专利名称：来自肺炎链球菌的重组防护蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明提供了涉及具有约20千道尔顿(kDa)分子量的肺炎链球菌蛋白质的氨基酸序列和核酸序列。本发明还涉及用于治疗和预防与细菌感染相关的感染或炎症的组合物。
背景技术：
中耳是经鼓室与外耳隔开的无菌充气的腔。当声波冲击鼓室时，与鼓室连接的三根耳骨发生振动。振动被传递至内耳，内耳产生被传送至大脑的神经冲动。气体可以通过在鼻咽壁上开放的咽鼓管进入中耳。
鼻咽位于鼻腔后面。鼻咽内衬有呼吸上皮和复层扁平上皮。在呼吸上皮下，大量与粘膜连接的淋巴样组织(MALT)形成鼻咽扁桃体(腺样)。
主要在儿童中观察到中耳的细菌感染或炎症。由于中耳的分离，所以提示中耳感染的发展需涉及鼻咽和咽鼓管。感染肺炎链球菌(S.pneumoniae)是中耳感染以及菌血症、脑膜炎和全世界致死性肺炎的主要原因(Butler，J.C.等，《美国药物杂志》(American Journal ofMedicine)，1999，10769S-76S)。世界范围内多药物抗性肺炎球菌菌株的迅速出现已经增加了对通过接种疫苗预防肺炎球菌感染方面的关注(Goldstein和Garau，《柳叶刀》(Lancet)，1997，350233-4)。
已经在肺炎球菌感染动物模型中评价了肺炎链球菌的蛋白质抗原的预防功效。某些最常见研究的疫苗候选物包括PspA蛋白质、PsaA脂蛋白质和CbpA蛋白质。大量研究已经证实PspA蛋白质是毒力因子(Crain，M.J.等，《感染与免疫》(Infect Immun)，1990，583293-9；McDaniel，L.S.等，《实验药物杂志》(J Exp Med)，1984，160386-97)，但它在肺炎球菌菌株中是抗原可变的。另外，近期研究已经表明重组PspA变体的某些抗原保守区可以在成年人中引起交叉反应抗体(Nabors，G.S.等，《疫苗》(Vaccine)，2000，181743-1754)。与其它革兰氏阳性粘附素具有相似性的37kDa脂蛋白质PsaA涉及肺炎球菌中的锰转运(Dintilhac，A.等，《分子微生物学》(Molecular Microbiology)，1997，25(4)727-739；Sampson，J.S.等，《感染与免疫》(Infect Immun)，1994，62319-24.)且已经证实它可在小鼠模型中预防系统性疾病(Talkington，D.E等，《微生物病理》(Microb Pathog)，1996.2117-22)。表面暴露的胆碱结合蛋白质CbpA是抗原保守的，且也可预防小鼠模型中的肺炎球菌性疾病(Rosenow，C.等《分子微生物学》(Molecular Microbiology)，1997，25819-29)。由于鼻咽定殖(colonization)是耳部疾病先决条件，所以已经将给小鼠鼻内免疫接种肺炎球菌蛋白质和适宜的粘膜佐剂这一技术用于增强粘膜抗体反应和由此的蛋白质疫苗候选物的效力(Briles，D.E.等，《感染与免疫》(Infect Immun)，2000，68796-800；Yamamoto，M.等，《美国免疫学杂志》(A.J Immunol)，1998，1614115-21)。
目前可得到的23价肺炎球菌荚膜多糖疫苗在受到肺炎球菌感染危害的两个主要群体即低于2周岁的儿童或无免疫应答患者中无效(Douglas，R.M.等，《感染性疾病杂志》(Journal of InfectiousDiseases)，1983，148131-137)。经证实7价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合疫苗在婴儿和儿童中对由疫苗血清型导致的系统性肺炎球菌疾病和对交叉反应荚膜血清型非常有效(Shinefield和Black，《儿科感染性疾病杂志》(Pediatr Infect Dis J)，2000，19394-7)。在美国7种荚膜型涵盖了80％以上的疾病分离物，但在世界其它地区仅涵盖了57-60％的疾病分离物(Hausdorff，W.P.等，《临床感染性疾病》(ClinicalInfectious Diseases)，2000，30100-21)。因此，存在对涵盖大部分或全部产生肺炎球菌血清型疾病的疫苗的急切需求。
铁是许多致病菌定殖和感染的必需元素。获得过程的预防应导致定殖减少和发病的可能性降低。其它实验室已经评价了铁获得复合物在诸如但不限于淋病萘瑟氏球菌(N.gonorrheae)、脑膜炎萘瑟氏球菌(N.meningitides)、粘膜炎微球菌(M.catarrhalis)和流感嗜血杆菌(H.influenzae)这样成功的病原体中的疫苗可能性(Conte，M.P等，《感染与免疫》(Infection and Immunity)，1999，643925；Gray-Owens，S.D.等《感染与免疫》(Infection and Immunity)，1995，641201；Luke N.R.等，《感染与免疫》(Infection and Immunity)，1999，67681；Pettersson，A等，《感染与免疫》(Infection and Immunity)，1993，614724)。因此，导致铁获得的结构的分离可以产生疫苗候选物。
发明概述本发明涉及具有约20千道尔顿(kDa)分子量的分离的肺炎链球菌表面相关肺防护蛋白质(Penumo Protective Protein，PPP)或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力。
本发明涉及具有约20kDa分子量的重组肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力。
本发明涉及具有约20kDa分子量的重组肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力；其中该PPP具有约4.587的等电点。
本发明涉及具有约20kDa分子量的重组肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力；其中该PPP具有约4.587的等电点并在pH 7下带有约-14.214的电荷。
本发明还涉及具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量量；其中所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其片段；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力。
本发明还涉及编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；其中所述的核酸序列具有SEQ ID NO4中所示的序列或其片段；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力。
本发明还涉及编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的cDNA或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；其中所述的核酸序列具有SEQ ID NO4中所示的序列或其片段；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力。
本发明涉及包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的表达载体；其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力，其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接。
本发明还涉及包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力，其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接；且其中所述的PPP具有约4.587的等电点。
本发明进一步涉及包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力，其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接；且其中所述的PPP具有约4.587的等电点并在pH 7下带有约-14.214的电荷。
本发明还涉及包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；其中所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其片段；且其中所述的核酸序列可操作地与表达控制序列连接。
本发明还涉及包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；其中所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其片段；其中所述的氨基酸序列由SEQ IDNO4中所示的核酸序列或其片段编码；且其中所述的核酸序列可操作地与表达控制序列连接。
本发明涉及用包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的表达载体转染的宿主细胞，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力；其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接。
本发明进一步涉及用包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的载体转染的宿主细胞，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；其中所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其片段；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力；其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接。
本发明还涉及重组PPP的生产方法，该方法包括分离由宿主细胞产生的PPP，其用表达载体转染的、并在提供所述载体表达所述PPP的条件下培养，其中所述的载体包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力；其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接。
本发明还涉及重组PPP的生产方法，该方法包括分离由宿主细胞产生的PPP，并用载体转染的、并在提供用所述载体表达所述PPP的条件下培养，其中所述的载体包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；其中所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其片段；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力；其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接。
本发明还涉及包括下列组分的组合物(1)具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力；和(2)药物上可接受的载体。
本发明还涉及包括下列组分的组合物(1)具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力，且所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其片段；和(2)药物上可接受的载体。
本发明涉及包括下列组分的组合物(1)编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力，其中所述的核酸序列具有SEQ ID NO4中所示的序列或其片段；和(2)药物上可接受的载体。
本发明涉及包括下列组分的组合物(1)包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力，其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接；和(2)药物上可接受的载体。
本发明还涉及包括下列组分的组合物(1)包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；其中所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其片段，且其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接；和(2)药物上可接受的载体。
本发明还涉及包括下列组分的组合物(1)用包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的表达载体转染的宿主细胞，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力，且其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接；和(2)药物上可接受的载体。
本发明涉及包括下列组分的组合物(1)用包括编码具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP的核酸序列或其片段的载体转染的宿主细胞，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力；其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接；其中所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其片段；和(2)药物上可接受的载体。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)具有约20kDa分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)具有约20kDa分子量的分离的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，所述的PPP具有约4.587的等电点；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)具有约20kDa分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，所述的PPP具有约4.587的等电点并在pH 7下带有约-14.214的电荷；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)具有约20kDa分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其免疫原性片段；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)具有约20kDa分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，所述的PPP由具有SEQ ID NO4中所示序列的核酸序列或其免疫原性片段编码；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)具有约20kDa分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂；其中该组合物引起对由肺炎链球菌导致的疾病的保护性免疫。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)具有约20kDa分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂；其中该组合物引起对由肺炎链球菌导致的疾病的保护性免疫；其中所述的疾病选自中耳炎、鼻窦炎、菌血症、脑膜炎、肺炎和下呼吸道感染。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)具有约20kDa分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂；其中该组合物引起对由肺炎链球菌导致的疾病的保护性免疫；其中所述的PPP包括如SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其免疫原性片段。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)具有约20kDa分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，所述的PPP由如SEQ ID NO4中所示序列的核酸序列或其免疫原性片段编码；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂；其中该组合物引起对由肺炎链球菌导致的疾病的保护性免疫。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂；其中所述的肺炎球菌是肺炎链球菌。
本发明还涉及免疫原性组合物，它包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂；其中该组合物引起对由肺炎链球菌导致的疾病的保护性免疫。
本发明涉及免疫原性组合物，它包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂；其中该组合物引起对由肺炎链球菌导致的疾病的保护性免疫；其中所述的疾病选自中耳炎、鼻窦炎、菌血症、脑膜炎、肺炎和下呼吸道感染。
本发明涉及免疫原性组合物，它包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，其中所述的PPP具有约4.587的等电点；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明涉及免疫原性组合物，它包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，其中所述的PPP具有约4.587的等电点并在pH7下带有约14.214的电荷；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明涉及免疫原性组合物，它包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，其中表达载体包括编码如SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列的核酸序列或其免疫原性片段；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明涉及免疫原性组合物，它包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，其中表达载体包括编码如SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列的核酸序列或其免疫原性片段；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明涉及免疫原性组合物，它包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，其中表达载体包括如SEQ ID NO4中所示的核酸序列或其免疫原性片段；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明涉及诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，该方法包括对所述哺乳动物给予诱导该哺乳动物体内免疫应答有效量的组合物；其中该组合物包括(i)具有约20千道尔顿(kDa)分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明涉及诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，该方法包括对所述哺乳动物给予诱导该哺乳动物体内免疫应答有效量的免疫原性组合物；其中该组合物包括(i)具有约20kDa分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，所述的PPP具有如SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其免疫原性片段；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明涉及诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，该方法包括对所述哺乳动物给予诱导该哺乳动物体内免疫应答有效量的免疫原性组合物；其中该组合物包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量，其中所述的PPP具有4.582的等电点；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
本发明涉及诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，该方法包括对所述哺乳动物给予诱导该哺乳动物体内免疫应答有效量的组合物；其中该组合物包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂；其中所述的表达载体包括编码如SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列的核酸序列或其免疫原性片段。
本发明涉及诱导感染了肺炎球菌的哺乳动物体内的免疫应答的方法，该方法包括对所述的哺乳动物给予抑制结合如SEQ ID NO5中所示氨基酸序列有效量的化合物以诱导该哺乳动物体内的免疫应答。
本发明还有效诱导感染了肺炎球菌的哺乳动物体内免疫应答的化合物的筛选方法，该方法包括下列步骤将在有所述化合物存在情况下如SEQ ID NO5中所示氨基酸序列的第一种结合量与在没有所述化合物存在情况下如SEQ ID NO5中所示氨基酸序列的第二种结合量进行比较；从而由第一种结合量低于第二种结合量这一结果表明所述的化合物可以在所述哺乳动物体内诱导免疫应答。
本发明还涉及肺炎球菌感染的诊断方法，该方法包括下列步骤将可疑样品内如SEQ ID NO5中所示的PPP或其片段的水平与对照样品中如SEQ ID NO5中所示PPP或其片段的水平进行比较，从而由所述可疑样品中的所述肺防护蛋白质水平高于所述对照样品中的所述肺防护蛋白质水平这一结果表明所述的可疑样品中包含肺炎球菌感染。
本发明进一步涉及结合肺炎链球菌PPP的抗体。
本发明还涉及结合肺炎链球菌PPP的抗体，该抗体选择性识别如SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其片段。
本发明还涉及结合肺炎链球菌PPP的嵌合抗体。
本发明还涉及结合肺炎链球菌PPP的人源化抗体。
本发明还关注结合肺炎链球菌PPP的抗独特型抗体。
本发明还关注结合肺炎链球菌PPP的抗体，其中该抗体与药物活性化合物缀合。
本发明还涉及结合肺炎链球菌PPP的单克隆抗体。
本发明还涉及结合肺炎链球菌PPP的单克隆抗体，其中该抗体是人源化单克隆抗体。
本发明还涉及结合肺炎链球菌PPP的单克隆抗体，其中该抗体是抗独特型单克隆抗体。
本发明还涉及结合肺炎链球菌PPP的单克隆抗体，其中该抗体与药物活性化合物缀合。
本发明涉及诱导哺乳动物体内的免疫应答的方法，该方法包括对所述哺乳动物给予结合肺炎链球菌PPP的、诱导该哺乳动物体内免疫应答有效量的抗独特型抗体。
本发明涉及诱导哺乳动物体内的免疫应答的方法，该方法包括对所述哺乳动物给予结合肺炎链球菌PPP的、诱导该哺乳动物体内免疫应答有效量的单克隆抗体，其中所述的抗体是抗独特型单克隆抗体。
本发明涉及诱导感染了肺炎球菌的哺乳动物体内的免疫应答的方法，该方法包括对所述哺乳动物给予结合肺炎链球菌PPP的、诱导该哺乳动物体内免疫应答有效量的抗体，其中所述的抗体与药物活性化合物缀合。
本发明还涉及诱导感染了肺炎球菌的哺乳动物体内的免疫应答的方法，该方法包括对所述哺乳动物给予结合肺炎链球菌PPP的、诱导该哺乳动物体内免疫应答有效量的单克隆抗体，其中所述的抗体与药物活性化合物缀合。
附图简述附
图1.来自肺炎链球菌菌株49136的PBS洗涤物的DEAE级分的SDS-PAGE凝胶。泳道1是未染色的标准品；泳道2是级分#8；泳道3是级分#9；泳道4是级分#10；泳道5是级分#11；泳道6是级分#12；泳道7是级分#13；泳道8是级分#19；泳道9是级分#15；且泳道10是级分#16。附图1中的凝胶显示用该凝胶分离的级分#14和#15(泳道8和9)中的分子量带差异较小。
附图2.显示所需产物表达的pLP533的重组表达的完整细胞裂解物的凝胶。泳道1，Biorad预染色的标记物；泳道2，未诱导的细胞；泳道3，诱导的细胞。
附图3.显示交叉反应性和寡聚体形成的几种血清型的完整细胞裂解物的Western印迹。泳道1，Biorad精密预染色标记物；泳道2，3型；泳道3，4型；泳道4，9型；泳道5，14型；泳道6，19F型；泳道7，18C型；泳道8，5型；和泳道9，23F型。
附图4.rPPP1定殖减少。以Log10CFU/克组织所示回收的细菌。显示了平均值的一种标准误差。通过Tukey-Kramer统计学检验显示*值与对照组相比具有显著性差异。
附图5.SDS-PAGE凝胶显示了rPPP1的纯化。泳道1，Bio Rad精密标准品；泳道2，渗滤物；泳道3，纯化的rPPP1。
附图6.来自肺炎链球菌血清型的PPP1的序列比较。
附图7.凝胶显示了由体外和体内培养物扩增的PPP1。
发明描述本发明的蛋白质和核酸具有对由肺炎链球菌感染导致的疾病的诊断、预防和治疗效用。可以将它们用于设计干扰或破坏与肺炎链球菌相关的蛋白质与铁的相互作用的化合物的筛选系统。还可以将所述的核酸和蛋白质在用于表达外源基因时用于制备抗肺炎链球菌感染和/或其它病原体的组合物。
在本发明中，已经在鼻内攻击模型中鉴定了来自完整肺炎链球菌的减少肺炎链球菌定殖的重组20kDa蛋白质。已经将本文所述的蛋白质命名为肺防护蛋白质1(Pneumo Protective Protein1)(PPP1)。该蛋白质表现出与来自无害利斯特氏菌(L.innocua)的非血红素铁蛋白具有显著的同源性，有意思的是，其是Dps族DNA结合蛋白质的成员(Pikis，A.等，《感染性疾病杂志》(J.Infect.Diseases)，1998，178700)。因该蛋白质在胞质中的推定位置而没有预测到该蛋白质减少定殖的能力。
化学研究表明分离的肺炎链球菌表面相关PPP具有约20kDa的分子量，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定该分子量。经测定该重组PPP具有约4.587的等电点。另外，该蛋白质在约pH 7下带有约-14.214的电荷。
肺炎链球菌肺炎链球菌是在人体内具有高度感染性的细菌种类。迄今为止已经鉴定了80种以上的血清型。这些血清型中的几种是多种疾病的病原体，所述的疾病包括但不限于肺炎、脑膜炎、心内膜炎、关节炎、鼻窦炎、耳炎、支气管炎和喉炎。已经鉴定肺炎球菌感染为诸如感染了HIV的无免疫应答系统的人死亡的主要原因。
肺炎链球菌是链球菌科的链球菌属的种类。该科包括未形成内孢子的革兰氏阳性菌的不能动的球形或椭圆形细胞。肺炎链球菌带有氧化代谢用的无机末端电子受体；然而，它们在有氧存在的情况下生长。这使得肺炎链球菌在各种环境中生长，且它由此会非常适于在不同人体组织内生长。这种细菌难以用青霉素靶向，因为许多菌株产生了多糖荚膜。
趋向于肺炎球菌感染的第一个步骤是鼻咽的定殖。破坏肺炎球菌与人鼻咽/耳细胞的结合应导致定殖减少和导致疾病的可能性降低。因此，分离导致肺炎球菌与人细胞结合的结构可产生疫苗候选物。肺炎球菌具有大量结合人鼻咽细胞的机制，包括PspA、PsaA和CbpA蛋白质。另外，肺炎球菌可能特异性结合人鼻咽粘蛋白质作为定殖的第一个步骤。因此，鉴定导致这种相互作用的肺炎球菌结构可以确定潜在的疫苗靶物。
分子生物学本发明的实施方案涉及编码多肽或蛋白质的分离的多核苷酸序列，以及这类序列的变体。优选这些变体序列在高度严格条件下与编码一种或多种肺防护蛋白质的多核苷酸杂交。更优选这些变体序列在高度严格条件下与编码一种或多种肺防护蛋白质序列的多核苷酸(诸如SEQ ID NO4的多核苷酸序列)杂交。为确定高度严格Southern杂交，可以便利地参照Sambrook等(1989)的387-389页，将该文献引入本文作为参考，其中认为洗涤步骤是高度严格的。
本发明还涉及保守变体，其中多核苷酸序列通过对核苷酸三联体的第三个核苷酸的改变而不同于参比序列。优选这些保守变体起PPP1参比多核苷酸序列的生物等价物的作用。在一个优选的实施方案中，起生物等价物作用的变体是那些与铁结合的变体。
本发明进一步包括DNA序列，它们通过遗传密码的丰余性而生物学上等价于编码PPP1的序列，即这些其它DNA序列的特征在于核苷酸序列不同于本文所示的那些核苷酸序列，但它们编码与由SEQ IDNO4中所示DNA序列编码的蛋白质具有相同氨基酸序列的蛋白质。
本发明还包括DNA序列，它们编码不同于肺炎链球菌PPP1的、但生物学上等价于该蛋白质(SEQ ID NO5)的氨基酸序列。如果其序列仅由于小缺失、插入或取代而不同于PPP1序列，使得这些序列的三级构型与野生型蛋白质的构型相比基本上没有改变，可以认为这类氨基酸序列生物学上等价于这类PPP1。
例如，疏水性氨基酸丙氨酸的密码子可以被编码另一种疏水性较低的残基(诸如甘氨酸)或疏水性更高的残基(诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，还可以预计使一种带负电荷的残基取代另一种残基(诸如天冬氨酸取代谷氨酸)或一种带正电荷的残基取代另一种残基(诸如赖氨酸取代精氨酸)的改变以及基于残基在其亲水指数方面的相似性的改变可产生生物等价产物。还没有预计到使该蛋白质分子的N-末端或C-末端部分改变的核苷酸变化会改变该蛋白质的活性。
正如Kyte和Doolittle(1982)所讨论的，可以应用氨基酸在提供对多肽相互生物作用功能上的亲水指数，其中确定某些氨基酸可以被具有相似亲水指数的其它氨基酸取代且仍然保留相似生物活性。另外，可以基于亲水性进行类似的氨基酸取代，特别是当将产生的多肽中所需的生物功能用于免疫实施方案时。例如，参见美国专利US 4,554,101(将该文献引入本文作为参考)，该文献中描述邻近氨基酸亲水性所控制的″蛋白质″的最大局部平均亲水性与其免疫原性相关。因此，应注意可以基于每一氨基酸的亲水性进行取代。在应用将数值赋予每一氨基酸的亲水性指数或亲水指数的过程中，优选引入这些数值±2时的氨基酸取代，其中特别优选±1，且在±0.5以内是最优选的取代。
此外，当保守区的三级构型基本上与PPP1的三级构型相同时，已知可变区中的改变是生物学上等价的。生物学上等价序列的另一种定义是仍然能够产生交叉反应性免疫应答的序列。具体而言。可以延长或缩短淋球菌菌毛蛋白质的相应的插入来修饰该蛋白质，只要该修饰蛋白质仍然能够产生所需免疫应答。
每一种提出的修饰显然属于本领域技术人员的能力范围，其确定编码产物的结构和生物活性的保持。因此，如果术语″肺防护蛋白质″或″PPP1″或″PPP″用于本说明书或权利要求中时，应理解为它包括导致生物学上等价蛋白质产生的所有这类修饰和变异。
由本发明核苷酸序列编码的本文所述的PPP1的优选特征包括下列特征中的一种或多种(a)是膜蛋白质或直接与膜相关的蛋白质；(b)能够使用SDS丙烯酰胺凝胶被分离的蛋白质；和(c)保留其与铁发生相互作用的生物功能。
变体和片段可以被减毒，即当与本发明野生型PPP1比较时有关非铁结合活性降低。优选该片段和变体氨基酸序列和表达PPP1的变体核苷酸序列是生物等价物，即它们基本上保留了野生型PPP1的相同功能。这类变体氨基酸序列由本发明的多核苷酸序列编码。这类变体氨基酸序列可以与PPP1的氨基酸序列具有约70％一约80％、且优选约90％的总体相似性。在一个优选的实施方案中，这些序列如附图6和SEQ ID NOs10-19中所示。所述的变体核苷酸序列可以与转录时编码PPP1的氨基酸序列或PPP1的变体氨基酸序列的核苷酸序列具有约70％-约80％、且优选约90％的总体相似性。本发明减毒的蛋白质包括野生型蛋白质的至少一种表位区。在另外的实施方案中，该蛋白质的表位区包括至少20个连续的核苷酸或8个连续的氨基酸。
本发明进一步涉及PPP1的全部共有序列。可以将来自肺炎链球菌不同血清型的PPP1的推定氨基酸序列进行比较以便测定保守序列。在一种实施方案中，比较了10种不同的血清型。保守序列可以具有许多应用，诸如但不限于测定蛋白质结合、活性和/或功能所需的最低需求。在一个优选的实施方案中，PPP1的共有序列如附图6和SEQ IDNO20中所示。
本发明的″分离的″序列是非天然出现的序列。例如，这些序列可以分离自细菌基因组内其正常状态；或这些序列可以是合成的，即通过诸如众所周知的重组表达系统这样的重组技术产生或通过机器产生。
本发明还提供了能够表达PPP1的重组DNA克隆载体，它包括带有启动子和起始密码子序列的表达控制序列和位于该启动子和起始密码子序列3′端的本发明核酸序列。克隆载体可以是本领域中所公知的任意的质粒或表达载体，包括病毒载体(参见下文)。在另一个方面中，本发明提供了含有本发明重组DNA克隆载体和/或重组PPP1的宿主细胞。合适的表达控制序列、宿主细胞和表达载体在本领域中是众所周知的，且在Sambrook等(1989)中通过实例描述。
可以基于可能影响重组表达蛋白质产率的因素筛选合适的宿主细胞。这些因素包括但不限于生长和诱导条件、mRNA稳定性、密码子的应用、翻译效率和使启动子通读减少到最低限度的转录终止子的存在。在筛选合适的宿主细胞时，可以用包括本发明核酸序列的表达载体转染该细胞。可以使用本领域中所公知的任意方法转染该细胞(参见下文)。
一旦用本发明的表达载体转染了宿主细胞，则在表达多肽类的条件下培养细胞。然后通过本领域技术人员众所周知的技术分离多肽，基本上不含污染宿主细胞的成分。
随着所需重组蛋白质应用的不同，异源核苷酸序列可以编码辅因子、细胞因子(诸如白细胞介素)、T-辅助细胞表位、限制标记物、佐剂或不同微生物病原体(例如病毒、细菌、真菌或寄生虫)的蛋白质、尤其是能够引起保护性免疫应答的蛋白质。可能需要筛选编码辅因子、细胞因子(诸如白细胞介素)、T-辅助细胞表位、限制标记物、佐剂或不同微生物病原体(例如病毒、细菌或真菌)的蛋白质的的免疫原性部分的异源序列。其它类型的非-PPP1部分包括但不限于那些来自癌细胞或肿瘤细胞、过敏原、淀粉样肽、蛋白质或其它大分子成分的部分。
例如，在某些实施方案中，异源基因编码细胞因子(诸如白细胞介素-12)，选择它们用于改善所述重组蛋白质的预防或治疗特性。
这类癌细胞或肿瘤细胞的实例包括但不限于前列腺特异性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。
这类过敏原的实例包括但不限于美国专利US5,830,877和公开的国际专利申请WO 99/51259中所述的那些过敏原，将这些文献的内容引入本文作为参考，且所述的那些过敏原包括花粉、昆虫毒液、动物毛发皮屑、真菌孢子和药物(诸如青霉素)。这类成分干扰已知过敏反应原因的IgE抗体的产生。
淀粉样肽蛋白质(APP)与不同称作阿尔茨海默病、淀粉样变性或amyloidogenic病的疾病有关。β-淀粉样肽(也称作Aβ肽)是APP的42个氨基酸片段，它通过由β和γ分泌酶(secretase) 加工APP而产生且具有下列序列Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His GlnLys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile IleGly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO6)。
在某些患者中，淀粉样蛋白质的沉积采取了凝集Aβ肽的形式。令人意外的是，目前已经发现给予分离的Aβ肽在脊椎动物宿主体内诱导对淀粉样蛋白质沉积物中的Aβ肽成分的免疫应答(参见公开的国际专利申请WO 99/27944)。这类Aβ肽还与不相关部分连接。因此，本发明的异源核苷酸序列包括这种Aβ肽的表达，以及Aβ肽的片段和Aβ肽的抗体或其片段。一种这类Aβ肽的片段是具有下列序列的28个氨基酸的肽(如美国专利US 4,666,829中所公开的)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His GlnLys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(SEQ ID NO7)。
可以对所述的异源核苷酸序列进行筛选以便充分利用通过呼吸道进入体内且可以感染多种组织和细胞(例如脑膜、血液和肺)的肺炎球菌的正常感染途径。还可以将异源基因用于产生用于基因疗法或靶向特定细胞的介质。作为唯一利用肺炎球菌感染过程中接触的正常细胞的替代方法，异源基因或片段可以编码来自不同病原体的另一种蛋白质或氨基酸序列，其在用作所述重组蛋白质部分时使所述重组蛋白质定向于不处于正常感染途径中的细胞或组织。按照这种方式，所述蛋白质成为转运各种外源蛋白质的靶向工具。
可以使用本领域中所公知的任意方法测定蛋白质的分子量。方法的非限制性实例包括变性SDS-PAGE凝胶、大小排阻层析和等电聚焦。可以根据需要使用本领域中确定的方法确定适于各方法合适的条件(例如分离时间、电压、电流和缓冲液)。在一个优选的实施方案中，将变性SDS-PAGE用于测定所述蛋白质的分子量。另外，用于测定分子量的条件是优选在20 milli Amps和恒定电流下的1小时的分离时间。
可以使用本领域中的多种方法检测蛋白质。这些方法包括但不限于Western印迹、考马斯蓝染色、银染色、放射自显影、荧光和磷光探查。在本发明的一个优选实施方案中，通过Western印迹检测所述蛋白质。
除非另有说明，在下面描述本发明实施方案中的术语″肺防护蛋白质″、″PPP1″和″PPP″包括应用代替野生型PPP1或作为其添加物的的片段、变体及其减毒形式实施方案。
病毒和非病毒载体优选的载体、特别是在体外和体内细胞试验中的优选载体是病毒载体，诸如慢病毒、反转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、牛痘病毒、杆状病毒、α病毒和其它带有所需细胞向性的重组病毒。因此，可以使用病毒载体或通过直接导入DNA而体内、离体(exvivo)内或体外导入编码功能或突变蛋白质或其多肽结构域片段的基因。可以通过使转基因载体靶向至特定细胞，诸如使用病毒载体或受体配体，或通过使用组织特异性启动予，或通过这两种方式，在靶向组织中进行表达。靶向基因的转运在PCT申请WO 95/28494中描述。
常用于体内或离体靶向和治疗步骤的病毒载体是基于DNA的载体和反转录病毒载体。构建和使用病毒载体的方法在本领域中是公知的(例如Miller和Rosman，《生物技术》(BioTechniques)，1992，7980-990)。优选所述的病毒载体是复制缺陷型载体，即它们不能在靶细胞中自主复制。优选该复制缺陷型病毒是最小病毒，即它仅保留被囊基因组以产生病毒颗粒必不可少的其基因组的序列。
α病毒的实例包括但不限于东部马脑炎病毒(EEE)、Venezuelan马脑炎病毒(VEE)、沼泽地病毒(Everglades virus)、Mucambo病毒、Pixuna病毒、西部马脑炎病毒(WEE)、新培斯病毒(Sindbis virus)、Semliki Forest病毒、Middelburg病毒、Chikungunya病毒、O′nyong-nyong病毒、Ross River病毒、Barmah Forest病毒、Getah病毒、Sagiyama病毒、Bebaru病毒、Mayaro病毒、Una病毒、Aura病毒、Whataroa病毒、Babanki病毒、Kyzylagach病毒、Highlands J病毒、Fort Morgan病毒、Ndumu病毒和Buggy Creek病毒(美国专利US 6,156,558)。
DNA病毒载体包括减毒的或缺陷型DNA病毒，诸如但不限于单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、EB病毒(Epstein Barr Virus)(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)等。优选完全或基本上完全缺乏病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在导入细胞后并非是缺陷型的。应用缺陷型病毒载体可使对特定的、局限性区域中的细胞进行给药，而与该载体可以感染其它细胞不相关。因此，可以特异性靶向特定组织。特定载体的实例包括但不限于缺陷型1型疱疹病毒(HSV1)载体(Kaplitt等，《分子细胞神经科学》(Molec.Cell.Neurosci.)，1991，2320-330)；缺乏糖蛋白质L基因的缺陷型疱疹病毒载体或其它缺陷型疱疹病毒载体(PCT公开号WO 94/21807和WO 92/05263)；减毒的腺病毒载体，诸如Stratford-Perricaudet等所述的载体(《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)，1992，90626-630；另外参见La Salle等，《科学》(Science)，1993，259988-990)；和缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski等，《病毒学杂志》(J.Virol.)，1987，613096-3101；Samulski等，《病毒学杂志》(J.Virol.)，1989，633822-3828；Lebkowski等，《细胞分子生物学》(Mol.Cell.Biol.)，1988，83988-3996)。
多家公司生产了商品化的病毒载体，包括但不限于Avigen，Inc.(Alameda，CA；AAV载体)、Cell Genesys(Foster City，CA；反转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)、Clontech(反转录病毒和杆状病毒载体)、Genovo，Inc.(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV载体)、Genvec(腺病毒载体)、IntroGene(Leiden，Netherlands；腺病毒载体)、Molecular Medicine(反转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)、Norgen(腺病毒载体)、Oxford BioMedica(Oxford，United Kingdom；慢病毒载体)和Transgene(Strasbourg，France；腺病毒、牛痘、反转录病毒和慢病毒载体)。
腺病毒载体。腺病毒是可以被修饰以便将本发明的核酸有效转运至多种细胞类型的真核DNA病毒。存在腺病毒的不同血清型。在这些血清型中，优选在本发明范围内使用人腺病毒2型或5型(Ad 2或Ad 5)或动物来源的腺病毒(参见PCT公开号WO 94/26914)。可以在本发明范围内使用的这些动物来源的腺病毒包括犬、牛、鼠(例如Mavl，Beardetal.，《病毒学》(Virology)，1990，75-81)、羊、猪、鸟和猿(例如SAV)来源的腺病毒。优选动物来源的腺病毒是犬的腺病毒，更优选CAV2腺病毒(例如Manhattan或A26/61株系，例如ATCC VR800)。已经描述了多种复制缺陷型腺病毒和最小腺病毒载体(PCT公开号WO 94/26914、WO 95/02697、WO 94/28938、WO 94/28152、WO94/12649、WO 95/02697、WO 96/22378)。可以通过本领域技术人员所公知的任意技术制备本发明的复制缺陷型重组腺病毒(Levrero等，《基因》(Gene)，1991，101195；欧洲公开号EP 185 573；Graham，《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)，1984，32917；Graham等，《遗传病毒学杂志》(J.Gen.Virol.)，1977，3659)。使用本领域技术人员众所周知的标准分子生物学技术回收并纯化重组腺病毒。
腺伴随病毒。腺伴随病毒(AAV)是可以以稳定和位点特异性方式整合入它们所感染的细胞基因组的相对较小的DNA病毒。它们能够感染广泛细胞而不会诱导对细胞生长、形态或分化的任何作用，且看起来它们不涉及人体病理学。已经克隆、测序并性质鉴定了AAV基因组。已经描述了来源于AAVs的载体在体外和体内转移基因中的应用(参见PCT公开号WO 91/18088和WO 93/09239；美国专利US 4,797,368和5,139,941；欧洲公开号号EP 488 528)。可以通过共转染含有位于两个AAV末端反向重复(ITR)区侧翼的目的核酸序列的质粒和携带AAV包壳基因(rep和cap基因)的质粒进入感染了人辅助病毒(例如腺病毒)的细胞系来制备本发明的复制缺陷型重组AAVs。然后通过标准技术纯化产生的AAV重组体。
反转录病毒载体。在另一个实施方案中，例如可以如下列文献中所述将基因导入反转录病毒载体美国专利No.US5,399,346；Mann等，《细胞》(Cell)，1983，33153；美国专利No.US4,650,764和US4,980,289；Markowitz等，《病毒学杂志》(J.Virol.)，1988，621120；美国专利No.US5,124,263；欧洲公开号EP 453 242和EP178 220；Bernstein等，《英国遗传学》(Genet.Eng.)，1985，7235；McCormick，《生物技术》(BioTechnology)，1985，3689；PCT公开号WO95/07358；和Kuo等，《血液》(Blood)，1993，82845。这些反转录病毒是感染分裂细胞的整合病毒。该反转录病毒基因组包括两个LTR、包壳序列和三个编码区(gag、pol和env)。在重组反转录病毒载体中，gag、pol和env一般全部或部分缺失，且被目的异源核酸序列取代。可以由不同的反转录病毒类型构建这些载体，诸如HIV、MoMuLV(″莫洛尼鼠类白血病毒″MSV(″莫洛尼鼠类肉瘤病毒″)、HaSV(″Harvey肉瘤病毒″)；SNV(″脾坏死病毒″)；RSV(″劳斯肉瘤病毒″)和弗罗德病毒(Friend Uirus)。现有技术中已经描述了包装合适的细胞系，特别是细胞系PA317(美国专利No.US 4,861,719)；PsiCRIP细胞系(PCT公开号WO 90/02806)和GP+envAm-12细胞系(PCT公开号WO 89/07150)。此外，重组反转录病毒载体可以含有用于抑制转录活性的LTRs内的修饰以及可以包括部分gag基因的扩展包壳序列(Bender等，《病毒学杂志》(J.Virol.)，1987，611639)。通过本领域技术人员所公知的标准技术纯化重组反转录病毒载体。
可以构建起感染颗粒或进行单循环转染作用的反录病毒载体。在前一种情况中，修饰所述病毒以保留除产生致癌基因转化特性外的其全部基因，并表达异源基因。操作非感染性病毒载体以破坏病毒包装信号，但保留包装改造成含有异源基因和包装信号的共导入病毒所需的结构基因。因此，产生的病毒颗粒不能产生其它病毒。
还可以通过DNA病毒导入反转录病毒载体，这一过程允许一个反录病毒复制循环并增强转染效率(参见PCT公开号WO 95/22617、WO 95/26411、WO 96/39036和WO 97/19182)。
慢病毒载体。在另一个实施方案中，可以将慢病毒载体用作在几种组织类型中直接转运和连续表达转基因的介质，所述的组织类型包括大脑、视网膜、肌肉、肝脏和血液。这些载体可以在这些组织中有效转导分裂和未分裂的细胞，并维持目基因的长期表达。综述参见Naldini的《最新生物技术观点》(Curr.Opin.Biotechnol.)，1998，9457-63；另外参见Zufferey等，《病毒学杂志》(J.Virol.)，1998，729873-80)。慢病毒包装细胞系是已有的，且在本领域中是公知的。它们有利于用于基因疗法的高滴度慢病毒载体的产生。实例是可以至少3-4天高于106IU/ml的滴度产生病毒颗粒的四环素诱导型VSV-G假型慢病毒包装细胞系(Kafri等，J《病毒学杂志》(J.Virol.)1999，73576-584)。可以根据在体外和体内有效转导未分裂细胞的需要浓集由该诱导型细胞系产生的载体。
非病毒载体。在另一个实施方案中，可以作为裸DNA通过脂转染或使用其它转染促进剂(肽类、聚合物等)将所述载体导入体内。可以使用合成的阳离子型脂类制备用于编码标记物的基因体内转染的脂质体(Felgner等，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，1987，847413-7417；Felgner和Ringold，《科学》(Science)，1989，337387-388；参见Mackey等，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，1988，858027-8031；Ulmer等，《科学》(Science)，1993，2591745-1748)。用于转移核酸的有用的脂类化合物和组合物描述在PCT专利公开号WO 95/18863和WO 96/17823以及美国专利No.US5,459,127中。可以使脂类与靶向目的的其它分子进行化学偶联(参见Mackey等，文献同上)。可以使例如激素或神经递质这样的靶向肽类和诸如抗体这样的蛋白质或非肽分子与脂质体进行化学偶联。
其它分子也用于促进核酸的体内转染，诸如阳离子型寡肽(例如PCT专利公开号WO 95/21931)、来源于DNA结合蛋白质的肽类(例如PCT专利公开号WO 96/25508)或阳离子型聚合物(例如PCT专利公开号WO 95/21931)。
还能够将所述的载体作为裸DNA质粒导入体内。可以通过本领域中所公知的方法将用于基因疗法的裸DNA载体导入所需宿主细胞，例如电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、应用基因枪或应用DNA载体转运蛋白质(例如Wu等，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)，1992,267963-967；Wu和Wu，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)，1988,26314621-14624；加拿大专利申请No.2,012,311；Williams等，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1991，8827262730)。还可以使用受体介导的DNA转运手段(Curiel等，《人类基因疗法》(Hum.Gene Ther.)，1992，3147-154；Wu和Wu，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)，1987，2624429-4432)。美国专利No.US5,580,859和US5,589,466中公开了哺乳动物体内不含转染促进剂的外源DNA序列的转运。近来已经描述了称作电转移的相对低电压高效率的体内DNA转移技术(Mir等，C.P.Acad.Sci.，1988，321893；PCT公开号WO 99/01157；WO 99/01158；WO 99/01175).
试验系统本发明涉及用于评价调节PPP1与铁结合的免疫原性组合物和化合物的功能活性的任意细胞试验系统。在一个特定的实施方案中，可以将该试验用于鉴定与PPP1发生相互作用以减少本文所述的PPP1与铁结合的化合物。可以通过评价测试化合物对本文所述的蛋白质的相互作用的影响来评价它。还可以使用评价所述化合物引发抗肺炎链球菌的调理素吞噬(opsonophagocytic)抗体的能力的细胞试验系统(Gray，B.M.1990.《缀合疫苗增刊》(Conjugate Vaccines Supplement)p694-697)。
本发明涉及允许检测铁与PPP结合的任意便利方法。在本发明的一个优选实施方案中，可以在聚丙烯酰胺凝胶上分离肺炎链球菌的蛋白质成分，并将其转移到固体支持物上。然后用标记的相互作用成分(例如铁)探测该支持物。用本领域中公知的任意标记物标记该成分，包括但不限于放射性的、基于酶的、染料分子或荧光或磷光的标记物。在优选的实施方案中，所述的标记物是放射性标记物。可以通过本领域中公知的任意方式检测标记物。例如放射自显影、闪烁计数器或紫外光。在优选的实施方案中，通过放射自显影检测所述的放射性标记。由所述探针放大所述信号的试验也是公知的，诸如例如应用生物素和抗生物素蛋白质的那些试验和诸如ELISA试验这样的酶标记的免疫测定法。
体外筛选方法向通过本领域中已知方法制备的试验系统中加入候选物试剂并测定铁与PPP1之间的结合水平。可以将多种体外系统用于分析化合物对铁结合的作用。优选将每次实验进行一次以上，诸如例如以多种不同稀释度的化合物按一式三份进行实验。
本发明的筛选系统允许检测结合抑制剂。抑制剂的筛选包括当与调节这些蛋白质相互作用的化合物接触时检测铁与PPP1相互作用。如果检测到铁与PPP1的结合减少，那么该化合物是候选抑制剂。如果没有观察到减少，那么该化合物不会改变铁与本发明蛋白质的结合。
免疫原性组合物在本发明的其它实施方案中，将PPP1用于免疫原性组合物，该组合物包括(i)至少一种PPP1；(ii)至少一种药物上可接受的缓冲剂、稀释剂或载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。在一个优选的实施方案中，将所述的免疫原性组合物用作疫苗。所述的PPP1可以按照本领域中公知的方法以重组方式产生或分离自细菌制备物。优选这些组合物具有作为预防、防止和/或改善肺炎球菌感染的免疫原性组合物的治疗和预防应用。在这类应用中，使用免疫有效量的至少一种PPP1，以这类用量可在一般肺炎球菌感染过程中的使感染减轻、优选基本上减轻。可以将所述的蛋白质减毒。术语″减毒的″指的是维持其免疫原性活性，而一种或多种其它功能特征减少或缺失的蛋白质。例如该蛋白质的减毒形式可以表现出减少的结合特性，诸如其结合铁的能力降低。另一方面，该减毒形式可以降低肺炎链球菌与铁结合的能力。
本文所用的术语″有效量″指的是本文所述的免疫原成分(即PPP1)刺激免疫应答、即在导入受试者时导致抗体和/或细胞介导的应答产生的用量。在一个优选的实施方案中，所述的有效量会减少肺炎链球菌的定殖。术语″免疫原成分″指的是作为本发明免疫原性组合物全身给药时，这种成分刺激局部区域(例如鼻咽)中分泌抗体和/或细胞介导的应答产生的能力。
本文所用的术语″佐剂″指的是与所述免疫原性组合物一起给药时加强或刺激受试者体内免疫应答的试剂、化合物等。因此，正如通过本领域中公知的任意常规方法所测定的，由免疫原性组合物组合引发的免疫应答一般高于单一免疫原性组合物激发的免疫应答。
本发明的组合物可以包括佐剂，其包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝、StimulonTM QS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)、MPLTM(3-O-脱酰一磷酰脂A；Corixa，Seattle，Washington)、RC529(Corixa)和如PCT公开申请WO 98/50399中所述的氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(RIBI Immunochem Research)、IL-12(Cenetics Institute，Cambridge，MA)；N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-异谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰基-去-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称作去-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称作MTP-PE)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和霍乱毒素。可以使用的其它佐剂是霍乱毒素的无毒衍生物，包括其B亚单位(例如，其中29位氨基酸上的谷氨酸被另一种氨基酸、优选按照公开的国际专利申请WO 00/18434所述组氨酸取代)，和/或非PPP多肽类与霍乱毒素或其B亚单位、原霍乱类菌素(procholeragenoid)、真菌多糖类的缀合物或基因工程的融合体。可以使用所述佐剂的天然形式或可以使用佐剂的合成或半合成形式。可以使用该佐剂的任意制剂，这取决于所需的反应和给药方法。可以使用多种剂型的佐剂，例如液体、粉末或乳剂。
可以将所述的免疫原性组合物作为单一大剂量或作为一定时间期限内(例如一年)″系列″给药的方式进行给药。当在下一年给药时，这类系列给药称作″加强注射″。这些给药增加由以前给药产生的抗体水平。可以给予所述的免疫原性化合物，直到在受试者中鉴定了足够的抗体水平为止，从而在用免疫原攻击时诱导免疫应答。
这类免疫原性组合物的制剂对本领域技术人员而言是众所周知的。本发明的免疫原性组合物可以包括其它抗原成分(例如多肽或其片段或编码抗原或其片段的核酸)，且优选包括药物上可接受的载体。合适的药物上可接受的载体和/或稀释剂包括任意和全部的常用溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣材料、抗菌和抗真菌剂、等渗和延缓吸收剂等。术语″药物上可接受的载体″指的是不在所给药的患者体内产生过敏反应或其它不良作用的载体。合适的药物上可接受的载体包括例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。药物上可接受的载体可能进一步包括少量的增强抗原贮存期或功效的辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。这类用于药物活性物质的介质和试剂的应用在本领域中是众所周知的。除任意常用介质或试剂与所述活性组分不相容外，涉及它们在本发明免疫原性组合物中的应用。
组合物在本发明的其它实施方案中，将PPP1核酸序列、氨基酸序列、表达载体或宿主细胞用于组合物中，该组合物包括(i)至少一种PPP1蛋白质，或编码PPP1氨基酸序列的核酸，或表达这类核酸的表达载体或宿主细胞；和(ii)至少一种药物上可接受的缓冲剂、稀释剂或载体。所述的PPP1可以按照本领域中公知的方法以重组方式产生的或分离自细菌制备物。优选这些组合物具有治疗和预防应用。在这类应用中，使用药物有效量的至少一种PPP1，以这类用量可以产生确定的功能活性。本文所用的术语″有效量″指的是本文所述的PPP1蛋白质产生功能作用的用量。
可以通过任意常规有效形式给予这类组合物或免疫原性组合物，诸如通过鼻内、非肠道、口服或诸如使用气溶胶喷雾剂局部施用于粘膜表面(诸如鼻内、口腔、眼、肺、阴道或直肠表面)。优选的给药方式是非肠道或鼻内给药。
口服制剂包括例如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等通常使用的赋形剂。
可以将本发明的多核苷酸和多肽类作为免疫原性组合物中的唯一活性免疫原给药。然而，另一方面，所述的免疫原性组合物可以包括其它活性免疫原，包括来自其它病原体种类的其它免疫活性抗原。优选提供其它免疫活性抗原的病原体种类是细菌病原体，例如细菌感染中涉及的病原体。实际上，本发明PPP抗原的优选治疗应用是作为包括来自肺炎链球菌或其它病原体细菌的其它细菌抗原的多价疫苗成分。所述的其它免疫活性抗原可以是复制剂(replicating agent)或非复制剂。复制剂例如包括麻疹病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹(variscella)病毒(VZV)、副流感病毒(PIV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的减毒形式。
本发明的重要方面之一涉及诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，该方法包括对所述的哺乳动物提供本发明的免疫原性组合物的步骤。所述的免疫原性组合物是在所治疗的动物或人提内为免疫原性的组合物，使得这类组合物中含有的免疫有效量的多肽(类)产生对肺炎球菌感染的所需反应。优选的实施方案涉及人体内肺炎球菌感染的治疗方法，包括改善方法或预防方法，该方法包括对人给予免疫有效量的所述免疫原性组合物。剂量可以随个体的特定情况而改变。可以通过本领域技术人员所公知的方式在常规试验中确定这种用量。
当然，可以将本发明蛋白质的分离的氨基酸序列用于形成亚单位免疫原性组合物。还可以将它们用作增加多克隆抗体或单克隆抗体的抗原，并用于检测抗-PPP1蛋白质-反应抗体的免疫测定法中。本发明包括的免疫测定法包括但不限于美国专利No.US4,367,110(双单克隆抗体夹心式测定法)和美国专利No.US4,452,901(Western印迹)中所述的那些方法，将这些美国专利引入本文作为参考。其它测定法包括体外和体内进行的标记配体的免疫沉淀法和免疫细胞化学法。
诱导免疫应答的方法按照本发明，肺炎链球菌的定殖涉及PPP1蛋白质。本发明提供通过给予受试者治疗有效量的、在受试者体内诱导免疫应答的免疫原性组合物而预防肺炎球菌感染的方法。这些方法包括但不限于给予由至少一种PPP1蛋白质、其变体、其片段或其减毒形式或至少一种编码所述蛋白质、变体、其片段或其减毒形式的表达载体组成的免疫原性组合物。
抑制肺炎球菌感染的方法本发明进一步提供了通过给予受试者治疗有效量的阻断与PPP1蛋白质相关的功能作用的组合物或化合物诱导感染了肺炎球菌的受试者体内免疫应答的方法。这些方法包括但不限于给予由至少一种PPP1蛋白质或其片段或至少一种编码PPP1蛋白质的表达载体组成的组合物，或给予基本上全部阻断或至少部分阻断PPP1蛋白质功能的化合物。
诊断方法本发明还提供了肺炎球菌感染的诊断方法或已经给予的肺炎球菌免疫原性组合物的鉴定方法，该方法包括测定样品中存在的SEQ IDNO5或10-19任一种的氨基酸序列的步骤。可以使用任意常规的诊断方法。这些诊断方法易于基于存在的氨基酸序列或多肽。优选这类诊断方法适合于带有至少10个、且优选至少20个氨基酸的多肽，这些氨基酸对本发明的氨基酸序列而言是常用的。
可以将本文公开的核酸序列用于多种诊断应用。可以将这些核酸序列用于制备相对短的DNA和RNA序列，它们具有与编码PPP1蛋白质的核酸序列特异性杂交的能力。根据所选的诊断试验特异性的参数选择所需长度的核酸和探针。可以在诊断试验中使用探针用于检测指定样品中存在的病原体生物或在鉴定已经给予的肺炎球菌免疫原性组合物。就目前的高级重组表达技术而言，可以将核酸序列插入表达构建体以筛选相应的寡肽和多肽与存在抗体的反应性和产生诊断或治疗试剂的能力。合适的表达控制序列和宿主细胞/克隆载体组合在本领域中是众所周知的，且在Sambrook等(1989)中通过实例来描述。
在优选的实施方案中，用于杂交研究或试验的核酸序列包括与至少约10个、优选约15个、且更优选约20个核苷酸的一段核苷酸序列互补的序列。许多已知杂交技术和系统可用于实施本发明的杂交方面，包括诊断试验，诸如Falkow等的美国专利US4,358,535中所述的那些技术。优选识别或结合PPP1蛋白质上核酸序列的序列是连续的。
一般来说，预计本文所述的杂交探针可用作溶液杂交和使用固相的实施方案中的试剂。在涉及固相的实施方案中，使来自诸如渗出物、体液(例如中耳流出物、支气管肺泡灌洗液)乃至组织这样的可疑临床样品的测试DNA(或RNA)吸附或固定在选择的基质或表面上。然后使这种固定的单链核酸与选择的探针在所需条件下进行特异性杂交。所选择的条件取决于基于所需特定标准(例如取决于G+C含量、靶核酸的类型、核酸的来源、杂交探针的大小)的特定情况。在洗涤杂交表面以除去非特异性结合探针分子后，使用标记检测特异性杂交乃至对其进行定量。
编码本发明PPP1蛋白质的核酸序列或其变体可以与例如美国专利US4,603,102中所列的PCR*技术结合使用。可以将本发明的任意PPP1蛋白质序列的不同部分用作对确定的PPP1基因或核苷酸部分进行PCR*扩增的寡核苷酸探针，然后通过与含有互补序列的杂交探针进行杂交来检测该序列。在这种方式中，可以使用本发明的核酸序列在样品中检测到极小浓度的PPP1核酸序列。
下面的实施例用于解释本发明的某些实施方案。然而，本领域技术人员应理解可以根据本说明书的公开内容对所公开的特定实施方案进行改变，且仍然可以获得相似或类似的结果，而不会脱离本发明的实质和范围。
抗体本发明描述了可以用于检测样品中存在的PPP1蛋白质的抗体。另外，该抗体(例如抗独特型抗体)可用于抑制对肺炎球菌感染的免疫应答。
按照本发明，以重组方式或通过化学合成生产的PPP1蛋白质多肽和片段或其它衍生物可用作免疫原以产生识别多肽或其部分的抗体。可以特别选择用作免疫原的多肽部分以调节所开发抗体的免疫原性。这类抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。对人PPP1蛋白质特异的抗体可以识别PPP1蛋白质的野生型或突变体形式。在特定的实施方案中，该抗体由至少8个氨基酸、优选8-10个氨基酸、且更优选15-30个氨基酸组成。优选识别或结合PPP1上的氨基酸的抗体是连续的。
本领域中公知的多种方法可用于产生对多肽、衍生物或类似物的多克隆抗体。为了产生抗体，可以通过注射所述多肽或衍生物(例如片段或融合蛋白质)来对包括但不限于家兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等的多种宿主动物进行免疫接种。可以将所述多肽或其片段与免疫原性载体(例如牛血清清蛋白质(BSA)或匙孔血蓝蛋白质(KLH))缀合。多种佐剂可用于增加免疫应答，这取决于宿主的种类，包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂，矿物凝胶，诸如氢氧化铝，表面活性物质，诸如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、KLH、二硝基苯酚，和可能使用的人佐剂，诸如BCG(卡介苗)和小棒杆菌通过可以使用连续培养的细胞系提供抗体分子产生的任意技术制备定针对PPP1蛋白质、其片段、其类似物或其衍生物的单克隆抗体。这些技术包括但不限于最初由Kohler和Milstein(《自然》(Nature)256495-497，1975)开发的杂交瘤技术以及三倍体瘤(trioma)技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等《今日免疫学》(Immunology Today)472，1983；Cote等，《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)802026-2030，1983)和用于产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，在《单克隆抗体与癌症疗法》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中所述，Alan R.Liss，Inc.，77-96页，1985)。可以通过对多肽特异的非人抗体分子的基因以及来自具有适宜生物活性的人抗体分子的基因进行剪接来生产″嵌合抗体″(Morrison等，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)159870，1984；Neuberger等，《自然》(Nature)312604-608，1984；Takeda等，《自然》(Nature)314452-454，1985)。
在抗体的生产与应用中，可以通过本领域中所公知的技术来对所需抗体进行筛选或使用所需抗体进行检测，例如放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、″夹心式″免疫测定、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀素反应(gel diffusion precipitin reactions)、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、Western印迹、沉淀反应、凝集试验(例如凝胶凝集试验、血细胞凝集试验)、补体结合试验、免疫荧光试验、蛋白质A测定和免疫凝胶电泳测定等。
上述抗体可用于本领域中所公知的涉及多肽定位和活性的方法中，用于Western印迹、原位多肽成象、使用上述或本领域中公知的任意检测技术测定其在适宜生理样品中的水平等。还可以将这类抗体用于例如美国专利No.US5,679,582中所述的配体结合试验中。抗体结合一般最易于在生理条件下发生，例如pH约为7-8和生理离子强度。缓冲溶液中存在的载体蛋白质稳定所述试验。尽管存在对最佳条件干扰的一定程度的耐受性，例如增加或降低离子强度、温度或pH或添加洗涤剂或离液序列高的盐，但是这类干扰会降低结合稳定性。
在特定的实施方案中，可以产生激动(agonize)PPP1蛋白质活性的抗体。特别可以将胞内单链Fv抗体用于调节PPP1蛋白质。可以使用下述用于鉴定配体的试验检测这类抗体。
在另一个特定的实施方案中，本发明的抗体是抗独特型抗体。这些抗体识别和结合存在于该系统中的其它抗体。所述的抗独特型抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体。
在另一个特定的实施方案中，本发明的抗体与第二种成分缀合，诸如例如小分子、多肽或多核苷酸。可以通过对所述抗体进行化学修饰来产生这种缀合，其使所述抗体缀合至第二种成分。缀合的抗体使第二种成分(诸如抗生素)靶向至所目的部位。所述的第二种成分可以是任意大小或长度。在特定的实施方案中，所述的第二种成分是药物活性化合物。
本发明的另一个方面涉及如上文所述的抗体在靶向药物化合物中的应用。在该实施方案中，将PPP1蛋白质的抗体用于使特定的化合物达到受感染的部位。这些化合物，优选抗生素试剂，当与抗体缀合时称作靶向化合物或靶向剂。用于产生这类靶向化合物和靶向试剂的方法在本领域中是公知的。有关靶向化合物及其制备方法的典型公开内容如美国专利No.US5,053,934、US5,773,001和US6,015,562中所列。
实施例材料和方法细菌菌株和质粒用于本工作的质粒肺炎链球菌菌株是肺炎链球菌CP1200，一种获自Yale University，CT.的Margaret Hostetter的R36A的非被囊的、可高度转化的衍生物、一种D39的粗变体、2型毒性株(Morrison，D.A.等，《细菌学杂志》(J.Bacteriology)，1983，156281)且使获自ATCC.肺炎链球菌的肺炎链球菌菌株49136在37℃和充气环境下，在含有0.5％酵母提取物(Difco)的Todd Hewitt培养基(Difco Lab.，Detroit，MI)上或Tryptic Soy(Difco)血琼脂平板上生长至对数期(在600nm下O.D.约为0.6-0.8)。在本研究中使用的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株是BL21(DE3)、BLR(DE3)(Novagen，Madison，WI)、ToplOF′(Invitrogen，San Diego，CA)，使它们在37℃下和充气环境中在含有适宜抗生素的SOB培养基(15)中生长。用于本工作的质粒是PCR2.1 TOPO(Invitrogen)和pET28a(Novagen)。如果进行特别指定，那么使用20μg/ml的氯霉素、100μg/ml的氨苄青霉素、100μg/ml的链霉素和25μg/ml的卡那霉素。限制酶商购自New England Biolabs(Beverly，MA)，且按照生产说明书使用。
肺炎链球菌外膜级分中表面相关蛋白质的鉴定表面相关成分的提取-使细菌在4升的Todd Hewitt肉汤中生长，并通过8000xg离心30分钟来收集。借助于吸管使沉淀悬浮于～175ml的PBS中，并立即以20000xg离心30分钟。使洗涤物通过0.45m滤膜(Nalgene，Rochester，NY)过滤、透析并冻干。
表面相关蛋白质成分的离子交换层析-将肺炎链球菌的PBS提取物溶于pH7.6的Tris-HCl(10mM，100ml)中，并在DEAE-琼脂糖CL-6B柱上进行离子交换层析。在用样品缓冲液洗涤该柱后，首先用200mM pH 7.6的Iris-HCl洗脱，随后用NaCl终浓度为0.75M的(200mM pH 7.6的Tris-HCl中)线性NaCl梯度洗脱300ml以上。通过SDS-PAGE凝胶分析柱级分。收集含有主要量的约18-20kDa的表面相关蛋白质的级分、通过Centricon SR3浓缩器脱盐并冻干。通过PVDF印迹切除进行N-末端氨基酸序列分析将样品稀释至1mg/mL总蛋白质，并与2X Tris-SDS-β-ME样品加样缓冲液(0.25M Tris-HCl pH6.8、2％SDS、10％β-巯基乙醇、30％甘油、0.01％溴酚蓝)(Owl Separation，Portsmouth，NH)按1∶1合并，并在100℃下加热5分钟。在12个10cm×10cm×1mm的10-20％梯度丙烯酰胺/双-丙烯酰胺凝胶(Zaxis，Hudson，OH)的泳道上的10个泳道中的每一个中均加有约10μg的样品总蛋白质(20μL的热溶液)。在凝胶每侧的最外侧泳道上加有分子量标记(Novex，San Diego，CA)。在Owl Separations Mini-Gel rig上，在Bio-Rad Tris-Glycine-SDS运行缓冲液中以50mA的恒定安培数进行凝胶电泳1小时。然后用去离子水冲洗该凝胶，并使用Owl Separations提供的半干印迹系统以150mA的恒定安培数1小时将其转移至Millipore Immobilon-P PVDF(聚氟乙烯)上。用Amino Black(10％乙酸、0.1％胺黑的去离子水溶液)染色所得印迹，并在10％乙酸中脱色。然后使用甲醇清洁的柳叶刀或小型-Exacto刀从10个泳道上切下蛋白质带，并将其置于AppliedBiosystems 477A蛋白质测序仪(Foster City，CA)的反应筒中。然后在最佳印迹条件下使N-末端测序仪运转12或12个循环以上(1个循环为空白、1个循环为标准物，且10个或10个以上循环为所需残基的鉴定)。在Applied Biosystems 120A PTH分析仪上进行PTH-氨基酸检测。在类似物图记录仪上并通过工具软件以数字方式采集循环。通过将类似物和数字数据与一组标准PTH-氨基酸及其分析仪上相应的保留时间进行比较来进行末端氨基酸定位(在转化过程中半胱氨酸残基受到破坏，且未检测到)。
重组20kDa表面相关蛋白质的亚克隆和表达使用Altschul(Altschul，SF等，《分子生物学杂志》(J.Mol-Biol.)，1990，215403)开发的BLAST算法将N-末端序列与位于www.ncbi.nlm.org上的NCBI非丰余数据库进行比较。它表明该N-末端序列与NCBI数据库中的开放阅读框架(ORF)具有同一性。预先已经对该ORF进行了测序并列为未鉴定的ORF(Pikis，A.等，《感染性疾病杂志》(J.Infect.Dis.)，1998，178700)。对The Institute for Genomic Research(TIGR，www.tigr.org)公开的肺炎链球菌基因组(血清型4)的未知ORF的后续BLAST分析表明该基因组中存在ORF、但也没有得到鉴定。使用DNASTAR(Madison，WI)Lasergene DNA和蛋白质分析软件对肺炎链球菌基因组序列和引物设计中未知的ORF进行DNA分析。
设计位于所述ORF侧翼的引物(SED ID NOs1和2)，且随后使用ABI 380A DNA合成仪进行合成。为了有利于将PCR产物亚克隆入pET28a表达载体，将限制位点设计入PCR引物。在5′引物中包括Ncol位点，其使在所述表达载体的Ncol位点连接，且还包括ATG起始密码子。为了维持正确的读框，在该5′引物中包括两个额外的碱基，从而使得添加了亮氨酸的密码子。在3′引物中包括Sall位点。
由CP1200产生预计大小的PCR片段，将其连入pCR2.1载体并用于转化OneShot Top 10F′细胞(Invitrogen)。通过对经碱裂解(Birnboim，H.C.和Duly，J.，《核酸研究》(Nuc.Acid Res.)，1978 71513)制备的质粒DNA进行限制消化来筛选氨苄青霉素抗性转化体。鉴定了含有20kDa基因的重组质粒。使用由销售商提供的基于Prism方案的Applied Biosystems Prism Dye Terminator循环-测序核心试剂盒从所述克隆中获得DNA序列。将约1ug的模板DNA和100ng的引物用于每一循环反应。在GeneAmp PCR Systems 2400设备上使反应循环进行、使用Prism法纯化，并在ABI 373A DNA测序仪(AppliedBiosystems)上进行分析。
通过用Ncol和Sau限制性消化来切下含有r20kDa基因的插入物，并在1.5％琼脂糖凝胶上分离。从该凝胶上切下DNA片段，并使用Bio101旋转Spin盒(Vista，CA)使其从琼脂糖中纯化出来。将插入物与也用Ncol和Sall消化的质粒载体DNA(pET28a)连接，且随后转化入rop10F′细胞(Invitrogen)。通过对经碱裂解(Birnboim，H.C.和Duly，J.，《核酸研究》(Nuc.Acid Res.)，1978 71513)制备的质粒DNA进行限制消化来筛选卡那霉素抗性转化体。随后将重组质粒转化入BL21细胞(Novagen)以生成pLP533，并在补充了30ug/ml卡那霉素的SOB培养基中生长。使细胞生长至O.D.600为0.6，且随后用0.4mM IPTG(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)诱导2-4小时。制备完整细胞裂解物，并使其在15％SDS-PAGE凝胶上电泳(Laemmli，U.K.，《自然》(Nature)，1970，227680)以证实目的重组产物的表达。
重组20kDa表面相关蛋白质的纯化将大肠杆菌pLP533冷冻培养物的刮取物接种于含有补充了30μg/mL卡那霉素(Sigma，St.Louis，MO)的50mL SOB培养基的250mL烧瓶。将该培养物在37℃下以200rpm振摇保温约16小时。随后在含有SOB+30ug/ml卡那霉素的两个1升烧瓶接种20mL过夜培养物，并在37℃下以200rpm振摇保温。当该培养物达到OD6000.7-0.8的光密度时，加入达0.8mM的IPTG(Gold Biotechnology，St.Louis，MO)。将该培养物在相同温度下再振摇保温3小时。然后通过以7300xg离心15分钟收集细胞。在-20℃下冷冻细胞沉淀，然后融化并重新悬浮于300mL、pH 6.0的10mM磷酸钠(J.T.Baker，Phillipsburg，PA)中。随后使细胞混悬液通过微量流化床装置(microfluidizer)(Microfluidics Corporation，Newton，MA)以便裂解该细胞。以16,000xg将裂解物离心15分钟，且然后以200,000xg将所得上清液离心45分钟。通过SDS-PAGE检测每一步骤中的上清液和沉淀。将上清液在pH 6.0的10mM磷酸钠中稀释至500mL。然后用100,000MW截止膜(Millipore，Bedford，MA)对1L相同缓冲液对该溶液进行渗滤并浓缩2.5倍。使保留物中的蛋白质上样陶瓷羟基磷灰石柱(Bio-RadLaboratories Hercules，CA)。然后用10个柱体积(CV)的加样缓冲液洗涤该柱。通过用10CV的108mM、pH 6.0的磷酸钠洗涤该柱而除去污染的蛋白质。用10CV的pH 6.0的108mM-500mM磷酸钠的线性梯度从该柱上洗脱下蛋白质。在10％-20％SDS-PAGE凝胶(Zaxis，Hudson，OH)上分离峰值级分。收集含有所述蛋白质的级分并在-20℃下储存。通过SDS-PAGE分析该蛋白质的均一性，并通过Lowry的方法(Lowry，O.H.等，S.Biol.Chem.，1951，198265)来测定纯化过程中的蛋白质浓度。使用获自Pierce Chemicals(Northbrook，IL)的BCA试剂盒，并按照制造商的说明使用测定免疫接种前的蛋白质浓度。将BSA用作蛋白质标准品。
用于Western印迹分析的多克隆抗血清将重组蛋白质用于在小鼠体内产生多克隆抗血清。简单地说，将10ug的r20kDa蛋白质的每一剂量佐以弗氏不完全佐剂而成为乳剂(IFA)(1∶1v/v)，并经皮下注入6-8周龄的瑞士Webster小鼠。给该小鼠取血，并在0周时接种疫苗、在4周时加强注射，然后在6周时放血。给10只小鼠免疫接种以IFA为佐剂的r20kDa蛋白质。采集血清并用于进一步的分析。
SDS-PAGE和Western印迹通过在微型离心机中基于OD600将等数量的肺炎球菌细胞离心30秒来制备完整细胞裂解物。将肺炎球菌细胞沉淀重新悬浮于适宜体积的加样缓冲液。如果指定了样品，那么将样品煮沸5分钟并使用Laemmli法(Laemmli，《自然》(Nature)，1970；227680)在10％SDS-PAGE凝胶上分离。使用Biorad Mini Transblot cell(Biorad)将样品转至硝化纤维上(BioRad，Hercules，CA)，并在室温下在5％脱脂奶粉-PBS(BLOTTO)中封闭印迹30分钟。按1∶1000在BLOTTO中稀释60分钟使用采集的小鼠抗血清，随后在PBS-0.2％Tween80中洗涤25分钟。将与碱性磷酸酶(Biosource International，Camarillo，CA)缀合的山羊抗-小鼠IgG+M用于检测按1∶1000在BLOTTO中稀释的结合抗体。如上所述洗涤印迹，并用来自BioRad的NBT和BCIP、按照制造商的说明进行检测。
攻击前对小鼠进行的鼻内免疫接种6周龄的不含病原体的Balb/c小鼠商购自Jackson Laboratories(Bar Harbor，Maine)，并在标准温度、湿度和光照条件下使它们养在笼中。给BALB/C小鼠(每组10只动物)免疫接种5μg的r20kDag蛋白质。在第0、2和4周，每次接种时，将用0.1μg的CT-E29H即酶活性和毒性降低的遗传修饰的霍乱毒素配制的5μg r20kDa(Tebbey，P.W.等，《疫苗》(Vaccine)，2000，182723)缓慢滴注入每只小鼠的鼻孔、体积为10μl。将免疫接种匙孔血蓝蛋白质(KLH)-CT-E29H的小鼠用作对照组。在最后免疫接种后的4天采集血清样品。
小鼠鼻内攻击模型在第4周的第6天用1×105CFU′s的血清型3链霉素抗性肺炎链球菌攻击Balb/c小鼠。将肺炎球菌接种入含有100μg/ml链霉素的3ml的Todd-Hewitt肉汤。在37℃下将使该培养物生长至中对数期，然后用Todd-Hewitt肉汤稀释至所需浓度，并在冰上储存至应用。用盐酸氯胺酮(Fort Dodge Laboratory，Ft.Dodge，Iowa)经腹膜内(i.p.)注射麻醉每只小鼠。将细菌混悬液接种入麻醉小鼠鼻孔(10μl/小鼠)。通过平板计数证实给予细菌的实际剂量。攻击后4天处死小鼠，摘除鼻，并使用组织匀浆器(Ultra-Turax T25，Janke &Kunkel Ika-Labortechnik，Staufen，Germany)在3-ml无菌盐水中匀化。将匀化物在盐水中依次稀释10倍，并铺板在含有链霉素的TSA平板上。另外将来自每只小鼠的攻击后2天采集的50ul血液铺板在相同类型的平板上。在37℃下保温平板过夜，且然后对菌落进行计数。
r20kDa蛋白质的ELISA测定通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定对r20kDa蛋白质的抗体滴度。使用r20kDa(100ul/孔5ug/ml PBS储备溶液，pH7.1)进行ELISAs以包被Nunc-Immuno′PolySorp平板。在4℃下将平板包被过夜。在室温下用含有5％脱脂奶粉的200ul PBS(封闭缓冲液)封闭1小时后，在室温下将该平板与在封闭缓冲液中稀释的测试血清的连续稀释液一起保温1.5小时。然后在室温下用含有0.1％Tween的PBS(PBS-T)将该平板洗涤5次，并与生物素化的山羊抗小鼠IgG或IgA(按1∶8000或1∶4000稀释入PBS；Brookwood Biomedical，Birmingham，AL)一起室温保温1小时。在用PBS-T再洗涤5次后，在室温下将平板与链霉抗生物素缀合的辣根过氧化物酶(按1∶10,000稀释入PBS；ZymedLaboratory Inc.，San Francisco，CA)一起保温1小时。接着用PBS-T将该平板洗涤5次、与100μl的ABTS底物(KPL，Gaithersburg，MD)一起保温20分钟，随后添加100μl的终止溶液(1％SDS)。使用VERSAmax小平板读出器(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)在405nm下读取吸收度值。测试血清的终点滴度是在OD405下读数为0.1的最高稀释平均值的倒数。通过在含有除血清外的全部试剂的孔上在405nm下读取吸收度值对测试血清的平均背景滴度进行定量。统计学方法.使用Tukey-Kramer检验(Ludbrook，J.，《临床实验药理学和生理学》(Clin Exp Pharmacol Physiol.)，1998，251032)对各组进行鼻部定殖比较。将p＜0.05的结果看作具有统计学显著性。
PPP1的序列异质性为了检验PPP1蛋白质的序列异质性，比较10种不同的血清型中基因的核苷酸序列。由肺炎链球菌的每种血清型的过夜培养物制备基因组DNA。通过在4℃下以1000xg离心15分钟来采集细胞，并将其重新悬浮于2ml TE缓冲液中。通过将SDS加至0.3％，并将蛋白质酶K(Sigma)加至10μg/ml来裂解细胞。在55℃下将细胞保温过夜。通过添加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(通过合并24∶1的氯仿/异戊醇的混合物与等体积的水饱和的苯酚制备)而从澄清的裂解物中提取蛋白质。通过在室温下以7500xg离心10分钟来分离各相，然后将水相移至新管中。重复该步骤，然后通过添加10.4M NH4Ac至20％和2.5个体积的乙醇而使DNA从水相中沉淀出来。使用玻璃棒缠绕基因组DNA并使其重新悬浮于200μl TE缓冲液中。使用由销售商提供的基于Prism方案的App1ied Biosystems Prism Dye Terminator循环-测序核心试剂盒从血清型1、3、4、5、6、7、9、14、18、23F和CP1200的基因组DNA中测序PPP1的基因。将约1ug的模板DNA和100ng的引物用于每一循环反应。在GeneAmp PCR Systems 2400设备上循环反应、使用Prism法纯化，并在ABI 373A DNA测序仪(AppliedBiosystems)上进行分析。使用Clustal W算法在来自DNAstar的DNALasergene包的Megalign应用中对核苷酸序列及其推定的氨基酸序列进行序列比对。
对体内表达的PPP1信息的评价由体外生长细胞制备RNA在37℃下和5％CO2中使多种肺炎链球菌血清型在60mlTHB-0.5％YE中生长至对数期(O.D.550约0.3)。在4℃下通过以1000xg离心15分钟来收集细胞。抽吸上清液，且此后将细胞重新悬浮于1mlRNA酶(Ambion，CA)中，并在4℃下储存＞1小时。然后在微量离心机中以8000xg离心细胞。抽吸上清液，并将细胞重新悬浮于100ul10％脱氧胆酸(DOC)中。随后加入1100μl的RNAZOL B(Tel-Test，Inc)，并通过翻转使混悬液简单混合。然后加入120μl的CHCl3，通过翻转混合样品且然后在4℃下的微量离心机中以全速离心10分钟。取出水层，并通过添加等体积的2-丙醇使RNA沉淀。在4℃下保温RNA＞l小时，且然后在室温下的微量离心机中以全速离心10分钟。抽吸上清液，并用75％乙醇洗涤RNA，且再离心5分钟。抽吸上清液，并将RNA重新悬浮于50-100ul不含核酸酶的水中。在37℃下通过用不含RNA酶的DNA酶(DNA FREE，Ambion)将样品处理20分钟而从RNA中除去DNA，随后通过添加DNA FREE螯合物使酶失活。通过测定260和280nm下的吸收度来估计RNA的纯度和产率。
由体内生长细胞制备RNA如上所述制备对数期的肺炎链球菌细胞并将其在补充了0.4％葡萄糖的RPMI培养基(Celltech)中重悬至106cfu/ml。用具有80,000MW截止值的PVDF透析膜(SprectraPor)密封1ml的细胞混悬液。将两个这类包经腹膜内植入400g Sprague Dawley大鼠。使这些包保留在大鼠体内22小时，此后处死大鼠并收集所述包。如上所述由腹膜内生长的细胞制备RNA。
RT-PCR检验体内PPP1信息使用RT-PCR由体外和体内生长的细胞制备的RNA扩增出PPP1基因信息。将相当于该基因3′端的反向PCR引物用于在下列反应中产生ds cDNA。在75℃下将1μg RNA与0.25uM的反向引物GGG GTCGAC TAA ACC AGG TGC TTG TCC AAG TTC(SEQ ID NO8)一起保温3分钟，然后冷却至44℃。使用RETROscript(Ambion)试剂盒、按照制造商的说明对该信息进行反转录。按照制造商的说明使用ReddyMix(ABgene)扩增来自2-5μl样品的PPP1信息，其中使用0.25uM的上述反向引物和正向引物GGG GCC ATG GCT GTA GAATTG AAA AAA GAA(SEQ ID NO9).在2％琼脂糖凝胶上对10μl扩增产物进行电泳。
结果20kDa表面相关蛋白质的鉴定-用PBS洗涤和离子交换层析鉴定20kDa肺炎链球菌的表面相关成分(附图1)。附图1中的泳道2-9代表来自DEAE柱的级分#8-16。显然存在15-20kDa的主要蛋白质带。在制备型SDS-PAGE凝胶上分离低分子量带，并转至PVDF膜。该PVDF膜具有高结合能力，其增加样品回收和测序特性，从而能对氨基末端残基进行有效测定。该蛋白质的氨基末端序列(SEQ ID NO3)可鉴定肺炎链球菌基因组(SEQ ID NOs4和5)中的相应开放阅读框架。该ORF表现出与其它生物体内的非血红素的含铁铁蛋白质类似的相似性，这可以表明肺炎链球菌中的相似功能(Pikis，A.等，《感染性疾病杂志》(J.Infectious Diseases)，1998，178700)。然而，肺炎链球菌中蛋白质的实际功能和细胞定位是未知的。这种ORF的亚克隆和表达提供预计大小的重组物质(附图2)。
重组20kDa表面相关蛋白质的纯化。重组蛋白质的溶解性有助于纯化。通过连续离心从细胞膜中进行明显的纯化。此外，可以将形成寡聚体的特征成功地用于通过渗滤除去剩余的低分子量污染蛋白质。在中性pH下推定的蛋白质电荷使得该蛋白质在羟基磷灰石柱上的纯化达到90％以上的均一性，如附图5所示。
抗-r20kDa表面相关蛋白质血清的反应性。在瑞士Webster小鼠中产生对重组20kDa表面相关蛋白质的多克隆抗血清，以评价菌株中蛋白质的抗原保守性。r20kDa蛋白质的抗血清与在未加热的天然种类的完整细胞裂解物中约20、40和80kDa的蛋白质反应(附图3)，而在加热样品中观察到的主要反应种类在约20kDa(未显示)。这些结果提示这种蛋白质是4亚单位或4以上亚单位的复合物的组成部分。
鼻内攻击。为了测定鼻内免疫接种r20kDa表面相关蛋白质是否可以诱导血清免疫应答，使用CT-E29H(0.1μg/剂量)作为粘膜佐剂用5ugr20kDa对Balb/c小鼠以双周间隔给药3次。在抗原特异性ELISA测定中测试最后一次加强免疫接种后4天采集的免疫血清。在最后一次加强免疫接种后4天时，在免疫接种r20kDa-E29H的小鼠体内产生了强抗原特异性IgG和IgA抗体反应(表6)。当与无关蛋白质KLH比较时，免疫接种r20kDa表面相关蛋白质能够显著减少3型肺炎链球菌在BALB/C小鼠鼻咽中的定殖(附图4)。结果与3型缀合物减少同源血清型定殖的能力相当(Henrikson，J等《乙醇临床实验研究》(AlcoholClin Exp Res)，1997，211630)。
来自肺炎链球菌的r20kDa表面相关蛋白质的抗原特异性ELISA滴度。
注意根据5BALB/c小鼠混合物测定终点滴度来自10个血清型的PPP1蛋白质的序列比对。正如附图6中所示，PPP1的序列在血清型中高度保守。正如可以观察到的，血清型9是最趋异的血清型。分离自该血清型的PP1与大部分血清型有15个氨基酸的不同。剩余的血清型表现出5个氨基酸以下的差异。PPP1的全部共有序列如附图6中所示(SEQ ID NO20)。
RNA扩增。在体外和体内样品中均观察到了预计大小的分离带(附图7)。通过与λDNA的Hae III限制片段比较估计该产物的大小是全长的。
***将本文所述的专利、申请、测试方法和公开文献的全部内容引入本文作为参考。
对本领域技术人员而言可以根据上述详细描述提示出本发明的许多变化形式。所有这类显而易见的变化形式属于所附权利要求中的全部指定范围。
序列表<110>American Home Products CorporationGreen，BruceMasi，Amy<120>来自肺炎链球菌的重组保护蛋白<130>0630/2H814<140>TBA<141>与此同时<150>US 60/258,841<151>2000-12-28<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’引物<400>1ggggccatgg tctttccagt ttggtcaaaa 30<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3’引物<400>2ggggtcgact tataaaccag gtgcttgtcc aagttc36
<210>3<211>20<212>PRT<213>肺炎链球菌<400>3Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu Thr Lys1 5 10 15Ala Ala Pro Val20<210>4<211>537<212>DNA<213>肺炎链球菌<400>4atgaatgagg taaagaaaat ggtagaattg aaaaaagaag cagtaaaaga cgtaacatca60ttgacaaaag cagcgccagt agcattggca aaaacaaagg aagtcttgaa ccaagctgtt120gctgatttgt atgtagctca cgttgctttg caccaagtgc actggtatat gcatggtcgt180ggtttccttg tatggcatcc aaaaatggat gagtacatgg aagctcttga cggtcaattg240gatgaaatca gtgaacgctt gattacactc ggtggaagcc cattctctac attgacagag300ttccttcaaa atagtgaaat cgaagaagaa gctggtgaat accgtaatgt tgaagaaagc360ttggaacgtg ttcttgttat ctaccgttac ttgtcagaac ttttccaaaa aggtttggat420gtcactgatg aagaaggtga cgatgtgaca aacggtatct ttgcaggcgc taaaactgaa480acagataaaa caatttggat gcttgcagcc gaacttggac aagcacctgg tttgtaa 537<210>5<211>178<212>PRT<213>肺炎链球菌
<400>5Met Asn Glu Val Lys Lys Met Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys1 5 10 15Asp Val Thr Ser Leu Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr20 25 30Lys Glu Val Leu Asn Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val35 40 45Ala Leu His Gln Val His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val50 55 60Trp His Pro Lys Met Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu65 70 75 80Asp Glu Ile Ser Glu Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser85 90 95Thr Leu Thr Glu Phe Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly100 105 110Glu Tyr Arg Asn Val Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr115 120 125Arg Tyr Leu Ser Glu Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu130 135 140Glu Gly Asp Asp Val Thr Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu145 150 155 160Thr Asp Lys Thr Ile Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro165 170 175
Gly Leu<210>6<211>42<212>PRT<213>人类<400>6Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>7<211>28<212>PRT<213>人类<400>7Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 25<210>8<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>8ggggtcgact aaaccaggtg cttgtccaag ttc 33<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>9ggggccatgg ctgtagaatt gaaaaaagaa 30<210>10<211>176<212>PRT<213>肺炎链球菌<400>10Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu1 5 10 15Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn20 25 30Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val35 40 45His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met50 55 60Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu65 70 75 80
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Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val35 40 45His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met50 55 60Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu65 70 75 80Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe85 90 95Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val100 105 110Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu115 120 125Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val130 135 140Thr Asn Gly Ile Phe Glu Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile145 150 155 160Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro165 170 175<210>13<211>175<212>PRT<213>肺炎链球菌<400>13Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu Thr1 5 10 15
Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn Gln20 25 30Ala Val Ala Asp Leu His Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val His35 40 45Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met Asp50 55 60Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Thr Ser Glu Arg65 70 75 80Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe Leu85 90 95Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val Glu100 105 110Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu Leu115 120 125Phe Gln Lys Asp Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val Thr130 135 140Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile Trp145 150 155 160Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro165 170 175<210>14<211>176<212>PRT
<213>肺炎链球菌<400>14Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu1 5 10 15Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn20 25 30Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val35 40 45His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met50 55 60Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu65 70 75 80Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe85 90 95Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val100 105 110Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu115 120 125Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val130 135 140Thr Asn Asp Ile Phe Val Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile145 150 155 160Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro
165 170 175<210>15<211>176<212>PRT<213>肺炎链球菌<400>15Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu1 5 10 15Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn20 25 30Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val35 40 45His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met50 55 60Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu65 70 75 80Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe85 90 95Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val100 105 110Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu115 120 125Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val130 135 140
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65 70 75 80Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe85 90 95Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val100 105 110Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu115 120 125Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val130 135 140Thr Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile145 150 155 160Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro165 170 175<210>19<211>176<212>PRT<213>肺炎链球菌<400>19Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Ala Lys Asp Val Ala Arg Leu1 5 10 15Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn20 25 30Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val35 40 45
His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met50 55 60Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly His Leu Asp Glu Ile Ser Glu65 70 75 80Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe85 90 95Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val100 105 110Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Ala Ile Tyr Arg Tyr Leu Ile Thr115 120 125Leu Phe Gln Lys Ala Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val130 135 140Thr Asn Asp Ile Phe Val Gly Ala Lys Ala Glu Leu Glu Lys Thr Val145 150 155 160Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro165 170 175<210>20<211>176<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>共有序列<400>20Met Ala Val Glu Leu Lys Lys Glu Ala Val Lys Asp Val Thr Ser Leu1 5 10 15
Thr Lys Ala Ala Pro Val Ala Leu Ala Lys Thr Lys Glu Val Leu Asn20 25 30Gln Ala Val Ala Asp Leu Tyr Val Ala His Val Ala Leu His Gln Val35 40 45His Trp Tyr Met His Gly Arg Gly Phe Leu Val Trp His Pro Lys Met50 55 60Asp Glu Tyr Met Glu Ala Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ser Glu65 70 75 80Arg Leu Ile Thr Leu Gly Gly Ser Pro Phe Ser Thr Leu Thr Glu Phe85 90 95Leu Gln Asn Ser Glu Ile Glu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Asn Val100 105 110Glu Glu Ser Leu Glu Arg Val Leu Val Ile Tyr Arg Tyr Leu Ser Glu115 120 125Leu Phe Gln Lys Gly Leu Asp Val Thr Asp Glu Glu Gly Asp Asp Val130 135 140Thr Asn Gly Ile Phe Ala Gly Ala Lys Thr Glu Thr Asp Lys Thr Ile145 150 155 160Trp Met Leu Ala Ala Glu Leu Gly Gln Ala Pro Gly Leu Val Asp Pro165 170 17权利要求
1.具有约20千道尔顿(kDa)分子量的分离的肺炎链球菌表面相关肺防护蛋白质(PPP)或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；所述的PPP具有减少肺炎球菌定殖的能力。
2.如权利要求1中所述的PPP，其中所述的PPP是重组蛋白质。
3.如权利要求2中所述的PPP，其中所述的PPP具有约4.587的等电点。
4.如权利要求3中所述的PPP，其中所述的PPP在pH7下带有约-14.214的电荷。
5.如权利要求1所述的PPP，其中所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列PPP或其片段。
6.编码如权利要求1中所述的PPP的核酸序列，其中所述的核酸序列具有SEQ ID NO4中所示的序列或其片段。
7.如权利要求6中所述的核酸，它是cDNA。
8.包括编码如权利要求1中所述的PPP的核酸序列的表达载体，其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接。
9.如权利要求8中所述的载体，其中所述的PPP具有约4.587的等电点。
10.如权利要求9中所述的载体，其中所述的PPP在pH7下带有约-14.214的电荷。
11.包括编码如权利要求5中所述的PPP的核酸序列的表达载体，其中所述的序列可操作地与表达控制序列连接。
12.如权利要求11中所述的载体，其中所述的核酸序列具有SEQID NO4中所示的序列或其片段。
13.用如权利要求8中所述载体转染的宿主细胞。
14.用如权利要求11中所述载体转染的宿主细胞。
15.重组PPP的生产方法，该方法包括分离如权利要求13所述宿主细胞产生的PPP，其中在提供所述载体表达所述PPP的条件下培养了所述宿主细胞。
16.重组PPP的生产方法，该方法包括分离如权利要求14所述宿主细胞产生的PPP，其中在提供所述载体表达所述PPP的条件下培养了所述宿主细胞。
17.包括如权利要求1中所述PPP和药物上可接受载体的组合物。
18.包括如权利要求5中所述PPP和药物上可接受载体的组合物。
19.包括如权利要求6中所述编码PPP的核酸序列和药物上可接受载体的组合物。
20.包括如权利要求8中所述表达载体和药物上可接受载体的组合物。
21.包括如权利要求11中所述表达载体和药物上可接受载体的组合物。
22.包括如权利要求13中所述宿主细胞和药物上可接受载体的组合物。
23.包括如权利要求14中所述宿主细胞和药物上可接受载体的组合物。
24.免疫原性组合物，它包括(i)具有约20千道尔顿(kDa)分子量的肺炎链球菌表面相关PPP或其片段，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
25.如权利要求24中所述的组合物，所述的PPP具有约4.587的等电点。
26.如权利要求25中所述的组合物，所述的PPP在pH7下带有约-14.214的电荷。
27.如权利要求24中所述的组合物，所述的PPP具有SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其免疫原性片段。
28.如权利要求27中所述的组合物，所述的PPP由具有SEQ IDNO4中所示的序列的核酸序列或其免疫原性片段编码。
29.如权利要求24中所述的组合物，其中所述的组合物引起对由肺炎链球菌导致的疾病的保护性免疫。
30.如权利要求29中所述的组合物，其中所述的疾病选自中耳炎、鼻窦炎、菌血症、脑膜炎、肺炎和下呼吸道感染。
31.如权利要求29中所述的组合物，其中所述的PPP包括SEQ IDNO5中所示的氨基酸序列或其免疫原性片段。
32.如权利要求29中所述的组合物，其中所述的PPP由SEQ IDNO4中所示的核酸序列或其免疫原性片段编码。
33.免疫原性组合物，它包括(i)至少一种编码具有约20kDa分子量的PPP的表达载体，其中使用10-20％SDS-PAGE凝胶测定所述的分子量；(ii)药物上可接受的载体；和(iii)可选的至少一种佐剂。
34.如权利要求33中所述的组合物，其中所述的肺炎球菌是肺炎链球菌。
35.如权利要求34中所述的组合物，其中所述的组合物引起对由肺炎链球菌导致的疾病的保护性免疫。
36.如权利要求35中所述的组合物，其中所述的疾病选自中耳炎、鼻窦炎、菌血症、脑膜炎、肺炎和下呼吸道感染。
37.如权利要求33中所述的组合物，所述的PPP具有约4.582的等电点。
38.如权利要求37中所述的组合物，所述的PPP在pH7下带有约14.214的电荷。
39.如权利要求33中所还的组合物，其中所述的表达载体包括编码SEQ ID NO5中所示氨基酸序列的核酸序列或其免疫原性片段。
40.如权利要求33中所述的组合物，其中所述的表达载体包括SEQ ID NO4中所示的核酸序列或其免疫原性片段。
41.诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，所述的方法包括对所述的哺乳动物给予诱导所述哺乳动物体内免疫应答有效量的如权利要求24中所述组合物。
42.诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，所述的方法包括对所述的哺乳动物给予诱导所述哺乳动物免疫应答有效量的如权利要求27中所述组合物。
43.诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，所述的方法包括对所述的哺乳动物给予诱导所述哺乳动物体内免疫应答有效量的如权利要求33中所述组合物。
44.诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，所述的方法包括对所述的哺乳动物给予诱导所述哺乳动物体内免疫应答有效量的如权利要求39中所述组合物的步骤。
45.诱导感染了肺炎球菌的哺乳动物体内的免疫应答的方法，所述的方法包括下列步骤对所述哺乳动物给予抑制结合SEQ ID NO5中所示氨基酸序列有效量的化合物以诱导所述哺乳动物体内的所述免疫应答。
46.诱导感染了肺炎球菌的哺乳动物体内的免疫应答的化合物的筛选方法，所述的方法包括下列步骤将在有所述化合物存在情况下SEQ ID NO5中所示氨基酸序列的第一种结合量与在没有所述化合物存在情况下SEQ ID NO5中所示氨基酸序列的第二种结合量进行比较；从而由第一种结合量低于所述的第二种结合量这一结果表明所述的化合物可能在所述哺乳动物体内诱导所述的免疫应答。
47.肺炎球菌感染的诊断方法，所述的方法包括下列步骤将可疑样品内SEQ ID NO5中所示的PPP或其片段的水平与对照样品中SEQ ID NO5中所示PPP或其片段的水平进行比较，从而由所述可疑样品中的所述肺防护蛋白质水平高于所述对照样品中的所述肺防护蛋白质水平这一结果表明所述的可疑样品中包含肺炎球菌感染。
48.结合肺炎链球菌PPP的抗体。
49.如权利要求48中所述的抗体，它选择性识别如SEQ ID NO5中所示的氨基酸序列或其片段。
50.如权利要求48中所述的抗体，它是嵌合抗体。
51.如权利要求48中所述的抗体，它是人源化抗体。
52.如权利要求48中所述的抗体，它是抗独特型抗体。
53.如权利要求48中所述的抗体，它与药物活性化合物缀合。
54.如权利要求48中所述的抗体，它是单克隆抗体。
55.如权利要求54中所述的抗体，它是人源化抗体。
56.如权利要求54中所述的抗体，它是抗独特型抗体。
57.如权利要求54中所述的抗体，它与药物活性化合物缀合。
58.诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，所述的方法包括对所述的哺乳动物给予诱导所述哺乳动物体内免疫应答有效量的如权利要求52中所述抗体。
59.诱导哺乳动物体内免疫应答的方法，所述的方法包括对所述的哺乳动物给予诱导所述哺乳动物体内免疫应答有效量的如权利要求56中所述抗体。
60.诱导感染了肺炎球菌的哺乳动物体内的免疫应答的方法，所述的方法包括对所述哺乳动物给予诱导所述哺乳动物体内免疫应答有效量的如权利要求53中所述抗体。
61.诱导感染了肺炎球菌的哺乳动物体内的免疫应答的方法，所述的方法包括对所述哺乳动物给予诱导所述哺乳动物体内免疫应答有效量的如权利要求57中所述抗体。
全文摘要
本发明公开了涉及具有约20千道尔顿(kDa)分子量的肺炎链球菌表面相关肺防护蛋白质(PPP)的氨基酸序列和核酸序列。该PPP表现出减少肺炎球菌定殖的能力。由此本发明还涉及用于治疗和预防与细菌感染相关的感染或炎症的组合物。
文档编号A61P31/04GK1529710SQ01821556
公开日2004年9月15日 申请日期2001年12月28日 优先权日2000年12月28日
发明者B·A·格林, B A 格林, A·W·马希, 马希 申请人:Wyeth公司