专利名称：联合应用酶抑制剂及其药学组合物治疗和预防动脉硬化、预防和治疗根据杰尔－库姆斯 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过氨基酞酶N(APN；E.C.3.4.11.2；CD13)、二肽酰肽酶IV(DP IV；E.C.3.4.14.5；CD26)、脯氨酰基寡肽酶(POP；脯氨酰基肽链内切酶；PEP；E.C.3.4.21.26)、位于膜上的氨基酞酶P(X-脯氨酸-氨基酞酶；APP；XPNPEP2；E.C.3.4.11.9)、血管紧张素转换酶(ACE；E.C.3.4.15.1；CD143)的抑制剂的联合效果或分别通过对上述酶活性的联合抑制作用抑制DNA合成，因此抑制免疫细胞的增殖，其抑制作用是所述酶在其氨基酸衍生物、肽或肽的衍生物的基础上的特异抑制剂的刺激应用的结果，通过该结果抑制免疫细胞的激活、DNA合成，从而抑制免疫细胞的增殖。
本发明还涉及通过氨基酞酶N(APN；E.C.3.4.11.2；CD13)、二肽酰肽酶IV(DP IV；E.C.3.4.14.5；CD26)抑制剂的联合作用对TH2细胞产生细胞因子(白介素4，IL-4)的抑制以及对增殖必需的DNA合成的抑制，其结果为所述的酶在其氨基酸衍生物、肽或肽的衍生物的基础上的特异抑制剂刺激应用来抑制TH2细胞的激活、增殖(DNA合成)，以及细胞因子(IL-4)的产生。
本发明也涉及联合使用氨基酞酶N(APN；E.C.3.4.11.2；CD13)和二肽酰肽酶IV(DP IV；E.C.3.4.14.5；CD26)的抑制剂抑制角质细胞合成所必需的DNA合成。作为同时或立即相继应用上述酶或其氨基酸衍生物、肽或肽的衍生物的基础上的同功酶的特异抑制剂的结果，抑制角质细胞的增殖(DNA合成)。
这类抑制剂可应用于所有与自身免疫发病相关的疾病，这类疾病及发病过程及进展基于或由免疫细胞、特别是自身反应性T细胞的激活和增殖构成。同样的机制适用于其它-些炎症疾病，如动脉硬化，其中T淋巴细胞在疾病的发展和导致慢性化中起重要作用。
研究显示定位于膜上的肽酶如DP IV或APN在免疫细胞，特别是T淋巴细胞的激活和集落性表达过程中起重要作用(Fleischer BCD26-种参与T细胞激活的表面蛋白酶。今日免疫(Immunology Today)1994；15180-184；Lendeckel U等，丙氨酰氨基肽酶在人T细胞生长和功能中的作用，国际分子医学杂志(Intenational Journal ofMolecular Medicine)1999；417-27；Riemann D等，CD13-不仅仅是白血病分型的一种标志物，今日免疫(Immunology Today)1999；2083-88)。有丝分裂素刺激的单核细胞(MNC)或聚集的T淋巴细胞的多种功能，如DNA合成和免疫刺激细胞因子(IL-2，IL-6，IL-12，IFN-γ)的产生及分泌以及B细胞的辅助功能(合成IgG和IgM)可能在DP IV或APN的特异抑制剂存在时被抑制(Schon E等二肽酰肽酶IV，一种参与T淋巴细胞增殖的膜酶。Biomed.Biochim.Acta1985；2K9-K15；Schon E等二肽酰肽酶IV在人T淋巴细胞激活中的作用，二肽酰肽酶IV的抑制剂和抗体在体外抑制淋巴细胞的增殖和免疫球蛋白的合成。欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol)1987；171821-1826；Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360；Lendeckel U等通过有丝分裂原活化在人T细胞中诱导膜丙氨酰氨基肽酶基因及其在膜上的表达，生化杂志(Biochem.J.)1996；319817-823；Kahne T等二肽酰肽酶IV一种参与调节T细胞生长的细胞表面肽酶(综述) 国际分子医学杂志(IntenationalJournal of Molecular Medicine)1999；43-15；Lendeckel U等丙氨酰氨基肽酶在人T细胞生长和功能中的作用(综述)。国际分子医学杂志(Intenational Journal of Molecular Medicine)1999；417-27)。
另一方面，近年来的科学研究将动脉硬化定为一种炎症疾病，而T淋巴细胞在该病的发展和进程中起决定性作用(Ross R动脉硬化-一种炎症疾病。新英格兰医学杂志(New England J.Med.)1999；340(2)115-126)。根据那些发现，将动脉硬化损伤理解为一系列特异的细胞和分子反应，合起来即明确的特征为炎症反应。这类损伤最初发生在大中等弹性和肌肉动脉上，导致心脏、大脑和四肢缺血(扰乱循环)以至引起以上器官的梗死。动脉硬化损伤形成于特定的动脉位置，而分支和弯曲作用特性改变了血流、偏离应力以及紊乱的产生(Gotlieb AI等流变学在冠状动脉粥样硬化疾病中的作用，Fuster V，RossR，Topol EJ编辑，动脉粥样硬化和冠状动脉疾病，第1卷，费城Lippincott-Raven，1996595-606)。血管内皮细胞在那些位置产生特定的分子，这些分子负责T淋巴细胞和单核细胞的趋化、结合、聚集和激活。T淋巴细胞是动脉粥样硬化所有时期中必需的炎症细胞。T细胞从外周血浸润至动脉硬化灶，并在损伤的位置增殖(Jonasson L等T细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞在人动脉硬化灶的区域性聚集，动脉粥样硬化(Arteriosclerosis)，1986；6131-138；Van der Wal AC等人的动脉硬化损伤原位免疫表型分析提示为一种免疫介导的应答。Lab Invest.1989；61166-170)。这类激活的T淋巴细胞在动脉硬化损伤部位的聚集的结果是大量表达丙氨酰氨基肽酶和二肽酰肽酶IV、以及趋化因子(chemokines)、细胞因子、生长因子和蛋白酶的释放，由于其它免疫细胞的聚集和激活，这类化合物进一步加重病情(Libby P和Ross R.细胞因子和生长调节分子，Fuster V，RossR，Topol EJ编辑，动脉粥样硬化和冠状动脉疾病，第1卷，费城Lippincott-Raven，1996585-594)。
另外，定位于动脉粥样硬化灶的单核细胞的特征为持续性表达如丙氨酰氨基酞酶(APN)的酶，而且，如本发明所显示的，其生长和功能可以被上述酶的抑制物有效抑制，这同样也适应于能表达外肽酶的内皮细胞。
血管紧张素转换酶在动脉粥样硬化的发病机制中起特殊的作用。所述的酶可使血管紧张素I(ang I)转换为血管紧张素II(ang II)，而ang II可显著增加血压。高血压是促进动脉粥样硬化危险性的重要因子，患高血压的患者经常有血液ang II水平的升高。另外，ang II可通过刺激平滑肌细胞(血管)的生长成为前-动脉原(Chobanian AV等，高血压蛋白原酶血管紧张素系统和动脉粥样硬化性血管疾病。Fuster V，RossR，Topol EJ编辑，动脉粥样硬化和冠状动脉疾病，第1卷，费城Lippincott-Raven，1996237-242；Gibbons GH等，血管平滑肌细胞肥大与过度增生自分泌型TGF-β1的表达决定对血管紧张素II的生长反应。J Clin Invest 1992；90456-461)。此外，ang II也通过增加脂肪加氧酶活性从而大量释放促炎症介质来增强炎症反应。
本发明是基于一个意外的发现，即抑制剂通过同时作用或影响以下酶活性或生物活性((1)二肽酰肽酶IV和氨基肽酶N；(2)二肽酰肽酶IV和血管紧张素转换酶；(3)二肽酰肽酶IV和脯氨酰基寡肽酶以及(4)二肽酰肽酶IV和X-脯氨酸氨基肽酶)，从而抑制DNA合成并因此抑制单核细胞(MNC)和T细胞的增殖，而这种作用是任何单独一种酶抑制剂即使在增加剂量时也不能达到的。尽管所述的抑制剂最终也能影响同样的过程，即DNA合成，由此影响免疫细胞的增殖，但这种作用本质上不显著而且也不持久。由于上述酶活性功能的相互叠加，导致同时抑制两种或两种以上所述酶时，如本发明所显示的，对DNA合成以及增殖产生一种大于加成或超加成的抑制作用。
本发明显示，同时应用上述酶的抑制剂或同时应用相应的制剂和给药形式时，显然适应于治疗炎症疾病如动脉粥样硬化，在这类疾病中T淋巴细胞的增殖和激活起中心和重要的作用。
详细地说，本发明是基于这样一个发现，即同时给予抑制以下酶活性的物质时，对单核细胞(MNC)和T细胞的DNA合成的抑制以大于加成或超加成的方式进行(1)二肽酰肽酶IV和氨基肽酶N；(2)二肽酰肽酶IV和血管紧张素转换酶；(3)二肽酰肽酶IV和脯氨酰基寡肽酶以及(4)二肽酰肽酶IV和X-脯氨酸氨基肽酶应用酶抑制剂是一种治疗上述疾病的新方法和辅助方式。
本发明的二肽酰肽酶IV、氨基肽酶N、脯氨酰基寡肽酶、血管紧张素转换酶和X-脯氨酸氨基肽酶的抑制剂可以以下药学实用性复合物剂型来应用抑制剂、底物、拟底物、具抑制作用的多肽和多肽衍生物以及该酶的抗体。DP IV的优选效应物是，如Xaa-脯氨酸二肽相应的衍生物，优选的是二肽膦酸二芳基酯，二肽硼酸(boronic acid)(如脯氨酸-boro-脯氨酸)及其盐Xaa-Xaa-(Trp)-脯氨酸-(Xaa)n多肽(n＝从0至10)，相应的衍生物及其盐，其中Xaa分别是一种α-氨基酸或亚氨基酸或一种α-氨基酸衍生物或亚氨基酸衍生物，优选的是Nε-4-硝基苄氧羰基-L-赖氨酸，L-脯氨酸，L-色氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸和环胺，如吡咯烷、哌啶、噻唑烷以及作为酰胺结构的衍生物。这类化合物及其制备物在一份早期的专利中进行了描述(K.Neubert等，DD 296 075 A5)。
抑制物与已知的载体物质同时给药。一方面，给药途径可以是局部用药，如乳剂、软膏、糊剂、胶剂、溶液、喷雾剂、脂质体、可摇匀混合物、水状胶质敷料和包含可滴入性药剂的其它皮肤基/载体。另一方面，可以合适的配方或合适的盖仑派医学形式通过口服、经皮、静脉内、皮下、皮内、或肌肉内途径全身给药。
研究发现，I型过敏反应如支气管哮喘或花粉热的发生是基于免疫细胞，特别是TH2细胞的激活、增殖和细胞因子(特别是白介素4)的产生(D.D.Corry等，IgG反应的诱导和调控，Nature1999；402B18-B23)。
研究显示，定位于膜上的多肽酶如DP IV或APN，在免疫细胞特别是T淋巴细胞的激活和集落性增生过程中起关键作用(Fleischer BCD26一种参与T细胞激活的表面蛋白酶。今日免疫(Immunology Today)1994；15180-184；Lendeckel U等，丙氨酰氨基肽酶在人T细胞生长和功能中的作用，国际分子医学杂志(Intenational Journal ofMolecular Medicine)1999；417-27；Riemann D等，CD13-不仅仅是白血病分型的一种标志物，今日免疫(Immunology Today)1999；2083-88)。有丝分裂素刺激的单核细胞(MNC)或趋化的T淋巴细胞的多种功能，如DNA合成和免疫刺激细胞因子(IL-2，IL-6，IL-12，IFN-γ)的分泌以及B细胞的辅助功能(合成IgG和IgM)可能在DP IV或APN的特异抑制剂存在时被抑制(Schon E等二肽酰肽酶IV，一种参与T淋巴细胞增殖的膜蛋白酶。Biomed.Biochim.Acta1985；2K9-K15；Schon E等二肽酰肽酶IV在人T淋巴细胞激活中的作用，二肽酰肽酶IV的抑制剂和抗体在体外抑制淋巴细胞的增殖和免疫球蛋白的合成。欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol)1987；171821-1826；Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360；Lendeckel U等通过有丝分裂原活化在人T细胞中诱导膜丙氨酰氨基肽酶基因及其在膜上的表达，生化杂志(Biochem.J.)1996；319817-823；Kahne T等二肽酰肽酶IV一种参与调节T细胞生长的细胞表面肽酶(综述) 国际分子医学杂志(IntenationalJournal of Molecular Medicine)1999；43-15；Lendeckel U等丙氨酰氨基肽酶在人T淋巴细胞生长和功能中的作用(综述)。国际分子医学杂志(Intenational Journal of Molecular Medicine)1999；417-27)。
另一方面，近年来的科学研究将I型过敏反应定为一种炎症疾病，其中TH12淋巴细胞在该病的发展和进程中起决定性作用(D.D.Corry等，IgE反应的诱导和调控，Nature 1999；402B18-B23；P.J.Barnes过敏性疾病的治疗方案，Nature 1999；402B31-B38)。
IL-4是B细胞增殖、刺激IgE的产生和低亲和力的Fc-IgE受体表达的辅助细胞因子。而且，IL-4可以增强TH2细胞的自身诱导，以及调控嗜酸性细胞和肥大细胞的增殖和活性。这是IL-4在I型过敏反应中起决定性作用的原因(D.P.Stites，A.I.Terr，T.G.Parslow医学免疫学(Medicai Immunology)。Appelton & Lange，Stamfort，CT，1997)。
本发明也是基于一个意外的发现，即同时应用二肽酰肽酶IV和氨基肽酶N的抑制剂时，其抑制有丝分裂原刺激的单核细胞(MNC)增殖(DNA合成)和IL-4产生的效果是任何单独一种酶抑制剂即使增加剂量也不能达到的。尽管所述的抑制剂在单独使用时，最终也能影响同样的过程，即DNA合成以及TH2细胞产生IL-4，但这种作用本质上不显著而且也不持久。由于上述酶活性的相互叠加，从而同时抑制两种酶时，如本发明所显示的，对DNA合成以及增殖产生一种大于加成或超加成的抑制作用。
本发明显示，同时应用酶DP IV和APN的抑制物或相应的制备物和药剂时，显然适合于治疗I型过敏反应，在I型过敏反应的发生过程中T淋巴细胞的增殖和活化起中心和重要的作用。
详细地讲，本发明是基于这样一个发现，即单核细胞(MNC)的DNA合成和IL-4的产生可在同时应用酶DP IV和APN的抑制剂时，被以一种大于加成或超加成的形式所抑制。
应用酶抑制剂治疗上述疾病是一种新方法和一种补充方式。
按照本发明，二肽酰肽酶IV、氨基肽酶N的抑制剂可以以下药学上实用的复合物剂型来应用抑制剂、底物、拟底物、具抑制作用的肽或肽衍生物以及该酶的抗体。DP IV的优选效应物是，如Xaa-脯氨酸二肽相应的衍生物，优选的是二肽膦酸二芳基酯，二肽硼酸(如脯氨酸-boro-脯氨酸)及其盐Xaa-Xaa-(Trp)-脯氨酸-(Xaa)n多肽(n＝从0至10)、相应的衍生物及其盐，其中Xaa分别是一种α-氨基酸或亚氨基酸或一种α-氨基酸衍生物或亚氨基酸衍生物，优选的是NE-4-硝基苄氧羰基-L-赖氨酸，L-脯氨酸，L-色氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸和环胺，如吡咯烷、哌啶、噻唑烷以及作为酰胺结构的衍生物。这类化合物及其制剂在一份早期的专利中进行了描述(K.Neubert等，DD 296 075 A5)。
丙氨酰氨基肽酶的优选抑制剂是贝他定(乌苯美司)、海葵素、脯氨酸抑制素(probestine)、苯丙氨酸抑制素、RB3014或亮氨酸抑制素。
抑制物与已知的载体物质同时给药。一方面，给药途径可以是局部用药，如乳剂、软膏、糊剂、胶剂、溶液、喷雾剂、脂质体、可摇匀混合物、水状胶质敷料和包含可滴入性药剂的其它皮肤基/载体。另一方面，可以合适的配方或合适的盖仑派医学形式通过口服、经皮、静脉内、皮下、皮内、或肌肉内途径全身给药。
多种皮肤疾病伴有毛囊和表皮的过度角质化以及角质细胞的过度增殖。这类疾病包括表皮炎性和非炎性的过度增生(如先天性鱼鳞癣和银屑病)，良性和恶性的表皮集落性增生(如疣、湿疣、光化性角化病/癌前病变)，良性和恶性的毛囊过度增生(如毛囊角质化)以及良性和恶性上皮皮肤附属器肿瘤和初期和反应性指(趾)甲细胞过度增生。详细列于表1中。
多肽酶如二肽酰肽酶IV、氨基肽酶N或其它具类似作用的酶在细胞间相互作用的调控中非常重要。这是由于这类酶与其它定位于细胞质膜的胞外酶一样，可以与细胞外结构相互作用，通过酶催化的水解作用激活或灭活肽信使物质，因此，在细胞间信息传递中起重要作用(Yaron A等依赖于脯氨酸的多肽和蛋白质的结构和生物学性质。Crit Rev Biochem Mol Biol 1993；2831-81；Vanhoof G等脯氨酸在多肽的基序及其生物学递呈。FASEB J 1995；9736-744)。
研究显示，定位于膜上的多肽酶如DPIV或APN，在免疫细胞特别是T淋巴细胞的激活和集落表达过程中起关键作用(Fleischer BCD26一种参与T细胞激活的表面蛋白酶。今日免疫(Immunology Today)1994；15180-184；Lendeckel U等，丙氨酰氨基肽酶在人T细胞生长和功能中的作用，国际分子医学杂志(Intenational Journal ofMolecular Medicine)1999；417-27；Riemann D等，CD13-不仅仅是白血病分型的一种标志物，今日免疫(Immunology Today)1999；2083-88)。有丝分裂素刺激的单核细胞(MNC)或趋化的T淋巴细胞的多种功能，如DNA合成和免疫刺激细胞因子(IL-2，IL-6，IL-12，IFN-γ)的分泌以及B细胞的辅助功能(合成IgG和IgM)可能在DP IV或APN的特异抑制剂存在时被抑制(Schon E等二肽酰肽酶IV，一种参与T淋巴细胞增殖的膜蛋白酶。Biomed.Biochim.Acta1985；2K9-K15；Schon E等二肽酰肽酶IV在人T淋巴细胞激活中的作用，二肽酰肽酶IV的抑制剂和抗体在体外抑制淋巴细胞的增殖和免疫球蛋白的合成。欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol)1987；171821-1826；Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360；Lendeckel U等通过有丝分裂原活化在人T细胞中诱导膜丙氨酰氨基肽酶基因和膜上表达，生化杂志1996；319817-823；Kahne T等二肽酰肽酶IV一种参与调节T细胞生长的细胞表面肽酶(综述)国际分子医学杂志(Intenational Journal of MolecularMedicine)1999；43-15；Lendeckel U等丙氨酰氨基肽酶在人T淋巴细胞生长和功能中的作用(综述)。国际分子医学杂志(Intenational Journal of Molecular Medicine)1999；417-27)。已知可以通过协同抑制剂对位于免疫细胞的二肽酰肽酶IV进行抑制，来治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应(如欧洲专利0 764 151 A1；WO 95/29691；欧洲专利0 731 789 A1；欧洲专利0 528 858 A1)。
本发明也是基于一个意外的发现，即在给定剂量时，同时应用在角质细胞内或膜上表达的二肽酰肽酶IV/CD26以及氨基肽酶N/CD13或其它类似的酶的抑制剂时，其抑制细胞增殖(DNA合成)的效果是任何单独一种酶抑制剂所不能达到的。尽管所述的抑制剂在单独使用时，最终也能影响同样的过程，即抑制DNA合成从而抑制角质细胞的增殖，但这种作用本质上不显著而且也不持久。由于上述酶活性的相互叠加，从而同时抑制两种酶时，如本发明所显示的，在低剂量时，对DNA合成以及细胞增殖产生一种大于加成或超加成的抑制作用。
本发明显示，同时应用酶DP IV和APN或其类似酶的抑制物或相应的制剂和药剂显然适合于预防和治疗表皮炎性和非炎性的过度增殖(如先天性鱼鳞癣和银屑病)，良性和恶性的表皮集落性增生(如疣、湿疣、光化性角化病/癌前病变)，良性和恶性的毛囊过度增生(如毛囊角质化)以及良性和恶性上皮皮肤附属器肿瘤和初期和反应性指(趾)甲细胞过度增生，这是由于在这类疾病的发病过程中，表皮和毛囊角质细胞以及迁移层粘膜区的角质细胞的增殖和活化非常重要。
除角质细胞外，T淋巴细胞在皮肤炎症疾病中也起重要作用。像角质细胞一样，T细胞也表达上述的肽酶DP IV和APN。因此，所要求或被保护的角质细胞的治疗作用被T细胞所强化。这也是德国专利申请100 25 464.0“联合应用酶抑制剂及其药学制剂治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎、红斑狼疮、多发性硬化症、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、节段性回肠炎、结肠溃疡、银屑病、神经性皮炎、肾小球肾炎、间质性肾炎、脉管炎、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性溶血性贫血以及移植和肿瘤”的主题。
详细地讲，本发明是基于这样一个发现，即在同时应用酶DP IV和APN的抑制剂时，HaCaT角质细胞的DNA合成被以加成或低浓度时超加成的形式所抑制。
迄今为止，治疗上述疾病所采用的是局部使用抗增殖和分化的物质(水杨酸、尿素、内源性和合成的视黄醛、维生素D3衍生物、皮质甾类)以及全身使用部分免疫抑制剂和抗增生制剂(如环孢菌素、皮质甾类、视黄醛)。特别是在全身给药时，经常观察到不期望的副作用。联合应用DP IV和APN的抑制剂是一种新的，预计非常有效而且价格低廉的方法，是已知治疗方法的有价值的替代疗法。
按照本发明，二肽酰肽酶IV、氨基肽酶N或其它类似酶的抑制剂可以以下药学上实用的复合物剂型来应用抑制剂、底物、拟底物、具抑制作用的肽或肽衍生物以及该酶的抗体。DP IV的优选效应物是，如Xaa-脯氨酸二肽相应的衍生物，优选的是二肽膦酸二芳基酯，二肽硼酸(如脯氨酸-boro-脯氨酸)及其盐，Xaa-Xaa-(Trp)-脯氨酸-(Xaa)n肽(n＝从0至10)，其相应的衍生物及其盐，其中Xaa分别是一种α-氨基酸或亚氨基酸或一种α-氨基酸衍生物或亚氨基酸衍生物，优选的是NE-4-硝基苄氧羰基-L-赖氨酸，L-脯氨酸，L-色氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸和环胺，如吡咯烷、哌啶、噻唑烷以及作为酰胺结构的衍生物。这类化合物及其制剂在一份早期的专利中进行了描述(K.Neubert等，DD 296 075 A5)。
丙氨酰氨基肽酶的优选抑制剂是贝他定(乌苯美司)、海葵素、脯氨酸抑制素、苯丙氨酸抑制素、RB3014或亮氨酸抑制素。
抑制物与已知的载体物质同时给药。一方面，给药途径可以是局部用药，如乳剂、软膏、糊剂、胶剂、溶液、喷雾剂、脂质体、可摇匀混合物、水状胶体敷料、膏药和其它同类的新型载体物质，喷雾注射剂和包含其它可滴入形式的其它皮肤基/载体。另一方面，可以合适的配方或合适的盖仑派医学形式通过口服、经皮、静脉内、皮下、皮内、或肌肉内途径全身给药。
表1 表皮过度增生的情况例如 非炎症 例如 炎症先天性鱼鳞癣 银屑病及亚型包括指甲及毛发获得性鱼鳞癣(类瘤) 牛皮癣及亚型类牛皮癣掌跖角化病 牛皮癣角化病先天性/获得性PARA瘤 慢性单纯苔癣+活动性过度增生苔癣(如特应性皮癣)毛囊角化病 似苔癣反应表皮痣 炎性线形疣状表皮痣颈部菱形皮肤 慢性红斑狼疮疾病/SCLE/系统性红斑狼疮黑棘皮症 毛发红糠疹厚皮病 M.GROVER白斑剥脱性皮炎伴随角质细胞的过度增生表皮集落性增生良性 恶性人乳头(状)瘤病毒相关病(疣、湿疣) 人乳头(状)瘤病毒相关肿瘤皮脂溢性角化病 光化性角化病/癌前病变状态肛门棘皮瘤炎性硬结 博温氏病+博温氏癌表皮囊肿 佩吉特病+佩吉特氏癌粟粒疹 血小板性上皮癌古热罗氏综合症 默克尔细胞癌毛囊过度增生的情况良性 恶性毛囊角化病 毛囊细胞瘤毛囊过度角化 增生性毛鞘囊肿眉部疤痕性红斑 混合肿瘤多毛症毛鞘囊肿上皮皮肤附属器肿瘤良性 恶性骨痂 外分泌型/旁分泌型癌+亚型瘘管及导管肿瘤汗腺腺瘤螺旋性腺瘤圆柱瘤原发和活动性指(趾)甲细胞过度增生先天性(如指(趾)甲肥厚症) 非传染性获得性传染性霉菌病实施例1通过DP IV和APN的合成抑制剂与人T淋巴细胞培养抑制DNA合成本发明研究显示，同时给予DP IV(LYS(Z(NO2))-噻唑酐(thiazolidide)＝I49)和APN(海葵素)的抑制剂可以以加成或超加成方式抑制人外周血T淋巴细胞DNA的合成。在所述的抑制剂存在的情况下，T细胞与所述抑制剂共同培养72小时，DNA合成用Reinhold等描述的3H-胸腺嘧啶核苷掺入法进行测定(Reinhold D等，二肽酰肽太酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360)。
图1(第1/14页)显示剂量依赖性的、对DNA合成大于加成或超加成的抑制作用。
实施例2DP IV和APN的合成抑制剂与人外周血单核细胞培养时对细胞DNA合成的抑制本发明研究显示，同时给予DP IV(LYS(Z(NO2))-噻唑酐(thiazolidide)＝I49)和APN(海葵素)的抑制剂可以以加成或超加成方式抑制人外周血单核细胞(MNC)DNA的合成。在所述的抑制剂存在的情况下，MNC与所述抑制剂共同培养72小时，DNA合成用Reinhold等描述的3H-胸腺嘧啶核苷掺入法进行测定(Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360)。图2(第2/14页)显示剂量依赖性的、对DNA合成大于加成或超加成的抑制作用。
实施例3DP IV和POP的合成抑制剂与人T淋巴细胞培养对细胞DNA合成的抑制本发明研究显示，同时给予DP IV(LYS(Z(NO2))-噻唑酐(thiazolidide)＝I49)和脯氨酰寡肽酶(Boc-Ala噻唑酐)的抑制剂可以以加成或超加成方式抑制人血T淋巴细胞DNA的合成。在所述的抑制剂存在的情况下，T细胞与所述抑制剂共同培养72小时，DNA合成用Reinhold等描述的3H-胸腺嘧啶核苷掺入法进行测定(Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360)。图3(第3/14页)显示剂量依赖性的、对DNA合成大于加成或超加成的抑制作用。
实施例4DP IV和POP的合成抑制剂与人外周血单核细胞培养对细胞DNA合成的抑制本发明研究显示，同时给予DP IV(LYS(Z(NO2))-噻唑酐(thiazolidide)＝I49)和脯氨酰寡肽酶(Boc-Ala噻唑酐)的抑制剂可以以加成或超加成方式抑制人外周血单核细胞(MNC)DNA的合成。在所述的抑制剂存在的情况下，T细胞与所述抑制剂共同培养72小时，DNA合成用Reinhold等描述的3H-胸腺嘧啶核苷掺入法进行测定(Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360)。图4(第4/14页)显示剂量依赖性的、对DNA合成大于加成或超加成的抑制作用。
实施例5DP IV和ACE的合成抑制剂与人T淋巴细胞培养对细胞DNA合成的抑制本发明研究显示，同时给予DP IV(LYS(Z(NO2))-噻唑酐(thiazolidide)＝I49)和血管紧张素转换酶(卡托普利)的抑制剂可以以加成或超加成方式抑制人外周血T淋巴细胞DNA的合成。在所述的抑制剂存在的情况下，T细胞与所述抑制剂共同培养72小时，DNA合成用Reinhold等描述的3H-胸腺嘧啶核苷掺入法进行测定(Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360)。图5(第5/14页)显示剂量依赖性的、对DNA合成大于加成或超加成的抑制作用。
实施例6DP IV和ACE的合成抑制剂与人外周血单核细胞培养对细胞DNA合成的抑制本发明研究显示，同时给予DP IV(LYS(Z(NO2))-噻唑酐(thiazolidide)＝I49)和APN(海葵素)的抑制剂可以以加成或超加成方式抑制人外周血单核细胞(MNC)DNA的合成。在所述的抑制剂存在的情况下，MNC与所述抑制剂共同培养72小时，DNA合成用Reinhold等描述的3H-胸腺嘧啶核苷掺入法进行测定(Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360)。图6(第6/14页)显示剂量依赖性的、对DNA合成大于加成或超加成的抑制作用。
实施例7单独或同时给予DP IV(I49＝Lys(Z(NO2))-噻唑酐)和APN(海葵素)的抑制剂对人外周血单核细胞(MNC)增殖的抑制(图7第7/14页)实施例8单独或同时给予DP IV(I49＝Lys(Z(NO2))-噻唑酐)和APN(海葵素和脯氨酸抑制素)的抑制剂对人T细胞系KARPAS-299增殖的抑制(图8第8/14页)实施例9单独或同时给予DP IV(I49＝Lys(Z(NO2))-噻唑酐)和APN(海葵素和脯氨酸抑制素)的抑制剂对人外周血T细胞增殖的抑制(图9第9/14页)实施例10单独或同时给予DP IV(I49＝Lys(Z(NO2))-噻唑酐)和X-脯氨酸-氨基酞酶(APP)(APSTATINE)的抑制剂对植物凝血素(PHA)激活的人单核细胞(MNC)增殖的抑制(图10第10/14页)实施例11通过用DP IV和APN的合成抑制剂培养对外周血中由商陆-有丝分裂素(PWM)刺激的人单核细胞(MNC)DNA合成的抑制本发明研究显示，DP IV(LYS(Z(NO2))-噻唑酐＝I49)和APN(海葵素)的抑制剂可以一种加成方式抑制人外周血中由商陆-有丝分裂素(PMN)刺激的人单核细胞(MNC)DNA的合成。MNC细胞与所述抑制剂共同培养72小时，DNA合成用Reinhold等描述的3H-胸腺嘧啶核苷掺入法进行测定(Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360)。图11(第11/14页)显示剂量依赖性的、对DNA合成的加成抑制作用。
实施例12通过用DP IV和APN的合成抑制剂培养对外周血中由商陆-有丝分裂素刺激的人单核细胞产生白介素4的抑制本发明研究有趣地显示，同时给予DP IV(LYS(Z(NO2))-噻唑酐＝I49)和APN(海葵素)的抑制剂可以以加成或超加成方式抑制人外周中由商陆-有丝分裂素刺激的人单核细胞(MNC)产生细胞因子IL-4(TH2细胞特性)。MNC细胞与所述抑制剂和商陆-有丝分裂素一起培养48小时，IL-4在每种培养上清液中的浓度用Reinhold等描述的商用IL-4分析试剂盒(ELISA)进行检测(Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360)。图12(第12/14页)显示剂量依赖性的，对IL-4产生超加成的抑制作用。
实施例13通过DP IV和APN的合成抑制剂与人角质细胞(HaCaT细胞系)培养对DNA合成的抑制本发明研究显示，同时给予DP IV(LYS(Z(NO2))-噻唑酐＝I49)和APN(海葵素)的抑制剂可以以加成以及在低浓度时超加成方式抑制人角质细胞(HaCaT细胞系)DNA的合成。
人角质细胞系HaCaT是已被采纳的研究银屑病表达DP IV和APN的细胞模型。DP IV在这种重要细胞中的酶活性是30.2±5pkat/106细胞，APN的酶活性是90±4pkat/106细胞。以一种对应方式在同样细胞中可检测到DP IV和APN的mRNA(图13，第13/14页)。
HaCaT细胞与上述抑制剂共同培养48小时，随后DNA合成用Reinhold等描述的3H-胸腺嘧啶核苷掺入法进行测定(Reinhold D等，二肽酰肽酶IV的抑制剂在PWM刺激的PBMNC和T细胞中诱导转化生长因子β1的分泌。免疫学(Immunology)1997；91354-360)。图14(第14/14页)显示对DNA合成的剂量依赖性抑制作用。
权利要求
1.联合应用二肽酰肽酶IV(DP IV)以及具有相同底物的特异性酶(DP IV相似酶活性)和丙氨酰氨基酞酶(氨基酞酶N，APN)以及具有相同底物的特异性酶(APN相似酶活性)的抑制剂以加成或超加成方式用于抑制人T淋巴细胞和单核细胞的激活和增殖(DNA合成)以及产生TH2细胞因子中的用途。
2.联合应用二肽酰肽酶IV(DP IV)以及具有相同底物的特异性酶(DP IV相似酶活性)、丙氨酰氨基酞酶(氨基酞酶N，APN)以及具有相同底物的特异性酶(APN相似酶活性)的抑制剂以加成或超加成方式抑制人表皮和毛囊角质细胞以及皮肤与粘膜过渡区角质细胞的活化和增殖(DNA合成)。
3.联合应用二肽酰肽酶IV(DP IV)以及具有相同底物的特异性酶(DP IV相似酶活性)、丙氨酰氨基酞酶(氨基酞酶N，APN)以及具有相同底物的特异性酶(APN相似酶活性)、X-脯氨酸-氨基酞酶(氨基酞酶P，APN)、血管紧张素转换酶(ACE)和/或脯氨酰基寡肽酶(POP，脯氨酰基肽链内切酶肽酶，PEP)的抑制剂以加成或超加成用于方式抑制人T淋巴细胞和单核细胞的活化、DNA合成和增殖中的用途。
4.根据权利要求1-3中任何-项所述的用途，其中DP IV的抑制物优选是Xaa-脯氨酸二肽(Xaa＝α-氨基酸及侧链受保护的衍生物)及相应的衍生物，优选的是二肽膦酸二芳基酯、二肽硼酸(如脯氨酸-boro-脯氨酸)及其盐、Xaa-Xaa-(Trp)-脯氨酸-(Xaa)n肽(Xaa＝α-氨基酸，n＝从0至10)、相应的衍生物及其盐及氨基酸(Xaa)-酰胺、相应的衍生物及其盐，其中Xaa分别是α-氨基酸或侧链受保护的衍生物，优选的是NE-4-硝基苄氧羰基-L-赖氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和环胺，如吡咯烷、哌啶、噻唑烷以及作为酰胺结构的衍生物。
5.根据权利要求1-4中任何-项所述的用途，其中优选用作DPIV抑制剂的是酰胺氨基酸如Nε-4-硝基苄氧羰基-L-赖氨酸-噻唑酐、吡咯烷和哌啶以及对应的2-氰基噻唑酐、2-氰基吡咯酐(cyanopyrrolidide)和2-氰基哌啶酐(cyanopiperidide)衍生物。
6.根据权利要求1所述的用途，其中作为APN的抑制剂优选使用actinoine、亮氨酸抑制素、苯丙氨酸抑制素、amastatine、bestatine、脯氨酸抑制素、β-巯基氨基酸、α-氨基膦酸、α-氨基膦酸衍生物，优选的是D-苯丙氨酸-ψ[PO(OH)-CH2]-苯丙氨酸-苯丙氨酸及其盐。
7.根据权利要求3所述的用途，其中作为APP的抑制剂优选使用apstatine、(2S，3R)-HAMH-L-脯氨酸、(2S，3R)-HAPB-L-脯氨酸、以及相应的L-脯氨酸甲基酯、(2S，3R)-HAMH-/(2S，3R)-HAPB-吡咯酐、噻唑酐(HAMH＝3-氨基-2-羟基-5-甲基-己酰，HAPB＝3-氨基-2-羟基-4-苯基-丁酰)及其盐。
8.根据权利要求3或权利要求7所述的用途，其中作为ACE的抑制剂使用的是卡托普利、依托普利、赖诺普利、cilazopril及其盐。
9.根据权利要求3、7或8中任何-项所述的用途，其中用作POP(PEP)抑制剂的优选是postatin、eurystatin a或B、Nα-保护的肽醛，优选苄氧基羰基-L-脯氨酰-L-prolinal，以及苄氧基羰基-L-硫代脯氨酰基-L-硫代prolinal，Nα-保护的氨基酸(Xaa)-吡咯酐或噻唑酐(Xaa＝α-氨基酸，优选L-丙氨酸，L-缬氨酸、L-异亮氨酸)以及相应的2-氰基吡咯酐、2-氰基噻唑酐衍生物，底物类似的Nα-保护的膦酸肽二芳基酯、肽重氮甲基酮、prolinal和肽铵甲基酮及其分别的衍生物。
10.根据权利要求1和权利要求4-9任一项所述的联合抑制剂用于预防和治疗炎症发生性慢性疾病如自身免疫性疾病和动脉粥样硬化中的用途。
11.根据权利要求1和权利要求4-6任一项所述的联合抑制剂用于预防和治疗I型过敏反应中的用途。
12.根据权利要求1、2和权利要求4-6任何-项所述的联合抑制剂用于预防和治疗炎症和非炎症表皮过度增生状态(如先天性鱼鳞癣和银屑病)、良性和恶性的表皮集落性增生(如疣、湿疣、光化性角化病/癌前病变)、良性和恶性的毛囊过度增生(如毛囊角质化)以及良性和恶性上皮皮肤附属器肿瘤和原发和反应性指(趾)甲细胞过度增生中的用途。
13.药学制剂，其包含二肽酰肽酶IV(DP IV)或具有DP IV-类似酶活性的酶的抑制物与任-种丙氨酰氨基酞酶(氨基酞酶N，APN)以及具有相同底物特异性的酶(APN-类似酶活性)的抑制剂联合应用以及与任何-种已知载体、添加剂和/或辅助物联合应用。
14.药学制剂，包含二肽酰肽酶IV(DP IV)以及具有DP IV-类似酶活性的酶的抑制物与任-种丙氨酰氨基酞酶(氨基酞酶N，APN)以及具有相同底物特异性的酶(APN-类似酶活性)的抑制剂，以及与X-脯氨酸-氨基酞酶(氨基酞酶P，APP)、血管紧张素转换酶(ACE)和脯氨酰基寡肽酶(POP，脯氨酰基肽链内切酶肽酶，PEP)的抑制剂联合应用，以及与任何一种已知载体、添加剂和/或辅助物联合应用。
15.根据权利要求13或14任一项所述的药学制剂，包含作为DPIV的抑制物优选Xaa-脯氨酸二肽(Xaa＝α-氨基酸及侧链受保护的衍生物)及相应的衍生物，优选的是二肽膦酸二芳基酯，二肽硼酸(如脯氨酸-boro-脯氨酸)及其盐、Xaa-Xaa-(Trp)-脯氨酸-(Xaa)n肽(Xaa＝α-氨基酸，n＝从0至10)、其相应的衍生物及其盐及氨基酸(Xaa)-酰胺，相应的衍生物及其盐，其中Xaa分别是-种α-氨基酸或侧链受保护的衍生物，优选的是Nε-4-硝基苄氧羰基-L-赖氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和环胺，如吡咯烷、哌啶、噻唑烷以及作为酰胺结构的衍生物。
16.根据权利要求13、14或15所述的药学制剂，包含作为DP IV的抑制剂的优选的酰胺氨基酸如NE-4-硝基苄氧羰基-L-赖氨酸-噻唑酐，吡咯酐和哌啶酐以及对应的2-氰基噻唑酐、2-氰基吡咯酐和2-氰基哌啶酐衍生物。
17.根据权利要求13至16任-项所述的药学制剂，包含作为APN的抑制剂的优选的ACTINOINE、亮氨酸抑制素、苯丙氨酸抑制素、AMASTATINE、BESTATINE、脯氨酸抑制素、β-巯基氨基酸、α-氨基膦酸、α-氨基膦酸衍生物，优选的是D-苯丙氨酸-ψ[PO(OH)-CH2]-苯丙氨酸-苯丙氨酸及其盐。
18.根据权利要求14至17任一项所述的药学制剂，包含作为APP的抑制剂优选的APSTATINE、(2S，3R)-HAMH-L-脯氨酸、(2S，3R)-HAPB-L-脯氨酸、以及相应的L-脯氨酸甲基酯、(2S，3R)-HAMH-/(2S，3R)-HAPB-吡咯酐、噻唑酐(HAMH＝3-氨基-2-羟基-5-甲基-己酰，HAPB＝3-氨基-2-羟基-4-苯基-丁酮)及其盐。
19.根据权利要求14至18任一项所述的药学制剂，包含作为ACE的抑制剂的卡托普利、依托普利、赖诺普利、CILAZOPRIL及其盐。
20.根据权利要求14至19任一项所述的药学制剂，包含作为POP(PEP)抑制剂的优选的POSTATIN、扩张抑制素A或B、Nα-保护的肽醛，优选的是苄氧基羧基-L-脯氨酰-L-prolinal，以及苄氧基羧基-L-硫代脯氨酰基-L-硫代prolinal，Nα-保护的氨基酸(Xaa)-吡咯酐或噻唑酐(Xaa＝α-氨基酸，优选的是L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸)以及相应的2-氰基吡咯酐、2-氰基噻唑酐衍生物，底物类似的Nα-保护的肽膦酸二芳基酯、肽重氮基甲基酮、肽铵甲基酮及其分别的衍生物。
21.根据权利要求14至20任一项所述的药学制剂，包含两种或多种DP IV以及具有类似DP IV-酶活性的酶的抑制剂，APN或具有APN-类似酶活性的酶的抑制剂，ACE、POP(PEP)以及XPNPEP2以相对独立的配方与任何一种已知载体、佐剂和/或添加剂同时或立即连续应用，以达到一种结合的效果。
22.根据权利要求13至21任一项所述的药学制剂用于与已知载体、佐剂和/或添加剂一起使用，以口服、经皮、静脉、皮下、皮内、肌肉内、直肠内、阴道内以及舌下用药的全身给药。
23.根据权利要求13至21任一项所述的药学制剂用于局部应用时采用例如乳剂、软膏、糊剂、胶剂、溶液、喷雾剂、脂质体、可摇匀混合物、水状胶质敷料和包含可滴入性药剂的其它皮肤基/载体的形式。
全文摘要
本发明涉及联合应用二肽酰肽酶IV(DP IV)和具有相同底物特异性的酶(DP IV酶活性)的抑制剂和丙氨酰氨基酞酶(氨基酞酶N，APN)或具有相同底物特异性的酶(APN酶活性)的抑制剂以加成或超加成抑制人T淋巴细胞或单核细胞的激活和增殖(DNS合成)、抑制T
文档编号A61P9/10GK1484533SQ01821715
公开日2004年3月24日 申请日期2001年12月21日 优先权日2001年1月2日
发明者S·安佐格, S 安佐格, U·伦德凯尔, 驴, K·诺伊贝特, 帘刺, D·赖因霍尔德, 蚧舳 , R·韦特, 峥, H·戈尔尼克 申请人:马格德堡医疗技术研究所股份有限公司, 马格德堡医疗技术研究所股份有限公司Imtm