耐受性诱导的制作方法

专利名称：耐受性诱导的制作方法
技术领域：
本发明涉及在个体中诱导耐受抗原物质的方法，该方法通过给药增加个体细胞(特别是免疫反应细胞)中COX-2(环氧合酶2)活性的化合物和一种材料或其抗原物质，所述化合物还任选地增加IFN-γ含量，其中个体对所述材料或其抗原物质产生负性免疫反应。具体地说，本发明涉及含有这些化合物和抗原材料或其部分的食品或药物组合物。在供选择的实施方案中，本发明还涉及新的体外方法，用于确定个体对具体物质产生变态反应的倾向。
在现代疾病中，变态反应是工业社会不同环境因素带来的疾病。变态反应是一种过敏状态，其由对外来物质的夸大免疫反应引起，这种疾病影响成千上万生物的生命，其常常规定什么可以吃、被触摸、用嗅觉闻或者甚至可以居住。身体对外来物质的反应可以从较小的炎症和不适直至在严重情况下死亡。
变态反应过程中产生的临床症状是两种不同反应的结果，分别为早期特异性免疫反应和晚期炎症反应。吸入的抗原，例如花粉或微尘，通过刺激高亲和力免疫球蛋白(IgE)受体(例如肥大细胞和嗜碱细胞)介导早期反应，从而释放组胺和细胞因子。这种早期反应持续约30分钟。然后，在早期反应期间从肥大细胞和嗜碱细胞释放的细胞因子介导晚期反应，介导的方式为把炎症细胞引入到鼻和上呼吸道。嗜酸性细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜中性白细胞和血小板启动炎症循环。这种后期反应通常持续高达约2天的时间，其扩大起始的免疫反应，从而引起更多炎症细胞的释放。
目前治疗变态反应的方法通常有两种途径。一种方式仅仅治疗变态反应症状，其中药用药物例如抗组胺药。这种方法的缺点在于所给予的药物需要重复给药，从而可能引起不良副作用。另外，其仅仅治疗症状，而不是治疗参与过敏状况的内在疾病。另一种治疗变态反应的途径就是所谓的“脱敏治疗”，其包括把特异性抗原注射于个体内。然而，在能够启动治疗之前，首先必须识别患者特异性抗原，然后用低剂量抗原重复注射至患者。这种方法使人不适，可能需要走访临床工作者高达50次以上。而且，过敏患者的抗原并不总是能够被识别，从而使脱敏治疗不可能进行。
除了上述缺点外，上述途径均不能确保过敏状态的消除。同样，两种途径均不能防止过敏状态的进一步发展。
越来越多的人对环境中遇到的物质(例如花粉和纤维等)发展成变态反应，并且患有食物变态反应的患者数目也稳步增加。具体地说，对谷类、坚果或奶类食品产生过敏反应会出现严重问题，因为在许多国家这些产品是主要食物，其含有高数量的潜在蛋白质抗原。
为了治疗食物过敏反应，目前已经采取许多不同的措施。其中一种措施就是从日常饮食中除去过敏食品材料，然而这在实施起来非常困难，因为需要严格的饮食改变，通常涉及限制措施，并最终影响生活质量和/或抑制年轻人或新生儿的预期生长发育。
另一种措施就是修饰变态材料本身的来源，这样降低变态反应能力。通常通过排除过敏性成分的食品材料达到上述目的，这常常出现问题就是食品材料中的抗原性物质常常是未知的，因此许多情况下并不清楚应该选择性地除去哪些材料。另一种改变食品材料抗原性的途径就是以特异性方式处理食品材料，例如用热或蛋白水解酶处理食品材料。
在此方面，US-P-4,293,571公开了低过敏性组合物的制剂，其中蛋白质材料经过水解处理，剩余的非水解蛋白通过热处理凝聚，然后经超滤步骤除去可能构成过敏原的凝聚材料和大分子肽类。
食品过敏问题在新生儿中出现的问题更突出，因为他们不能明确地把他们的不适传达给照顾者，因此过敏性疾病常常在出现显著过敏症状后才被察觉，例如特应性皮炎、呼吸和/或胃肠道障碍。
过敏材料的预防可能包括对这些婴儿居家和具体生活的若干约束。然而，其饮食的关键预防措施是避免天然蛋白的致敏作用。例如，通过大量降低天然牛乳蛋白的摄取可以显著降低牛乳变态反应的发生。
无论饮食如何选择，如果不用牛乳蛋白攻击免疫系统，那么对牛乳蛋白的免疫耐受性不可能完成。迄今为止，当婴儿在局部(Prick测试)或全身攻击(DBPCFC)后没有显示特异性变态反应时，仅仅能够通过外推法检测耐受状态。
因此，本发明所要解决的问题是克服现有技术存在的缺点，提供一种治疗或预防变态反应症状的新方式。
通过在个体中提供一种对给定抗原诱导耐受性的方法解决了上述问题，该方法包括对个体给药一种抗原材料和提高个体细胞COX-2活性和/或增加IFN-γ含量的物质，其中所述细胞特别是涉及免疫反应的细胞，例如淋巴细胞。


图1显示在耐受化期间用药物和营养治疗引起的细胞免疫反应的调节；图2显示在耐受化期间由药物和营养治疗引起的对BLG的体液免疫反应的调节；图3显示评估口服耐受性的PGE2和IFN-γ的测定。
COX-2是一种主要催化从花生四烯酸合成前列腺素的酶。
其它已知的COX-2底物包括二高-γ-亚麻酸(20∶3n∶6)和二十碳五烯酸(EPA，20∶5n-3)，它们分别生成PGE1和PGE3。
已经克隆出人COX-2基因，并且现有技术已经记载了其基因组模式及其对不同因子的基因表达，例如cAMP、NF-κB和TGF-β、IL-1或TNF-α。
本发明所用的术语“增加COX-2活性”应该理解为增加其本身的酶活性，例如增加辅因子的量或增强与所述辅因子的合作，或者增加细胞中蛋白的转录和/或翻译，或者仅仅增加底物的含量。
类似地，术语“负性免疫反应”应该理解为包括对个体有害的任何免疫反应，例如变态反应、自免疫反应和器官排斥。
另外，术语“个体细胞”应该包括表达COX-2并且涉及产生耐受活性的所有细胞。这些细胞特别包括涉及免疫反应的细胞，例如产生抗原的细胞、淋巴细胞，特别是T-淋巴细胞、嗜中性白细胞、粒细胞和单核细胞等。
给至个体的抗原材料可以是通常的食品材料本身、自体材料或非食品非自体材料。这样的食品材料的例子为乳类、蛋类、豆类、花生、甲壳类、鱼类、肉类、芝麻、乳清、浆果或苹果。
作为自体材料，可以提到的任意个体内源性材料包括例如胶原、胰岛素、髓磷脂结合蛋白、髓磷脂、乙酰胆碱受体、视网膜样结合蛋白或体内合成肽。
非食品非自体材料可以是任意的能够诱导负性免疫反应的个体外源性材料。这样材料的例子是变应原材料，例如花粉、微尘、碘、镍、铜、毒液或胶乳、各种类型的洗涤剂、化妆品、香水、石膏和药物(例如抗生素)，还有异体抗原例如移植抗原。至于异体抗原，可以对接受这些异体抗原(例如移植物，例如器官)的患者在进行移植之前给予异体抗原和增强COX-2活性的物质，从而降低或基本上减少患者免疫系统对移植器官的排斥。这种目的可以这样达到对患者给予部分移植器官例如含有移植器官相应的HLA抗原的细胞材料，并给予患者目标物质从而引导患者免疫系统耐受即将到来的移植物。
在个体细胞中，特别是在涉及免疫反应的细胞(例如淋巴细胞)中，增加COX-2活性的物质可以是能够产生所述作用的任何物质。这些物质可以容易地识别通过其对T-淋巴细胞中从花生四烯酸合成例如PGE2(前列腺素E2)的作用，其可以通过常规酶免疫分析测定。
根据优选的实施方案，具有增加个体COX-2活性并且可选地增加IFN-γ含量的物质包括丁酸盐(酯)、n-6多不饱和脂肪酸(PUFAs)例如花生四烯酸或神经酰胺类物质。
所述目的物质可以以单一产品形式单独或共同给至个体。
为此目的，目的物质和抗原材料可以包含在任何已知的药物组合物中，例如片剂、小药囊、溶液或胶囊等，其含有相应给药方式所需要的载体和赋形剂。这样的给药途径包括局部给药、鼻给药、口腔给药、静脉给药或腹腔给药。
抗原材料可以按照需要进行预处理。例如，药物组合物中并不是包括引起负免疫反应的整个材料，可以从这些材料中分离出各个抗原化合物或其部分例如具体的抗原肽，所述药物组合物可以含有这些化合物。
目的物质还可以包含在食品材料中。此时可以考虑三种方式。
第一种方式，把抗原非食品自体或非自体材料与目的物质一起包含在通常食品材料中。因此，该方案是把已知抗原(例如上述提到的抗原)加入到食品材料中，再添加目的化合物。作为这样的食品材料，可以提出任意液体例如水或乳类、果冻和糖果等。
第二种方式，食品材料可以代表抗原材料，即，食品材料本身含有可能的抗原材料。此时，为了获得本发明的组合物，可以简单地把目的物质加入到食品材料中。作为这样的食品材料，个体可以对其产生过敏反应的任何食品均可，包括任意种类的浆果、苹果和桃类等。具体地说，来自谷类植物或牛奶的食品材料是优选的食品，因为已知这些食品含有高变应原性化合物。这样食品的例子为酸奶酪、凝乳、干酪、发酵乳、基于发酵产品的乳类、冰淇淋或谷类产品，例如基于发酵谷类的产品、奶粉、饮料、水基浆、婴儿食品或甚至宠物食品。
因此，本发明提供一种用于诱导个体中对给定抗原口服耐受性的有趣的新构思，其方式是仅仅把能够增加个体细胞COX-2活性的物质添加到食品材料中，所述细胞特别是指免疫反应细胞，例如淋巴细胞，优选T-细胞，所述物质可可选地能够增加IFN-γ的含量。
因此，本发明教导了一种诱导个体口服耐受食品材料的方法。该方法特别适用于那些可能需要对食品材料产生耐受或变态反应的新生儿。应用本发明的教导，可以把婴儿食品提供给不会产生过敏反应的新生儿。而且，新生儿的免疫系统将被教导耐受所述牛乳蛋白，从而当用相应的食品材料喂养新生儿时不会出现问题。
或者，可以把抗原组分加入到任意其它需要的食品材料中。例如，可以把花生或其相关过敏组分加入到发酵的乳类产品中，例如加入到酸奶中以便提供花生味的酸奶，并加入目的物质。这种方法也适用于把草莓和苹果等物质加入到这样的发酵乳类制品种。
下面将会理解本发明的组合物能够完美地适合于防止变态反应在出现于个体之前的发展。不愿被理论所束缚，据信免疫系统对抗原的接触同时诱导涉及抑制对所述材料的过度免疫学反应通常对产生的特异性抗原不引起有害反应。因此，本发明的构思主要在于调控涉及口服耐受诱导性个体细胞的生物学/代谢机理，其中所述个体细胞优选涉及免疫反应的细胞。本发明的构思可以进一步用于自身免疫性疾病(自体材料或自身抗原)，并且可以进一步用于特异性非食品、非自身抗原的耐受发展。
因此，本发明不但能够防止变态反应的发生，而且能够治疗已经存在的变态反应疾病，其方式是通过“教导”免疫系统不对材料起作用，所述材料同时具有能够增加个体细胞COX-2活性的物质，所述细胞优选涉及免疫反应的细胞，并且任选地增加IFN-γ含量。
下面将会理解药物组合物或食品组合物中的目的物质的量将足以达到所需效果，即足以增加COX-2在个体的各自细胞(优选淋巴细胞、更优选T-淋巴细胞)中的活性，并且任选地提高周围组织中TFN-γ的含量，这样一旦识别为诱导过度免疫反应的外来抗原后，个体的免疫系统将被教导耐受抗原物质。
本发明另一方面提供一种确定个体对抗原材料发展变态反应倾向的方法，包括从个体中采取血样品，可以任选地对其进行处理以收集含有淋巴细胞的样品细胞材料。这可以容易地通过下列方式达到例如，用小管收集细胞，或者把血样转移至培养基质中，因此制备初级培养物，培养血液中存在的细胞。在随后的步骤中，用抗原材料接触样品或血细胞，优选淋巴细胞，更优选T-淋巴细胞，然后分别测定样品中COX-2的活性；和任选地测定样品中TFN-γ的含量，将所述含量与对照组进行比较，其中对照组可以是通用校正曲线，但优选没有接触抗原材料的同一样品。
与对照组相比，COX-2活性的增加和IFN-γ含量的增加表明采取样品的个体对所述抗原材料不会产生大量的即过度或负性免疫反应，所述个体会耐受这些抗原材料。另一方面，COX-2活性的显著降低和IFN-γ含量的显著降低表明所述个体将对此材料产生不利的反应。
与现有技术相比，上述方法具有的许多基本优点，因为可以避免抗体材料直接攻击个体。因此，为了评估其相应的趋向，要测试的患者或个体不需要发展成变态反应症状，同时降低了与此类测试有关的危险性。而且，由于本发明方法借助于细胞和分子水平的测定，这种测试比评估个体是否会发展成变态反应症状的测试要敏感得多。另一个优点在于本发明的方法能够检测年轻的儿童甚至新生儿，不会使其遇到危险。
下列实施例将更详细地举例说明本发明，而不是限定本发明。
应用的材料和方法如下动物所有实验采用三周龄的雌性Balb/c小鼠，来自IFFA-Crédo(L′Abresle，法国)。用不含牛奶的饮食喂养所有小鼠。在所有实验中，在喂养时每天称重小鼠，根据其体重确定需要的食物消耗量。
抗原BLG(牛乳球蛋白；结晶3次)和OVA(卵清蛋白；V级)来自Sigma Chemical Co.。乳清蛋白浓缩物(Lacprodan 80)购自DanmarkProtein AS(MD-Foods)，其由超滤酸性乳清(acid whey)产生，蛋白含量为80％。
统计学应用ANOVA单因素测试比较Seric IgE反应。P＜0.05即达到显著性差异。
实施例1小鼠的处理在开始实验前，每天以强制喂养和/或腹腔注射方法让小鼠服用丁酸盐(酯)(增加COX-2活性)、异丁苯丙酸(抑制COX活性)或生理盐水(对照)，持续3-4天。在第0天，用灌胃法饲养小鼠乳清蛋白(3mg/g体重)或同样体积的生理盐水。把管饲法产品溶解于0.3ml生理盐水中。在各个实验的第4天，把置于0.04ml无菌生理盐水和0.16ml 2％Al(OH)3(Superfos Biosecotr A/S，Denmark)中的0.08mgBLG和0.08mg OVA经腹腔注射至所有小鼠。
在第4天或第26天，在3％异氟烷麻醉(Abbott SA)下经心脏主动脉穿刺采取血样。经颈脱位(cervical dislocation)处死后，立即取出脾脏，放置到20ml补充5％FCS的冷却RPMI的处理组中。用细胞筛(Falcon)均化脾细胞溶液，用Histopaque密度离心(Sigma)在390×g下离心20分钟从红细胞中纯化。让细胞在96孔平板微滴培养皿(Costar)中共同培养48小时，培养浓度为5×106细胞/毫升，培养液为补充2mM L-谷氨酰胺(Seromed)、100U青霉素/100mg链霉素(Seromed)、10％FCS(Bioconcept)的RPMI 1640(Bioconcept)，培养温度为37℃，培养环境含5％的CO2，同时培养液中还含有5、2.5、0.5或0.1mg/mL的BLG(Sigma)或含有250、50、10或2μg/mL的植物血球凝集素A(Seromed)。在最终培养的6小时加入(3H)Tdr(Amersham，Zurich)，收集培养皿，用闪烁计数法(TopCount，Canberra Packard，Zurich)分析。(3H)Tdr掺合结果以cpm表示，结果为三份培养物的平均值，把减去空白的平均值对BLG浓度作图。把刺激指数计算为减去空白测试和对照值的比例，其为2.5mg BLG/mL和50μg PHA/mL下的值。
对各组进行特异增生分析。在-20℃下快速冷冻分离后的血浆，直至用于BLG特异性IgE的分析。
实施例2用ELISA方法测定IgE特异性抗体用ELISA方法测定一式两份血清样品的抗-BLG IgE性能。简单地说，应用微滴培养皿(NUNC Immunoplate Maxisorp F96，丹麦)，以100μl/孔的浓度涂敷BLG，浓度为0.5mg/mL，在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中稀释，pH为9.6，在4℃下过夜。用PBS-Tw(磷酸盐-缓冲盐-吐温0.05％)洗涤四次，然后进行各个连续的试剂添加步骤。培养皿中未占据的位点用200μL/孔的0.5％在PBS-Tw中的鱼明胶(Sigma)占据，室温下放置1小时。以一式两份方式测定各个小鼠样品的系列稀释液(血清的3倍稀释液)。首先在PBS-Tw中稀释血清20倍，然后进行测试。加入样品稀释液，室温下孵化1小时，然后加入大鼠抗小鼠IgE过氧化物酶标记抗体(Harlan Sera-Lab，美国)，2小时后加入OPD底物(Sigma)。在492nm处测定光密度，室温孵化15分钟后，应用Dynatech MR500 ELISA读数计(Dynatech，Embrach Embraport，瑞士)。在各个培养皿中应用从二十只非免疫雌性小鼠中获得的混合样品作为阴性对照物。通过计算阴性对照吸收度两倍的样品稀释液确定截止(cut-off)稀释液。把滴定度表达为截止稀释液倒数的对数。
实施例3细胞因子ELISA在96孔微滴培养皿(Costar)诱导细胞因子分泌物，其中以2.5mg/mL/孔的BLG刺激5×105的脾细胞。经48小时刺激后收集细胞培养物上清液。应用细胞特异性ELISA试剂盒Endogen测定IFN-γ的含量，其中按照制备商的说明书进行操作。所有细胞因子样品按照一式两份进行测试。
实施例4前列腺素E2和γ-干扰素测定应用酶免疫分析(EIA)试剂盒(Cayman Chemical)测定淋巴细胞培养6小时或12小时的培养物中的PGE2含量。各个测试在两个稀释液中测试一式三份的样品。
在乳清蛋白喂饲的小鼠中，与非耐受化的对照组小鼠相比，经5天耐受化后，培养物中BLG-刺激的淋巴细胞的诱导耐受性导致PGE2和INF-γ生成的含量增加。
当用COX抑制剂异丁苯丙酸处理小鼠时，没有观察到PGE2和INF-γ含量的增加。另一方面，与用乳清蛋白喂饲的小鼠阳性对照组相比，用丁酸酯(盐)处理小鼠显示PGE2和INF-γ的进一步增加。
实施例5增生经4天耐受反应后(图3)，用乳清蛋白喂饲小鼠诱导的耐受性导致增生反应指数的降低。刺激指数低于0.5表明小鼠已经耐受。当用COX抑制剂异丁苯丙酸处理小鼠时没有观察到增生反应指数的降低。另一方面，与用乳清喂饲的阳性对照小鼠组相比，用丁酸盐(酯)处理小鼠显示增生反应指数的进一步降低。
用耐受原喂饲4天后用BLG攻击小鼠，在第26天耐受反应后观察到类似的较强结果。
实施例6IgE耐受反应26天后，用乳清蛋白喂饲小鼠方式的诱导耐受性导致体液抗BLG IgE滴度的降低。与非耐受的小鼠相比，这种降低显示显著的统计学差异(p＜0.05)。当用COX抑制剂异丁苯丙酸处理小鼠没有观察到体液抗-BLG IgE的降低(参见图2)。
另一方面，与用乳清蛋白喂饲的阳性对照组小鼠相比，用丁酸酯(盐)处理的小鼠显示体液抗BLG IgE滴度的进一步降低。与耐受化的小鼠(阳性对照组)相比，这种体液抗-BLG IgE滴度的进一步降低具有显著的统计学差异(p＜0.05)。
权利要求
1.诱导对抗原材料耐受性的方法，其通过给予个体抗原材料或其抗原部分，并给予至少一种增加个体细胞COX-2活性和/或增加IFN-γ含量的物质。
2.权利要求1的方法，其中抗原为食品材料、自体材料或非食品非自体材料。
3.权利要求2的方法，其中食品材料来自乳类、蛋类、豆类、坚果类、甲壳纲类、鱼类、肉类、芝麻、乳清、浆果或苹果。
4.权利要求2的方法，其中自体材料选自胶原、胰岛素、髓磷脂结合蛋白、髓磷脂、乙酰胆碱受体、视网膜结合蛋白或多肽。
5.权利要求2的方法，其中非食品非自体材料选自花粉、微尘、碘、镍、铜、毒素、胶乳、洗涤剂、化妆品、香水、石膏、抗生素或异体抗原。
6.上述任意一项权利要求的方法，其中能够增加个体细胞COX-2活性和任选增加IFN-γ含量的至少一种物质选自丁酸盐(酯)、n-6PUFA、神经酰胺、植物提取物或细菌材料。
7.食品或药物组合物，含有抗原材料或其抗原部分，和至少一种能够增加个体细胞COX-2活性的物质。
8.权利要求7的食品组合物，其选自乳类、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳类、乳基发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷类的产品、乳基粉末、饮料、水基果冻、婴儿食品或宠物食品。
9.权利要求5的组合物，其中至少一种能够增加个体细胞COX-2含量和任选增加IFN-γ含量的物质选自丁酸盐(酯)、n-6 PUFA、神经酰胺、植物提取物或细菌材料。
10.权利要求7-9任意一项的组合物用于防止个体对所述组合物中含有的抗原材料产生免疫反应的趋向的用途。
11.测定个体对给定材料产生负性免疫反应趋势的方法，包括(a)从个体中采取血样，(b)任选地从含有淋巴细胞的样品中收集细胞材料，(c)让样品接触抗原材料，和(d)测定COX-2的活性和/或测定IFN-γ的含量，和(e)将测定的含量与对照组比较，其中增加的COX-2活性和增加的IFN-γ含量是对所述材料耐受性的指示。
12.权利要求11的方法，其中测试致耐受性的材料是食品材料。
13.权利要求11的方法，其中食品材料选自乳类、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳类、乳基发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷类的产品、乳基粉末、饮料、水基果冻、婴儿食品或宠物食品。
全文摘要
本发明涉及诱导个体对抗原物质产生耐受性的方法，其通过对发生负性免疫反应的个体给予增加个体细胞COX－2(环氧合酶2)活性并任选增加IFN－γ含量的化合物，其中所述细胞优选免疫反应细胞，还给予一种材料或其抗原部分。具体地说，本发明涉及含有所述化合物和抗原材料或其抗原部分的食品或药物组合物。在可选择的实施方案中，本发明还涉及新的体外方法，用于确定个体对具体材料产生变态反应的趋势。
文档编号A61P37/00GK1529618SQ01821250
公开日2004年9月15日 申请日期2001年12月20日 优先权日2000年12月22日
发明者M·图里尼, B·格尔曼, S·佩奎特, , M 图里尼 申请人:雀巢制品公司