的血管内凝血。它们还可以用于保持医疗设备如静脉注射装置的开放。
在本发明的一个方面，所提供的方法和组合物用于预防或抑制由于止血紊乱性医学病情(例如，冠状动脉疾病、动脉粥样硬化，等)所致的血栓形成危险性升高的患者的凝血酶生成或活性。在另一个方面，所提供的组合物和方法用于医学处理后的血栓形成危险性增高的患者，例如心脏手术、血管手术，或经皮冠状动脉介入疗法。在一种实施方案中，本发明之方法和组合物用于心肺旁路。本发明方法中的组合物，或寡糖级分，可以在医学处理之前、期间或之后给药。
可以用标准药学方法以细胞培养或以实验动物测定疗效和毒性，例如统计学计算ED50(在50％群体中取得治疗效果的剂量)或LD50(50％群体致死的剂量)。治疗指数是治疗与毒性作用剂量的比值且它可以表示为ED50/LD50之比值。优选表现出较大治疗指数的药用组合物。
可以接受联合治疗或给予本发明的组合物的患者包括动物，包括哺乳动物，特别是人类。动物还包括饲养动物，包括马、牛、羊、家禽、鱼、猪、猫、狗和动物园动物。
本发明的组合物，肝素寡糖级分，或硫酸皮肤素寡糖级分，可以通过任何使活性药物与患者体内的药物作用位点产生接触的途径给药。肝素和硫酸皮肤素寡糖级分可以同时或按任何次序相继，或在不同的时间点给药，以产生所需作用。选择本发明的组合物及治疗的最佳作用的给药方案在熟练的医师或兽医的能力范围内。这些组合物可以用口服剂型如片剂、胶囊(每一种都包括缓释或定时释放制剂)、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、混悬液、糖浆剂及乳剂给药。它们还可以通过静脉内(大剂量注射或输注)、腹腔内、皮下或肌内剂型给药，所采用的所有剂型都是药学领域内一般技术人员所熟知的。本发明的组合物还可以采用合适的鼻内媒介物的鼻内剂型，或者通过透皮途径，例如采用常规透皮贴剂以局部给药。透皮释药系统的剂量给予是连续的而不是间歇性的全程给药方案。
本发明包括提供协同作用或释放协同作用有效量的硫酸皮肤素和肝素寡糖级分的联合疗法。适合用于本发明的药用组合物包括在其中含有协同作用有效量的活性成分的组合物。而“协同作用”和“协同作用有效量”是指肝素寡糖级分和硫酸皮肤素寡糖级分以足够的剂量存在以达到大于各级分自身所能达到的效果的所需结果，例如，在治疗血栓相关性心血管病症时增强对凝血酶的抑制，如上文所述，例如，促进结合于血块的凝血酶失活，通过抗凝血酶催化Xa因子的灭活而增强对凝血酶生成的抑制作用等。
本发明之给药方案将根据已知因素如特定药物的药效学特性及其给药方式和途径；患者的种属、年龄、性别、健康状况、医疗状况、以及体重；症状的性质和程度；并行的治疗种类、治疗次数、给药途径、患者的肝肾功能、以及所希望的疗效而变化。具有常规技术的医师或兽医能够容易地确定预防、对抗，或终止病情发展所需的药物有效剂量。
本发明的组合物或治疗可以包括单位剂量的至少一种肝素寡糖级分和单位剂量的至少一种硫酸皮肤素寡糖级分。“单位剂量”是指能够对患者给药的单元即单次剂量，所述单位剂量可易于处理和包装，以保持在物理和化学上的稳定的单位剂量，它包含活性成分本身或其与固体或液体药用赋形剂、载体或媒介物的混合物。
通常，活性药物，即，肝素寡糖级分和硫酸皮肤素寡糖级分，可以以约每剂量2mg至每剂量1000mg的浓度范围内分别以药用组合物存在(或用于本发明的治疗中)，且更优选在约每剂量5mg至每剂量500mg的浓度范围内。日剂量可以有较大变化，但通常以每天每剂量约20mg至每天每剂量约100mg的浓度范围存在，更优选在每天每剂量约40mg至每天每剂量约80mg的浓度范围内。
在本发明的组合物或治疗方法中肝素寡糖级分对硫酸皮肤素寡糖级分的比例可以是1∶1至10∶1，优选1∶1至8∶1，更优选2∶1至6∶1，最优选5∶1。
本发明的组合物或其级分通常包括根据拟用的给药剂型选择的合适的药用稀释剂、赋形剂、媒介物或载体，并与常规制药惯例一致。可采用这些载体、媒介物等以提供协同作用有效量的活性级分，以抑制或预防患者的凝血酶活性或其生成。
合适的药用稀释剂、赋形剂、媒介物和载体描述于标准教科书，雷明顿氏药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，Mack出版社。作为口服给药的胶囊和片剂剂型之实例，活性成分可以与口服、无毒的药学上可接受的惰性载体如乳糖、淀粉、蔗糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、葡萄糖、硫酸钙、磷酸钙、甘露醇、山梨糖醇等混合。对于口服液体剂型，药用成分可以与任何口服、无毒、药学上可接受的隋性载体如乙醇、甘油、水等混合。合适的粘合剂(例如明胶、淀粉、玉米甜料、包括葡萄糖的天然糖；天然和合成树胶，以及蜡质)，润滑剂(例如油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠)，崩解剂(例如淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土和黄原胶)，矫味剂，及着色剂也可以与这些组合物或其成分混合。
本发明组合物的肠道外给药制剂可以包括水溶液、糖浆剂、水或油悬液以及采用食用油如棉籽油、椰子油或花生油的乳剂。可以用于水悬液的扩散或混悬剂包括合成或天然树胶，如黄蓍胶、藻酸盐、阿拉伯胶、右旋糖酐、羧甲基纤维素钠、明胶、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
肠道外给药的组合物可包括无菌水或非水溶剂，如水、等渗生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲溶液，或其它常规用于治疗活性药物的肠道外给药的溶剂。拟用于肠道外给药的组合物还可以包括常规添加剂如稳定剂、缓冲剂或防腐剂，例如抗氧化剂如甲基羟基苯甲酸酯或类似的添加剂。
本发明的组合物可以通过，例如，细菌截留过滤器过滤、在组合物中添加灭菌剂、照射组合物，或加热组合物灭菌。此外，本发明的级分可以作为无菌固体制剂如冻干粉末来提供，它可以在临用前容易地溶解于无菌溶剂中。
除上述制剂外，组合物还可以配制为植入制剂。这些长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射给药。因此，例如，这些级分可以用合适的聚合物或疏水性物质(例如，作为可接受的油乳剂)，或离子交换树脂来配制，或者作为微溶性衍生物，例如，微溶性的盐。
本发明的组合物及其成分可以包括可溶性聚合物作为靶向药物载体。
药用组合物制备后，可以将它们放入合适的容器并标示所治疗的适应症。对于本发明的组合物的用药，这样的标鉴应包括用量、次数、以及用药方法。
本发明还包括本发明的组合物与一种或一种以上的其它治疗药联合使用的方法，它包括但不限于抗血小板药或血小板抑制剂如阿司匹林、prioxicam、氯吡格雷、噻氯匹定，或糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂，凝血酶抑制剂如boropeptide、水蛭素或阿加曲班；或溶栓药或纤溶剂例如纤溶酶原激活物(如组织纤溶酶原激活物)，阿尼普酶，尿激酶，或链激酶；或它们的组合。
除用于治疗上述心血管病症的药用组合物中外，本领域内的技术人员容易理解其活性产物，可以用作体外揭示血液凝固机理的试剂。
通过特定实施例可以更加详细地描述本发明。为说明的目的，给出下列实施例，而无意以任何方式限制本发明。本领域内技术人员容易认识到，可以改变或调整非关键性参数，以达到基本相同的结果。
实施例1表2总结了本发明所采用的几个区段(lots)的肝素寡糖级分以及其它肝素级分(来源于Sigma的UFH和来源于Rhne-Poulenc Rorer的伊诺肝素)的特征。所列特征包括平均分子量、活性、抗-IIa活性、多分散性和Kd值。多分散性为Mw/Mn(平均分子量重量除以平均分子量数目)并通过肝素样品的凝胶过滤峰分布积分表中的数据分析确定。通过以肝素样品滴定AT或IIa时观察测定荧光(280nm激发，340nm发射)的增加，将对肝素浓度I/I0的滴定曲线与结合等温方程拟合，并且解出α(最大荧光变化值)、Kd(解离常数)及n(与一摩尔配基结合所需的肝素摩尔数)可获得Kd值。获得结合配基化学计量(l/n)并转换成每种肝素级分中含五糖链的比例。
与肝素不同，所选肝素寡糖级分不能稳定凝血酶与纤维蛋白的结合。在AT和HCII都存在的情况下添加纤维蛋白单体降低未分级分离的肝素对凝血酶的灭活率的研究证明了这一点。相反，在等摩尔浓度的肝素寡糖级分存在下纤维蛋白单体对AT或HCII的凝血酶抑制率仅有极小的抑制效果。进一步的支持是在存在或不存在浓度范围为0到7500nM的肝素寡糖级分或未分级分离的肝素下测定结合于纤维蛋白凝块的125I标记的凝血酶的量，得出所选肝素寡糖级分不增强凝血酶与纤维蛋白的结合。
实施例2肝素级分和硫酸皮肤素寡糖级分的抗血栓形成活性采用体外循环以比较肝素寡糖级分、硫酸皮肤素寡糖级分、以及肝素及硫酸皮肤素寡糖级分联合使用的抗血栓形成活性。1999年Writz等详细描述了这种循环。简单地说，将不同浓度的被检测化合物加入到掺有125I标记的人纤维蛋白原并保持37C水浴的重新钙化的人的全血中。蠕动泵使血液循环于40μ血液过滤器中。通过环路中的压力计测定的滤器邻近处的压力而确定滤器中的血液凝块。从环路容器中取出系列血液样品并计算剩余放射活性作为纤维蛋白原消耗及凝块形成的指标。此外，还测定起始激活的凝固时间。
两项关键指标，开放时间及凝固过程中消耗的纤维蛋白原百分率，被用于评价该模型检测的化合物的效价。开放期作为不能滤过的时间来测量。于90分钟时停止该试验，由此确定开放的最大时间。
用于研究的硫酸皮肤素级分(在实施例和表3中也称为LMWDS)具有下列特征Mp5000Da，Mw7600Da，而多分散性为1.4。由肝素酶衍生的肝素寡糖级分通过本文所述的肝素酶解聚作用获得，且峰分子量为8000，抗IIa活性约为100IU/mg，抗Xa活性约为134IU/mg，而多分散性约为1.5。由一氧化氮产生的肝素寡糖级分通过PCT/CA98/00548所述之一氧化氮解聚法获得，且其分子量为7700Da，抗IIa活性约为84IU/mg，抗Xa活性为123IU/mg，而多分散性为1.3。由高碘酸衍生的肝素寡糖级分通过PCT/EP98/03007(1998年12月10日公开的WO98/55514)所述之高碘酸解聚法而获得，且其峰分子量为7900Da，抗IIa活性为19IU/mg，抗Xa活性为43IU/mg，而多分散性为1.5。
由于它与包括约27个糖单位的链相符而选用峰分子量为约8000道尔顿的肝素级分。桥接凝血酶和抗凝血酶所需最小长度为18个糖单位。由于这些级分中几乎所有的链均由18个以上的糖单位组成，因此它们具有足够的长度以催化抗凝血酶对凝血酶的灭活作用。相反，这些级分太短而不能使凝血酶与纤维蛋白桥接，因为这种桥接反应需要包括40或40个以上的糖单位的链(即，12000Da或更大)。所以，平均分子量为8000的肝素级分通过其激活抗凝血酶的能力而具有良好的抑制凝血酶的活性，并且能够灭活结合于纤维蛋白的凝血酶，因为它们不能使凝血酶桥接于纤维蛋白并使其抵抗经肝素/抗凝血酶或肝素/HCII复合物的灭活。相反，伊诺肝素，一种平均分子量约为5000的商品化低分子量肝素(Rhone-Poulenc Rorer，Montreal，PQ)包含的糖链大多数太短而不能桥接凝血酶和抗凝血酶，因此解释了为什么它对凝血酶的抑制活性低于对Xa因子的抑制活性的原因。
如先前所述(Weitz JI等，Circulation 1999；99682-689)，将不同浓度的各种级分加入到掺有125I标记的人纤维蛋白原并保持在37℃下水浴中的重新钙化的人全血中。然后采用蠕动泵使血液通过40μ血液过滤器循环。通过(a)用环路中的压力计测量滤器邻近处的压力，以及(b)从容器中取出系列血液样品并计算剩余放射活性作为纤维蛋白原消耗的指标，来测定滤器中的血的凝固。起始的激活凝固时间也被测定。
如表3所示，在单独使用时，需要250μg/ml浓度的硫酸皮肤素寡糖级分以保持滤器开放并且使纤维蛋白原的消耗量降低到＜10％。这是值得注目的，因为早先的研究报道了未分级分离的硫酸皮肤素在这种循环中即使在4mg/ml的浓度下也是无效的(Weitz，等，Circulation，1999)。
低分子量硫酸皮肤素与肝素酶衍生的8000Da肝素级分或伊诺肝素的联合使用也得到评价。当与1μg/ml肝素酶衍生的8000Da肝素联合使用时LMWDS在100μg/ml下有效，或与2μg/ml的这种肝素级分联合使用时在50μg/ml下有效。相反，50μg/ml LMEDS在与3μg/ml的伊诺肝素联合使用时无效，其滤器失效出现在80min时而纤维蛋白原消耗量为85％。这些结果表明肝素酶衍生的级分比伊诺肝素更有效。
当LMWDS和肝素酶衍生的8000Da肝素级分联合使用时，两种药物在分别比所述药物单独使用时保持开放所需的剂量低5倍和10倍的剂量下有效(即，50比250μg/ml的LMWDS和1比10μg/ml肝素酶衍生的8000Da的级分)。
对LMWDS(50μg/ml)与肝素酶、亚硝酸及高碘酸衍生的肝素级分，以及伊诺肝素(全部为2μg/ml)的联合使用进行了比较。LMWDS与肝素酶或亚硝酸衍生的肝素级分联合使用有效。另两种联合使用无效(见表4)。
为进一步评价肝素酶衍生的级分和伊诺肝素，比较了这两种药物的重量分析等效剂量(表5)。即使在30μg/ml剂量下，伊诺肝素的药效也低于10μg/ml的肝素酶衍生的级分。
实施例3纤维蛋白单体对肝素-和DS-催化的HCII抑制凝血酶的速率的比较在没有或存在递增浓度的DS或肝素下首先检测可溶性纤维蛋白单体(其制备如先前所述(15))对HCII所抑制凝血酶的速率的影响。在没有或存在3.3μM肝素或DS，或4μM SF，或两者同时存在时在准一级条件下检测HCII抑制凝血酶的二级速率常数(K2)。在不同浓度的肝素或DS(0至11μM)、SF(0至4μM)、10mM GPRP-NH2及15mMTris-HCl(pH7.5)存在下，使凝血酶(10nM)在室温下在含有0.6％PEG-8000的TBS中孵育5分钟。将反应混合物(10μl)等分量加入到96孔圆底微量滴定板中并以2秒至5分钟范围内的时间间隔将等体积的HCII(其浓度至少比凝血酶高10倍)加入到每个孔中。加入含10mg/ml聚凝胺的200μl TBS中的200μM显色底物(tGRP-pNA)终止所有反应。在405nm下采用Spectra Max 340 Microplate Reader(微量滴定板读出仪)(Molecular Divces，Menlo Park，CA)测定吸光度5分钟而计算剩余凝血酶活性。将数据代入等式K1·t＝1n([P]0/[P]t)中，以测定凝血酶抑制的准一级速率常数(k1)，其中[P]0为起始凝血酶活性而[P]t为时间t时的凝血酶活性。然后以HCII浓度除K1确定其二级速率常数，k2(15)。如图1(A图)所示，在2或4μM浓度下，可溶性纤维蛋白(Fm)仅引起DS催化的HCII对凝血酶的抑制速率稍微下降3倍。相反，Fm引起肝素催化的HCII对凝血酶的抑制速率呈剂量依赖性降低(B图)。在1μM肝素和4μM Fm时，观察到速率最大下降240倍，该数值与先前的报道一致(15)。
纤维蛋白单体对肝素及肝素酶衍生的级分通过抗凝血酶灭活凝血酶的速率的影响的比较采用类似的方法，比较在肝素或肝素酶衍生的8000Da的级分存在下纤维蛋白单体对抗凝血酶使凝血酶失活的速率的影响。如图2所示，对于肝素，在4μM纤维蛋白单体存在下凝血酶失活速率降低约45倍。相反，对于肝素酶衍生的8000Da的级分，纤维蛋白单体仅使凝血酶失活速率降低10倍。
肝素、DS或肝素酶衍生的8000Da的级分对125I-FPR-凝血酶与纤维蛋白结合的影响此前已经发现肝素促进凝血酶与纤维蛋白的结合，无论肝素具有高还是低的AT亲和力，该作用都发生，但仅当肝素链为11200Da或更高时发生(18)。在本研究中，比较了DS和肝素对凝血酶与纤维蛋白结合的促进能力。为完成该研究，按照所述(19)方法制备活性位点被阻断的凝血酶(FPR-凝血酶)和125I-FPR-凝血酶。在没有或存在肝素或DS下，在含有0.6％PEG-8000和0.01％吐温-20的TBS中研究125I-FPR-凝血酶与纤维蛋白凝块的结合。将纤维蛋白原(7.5μM)在总体积40μl的一系列微沉淀试管(目录号72.702，Sarstedt Inc.，St.Laurent，PQ)中与浓度递增的肝素或DS(0至2.5μM)一起孵育。通过加入10μl含10mM氯化钙、500nM125I-FPR-凝血酶及10μM凝血酶的贮备液A启动凝固。室温下孵育45分钟后，在15000xg下离心5分钟使纤维蛋白沉淀，并取出等份上清液样品进行γ记数。计算结合于纤维蛋白的凝血酶比例，作为结合的125I-FPR-凝血酶的变化与没有糖胺聚糖的对照组比较。如图3所示，DS对125I-FPR-凝血酶与纤维蛋白凝块的结合没有影响，即使在高达1μM的浓度下。相反，在高达250nM的浓度时，肝素以剂量依赖性方式促进125I-FPR-凝血酶与纤维蛋白凝块的结合。当肝素浓度高于250nM时，与凝块结合的125I-FPR-凝血酶减少，可能反映了肝素-纤维蛋白及肝素-凝血酶数量的显著聚集。当用低分子量(LMW)肝素(伊诺肝素)滴定凝血酶和Fm-琼脂糖时，与用DS所观察到的相比，所发现的凝血酶的量仅有少量增加。关于伊诺肝素的发现并不意外，因为该肝素链太短而不能桥接凝血酶和纤维蛋白。
也对8000Da的肝素酶衍生的级分促进凝血酶与纤维蛋白结合的能力与肝素进行了比较。如图4所示，肝素酶衍生的级分仅少量增加凝血酶的结合，而肝素则导致非常大的增加。这些发现表明类似于伊诺肝素，在肝素酶衍生的级分内的链也太短而不足以桥接凝血酶和纤维蛋白。
通过HCII从Fm-琼脂糖上置换IIa由于在DS存在下HCII对凝血酶抑制的催化作用不能被纤维蛋白修复，因此DS-HCII复合体必然能够接近凝血酶上的外切位点I甚至通过该位点凝血酶结合于纤维蛋白。此发现提示DS-HCII复合体应当能够从纤维蛋白上置换凝血酶。此项检验是监测在有或无DS的存在下浓度递增的HCII从Fm-琼脂糖上置换125I-FPR-凝血酶的量(图5)。在最高可达生理浓度的三倍时，单用HCII从Fm-琼脂糖上置换凝血酶的效力有限。当存在2.5μM的DS时，发现凝血酶被剂量依赖性地置换。生理浓度的HCII达到最大置换，其半数最大作用是在约250nM HCII下。因此，在DS存在下，HCII的氨基端能够有效地与纤维蛋白竞争结合凝血酶外切位点I。此发现表明DS/HCII复合体能够从纤维蛋白上置换凝血酶，由此使其易于失活。
实施例4功效与失血研究兔动脉血栓形成预防模型采用兔动脉血栓形成预防模型(Green等，J.Lab Clin Med.127583-587，1996；Klement等，J.Lab Clin Med.132181-185，1998；Klement等，Blood.942735-2743)检测本发明级分和组合物的功效和安全性。在该模型中，给兔注射被检测的抗凝剂和少量125I纤维蛋白原。对照组动物给予生理盐水以代替抗凝剂。五分钟后，将远端主动脉经气压式内皮剥离器，一种用于减少血流的狭窄术(结扎狭窄)，且主动脉壁被外部16号动脉夹压迫损伤。在没有抗凝剂时，创伤性血管壁损伤以及血流减少联合导致迅速凝血。采用放置于狭窄处之远端的超声流量探针可以连续测量血流量而监测凝血程度。该实验在注射抗凝剂后持续共90分钟。其主要功效终点是血管在所观察的共90分钟的时间内保持开放的时间百分比。各种抗血栓形成药的安全性可以在相同动物中采用耳出血模型测定，此包括在兔耳部作5个全厚度切口并且测定在所观察的30分钟的时间段内的累积失血量。这表示两种动物模型的合并(动脉血栓形成预防模型和耳出血模型)，以使所需动物数量减少50％。所设计的研究预防动脉血栓形成的这种模型，模拟了临床疾病如不稳定性心绞痛或颈动脉内皮切除术后凝血。
肝素寡糖级分在兔动脉血栓形成预防模型中比较了肝素寡糖级分(此处称作“V21”)和未分级分离的肝素、LMWH、水蛭素，或对照生理盐水的功效及安全性。在建立动脉狭窄和损伤之前5分钟给予被检测化合物。药效是测定90分钟内的血流(表示为开放期％)，同时采用兔耳出血模型测定安全性。在没有抗凝剂(SAL)以及在高剂量肝素(UFH)下观察到迅速凝血。V21和水蛭素(HIR)在保持血管开放方面远比LMWH更加有效。如图7所示，V21在与最低失血量相关剂量下产生100％的开放(底图)，同时证明水蛭素在其药效所需的剂量下有更大的出血倾向。
硫酸皮肤素寡糖级分在兔动脉血栓形成预防模型和耳出血模型中检测硫酸皮肤素寡糖级分(此处称之为“H2403”)的功效。共20只兔被分为4个组。以表6指定的1mg/ml至10mg/ml浓度的H2403对兔给药。
H2403使开放期呈剂量依赖性地增加。对在2.5-10mg/kg之间的所有剂量的H2403均使开放期在76-96％之间，但在1mg/kg剂量下仅为14％。H2403-123在2.5-10mg/kg剂量之间时，首次阻塞的平均时间为44-54分钟，但在1mg/kg的剂量下仅为1分钟。
与这些发现一致，H2403在2.5-10mg/kg之间的剂量时，主动脉中的累计血流量为160-288ml/hr，但在1mg/kg剂量下则少于20ml/hr。从一只兔到另一只兔，其血流量和方式差异很大，因此标准差很大。然而，H2403剂量较低时，主动脉血流量的减少趋势可以容易地见于个体兔变化轨迹以及平均的变化轨迹。这些数据支持H2403在2.5mg/kg及更高剂量下出现开放的一般性结论。
当H2403剂量从5mg/kg降低至2.5mg/kg时可见栓塞血管壁放射活性少量增加(从参照值的15％至19％)，但当H2403剂量降低到1mg/kg时则可见大幅度升高(达参照值的33％)。此数据也支持在该模型中2.5mg/kg及更高剂量的H2403显著增加功效的一般性结论。
在相同兔中采用耳出血模型测定LMWDS的安全性。H2403给药导致剂量依赖性的失血增加，而当剂量高于2.5mg/kg时发生失血显著增加(80μl及以上)。开放及栓塞数据都提示LMWDS在剂量高于或等于2.5mg/kg时起效。
总之，基于开放、阻塞时间、累计血流量及放射标记的纤维蛋白原沉积量，通过所有参数的测定，在兔动脉血栓形成模型中H2403在2.5mg/kg及更高的剂量下显示其功效。然而，在大于2.5mg/kg的剂量下发生失血显著增加。
V21和H2403-123联合使用(矩阵研究)V2I+LMWDS制剂的安全性和功效都在兔动脉血栓形成和预防模型中检测。将100只雄性新西兰兔分成各有5只兔的20个处理组(见表7)，并且每组在一次静脉注射给予一个剂量的V-21/LMWDS制剂(剂量矩阵见表8)给药后在90分钟实验的剩余时间里连续滴注重复剂量。
V21和LMWDS组分的剂量反应曲线与早先研究一致，而这些研究中的剂量范围向下延伸。
V21的功效和安全性模式优于LMWDS，并且在实验剂量下，V21和LMWDS均使出血的剂量反应曲线压低。
将LMWDS加入到V21中没有显著增加出血。
LMWDS对V21的加和或协同作用仅在其功效，而非出血。
同时检测V21-LMWDS剂量组合下的凝块重量、开放时间及失血量以寻找最佳组合。发现下列比例的V21∶LMWDS是有用的1∶1，4∶1及5∶1。对5∶1的组合的功效和失血量进行检测。与单独接受相同剂量的V21的兔相比，接受5∶1比例的V21∶LMWDS组合的兔中其功效更高(图6A)，而失血没有增加(图6B)。
实施例5狒狒血栓形成模型进行一项狒狒研究以检测V21、LMWDS、以及这些药物组合的效益与风险模式。该狒狒模型涉及测定在涤纶(Dacron)血管移植物放置于动-静脉旁路后的60分钟的时间内在移植物上的急性血栓形成(Hanson等，Arteriosclerosis 5595-603，1985)。
起初，所有动物都有一个手术安放于股动脉和静脉之间的长期外置的聚硅酮橡胶旁路。这些旁路不产生可检测的血小板激活作用。为评价血栓形成，将中心铺有涤纶移植物(2cm×4.0mm内径)的实验管段插入旁路系统并接触血流1小时。其旁路管段为标准聚硅酮橡胶，内径为4.0mm，它为固有的非血栓形成性材料。通过放置于实验段远端的动脉夹使血流保持在100ml/min并且采用超声流量计连续测量。以1mCi-111-铟-8-羟基喹啉标记狒狒自身血小板。平均标记效率＞90％。采用γ闪烁相机(General Electric 400T)连续测量累积的111-In-标记的血小板。以5分钟的间隔储存数据并采用连接于相机的计算机辅助的图象处理系统进行分析。以沉积的血小板放射活性(每分钟的计数)除以全血111-In-血小板活性(每分钟的计数/ml)并乘以循环血小板计数(血小板数/ml)计算血小板沉积总数。
如下测定与血液接触60分钟后所形成的全部血栓中的纤维蛋白含量。在启动血栓形成前10分钟，静脉注射5μCi的125-I-标记的同源狒狒纤维蛋白原。与血液接触1小时后，用等渗生理盐水彻底漂洗血栓形成性涤纶移植物。由于111-In和125-I发射谱之间相重叠，在采用γ计数器对血栓的125-I放射活性计数之前至少需要30天以使111-In衰竭(半衰期＝2.8天)。然后将各实验中测定的沉积125-I-放射活性(每分钟的计数)除以可凝固的纤维蛋白原放射活性(每分钟的计数/ml)并且乘以循环纤维蛋白原浓度(mg/ml)计算出累积的纤维蛋白总量。
如Hanson等，Arteriosclerosis 5595-603，(1985)所述，通过直接测量出血时间来评价安全性。
在6只未处理动物中进行平行对照研究。如上所述评定涤纶移植物上形成的血栓，并在移植物临放前，以及移植物放置1小时后测量凝血时间(APTT、PT)、Xa因子活性(Spectrozyme assay；AmericanDiagnostica)、以及出血时间(BT)。此外，取0.5ml柠檬酸化的狒狒血浆(在各时间点)以测定凝血酶时间。
V21及LMWDS的研究首先研究V21，起始总剂量为0.5mg/kg、1mg/kg及2mg/kg(其总剂量的50％一次性大剂量(bolus)给予而余下的连续输液65分钟给予)。大剂量给药5分钟后，放入涤纶移植物并对血小板进行图象处理另外60分钟，其后，撤去移植物并终止研究。
以相同的方式研究LMWDS，从2mg/kg、5mg/kg及10mg/kg剂量开始。在2mg/kg的剂量下，将总剂量的50％为一次性大剂量给予而余下的连续输液65分钟给予。随后调整一次性大剂量给予和输液给予的LMWDS的相对比例以达到稳定状态的凝血时间。因此，在两只狒狒中5mg/kg剂量下的一次性大剂量给药/输液给药量的比例为50％/50％和33％/67％。在10mg/kg剂量下，所述比例为20-25％的一次性大剂量给药对75-80的输液给药，此种输液在60分钟的输液时间内产生恒定的APTT值。
随后，以0.5mg/kg V21+0.5mg/kg LMWDS、1mg/kg V21+1mg/kgLMWDS、2mg/kg V21+5mg/kg LMWDS及2mg/kg V21+10mg/kgLMWDS的剂量联合给予V21和LMWDS(其中50％的V21和20％的LMWDS的剂量为一次性大剂量注射给予，而剩余量则连续输液65分钟给药)。这种给药方案在60分钟的输液过程中产生几乎恒定的APTT值。血小板血栓成像、出血时间及实验室测定也如本文所述进行。
采用Student t-检验(双尾)比较接触血液60分钟后(或在任何较早的时间点)测量的血小板血栓形成的结果。
结果V21对涤纶移植物血栓形成的作用见图8所示。0.5mg/kg的低剂量的V21，不能使血小板沉积量降低到低于对照值，它在接触血液60分钟后平均为2.96±0.85×109个血小板。1mg/kg的中等剂量在60分钟时使血小板沉积量降低24％，而2mg/kg的高剂量使血小板沉积量降低57％(图8)。
V21使纤维蛋白以剂量依赖方式减少。在最高剂量下，总纤维蛋白的累积量减少59％(对照组为2.54±0.37mg，而2mg/kg处理组为1.05±0.52mg)。V21在2mg/kg剂量下还以剂量依赖性方式延长APTT至＞200秒。PT的测定大多未受影响。V21没有使出血时间显著增加，在2mg/kg的研究组中平均仅为5.1分钟。应当注意的是在0.5mg/kg组中记录到一只动物的出血时间为12分钟；然而，根据该组及其它剂量组的其它发现考虑，该结果被认为是假象。
LMWDS对涤纶移植物血栓形成的作用见图9所示。在2-10mg/kg范围内，血小板沉积量都没有降低。类似地，LMWDS不能减少在涤纶移植物上的纤维蛋白形成，或延长出血时间。LMWDS使APTT凝血时间延长，在10mg/kg剂量下约为两倍(平均值60分钟内的59.1秒，对Pre的28.7秒)，PT凝血时间不受影响。
图10给出了V21和LMWDS联合使用时，在涤纶移植物处血栓形成的结果。与2mg/kg V21联合使用时，两只狒狒被输入10mg/kg的LMWDS而另一只狒狒接受了5mg/kg的LMWDS。在2mg/kgV21+(5-10mg/kg)LMWDS剂量下发现血小板沉积量显著减少；然而，此作用可以与相同剂量下的V21单独使用所产生的作用相比较(见图8和10)。类似地，联合治疗所见的纤维蛋白沉积减少可以与V21单独使用所产生的作用相比较。大部分出血时间不受影响。同时大部分PT值不受影响(在高剂量下PT延长2秒钟)，APTT值平均＞500秒(而2mg/kg的V21单独使用时平均为269秒)。
这些研究中所采用的狒狒模型是一种快速血流(它促进血小板的快速转运及利用)与提供强烈起始刺激的较强的血栓形成表面(涤纶移植物)的组合。在这些条件下，纤维蛋白形成不是广泛的且抗凝剂(例如，标准肝素、五糖、标准硫酸皮肤素)一般无效。但是，在这种模型中V21不减少动脉血小板并且在不延长出血时间下使纤维蛋白血栓形成减少＞50％。
表1
表2肝素寡糖级分与肝素及LMWH的特征比较
表3低分子量硫酸皮肤素(LMWDS)单独使用或与8.0Kda肝素酶级分或伊诺肝素联合使用在体外循环中的抗血栓形成活性LMWDS 肝素酶伊诺肝素 不能滤过纤维蛋白起始ACT时间 原消耗量μg/mlμg/mlμg/ml min ％ sec250 ----＞90 9 349220 ----＞90 15336200 ---- 65 82342100 1 --＞90 9 32080 1 --＞90 1331660 1 -- 70 8127350 2 --＞90 7 30850 1 -- 45 8529625 3 -- 85 6233925 2 -- 75 7228850 --3 80 85294表4LMWDS(50μg/ml)与2μg/ml的肝素酶、亚硝酸或高碘酸产生的级分或与2μg/ml伊诺肝素联合使用在体外循环中的抗血栓形成活性制剂不能滤过 纤维蛋白原 起始时间 消耗量 ACTmin ％ secLMWDS和肝素酶8450＞9011.2292LMWDS和亚硝酸7700＞9016.6299LMWDS和高碘酸1010045 85.4256LMWDS和伊诺肝素 85 80.5260
表5伊诺肝素和肝素酶衍生的级分在体外循环中的抗血栓形成活性比较药物 剂量不能滤过纤维蛋白原时间 消耗μg/ml min ％伊诺肝素 1025 822070 6530 ＞90 33肝素酶(8450Da) 10 ＞90 11表6处理组组别 H2403 H2403 动物数一次性大剂量静注 静脉输液1 10mg/kg 10mg/kg 52 5mg/kg 5mg/kg53 2.5mg/kg 2.5mg/kg 54 1mg/kg 1mg/kg5
表7处理组
表8剂量矩阵
本发明之范围不受本说明书描述的具体实施方案的限制，因为这些实施方案的目的是仅对本发明的某一方面作单一性的描述，而且所有功能等价的实施方案均在本发明的范围之内。事实上，本领域内技术人员能够从前文描述及附图中弄清在本说明书所示及所述之外的对本发明进行的各种修饰。这些修饰将被包括在所附的权利要求的范围内。
本说明书所参考的所有出版物、专利及专利申请均以其全文通过参考结合到本文中，如同具体和单独指定的每件独立的出版物、专利或专利申请均以其全文通过参考结合到本文中一样。本说明书引用的任何参考文献均不表示所述参考文献是可作为本发明的先有技术而加以利用的。
指出在用于本说明书以及所附的权利要求时，单数形式“一(a，an)”和“该(the)”包括相关的复数，除非上下文中另有清楚说明。
说明书引用的参考文献1.Hirsh，J.N.Eng.J.Med.1991；3241565-15742.Popma JJ等，Chest(胸)1995；108486-5013.Collins R等，BMJ(英国医学杂志)1996；313652-6594.Hogg PJ，Jackson CM.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989；863619-36235.Weitz JI，等，J.Clin.Invest.(临床检查杂志)1990；86385-3916.Carrie D，等，Thromb.Haemost.1992；68637-6417.Matthiason SE，等，Haemostasis(止血)1995；25203-2118.Cadroy Y，等，Arteriosclerosis and Haemostasis(动脉硬化与止血)1993；131213-12179.Fernandez F，等，Br.J.Haematol.(英国血液学杂志)1986；64309-31710.Cohen AT，等，Thromb.Haemost.1994；72793-79811.Agnelli G，等，Thromb.Haemost.1992；67203-20812.Prandoni P，等，Br.J.Surg.(英国外科杂志)1992；79505-50913.DiCarlo V，等，Thromb.Haemost.1999；8230-3414.Tollefsen DM，J.Bio1.Chem.(生物化学杂志)1983；2586713-671615.Becker D，等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)1999；2746226-623316.Bendayan P，等，Thromb.Haemost.1994；71576-58017.Cosmi B，等，Thromb.Haemost.1993；70443-44718.Hogg PJ，Jackson CM.，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)1990；265241-24719.Fredenburgh JC，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)1997；27225493-25499
权利要求
1.一种用作药物的组合物，它包括(a)至少一种肝素寡糖级分和(b)至少一种硫酸皮肤素寡糖级分的组合。
2.权利要求1所要求的组合物，其中肝素寡糖级分包括衍生自肝素的寡糖混合物，其特征在于具有下列一、二、三、四、五、六，或七项或更多项特征(a)具有与抗凝血酶及肝素辅因子II(HCII)-相关的体外抗凝血活性；(b)所述寡糖由于太短而不能将凝血酶与纤维蛋白桥接，但具有足够的长度使抗凝血酶或HCII与凝血酶桥接；(c)具有至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的含有一个或多个五糖序列的寡糖；(d)富含具有分子量范围约6000至约12000，6000至11000，或6000至10000的寡糖；(e)所述寡糖具有约7000至10000，7500至9700，或8000至9000的峰分子量；(f)至少30％、35％、40％、45％、50％或55％的寡糖具有大于或等于6000道尔顿的分子量；(g)至少有20％、25％、30％、35％或40％，具有大于或等于8000道尔顿的分子量；(h)多分散性为1.1-1.8；和(i)具有类似的抗Xa因子和抗IIa因子活性。
3.权利要求2所要求的组合物，其中肝素寡糖级分具有特征(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(d)、(c)、(h)和(i)；(b)、(c)、(d)和(h)；(b)、(e)、(h)和(i)；(b)、(e)、(f)、(h)和(i)；(b)、(e)、(g)、(h)和(i)；或(a)至(i)。
4.权利要求2所要求的组合物，其中肝素寡糖级分具有一项或一项以上的下列特征(a)富含具有分子量范围为6000至10000道尔顿，而均值为约8500的寡糖；(b)白色至黄白色的结晶固体；(c)在室温下稳定；及(d)多分散性为约1.2至1.5。
5.权利要求2、3或4所要求的组合物，其中硫酸皮肤素寡糖级分具有一项或一项以上的下列特征(a)硫含量为6.0％至10％(w/w)，优选6.0％至8.0％(w/w)，更优选6.5％至8％(w/w)；(b)硫酸根/羧基比例为1.2至2.5，优选1.2至2.0，更优选1.3至1.8，最优选1.3-1.6；(c)焦硫酸化二糖含量为20％至60％(w/w)，优选单硫酸化二糖含量为30％至60％(w/w)；(d)肝素辅因子II介导的抗凝血酶活性在20-60IU/mg，优选30-60IU/mg范围内。
6.权利要求2、3或4所要求的组合物，其中硫酸皮肤素寡糖级分具有一项或一项以上的下列特征(a)富含具有分子量在5000至8000道尔顿范围内的寡糖；(b)白色至黄白色的结晶固体；(c)在室温下稳定；及(d)磺化大于6.2％重量。
7.权利要求2、3或4所要求的组合物，其中硫酸皮肤素寡糖级分包含具有90％或90％以上的分子量范围在约1600至约20000道尔顿之间且峰分子量为约4500至约8000道尔顿的皮肤素聚合链的混合物。
8.权利要求1至7中任何一项所要求的组合物，其中(a)和(b)的量在预防或抑制凝血酶生成或活性方面有效产生协同作用。
9.权利要求1至8中任何一项所要求的组合物，其中肝素寡糖级分和硫酸皮肤素寡糖级分的剂量比每种级分预防或抑制患者凝血酶生成或活性的所需剂量低至少5至10倍。
10.一种药用组合物，它含有协同作用有效量的在药学上可接受的载体中的至少一种肝素寡糖级分和至少一种硫酸皮肤素寡糖级分的组合。
11.权利要求10所要求的药用组合物，其中药学上可接受的载体适合于提供协同作用有效量的所述级分以抑制或预防患者的凝血酶生成或活性。
12.一种预防或抑制患者凝血酶生成或活性的联合治疗，它包括给予患者有效量的(a)至少一种肝素寡糖级分；和(b)至少一种硫酸皮肤素寡糖级分。
13.权利要求12所要求的联合治疗，其中该方法提供协同作用。
14.权利要求12或13所要求的联合治疗，其中肝素寡糖级分和硫酸皮肤素寡糖级分是同时给予或分别给予。
15.权利要求12、13或14所要求的联合治疗，其中肝素寡糖级分包括衍生自肝素的寡糖混合物，其特征在于具有下列一、二、三、四、五、六，或七项或更多项特征(a)具有与抗凝血酶及肝素辅因子II(HCII)-相关的体外抗凝血活性；(b)所述寡糖由于太短而不能将凝血酶与纤维蛋白桥接，但具有足够的长度使抗凝血酶或HCII与凝血酶桥接；(c)具有至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的含有一个或多个五糖序列的寡糖；(d)富含具有分子量范围约6000至约12000，6000至11000，或6000至10000的寡糖；(e)所述寡糖具有约7000至10000，7500至9700，或8000至9000的峰分子量；(f)至少30％、35％、40％、45％、50％或55％的寡糖具有大于或等于6000道尔顿的分子量；(g)至少有20％、25％、30％、35％或40％，具有大于或等于8000道尔顿的分子量；(h)多分散性为1.1-1.8；和(i)具有类似的抗Xa因子和抗IIa因子活性。
16.权利要求15所要求的联合治疗，其中肝素寡糖级分具有特征(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(d)、(c)、(h)和(i)；(b)、(c)、(d)和(h)；(b)、(e)、(h)和(i)；(b)、(e)、(f)、(h)和(i)；(b)、(e)、(g)、(h)和(i)；或(a)至(i)。
17.权利要求12至16之任何一项所要求的联合治疗，其中硫酸皮肤素寡糖级分具有下列一项或一项以上的特征(a)硫含量为6.0％至10％(w/w)，优选6.0％至8.0％(w/w)，更优选6.5％至8％(w/w)；(b)硫酸根/羧基比例为1.2至2.5，优选1.2至2.0，更优选1.3至1.8，最优选1.3-1.6；(c)焦硫酸化二糖含量为20％至60％(w/w)，优选单硫酸化二糖含量为30％至60％(w/w)；(d)抗凝血酶活性在20-60IU/mg，优选30-60IU/mg范围内。
18.权利要求12至16中任何一项所要求的联合治疗，其中硫酸皮肤素寡糖级分包含具有90％或90％以上的分子量范围在约1600至约20000道尔顿之间且峰分子量为约4500至约8000道尔顿的皮肤素聚合链的混合物。
19.一种在患者中抑制或预防凝血酶生成或活性的方法，它包括对有这种需要的患者联合给予协同作用有效量的至少一种肝素寡糖级分和至少一种硫酸皮肤素寡糖级分。
20.上述权利要求中任何一项所要求的组合物或联合治疗在预防和/或缓解与过量凝血酶生成或活性有关的疾病严重性、疾病症状和/或疾病复发周期中的用途。
21.包括(a)至少一种肝素寡糖级分及(b)至少一种硫酸皮肤素寡糖级分的组合的组合物在用于预防或抑制凝血酶生成或活性的药物制备中的用途。
22.协同作用有效量的至少一种肝素寡糖级分及至少一种硫酸皮肤素寡糖级分在用于抑制或预防患者凝血酶生成或活性的药用组合物的制备中的用途。
23.一种药剂盒形式的上述权利要求中任何一项所要求的组合物。
全文摘要
本发明总体上涉及预防或抑制凝血酶生成或活性的组合物和方法。
文档编号A61P7/02GK1473061SQ01818447
公开日2004年2月4日 申请日期2001年9月7日 优先权日2000年9月8日
发明者J·希尔斯, K·约翰森, J·I·维茨, J 希尔斯, 维茨, 采 申请人:汉密尔顿市医院研究发展有限公司, 利奥药品股份有限公司