抗hiv药物的制作方法

专利名称：抗hiv药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗HIV的药物，特别是抑制HIV感染个体中该病毒复制的药物。
背景技术：
导致获得性免疫缺陷综合症的病毒HIV，是一种属于逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(Lentivirus)的RNA病毒。HIV按以下方式进行感染和复制。首先，HIV颗粒的包膜蛋白gp120(糖蛋白120)结合于靶细胞表面上的CD4。随后结合的Gp120和CD4结合于作为协同受体的趋化因子受体(主要是巨噬细胞上的CCR5或T细胞上的CXCR4)，形成由gp120、CD4和趋化因子构成的复合物。紧接着另一包膜蛋白gp41结合于靶细胞的细胞膜。这导致包膜与细胞膜融合，从而病毒的核心进入细胞。一旦进入细胞，HIV就脱被膜，并通过病毒带入的逆转录酶用模板RNA基因组合成双链原病毒DNA。然后在整合酶(也是病毒的酶)的协助下，原病毒DNA整合入宿主细胞染色体DNA中。用原病毒5’端的LTR(长末端重复序列)作启动子，掺入的原病毒转录产生病毒mRNA。在此过程中产生一些不同长度的mRNA，可将它们分成两组，即合成病毒蛋白质的mRNA与作为病毒基因组RNA的mRNA。病毒蛋白质包括如形成病毒颗粒的结构蛋白质和加速病毒复制的蛋白质。例如，病毒蛋白质Tat结合于掺入宿主基因组的原病毒5’LTR区域，从而将病毒RNA的转录产物增加几百倍。另一方面，形成病毒颗粒的结构蛋白质与细胞内、细胞膜附近的病毒基因组RNA联合装配成病毒颗粒。随后通过出芽将如此装配的病毒颗粒释放出细胞。装配和出芽的机制至今未知。在释放出的颗粒中，蛋白酶被活化，并进行加工，从而产生成熟的传染性病毒颗粒。通过重复由CD4结合于靶细胞、整合入宿主染色体DNA、复制、出芽和成熟组成的完整过程，HIV迅速再生。随着HIV的再生，宿主CD4-阳性细胞发生破坏。为了对付这种状况，宿主诱导了新鲜CD4-阳性细胞的迅速增殖来弥补这种损失。这种动力学平稳将在感染后持续几年，但或早或迟CD4-阳性细胞的补充将赶不上其损失，而导致免疫系统的整体瓦解，出现AIDS的各种症状。
在HIV感染个体中，为了去除HIV发生着各种免疫反应。其中有例如中和病毒抗原的抗体的产生和由细胞毒T细胞消灭被感染的细胞。现已知道CD8-阳性细胞产生的一些体液因子在维持HIV感染个体处于无症状状态中起着重要作用[Levy，J.A.，等人，Immunol.Today，17217-224(1996)，Fauci，A.S.，Nature，384529-534(1996)]。在这些因子中迄今已鉴定了趋化因子(RANTES、MIP-α、1β、SDF-1)和IL-16。但它们都不能提供足够的基础来完全解释CD8-阳性细胞产生的抗HIV活性，这提示还有一些未鉴定的HIV-抑制因子参与。
趋化因子起着抑制HIV进入靶细胞(巨噬细胞和T细胞)的作用。另一方面，也有报道表明趋化因子加速巨噬细胞中HIV的复制。已知IL-16能抑制HIV的转录过程，但认为显示出这种作用需要极高的浓度。虽然已进行努力来开发这些化合物作为AIDS治疗药物，但它们没有一种达到实际应用阶段。另一方面预计存在一些尚未确定的抗-HIV因子可抑制HIV的转录过程。然而，只要这些因子还未确定，它们的作用机制就仍然是需要探索的。
以下总结用迄今已报道的具有HIV抑制活性的生物起源的因子所测定的对HIV复制的抑制率。
(1)RANTES(MW＝7,851)用PM1细胞和HIV-1VBaL毒株系统；在0.78ng/ml(＝0.1nM)时5％，1.56ng/ml(＝0.2nM)时50％；和在3.12ng/ml(＝0.4nM)时90％(Cocchi，F.等人，Science 2701811-1815(1995)](2)MIP-1α(MW＝7,717)在采用上述RANTEA相同的系统中；3.12nm/ml时0％；6.25ng/ml(＝0.8nM)时5％；和12.5ng/ml(＝1.6nM)时50％[Cocchi，F.等人，同上]。
(3)MIP-1β(MW＝7,819)在采用上述RANTES相同的系统中；0.78ng/ml时0％；1.56ng/ml(＝0.2nM)时5％；3.12ng/ml(＝0.4nM)时15％；和6.25ng/ml(＝0.8nM)时60％[Cocchi，F.等人，同上](4)IL-16(MW＝12,422)对活跃的四聚体分别为40～70ng/ml(～1nM)时61％；400～700ng/ml(＝10nM)时76％；对单体在20μg/ml时为50％[Baier，M.等人，Nature 378563(1995)，Amiel，C.等人，J.Infect.Dis.17983-91(1999)]。
(5)MDC(MW＝7,936)在25ng/ml(＝3.15nM)时20％；50ng/ml(＝6.3nM)时50％和在200ng/ml(＝25nM)时78％[Pal.R.等人，Science 278695-698(1997)]。
(6)SDF-1(MW＝8,698)当测定病毒渗透的抑制率时，在500ng/ml(＝57.5nM)时30％，在1μg/ml(＝115nM)时60％；当测定病毒复制的抑制率时，700μg/ml(＝80.5nM)时为80-85％[Oberlin，E.等人，Nature 382833-835(1996)]。
现已发现了逆转录酶抑制剂(其抑制原病毒的形成)和蛋白酶抑制剂(抑制病毒颗粒的成熟)在AIDS的治疗中的实际用途。因此，现已可以商品购得6种核苷酸-为基础的逆转录酶抑制剂、2种非-核苷酸-为基础的逆转录酶抑制剂和5种蛋白酶抑制剂。已可以使用3种药物联合治疗(HAART高活性抗逆转录病毒治疗)，其联用这些药物中的3种(通常为2种逆转录酶抑制剂和1种蛋白酶抑制剂)，这使得可能将血液中的病毒水平降低至可检测水平之下。
然而，即使是如此三种药物联合治疗也不能完全消灭感染个体中的病毒。因此，为了防止AIDS的发展，那些HIV感染个体不得不在他们的一生中服用这些药物。为了有效，必须大剂量服用这些药物，而且这些药物的服用时间表是严格固定的。有时候按预定的安排表服用药物有困难，将导致顺应性差并降低了治疗效果。另外，这些药物经常会引起严重的副作用。
另一方面，在HIV中发生突变相当频繁。因此在用一种药物治疗几个月后就会出现耐药病毒株。而且当中断该药物治疗时，这种耐药病毒迅速复制，从而使得恢复该药物治疗时药物失效。另外，对某药物有抗性的病毒通常也会获得对其它抗-HIV药物(作用机制相同的药物)的多药物抗性。因此为了阻止AIDS发展并对其进行治疗，关键是要防止耐药HIV的产生。为此目的，同时抑制HIV生命周期的多个阶段是非常重要的。因此，需要新型的药物来抑制现有抗-HIV药物作用的不同阶段的HIV复制。在这一方面，预计CD8-阳性细胞所产生的一些体液因子可作为新型AIDSA治疗药物的潜在化合物，因为虽然这些因子的作用机制未知，但它们在抑制HIV的复制中起着显著作用。
如果在AIDS的治疗过程中出现严重的副作用或耐药性HIV，就需要改变所给予的药物。然而，至今选择的余地极小。因此，需要与那些已知的常规药物作用机制不同的抗HIV药物，来扩大AIDS治疗的选择范围并避免耐药性HIV问题。
在这种情况下，本发明的目的是提供一种新型的抗HIV药物，它的作用机制与目前临床所用的或正开发的那些药物不同。
发明概述本发明的发明者从受HIV感染的人中分离得到一株CD8-阳性细胞，并利用HTLV-1使它们无限增殖和克隆了它们，然后纯化得到一种在细胞上清液中表现出抗HIV活性的未知因子，并对其结构和功能进行了检验。结果，发现该因子是高分子量尿激酶-类型的血纤蛋白溶酶原激活剂的氨基末端片断(ATF氨酸末端片断)。还发现(1)该因子以令人惊讶低的浓度(0.74ng/ml)表现出抗HIV活性，(2)对巨噬细胞-嗜性和T-细胞嗜性HIV毒株都有效，和(3)该因子可能抑制HIV生命周期中病毒mRNA翻译阶段以后的阶段，具体是病毒颗粒装配或出芽阶段。虽然ATF具有特异性结合细胞表面CD87的性能，但采用健康人的尿激酶发现它也具有抗HIV活性，它是高分子量尿激酶类型血纤蛋白溶酶原激活剂(HMW-uPA)，已知其含有分子末端的ATF部分并且是CD87的配体分子。此外，已证实通过降解健康人尿激酶得到的ATF也具有抗HIV活性。而且发现抗CD87抗体具有ATF样抗HIV活性，ATF的抗HIV活性由作为抗CD87抗体靶子(即CD87)的同一靶分子所介导。这些发现显示有可能通过将潜在的HIV宿主细胞上的CD87与一种特异性结合配体分子(如ATF、HMW-uPA或它们的片段或类似物)接触，阻断CD87而抑制HIV的复制。
因此本发明提供了一种抗-HIV药物，其包括作为活性成分的一种结合CD87的配体分子。这种配体是例如高分子量尿激酶类型血纤蛋白溶酶原激活剂。另外，这种配体分子可以是高分子量尿激酶类型血纤蛋白溶酶原激活剂的片段或类似物，其具有对CD87特异性结合亲和力的片段或类似物。另外，此种配体分子可以是高分子量尿激酶-类型血纤蛋白溶酶原激活剂的氨基末端片断(ATF)和具有对CD87特异性结合亲和力的ATF的片段或类似物。此种配体分子的其它例子包括抗CD87抗体(单克隆或多克隆)以及具有对CD87特异性结合亲和力的抗CD87抗体的片段或类似物。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的能结合CD87的配体分子。这些配体的分子的例子如上所述。在这些配体分子中，特别优选ATF和其具有CD87特异性结合亲和力的片段或类似物。
本发明还提供了一种筛选抗-HIV药物的方法，包括分别使待测试的化合物接触CD87，并从这些化合物中选出能特异性结合CD87的化合物。
本发明还提供了一种制备抗-HIV药物的方法，包括如下步骤分别使待测试的化合物与CD87接触，从这些化合物中选出能特异性结合CD87的化合物，证实所选出的化合物具有抗-HIV活性，并将这种已证明具有抗HIV活性的化合物作为抗-HIV药物以给予人的药物制剂形式提供。
本发明还提供了一种筛选抗HIV的药物的方法，包括如下步骤提供一种含有受HIV慢性感染细胞和未感染细胞的共培养系统，将已知浓度的待测试化合物加到此共培养系统中后分别进行共培养，测定释放到共培养上清液中的HIV颗粒的量，将测得的HIV颗粒的量与不加任何测试化合物进行共培养的上清液中释放的HIV颗粒的量进行比较，并根据比较的结果选出显示能抑制HIV颗粒释放的测试化合物作为抗HIV药物。
本发明还提供了一种制备抗-HIV药物的方法，包括如下步骤提供一种含有HIV慢性感染细胞和未感染细胞的共培养系统，将已知浓度的待测试化合物加到此共培养系统中后分别进行共培养，测定释放到共培养上清液中的HIV颗粒的量，将测得的HIV颗粒的量与不加任何测试化合物进行共培养的上清液中释放的HIV颗粒的量进行比较，根据比较的结果筛选出显示能抑制HIV颗粒释放的测试化合物作为抗HIV药物，并将此抗HIV药物以给予人的药物制剂形式提供。
本发明还提供了一种方法，来治疗HIV感染的人以抑制人体内HIV的复制，该方法包括给予人HIV复制抑制量的能结合CD87的配体分子。这种配体分子的例子如上所述。
本发明还提供了将能结合CD87的配体分子用于制备一种药物组合物来抑制HIV感染者体内的HIV复制的用途。这些配体分子的例子如上所述。
附图简述

图1显示了尿激酶-类型血纤蛋白溶酶原激活剂和ATF的一级结构。
图2显示了pSEAP-Basic的结构。
图3显示了pSEP7的结构。
图4显示了pSBR的结构。
图5显示了pNL4-3的结构和PCR扩增的区域。
图6显示了pSBR-HIV的结构。
图7显示了羟基磷石灰柱洗脱组分的抗HIV活性和相应于这些组分的蛋白质浓度。
图8显示了羟基磷石灰柱洗脱组分的SDS/PAGE电泳图谱。
图9显示了加样人尿激酶材料的HiPrep Sephacryl S-100柱洗脱组分的抗HIV活性和这些组分相应的蛋白质浓度。
图10显示了加样人尿激酶材料的HiPrep Sephacryl S-100柱洗脱组分电泳图谱。
图11显示了共培养物(T细胞系)的抗-HIV活性实验结果(p17)。
图12显示了共培养物(巨噬细胞细胞系)的抗-HIV活性实验结果(p17)。
图13显示了非感染细胞(MC141)培养物的SEAP报道子实验结果。
图14显示了非感染细胞(CL35)培养物的SEAP报道子实验结果。
图15显示了用感染性HIV-DNA进行瞬时转染实验的结果。
图16显示了用慢性感染的细胞(U1)进行单-培养实验的结果。
图17显示了在急性感染后的几天内HIV数量的曲线图。
图18的一组图分别显示了感染后的不同天时ATF对病毒复制的抑制。
图19显示了在T细胞系中抗CD87抗体对ATF的抗HIV活性的影响。
图20显示了在巨噬细胞系中抗CD87抗体对ATF的抗HIV活性的影响。
发明详述CD87(一种CD抗原)是无细胞内结构域的一种膜蛋白，属于GPI(糖基磷脂酰肌醇)锚定类家族。它在细胞如T细胞和单核细胞(包括巨噬细胞)的表面表达。已知这种蛋白质对尿激酶原以及高分子量的尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂具有高亲和力，其作用是作为这些细胞如T细胞和单核细胞表面上的受体。首先，合成由氨基酸1-335构成的原形式的人CD87，然后加工从其切下信号肽部分(氨基酸1-22)，再切下羧基末端氨基酸(306-335)。在如此产生的羧基末端(305Gly)上加一个糖脂(GPI)，通过该糖脂将此蛋白质固定在细胞膜上。在CD87中，与配体分子(如尿激酶原和高分子量尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂)结合中起主要作用的是N-末端结构域1(CD87的氨基酸1-92)[Seki等人，Seikagaku，71(5)350-352(1999)]。
在本发明中，术语“结合于CD87的配体分子”指任何能特异性结合CD87的化合物，包括(但不限制于)列举的多肽/蛋白质如尿激酶原、高分子量尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂、ATF和抗CD87抗体以及它们的具有特异性结合CD87能力的片段或类似物，还包括任何其它具有特异性结合CD87能力且可以给予患者的化合物。
HIV可分成HIV-1和HIV-2两亚型。HIV-1和HIV-2都是通过出芽而从宿主释放出的病毒类型，且它们在遗传学上几乎难以区分。它们具有相同的生命周期而且以相同的方式复制。因此，就抗HIV的药物而言无需将它们彼此区分开来，而且实际上用常规抗-HIV药物治疗时它们通常也被视为相等的。在本说明书中(除非特别指出)，术语“HIV”包括“HIV-1”和“HIV-2”。
高分子量尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂(HMW-μPA)(图1(b)氨基酸21-178+氨基酸179-431)是由二硫键连接起来的两条肽链构成的蛋白质。通过在尿激酶原的氨基酸178和179之间的酶促切割形成这两条链，长A和B，即通过除去称为尿激酶原(sc-uPA)(图1(a)；氨基酸1-431)的单链蛋白质中的N-端信号肽(氨基酸1-20)而形成。HMW-uPA包括EGF样结构域、Kringle结构域和尿激酶受体(CD87)结合结构域。
然后体内在氨基酸155和156之间切断HMW-uPA，从而得到低分子量的尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂(LMW-uPA)(图1(c)氨基酸156-178和氨基酸179-431)和无血纤蛋白溶酶原激活剂活性的氨基末端片断(ATF)(图1(d)氨基酸21-155)。在用如磷酸盐缓冲盐水(pH8)培育过程中还在氨基酸155和156之间发生切割。因此，通过在缓冲液(25-37℃)中简单培育HMW-uPA可产生ATF。ATF包括EGF样结构域、Kringle结构域和HMW-uPA的尿激酶受体(CD87)结合结构域。在序列表中，分别以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2列出了编码sc-uPA的核苷酸序列及其氨基酸序列。在SEQ ID NO1和NO2所示的序列中，氨基酸1-20相应于信号肽、氨基酸21-431相应于尿激酶原、氨基酸21-431(在氨基酸178和179间有切割)相应于HMW-uPA、氨基酸21-155相应于ATF、和氨基酸156-431(在氨基酸178和179间有切割)相应于LMW-uPA。
巨噬细胞嗜性HIV引起HIV在人与人之间的传播。感染后随着时间的推移，感染人体中出现了T细胞嗜性HIV，认为这是预后不良相关因素。T细胞和巨噬细胞上出现CD87，且ATF抑制HIV感染的T细胞和巨噬细胞中的HIV复制(通过抑制这些细胞释放HIV)。这意味着感染后无论时间的推移，ATF将作为抗-HIV药物有效地起作用。此外，即使在很低浓度(0.74ng/ml)ATF也有效。因此，给予患者的ATF的量将少于常规抗-HIV药物。这可能减少病人因服药所产生的心理负担。N端包含ATF的HMW-uPA也具有抗HIV活性，虽然比ATF弱些，但可以与ATF相同的方式使用。无论是某完整的主体分子还是自主体上切下产生的ATF形式，一旦给予受感染患者，预计HMW-uPA将表现出抗HIV活性。另一方面，能抑制HIV感染T细胞中HIV复制的抗CD-87抗体可用于抑制感染后出现T细胞嗜性HIV后的HIV复制。
以下所述的测试结果表明作为本发明的抗-HIV药物活性成分之一的ATF，能抑制病毒mRNA翻译以后阶段的病毒生命周期(尤其是病毒颗粒装配或出芽的阶段)，这是与已知的其它抗-HIV药物不同的作用机制。ATF不影响宿主细胞的生长，因此不表现出细胞毒性症状。所以当ATF与常规抗-HIV药物联合使用时，将使感染患者的HIV复制动力学平衡朝有益于患者的方向移动，同时较易避免耐药病毒的产生和副作用问题，从而为AIDS提供改进的治疗方法。
<天然的ATF和重组ATF>
在本发明中，可以从例如健康人尿中得到的尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂制备ATF[Stoppelli，P.M.等人，Proc.Natl.Acacd.Sci.USA，824939-4943(1985)]。例如，在含有0.2M氯化钠的50mM磷酸盐缓冲盐水(pH8)中培育HMW-uPA8小时或更久，将反应产物进行凝胶过滤(如Sephadex G-100)。通过将相应于UV吸收曲线最后峰的洗脱组分与相应于先前峰(即峰1(HMW-uPA)和峰2(LMW-uPA))的组分分开，得到ATF。可将含有ATF的组分加样于离子交换层析柱(如Mono S HR5/5柱；50mM乙酸钠缓冲液，pH4.8，氯化钠梯度为0-1.0M)上进行进一步的纯化。
也可将编码ATF的DNA掺入适当的病毒载体中，然后用此载体转化合适的宿主细胞(如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞)，也可产生呈重组肽的ATF。天然形成的ATF没有糖链，用编码天然ATF的cDNA转化细胞产生的重组ATF具有相同的结构，因此具有与天然ATF相同的活性。可以制备具有特异性结合CD87能力的ATF或HMW-uPA的片断或模拟肽，例如通过部分修饰ATF或HMW-uPA，例如通过从它们的分子末端除去或加入一个或多个氨基酸残基，或取代一个或多个不同的具有类似化学特性的氨基酸残基。虽然这些加工是以化学方式进行的，但这比用已知方法将预定的突变引入编码TFA或尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂的cDNA中要容易得多。
<筛选配体分子的方法>
可以用表面携带有CD87的细胞(T细胞、巨噬细胞)进行本发明的筛选抗-HIV药物的方法，该方法包括分别将待测试的化合物与CD87接触，并从这些化合物中筛选出能特异性结合CD87的化合物。测试化合物与CD87的特异性结合可以通过用本领域已知的检测配体分子与其受体特异性结合的方法进行检测。例如，将待测试的化合物与重组方法产生的CD87混合，培育然后与抗CD-87抗体进行免疫沉淀。通过测定该化合物的共沉淀，可以评估特异性结合的发生。
参考以下的实施例，可实施本发明的筛选抗HIV药物的方法，该方法包括如下步骤提供一种含有HIV慢性感染细胞和未感染细胞的共培养系统，将已知浓度的待测试化合物加到此共培养系统中后分别进行共培养，测定释放到共培养上清液中的HIV颗粒的量，将测得的HIV颗粒的量与不加任何测试化合物进行共培养的上清液中释放的HIV颗粒的量进行比较，根据比较的结果挑选出显示能抑制HIV颗粒释放的测试化合物作为抗HIV药物。对选择用于测定上清液中HIV颗粒量的细胞和方法而言，无需局限于本发明实施例中所公开的细胞和方法，本领域技术人员可以选择任何所需的材料和方法，只要它们适用于本发明的目的。
通过肠胃外途径如注射或植入以及经鼻或经肺给药，将本发明的抗-HIV药物给予HIV感染患者。当本发明的抗-HIV药物以注射形式制备时，可以将制剂制备成适用于例如静脉内、腹腔内、肌内或皮下注射用的。对注射而言，本发明的抗-HIV药物可以无菌、水溶液或非水溶液、悬浮液或乳剂的形式提供。水性介质的例子包括水和一种或多种药学上可接受的惰性溶剂(如盐、多糖多元醇)的水溶液。可以用药学上可接受的缓冲液将它们的pH值调节至合适的范围内。这些水性介质的例子包括(但不限制于)氯化钠溶液、Ringer-葡萄糖溶液、葡萄糖溶液和乳酸Ringer溶液。为了改善制剂保存期中的稳定性，可以将其冷冻干燥。
对注射用制剂的非水性介质而言，可以使用任何肠胃外给药常规使用的非水性介质，例如多元醇如甘油和丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油、豆油、菜籽油)、有机酯如油酸乙酯。
当将本发明的抗-HIV药物以植入物形式使用时，可采用任何缓释载体，以建立所用CD87配体分子如ATF的持久释放。优选使用能减少给予配体分子频率和/或剂量的载体，以简化给药和提高或延长效果。这些载体的例子包括(但不限制于)脂质体、微球体和由天然或合成聚合物制成的微型胶囊。另外，适用于在大部分环境中延长和缓释的载体例子包括明胶、阿拉伯树胶、黄原胶聚合物、聚乳酸、聚羟乙酸和乳酸/聚羟乙酸共聚物。
经鼻或经肺给药(吸入法)是特别有效的减少患者因给药方法的负担的给药方法。在经鼻或经肺给药(吸入法)中，本发明的抗HIV药物可以任何适合于喷雾和吸入的小颗粒形式，如溶液或粉末。这种制剂的例子包括CD87配体分子(如ATF)和载体(颗粒直径小于10μm)的混合物组成的干粉。用于此目的的载体的例子包括单糖如葡萄糖和果糖，双糖如乳糖、麦芽糖和蔗糖，多糖如淀粉、纤维素、透明质酸、壳多糖和壳聚糖，糖醇如山梨糖醇和甘露醇，有机结合剂如纤维素衍生物如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素和羟乙基纤维素以及聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇、非离子表面活性剂，蛋白质如明胶和酪蛋白，和合成的聚合物如聚乙二醇。用于经鼻或经肺给药的其它制剂例子是悬浮于碳氟推进剂中的CD87配体分子如干ATF。
在本发明中，感染患者每份体重的抗-HIV药物中活性成分的剂量ATF约为10μg-10mg/kg/天，HMW-uPA 10μg-10mg/kg/天和抗-CD87抗体10μg-10mg/kg/天。
实施例通过以下的实施例进一步描述本发明。但这些实施例对本发明并无任何限制。
以下列出了用于纯化、鉴定ATF和测定ATF、HMW-uPA和抗-CD87抗体的抗HIV活性所用的材料和方法。
<材料>
1)质粒(i)pNL4-3使用由NIH AIDS研究和参考试剂程序分类号No.114保存的质粒(图5)。该质粒是将从一位HIV-1感染者基因组分离出的HIV-1原病毒基因组DNA掺入pUC18质粒载体构建的[Adachi，A.等人，J.Virol.，59(2)284-291(1986)]。用此质粒转染细胞将使该细胞产生感染性HIV-1病毒。
(ii)pSBR-HIV这是一种将pNL4-3的LTR区域作为启动子掺入到pSEAP-Basic基础质粒(CLONTECH，Palo Alto，CA，USA)中位于其报道基因(即分泌型碱性磷酸酶(SEAP)基因)上游，并进一步掺入潮霉素抗性基因作为选择标记物而构建的质粒。
按如下流程制备此质粒(a)用Notl和SalI消化pSEAP-Basic(图2)(CLONTECH)，切下包括SEAP基因的区域(图2中以弓弧显示)，并用T4聚合酶将其NotI位点加工成钝端。
(b)分别用SalI和ClaI消化pREP7(图3)(INVITROGEN，9704CH，Groningen，the Netherlands)，切下包括潮霉素抗性基因(潮霉素)、ColE1和氨苄青霉素抗性基因(Amp)的区域(图3中以弓弧显示)，并用T4聚合酶将其ClaI位点加工成钝端。
(c)将上述(a)得到的片断与(b)得到的片断连接，构建pSBR(图4)。
(d)分别用包含XhoI或HindIII位点的引物，PCR扩增pNL4-3的HIV-LTR(图5)，用XhoI和HindIII消化PCR产物，和(e)用HindIII消化上述(c)得到的pSBR，然后插入到步骤(d)得到的消化产物HIV-LTR中，构建pSBR-HIV(图6)。
如上所述，构建的pSBR-HIV可作为一种类型质粒的例子，这类质粒具有作为启动子的HIV-LTR并表达报道子基因(在该实施例中为SEAP)。也可构建其它质粒，其同样具有作为启动子的HIV-LTR并能表达合适的报道基因。
2)细胞(i)HUT.78使用由NIH AIDS研究和参考试剂程序分类号No.89保藏的细胞。这是从一位患有赛塞利综合症(一种慢性皮肤淋巴瘤)患者的外周血建立的一株CD4-阳性T细胞系。在含有10％FCS(Gibco/BRL)的RPMI1640培养基中培养这些细胞。
(ii)U937使用ATCC(美国典型培养物保藏中心)保藏的细胞(分类号No.CRL-1593.2)和国立健康科学研究院(日本)保藏的细胞(JCPB分类号No.9021)。这是从一位患有真组织细胞性淋巴瘤患者的腹水建立的一株CD4-阳性成单核细胞系。用含有10％FCS的RPMI1640培养基培养这些细胞。
(iii)TALL-1购得国立健康科学研究院(日本)保藏的细胞JCPB分类号No.0086)。这是从一位患有急性淋巴细胞白血病患者的外周血建立的一株CD4-阳性T细胞系。用含有10％FCS的RPMI1640培养基培养这些细胞。
(iv)T4/NL4-3用pNL4-3转染TALL-1细胞产生此细胞系。这是一株HIV-1慢性感染的细胞系。用含有10％FCS和5μM AZT的RPMI1640培养基培养这些细胞。
(v)U1从NIH AIDS研究和参考试剂程序购得其保藏的细胞(分类号NO.165)。这是一株巨噬细胞-嗜性HIV-1慢性感染的细胞系，通过用一位HIV-1感染者的外周血分离出的临床HIV-1菌株感染U937细胞产生的[Chen，B.K.，等人，J.Virol.，68(2)654-660(1994)]。用含有10％FCS和5μM AZT的RPMI1640培养基培养这些细胞。
(vi)MC141通过用pSBR-HIV转染HUT.78细胞，将HIV-LTR-SEAP报道基因引入HUT.78细胞产生此细胞系。这是一直表达SEAP的一种转染子。在含有10％FCS和300μg/ml潮霉素的RPMI1640培养基中培养这些细胞。
(vii)CL-35此细胞系是一种一直表达SEAP的转染子，是通过用pSBR-HIV转染U937细胞将HIV-LTR-SEAP报道基因引入U937细胞产生的。用含有10％FCS和300μg/ml潮霉素的RPMI1640培养基培养这些细胞。
(viii)克隆#62首先从一位HIV-1感染的长期无症状病史的日本患者的外周血中分离出CD8-阳性T细胞，用包被有抗CD8抗体的磁性小珠进行阳性筛选，并使得到的细胞与等量的产生HTLV-1的T细胞系(MT-2)(100拉德照射)接触，最后在培养1个月以后用有限稀释法克隆，获得无限增殖的此克隆。此克隆培养物的上清液表现出强SHIF(可溶性的HIV复制抑制因子)活性。将这些细胞在含有15％FCS、10单位/ml IL-2和10％PBMC(人外周血单个核细胞)条件培养液的RPMI1640培养基中传代保持。
(ix)PBMC这是用Ficoll-Plaque(Amersham Pharmacia)从鲜血者的血液白细胞层(buffy coat)纯化得到的。在用作条件培养液之前，在含有3μg/ml PHA、1单位/ml IL-2和10％FCS的RPMI1640培养液中培养3天，用相同的但无PHA的培养液替换后再培养6天。
<制备CD8-阳性克隆培养物的上清液>
用含有5％FCS和10单位/ml IL-2的PM1000培养基[Eiken Kagaku]替代RPMI1640培养液后，将原在RPMI1640培养液中保持传代的克隆#62培养3-4天。收集一半培养液，加入相同量的新鲜培养液后继续此细胞培养。用0.22μm膜过滤收集的上清液，以除去任何沉淀物，-80℃保存。
<抗-HIV活性的测定>
1)共培养试验在共培养试验中，培养由HIV慢性感染细胞系的细胞和未感染细胞系的细胞构成的细胞混合物。这提供了包括病毒生命周期所有阶段的一种测试系统，包括未感染细胞上病毒的吸附、感染、感染细胞中病毒的复制和病毒颗粒的释放。因此，用这种共培养系统，通过测定细胞释放出的病毒量并将存在或不存在测试化合物这两种情况下测得的值相比较，可以检测某给定测试化合物的抗病毒活性，而不论该化合物作用于何阶段的病毒。另外，联用T细胞系(HUT.78和T4/NL4-3)或巨噬细胞系(U1和U937)作为HIV慢性感染细胞和未感染细胞，可分别评估测试化合物对T细胞嗜性HIV和巨噬细胞嗜性HIV的抗HIV活性。
测试流程将300μl用PM1000培养液稀释的样品和100μl含有6ng/mlTNFα和20％FCS的RPMI1640培养液置于48孔板上。在其中加入100μl用OPTI-MEM I培养液调节至2×105个细胞/ml的HUT.78细胞，和100μl(5×104个细胞/ml悬浮于RPMI1640培养液中)的T4/NL4-3细胞(感染的T4/NL4-3未感染的HUT.78＝1∶4)，培养此混合物3天。然后用含有相同浓度样品的新鲜培养基替换一半培养上清液，继续培养3天。收集培养6天的上清液，测定病毒(p17)的数量和HIV-LTR转录物(SEAP)的量。在测定中，按制造商的说明使用HIV p17抗原ELISA试剂盒(Eiken Kagaku)和SEAP报道基因试验化学发光试剂盒(ROCHE)。在已培养6天的细胞中加入50μl MTS分析试剂(水溶性的四唑盐)(PROMEGA)。再培养此混合物4小时让颜色显色，在490nm测定光密度，其代表测试时活细胞的数量。
用相同的方法，测定由U1(慢性感染细胞系)和U937(未感染细胞系)(U1∶U937＝1∶4)构成的另一共培养系统。
2)慢性感染的细胞的单培养试验为了收集ATF抑制HIV生命周期的哪个阶段的信息，作为观察抗HIV总活性的基础，测试了在慢性感染的U1细胞构成的单培养系统中ATF的抗HIV活性。因为已知在U1细胞中不发生HIV的多重感染，故在U1细胞的单培养系统中任何检测到的抗HIV活性即提供证据，表明ATF在HIV原病毒DNA转录阶段或之后的阶段起作用。
测试流程将300μl用PM1000培养液稀释的样品和200μl含有6ng/mlTNFα和15％FCS的RPMI1640培养液置于48孔板上。在其中加入100μl用OPTI-MEM I培养液调节至2×105个细胞/ml的慢性感染的细胞(U1)，培养此混合物3天。然后用含有相同浓度样品的新鲜培养基替换一半培养上清液，继续培养3天。收集培养6天的上清液，测定病毒(p17)的数量。
3)用感染性HIV-DNA瞬时转染通过用脂质体强制性地将病毒DNA引入细胞，可以人工地将感染性HIV-DNA置于其进入核的阶段。用此系统，可以检验其给定的测试化合物对HIV生命周期比渗入宿主细胞更后阶段的抑制活性。
测试流程将4μg感染性HIV-1 DNA(pNL4-3)和10μl DMRIE-C试剂(GIBCO/BRL)混合。用此混合物转染2×106MC141细胞。24小时后，收集细胞并用OPTI-MEM I培养液将它们的密度调节至2×105个细胞/ml。将300μl用PM1000培养液稀释的样品和200μl含有6ng/ml TNFα和15％FCS的RPMI1640培养液置于48孔板上。在其中加入100μl转染的MC141细胞(2×105个细胞/ml)，培养此混合物3天。然后用含有相同浓度样品的新鲜培养基替换一半培养上清液，继续培养4天。收集转染后8天的上清液，测定病毒(p17)的数量和HIV-LTR转录物(SEAP)量。
4)未感染细胞中的SEAP报道子试验用TNFα刺激已掺入了HIV-LTR-SEAP报道基因的HIV-未感染的细胞(MC141细胞和CL35细胞)，触发了HIV启动子LTR的活化，导致掺入该启动子下游的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)基因表达。因此，可用这些细胞来检验某给定的测试化合物是否在HIV生命周期的原病毒转录阶段表现出抑制活性，而不HIV的实际复制。通过测定培养上清液中SEAP的量可确定HIV-LTR转录活性的程度。
测试流程将50μl用无血清PM1000培养基稀释的样品和25μl含有6ng/mlTNFα和15％FCS的RPMI1640培养液置于96孔板上。然后用以OPTI-MEM I培养液(GIBCO/BRL)配制的2×105个细胞/ml密度的25μl MC141细胞或C135细胞接种此板。分别用和不用ATF培养这些细胞，收集6天培养物的上清液，用SEAP报道基因试验化学发光试剂盒(ROCHE)测定其中所含有的SEAP的量。
5)测定急性感染中对HIV复制的抑制活性(转染试验)将4μg感染性HIV-1 DNA(pNL4-3)和10μl DMRIE-C试剂(GIBCO/BRL)混合，用此混合物转染2×106个HUT.78细胞。24小时后，收集细胞并用OPTI-MEM I培养液洗涤，密度调节至2×105个细胞/ml。将300μl用含有逐步稀释样品或缓冲液的PM1000培养液和200μl含有6ng/ml TNFα和15％FCS的RPMI1640培养液置于48孔板上。在其中加入100μl转染的HUT.78细胞(2×105个细胞/ml)，培养此混合物4天。然后收集一半培养液，用含有相同浓度样品或缓冲液的新鲜培养基替换。感染后培养继续12天，此期间每4天重复取样和替换一半培养液。
一式两份进行试验(n＝2)，用HIV p17抗原ELISA试剂盒(Eiken Kagaku)测定了培养上清液中病毒的数量。
6)研究抗CD-87抗体对ATF的抗HIV活性的影响因为已知ATF和HMW-uPA都能特异性结合细胞表面上的CD87，故预计ATF和HMW-uPA所观察到的抗HIV活性是通过它们与CD87的结合而介导的。为了验证这一预计，进行了确定抗CD87抗体能否封阻ATF的抗HIV活性的研究。
测试流程将300μl用PM1000培养液(#3936AMERICAN DIAGNOSTICAINC.)稀释的抗CD87单克隆抗体和100μl含有6ng/ml TNFα和20％FCS的RPMI1640培养液置于48孔板上。在其中加入100μl用OPTI-MEM I培养液调节至2×105个细胞/ml密度的MC141细胞，和100μl(5×104个细胞/ml悬浮于RPMI1640培养液中)的T4/NL4-3细胞，培养此混合物2小时(此抗体的终浓度为10μg/ml)。2小时后，加入12μl含有ATF的样品(ATF的终浓度约为3.3ng/ml)。培养3天后，用含有相同浓度抗体和样品的新鲜培养基替换一半培养上清液，继续培养3天。收集培养6天的上清液，测定其中所含病毒(p17)的数量。作为对照，分别用不含抗体或不含ATF或不含这两者的培养液，和含有非特异性IgG替代抗CD87抗体的培养液进行类似的培养。
用相同的方法，用由感染的U1和未感染的C135细胞(U1∶CL35＝1∶4)组成的共培养系统进行了研究。
<具有抗HIV活性的因子的制备>
除非特别指出，以下纯化的整个过程都是在4℃进行的。
1)首先，将1N盐酸加到上清液中，将上清液的pH调节至2.5，然后将此上清液在4℃中静置24小时。经过如此处理后，消除了病毒感染的潜在危险，而且使富含的干扰素γ失活。然后加入1N氢氧化钠溶液，将混合物的pH调节至3.8。将500ml经过pH处理的培养上清液加到SP琼脂糖高效(AMERSHAMPHARMACIA)柱(26mm×10cm)上，该柱已用含有50mM氯化钠的25mM乙酸缓冲液(pH 3.8)平衡。用175ml相同缓冲液洗涤后，用175ml 50mM HEPES/NaOH缓冲液(pH 7.4)(E1)洗涤后，用175ml含有250mM氯化钠的50mMHEPES/NaOH缓冲液(pH 7.4)(E2)洗脱。将缓冲液交换下的各组分通过NAP-5柱，测试其在50％浓度时的抗HIV活性。
2)在从SP琼脂糖高效柱收集的E2组分中发现了活性。将氯化钠加到两批E2组分(相应于1L培养上清液)中，终浓度为500mM。将此溶液加到已用含有500mM氯化钠的50mM HEPES/NaOH缓冲液(pH 7.4)平衡的Blue Sepharose6FF(AMERSHAM PHARMACIA)柱(26mm×10cm)上。用175ml相同缓冲液洗涤后，用200ml含有1.8M氯化钠和0.1％CHAPS的50mM HEPES/NaOH缓冲液(pH 7.4)(E1)洗脱该柱。将此组进行分缓冲液交换通过NAP-5柱，测试其在33％浓度时的抗HIV活性。
3)在从Blue Sepharose 6FF柱上收集的E1组分中发现了活性。将该组分加到已用含1.8M氯化钠和0.1％CHAPS(P)的50mM HEPES/NaOH缓冲液(pH7.4)平衡的HiPreP Butyl(丁基)4FF(AMERSHAM PHARMACIA)柱(16mm×10cm)上。用50ml相同缓冲液(W)洗涤后，用100ml 0.1％CHAPS/水(E)洗脱此柱。将此组分进行缓冲液交换通过NAP-5柱，测试其在33％浓度时的抗HIV活性。
4)在丁基琼脂糖柱收集的非吸附组分(P和W)中发现了活性。将氯化钠加到3批非吸附组分(相应于3L培养上清液)中，终浓度达到2M。将此溶液加到已用含有2M氯化钠和0.1％CHAPS的50mM HEPES/NaOH缓冲液(pH 7.4)平衡的HiPreP Phenyl(HighSub)6FF(AMERSHAM PHARMACIA)柱(16mm×10cm)上。用175ml相同缓冲液洗涤后，用150ml含有250mM氯化钠和0.1％CHAPS(E1)的50mM HEPES/NaOH缓冲液(pH 7.4)洗脱该柱，然后再用100ml0.1％CHAPS/水(E2)洗脱。将此组分进行缓冲液交换通过NAP-5柱，测试其在25％浓度时的抗HIV活性。
5)在收集的E1组分中发现了活性。将此组分加到已用含有0.1％CHAPS的10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.3)平衡的羟基磷石灰(CHT-2，20μm；BioRad)柱(10mm×10cm)上。用50ml磷酸钠缓冲液(W)洗涤后，用含有0.1％CHAPS(E200)的200mM磷酸钠缓冲液洗脱该柱。将此组分进行缓冲液交换通过NAP-5柱，测试其在25％浓度时的抗HIV活性。
6)在收集的羟基磷石灰(P)非吸附组分中发现了活性。用CentriPlus-10(MW10,000cut)超滤膜(AMICON MILLIPORE)将此组分浓缩约40倍。将浓缩的活性组分(3.75ml)加到已用含有0.1％CHAPS和5％甘油的10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.4)平衡的HiPrep Sephacryl S-100HR(AMERSHAM PHARMACIA)柱(16mm×60cm)上。用144ml相同缓冲液洗脱该柱，收集各2.5ml洗脱液。将此组分进行缓冲液交换通过NAP-5柱，测试其在12.5％浓度时的抗HIV活性。
7)收集活性组分，然后用含有0.1％CHAPS的10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.4)稀释2倍，并加到已用相同缓冲液平衡过的Resource S(AMERSHAMPHARMACIA)柱(0.64×3cm)中。用10ml相同缓冲液洗涤后，用含有0.1％CHAPS和氯化钠梯度为0-500mM(共25ml)的10mM磷酸钠缓冲液洗脱该柱，收集各1ml洗脱液。测试这些组分在2.5％浓度时的抗HIV活性。
8)收集活性组分。用含有0.1％CHAPS的10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.35)将3批Resource S活性组分(相应于9L培养上清液)稀释2.5倍，并加到已用此缓冲液平衡过的羟基磷石灰(CHT-2，20μm；BioRad)柱(0.5×5cm)上。用5ml此缓冲液洗涤后，用含有0.1％CHAPS和梯度为10mM-400mM(pH6.35)(共25ml)的磷酸钾缓冲液洗脱该柱，收集各0.5ml洗脱液。
测试了这些组分在1％浓度时的抗HIV活性。对各组分，用释放到HIV慢性感染细胞系和未感染细胞系(1∶4)组成的共培养系统上清液中的p17抗原的ELISA进行抗病毒活性的测定。
当样品的浓度为5％或更高时，将样品通过已用培养液平衡过(为了排除色层分析中过量盐的影响)的NAP-5柱(AMERSHAM PHARMACIA)，进行缓冲液交换，换成无血清PM1000培养液。当样品的浓度低于5％时，直接加样，且将此层析柱空白跑样得到的组分用作对照以消除层析过程中盐的影响。
图7和8显示了结果。在图7中，实心小方块代表所测试组分的抗病毒活性，虚线代表洗脱液的UV吸收曲线，斜线分别代表相应于各组分磷酸钾的浓度。图8显示组分8-19的SDS/PAGE电泳(还原条件)结果。如图7和8所示，在表现出抗HIV活性的组分(以抑制p17释放形式测定)中检测到约18kDa的条带。
9)收集活性组分，并用Centricon-10(MW10,000cut)超滤膜(MILLIPORE)浓缩15倍。为了浓缩羟基磷石灰柱两批活性组分(相应于18L培养上清液)，加入三氟乙酸(TFA)至终浓度为0.2％，将此混合物加到已用0.2％三氟乙酸/水平衡过的Resource PRC柱(AMERSHAM PHARMACIA)(0.64×3cm)上。用5ml缓冲液洗涤后，用5ml梯度为0.2％TFA/30％乙腈的洗脱液洗脱该柱，然后用15ml梯度为0.2％TFA/50％乙腈的洗脱液洗脱，最后用5ml梯度为0.2％TFA/100％乙腈的洗脱液洗脱，收集各0.5ml洗脱液。在10℃进行反相柱层析。测定了0.2％浓度时的抗HIV活性。结果，在SDS/PAGE上也从Resource RPC柱得到的表现出抗HIV活性的各洗脱组分中检测到18kDa条带。
收集活性组分并减压干燥得到约0.9μg(500pmol)的18kDa蛋白质。在活性试验中，将该蛋白质溶于含有0.5％BSA和0.1％CHAPS的磷酸盐缓冲液(PBS)中。将用于测序的蛋白质溶解于SDS/PAGE样品缓冲液中。
<氨基酸测序>
将一部分上述纯化的18kDa蛋白质加到SDS/PAGE上，用考马斯亮蓝(CBB)染色，并切下相应的条带。直接用胰酶消化所切下的凝胶片，并作肽图。在测序仪上分析了获得的3个峰的氨基酸序列。结果，发现存在如下内序列。
SEQ ID NO3所示的氨基酸序列(片断1)SEQ ID NO4所示的氨基酸序列(片断2)SEQ ID NO5所示的氨基酸序列(片断3)片断1、2和3的氨基酸序列与尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂的氨基端片断(ATF，也称为“长A链)的序列相匹配。肽图和氨基酸测序的结果表明上述纯化的蛋白质是ATF。
<从尿激酶粗品材料纯化ATF>
在该活性组分中，未检测到相应于单链尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂、HMW-uPA或LMW-uPA的条带。这强烈提示ATF表现出抗HIV活性。随后本发明的发明者从人尿的尿激酶粗品材料制备了ATF并如下所述评估了它的抗HIV活性。
将4.5ml等量的Seishin Factory of JCR Pharmaceuticals Co.，Ltd生产的人尿尿激酶粗品材料(JUN-9604)，加到已用10mM(含有0.1％CHAPS和100mM NaCl)的磷酸钠缓冲液(pH 6.4)平衡过的HiPrep Sephacryl S-100柱(16mm×60cm)上。用144ml此缓冲液洗脱此柱，收集各2.5ml洗脱液。测定1％浓度时的活性。
由分析结果发现上述尿激酶材料含有9∶1∶1比例的HMW-uPA、LMW-uPA和ATF。将这些组分通过HiPrep Sephacryl S-100柱，那些仅含有ATF(No.27-33)的组成表现出抗HIV强活性(抑制p17的释放)(图9和10)。这表明ATF具有抗HIV活性，如先前用可溶性、HIV复制抑制因子(从克隆#62上清液纯化的)进行的测试所预计的一样。
除了ATF的抗HIV活性外，还发现含有HMW-uPA(No.15-18)的组分具有抗HIV活性(p17)，虽然其弱于ATF(图9和10)。
<ATF在共培养系统中的抗HIV活性的试验结果>
纯化的ATF浓度依赖性地减少了由T细胞系或巨噬细胞系组成的共培养系统上清液中存在的p17的量。浓度1.5ng/ml时抑制率约为40％(图11和12)。由于加入ATF不改变培养的细胞的增殖速率(与对照相比)(图11和12)，显然ATF不影响细胞的增殖且无细胞毒性。这些发现表明ATF所观察到的抗HIV活性不是因为某些类型细胞毒性，ATF在极低的浓度表现出抗HIV活性，且ATF表现出对T细胞嗜性HIV和巨噬细胞嗜性HIV基本相同的抗HIV活性。
<在未感染细胞的培养物中进行SEAP报道子试验的结果>
见图13和14。在MC141和CL35细胞单培养物中进行的SEAP报道子试验中，ATF不影响两类细胞培养上清液中碱性磷酸酶的量(图13和14)。这表明ATF不抑制处于HIV-LTR促进的转录或其后翻译阶段的HIV的复制。在所述条件下，还证实了ATF不影响细胞的增殖速率(图13和14)。
<用感染性HIV-DNA瞬时转染的结果>
见图15。同样在用感染性HIV-DNA(pNL4-3)瞬时转染MC141细胞的试验中，1.5ng/ml ATF抑制了60％HIV p17释放到培养上清液中。然而，ATF对SEAP的表达没有影响，从而对LTR的转录促进活性没有影响。也没有观察到对细胞增殖速率的影响。
事实上，当ATF抑制p17释放时，LTR促进的转录水平未受ATF的影响，这表明所观察到的ATF抗HIV活性不是因为对LTR促进的转录、HIV-tat-增强的转录或随后的翻译阶段的任何抑制，并且提示所观察到的抗HIV活性是对翻译之后的某些阶段(即HIV颗粒的装配或出芽)的抑制结果。
<慢性感染细胞的单培养试验结果>
见图16。在慢性感染细胞(U1)的单培养试验中，1.5ng/ml ATF抑制了50％释放到培养上清液中的病毒抗原p17。然而，细胞内的p17未受ATF的影响。ATF也不影响细胞的增殖速率。
因为众所周知在U1细胞中不发生HIV的多重感染，故在U1细胞单培养中可检测到的抗HIV活性限于在原病毒DNA转录阶段或之后阶段的活性。因此，在U1细胞单培养物中ATF对病毒颗粒(p17)释放的抑制表明，ATF具有抑制原病毒DNA转录阶段或其之后阶段的活性。另一方面，由于ATF不影响细胞内p17的量，看来ATF不影响HIV原病毒DNA转录到HIVmRNA翻译的任何阶段。慢性感染细胞的单培养试验的结果与上述瞬时转染试验得到的结果相同。这些发现强烈提示ATF抑制HIV mRNA翻译之后的某些后期阶段，即HIV颗粒的装配到病毒颗粒出芽的阶段。
<急性感染(转染试验)中对HIV复制抑制活性试验的结果>
见图17，其显示了从培养开始后各天的病毒数量分布图。从图中可以看出在对照组在开始培养后的第8到第12天期间病毒的数量迅速增加。发现所用的缓冲液的影响极小。另一方面在ATF组中，病毒复制的速度显著降低，且发现对病毒复制的抑制取决于ATF的浓度。另外，对病毒复制的抑制率随着培养时间的推移而增加(参见图18)，显示感染后12天0.74ng/ml ATF时大于75％，2.22ng/ml ATF时大于87％。
<抗CD87抗体对ATF的抗HIV活性的影响>
见图19。在T细胞系即T4/NL4-3和MC141的共培养系统中，无论使用何种培养液即仅含有3.3ng/ml ATF的培养液或含有3.3ng/ml ATF和10μg/mlCD87单克隆抗体(CD87是ATF和HMW-uPA的受体)的培养液都观察到对释放到培养上清液中的p17的几乎相同的抑制。另一方面，发现10μg/ml抗-CD87抗体本身具有可与3.3ng/ml ATF大致相比的抗HIV活性。因为用含有抗CD87抗体或ATF或这两者的培养液观察到对p17释放的抑制水平相当，故认为ATF和抗CD87抗体二者通过细胞上的共同靶分子起作用。另外，用非特异性IgG替代抗CD87抗体进行的培养得到的结果，与不用任何抗体培养所得到的结果相同。此发现表明所观察到的抗CD87抗体的抗HIV活性取决于它的特异性。因此，认为此抗体通过特异性结合于细胞上的CD87而抑制HIV的释放。认为将ATF加到含有抗CD87抗体的培养液中不提高对HIV释放的抑制，是因为ATF不能与CD87结合，CD87已被抗CD87的抗体封闭了。更重要的是，由于抗CD87抗体和ATF都在T细胞系中表现出抗HIV活性(p17)而且这两种化合物都特异性结合于CD87，上述试验得到的结果表明CD87与其配体分子的特异性结合(由细胞中的一些未知机理所引起)导致对HIV释放(装配或出芽阶段)的抑制。
另外，在由巨噬细胞系U1和U937组成的共培养系统中(参见图20)，加入抗CD87抗体完全封阻了ATF的抗HIV活性。另外，在这些细胞系中抗CD87抗体未显示出抗HIV活性。因此这些结果与上述在T细胞中得到的结果不同。然而，这种矛盾可如下解释在含ATF和抗CD87抗体的培养液培养的细胞中，抗CD87抗体由于某些原因不能对巨噬细胞显示抗HIV活性，仅起到封阻CD87的作用，从而防止ATF结合CD87。因此上述结论，即ATF通过结合于CD87抑制了HIV的复制，也得到了巨噬细胞系中抗CD87抗体封阻了ATF的抗HIV活性这一事实的支持。
CD87及其复合物位于被称为“脂类运输筏”的富含神经鞘酯的细胞表面结构上[Koshelnic，Y.等人，Thromb.Haemost.，82(2)305-311(1999)]，而据报道HIV的出芽选择性地发生在脂类运输筏区域[Nguyen，D.H.等人，J.Virol.，74(7)3264-3272(2000)]。另外，已知也位于脂类运输筏区域的Thy-1被HIV选择性摄入其包膜中[Nguyen，D.H.等人，J.Virol.，74(7)3264-3272(2000)]。综合来看，这些报道和本发明实验的发现提出了一可能的机制，即CD87的配体分子如ATF，通过CD87对脂类运输筏成分分子的作用，抑制HIV的出芽。
<制备实施例1>制备静脉内、皮下或肌内注射剂按以下配方，将必要量的成分混合形成溶液，并将此溶液用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，制备所需的制剂。
ATF………………………………10mg甘露醇……………………………50mg蒸馏水……………………………至1ml<制备实施例2>制备静脉内、皮下或肌内注射剂按以下配方，将必要量的基本成分混合形成溶液。加入ATF后，将溶液配制到一定体积，并用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，制备所需的制剂。
ATF………………………………50mg氯化钠……………………………8.6mg氯化钾……………………………0.3mg氯化钙……………………………0.33mg注射用蒸馏水……………………至1ml<制备实施例3>制备静脉内、皮下或肌内注射剂按以下配方，将必要量的基本成分混合形成溶液。加入ATF后，将溶液配制到一定体积，并用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，制备所需的制剂。
ATF………………………………50mg氯化钠……………………………8.3mg氯化钾……………………………0.3mg氯化钙……………………………0.33mg磷酸氢二钠·12H2O……………1.8mg1N盐酸…………………………q.s.(pH 7.4)注射用蒸馏水……………………至1ml<制备实施例4>制备静脉内、皮下或肌内注射剂按以下配方，将必要量的基本成分混合形成溶液。加入ATF后，将溶液配制到一定体积，并用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，制备所需的制剂。
ATF……………………………………50mg氯化钠………………………………8.3mg氯化钾………………………………0.3mg氯化钙………………………………0.33mg葡萄糖………………………………0.4mg磷酸氢二钠·12H2O…………………1.8mg1N盐酸………………………………q.s.(pH 7.4)注射用蒸馏水………………………至1ml<制备实施例5>制备肺给药制剂按以下配方，称取ATF和乳糖并将它们溶于120ml纯水中得到喷雾溶液，用常规方法喷雾干燥形成用于肺部给药的制剂。
ATF…………………………………100mg乳糖(一水合物)…………………2900mg总计………………………………3000mg<制备实施例6>制备肺给药制剂按以下配方，称取ATF和羟丙基纤维素并将它们溶于120ml纯水中得到喷雾溶液，用常规方法喷雾干燥形成用于肺部给药的制剂。
ATF…………………………………100mg
羟丙基纤维素……………………2900mg总计………………………………3000mg<制备实施例7>制备肺给药制剂按以下配方，称取ATF和氢化卵磷脂并将它们溶于120ml纯水中得到喷雾溶液，用常规方法喷雾干燥形成用于肺部给药的制剂。
ATF…………………………………100mg氢化卵磷脂………………………2900mg总计………………………………3000mg<制备实施例8>制备肺给药制剂按以下配方，称取ATF、羟丙基纤维素和D-甘露醇并将它们溶于90ml纯水中得到喷雾溶液，用常规方法喷雾干燥形成用于肺部给药的制剂。
ATF…………………………………240mg羟丙基纤维素……………………129mgD-甘露醇…………………………2631mg总计………………………………3000mg本发明提供了一种新型抗-HIV的药物，其通过与常规药物已知的不同作用机制抑制感染患者中的HIV复制。因此，本发明为AIDS治疗方法拓展了选择余地，用于发病前预防和发病后治疗目的，与常规抗-HIV药物联用从而改善AIDS的治疗效果。
序列表<110>日本化学研究株式会社(JCR Pharmaceuticals Co.，Ltd.)<120>抗HIV药物<130>GP47<160>5<210>1<211>1296<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atg aga gcc ctg ctg gcg cgc ctg ctt ctc tgc gtc ctg gtc gtg agc 48Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser1 5 10 15gac tcc aaa ggc agc aat gaa ctt cat caa gtt cca tcg aac tgt gac 96Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp20 25 30tgt cta aat gga gga aca tgt gtg tcc aac aag tac ttc tcc aac att 144Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile35 40 45cac tgg tgc aac tgc cca aag aaa ttc gga ggg cag cac tgt gaa ata 192His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile50 55 60gat aag tca aaa acc tgc tat gag ggg aat ggt cac ttt tac cga gga 240Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly65 70 75 80aag gcc agc act gac acc atg ggc cgg ccc tgc ctg ccc tgg aac tct 288Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser85 90 95gcc act gtc ctt cag caa acg tac cat gcc cac aga tct gat gct ctt 336Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu100 105 110cag ctg ggc ctg ggg aaa cat aat tac tgc agg aac cca gac aac cgg 384Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg115 120 125agg cga ccc tgg tgc tat gtg cag gtg ggc cta aag ccg ctt gtc caa 432Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln130 135 140gag tgc atg gtg cat gac tgc gca gat gga aaa aag ccc tcc tct cct 480Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro145 150 155 160cca gaa gaa tta aaa ttt cag tgt ggc caa aag act ctg agg ccc cgc 528Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg165 170 175ttt aag att att ggg gga gaa ttc acc acc atc gag aac cag ccc tgg 576Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp180 185 190ttt gcg gcc atc tac agg agg cac cgg ggg ggc tct gtc acc tac gtg 624Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val195 200 205tgt gga ggc agc ctc atc agc cct tgc tgg gtg atc agc gcc aca cac 672Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His210 215 220tgc ttc att gat tac cca aag aag gag gac tac atc gtc tac ctg ggt 720Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly225 230 235 240cgc tca agg ctt aac tcc aac acg caa ggg gag atg aag ttt gag gtg 768Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val245 250 255gaa aac cta atc cta cac aag gac tac agc gct gac acg ctt gct cac 816Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His260 265 270cac aac gac att gcc ttg ctg aag atc cgt tcc aag gag ggc agg tgt 864His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys275 280 285gcg cag cca tcc cgg act ata cag acc atc tgc ctg ccc tcg atg tat 912Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr290 295 300aac gat ccc cag ttt ggc aca agc tgt gag atc act ggc ttt gga aaa 960Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys305 310 315 320gag aat tct acc gac tat ctc tat ccg gag cag ctg aaa atg act gtt 1008Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val325 330 335gtg aag ctg att tcc cac cgg gag tgt cag cag ccc cac tac tac ggc 1056Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly340 345 350tct gaa gtc acc acc aaa atg ctg tgt gct gct gac cca cag tgg aaa 1104Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys355 360 365aca gat tcc tgc cag gga gac tca ggg gga ccc ctc gtc tgt tcc ctc 1152Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu370 375 380caa ggc cgc atg act ttg act gga att gtg agc tgg ggc cgt gga tgt 1200Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys385 390 395 400gcc ctg aag gac aag cca ggc gtc tac acg aga gtc tca cac ttc tta 1248Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu405 410 415ccc tgg atc cgc agt cac acc aag gaa gag aat ggc ctg gcc ctc tga 1296Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu420 425 430<210>2<211>431<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser1 5 10 15Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp20 25 30Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile35 40 45His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile50 55 60Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly65 70 75 80Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser85 90 95Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu
100 105 110Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg115 120 125Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln130 135 140Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro145 150 155 160Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg165 170 175Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp180 185 190Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val195 200 205Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His210 215 220Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly225 230 235 240Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val245 250 255Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His260 265 270His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys275 280 285Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr290 295 300Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys305 310 315 320Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val325 330 335Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly340 345 350Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys355 360 365Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu370 375 380Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys385 390 395 400Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu405 410 415Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu420 425 430<210>3<211>4<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Lys Lys Phe Gly<210>4<211>12<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gln5 10
权利要求
1.一种抗HIV的药物，其特征在于，所述的药物包含作为活性成分的结合CD87的配体分子。
2.如权利要求1所述的抗HIV药物，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是高分子量尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂。
3.如权利要求1所述的抗HIV药物，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是高分子量尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂的片段或类似物，这种片段或类似物具有对CD87的特异性结合亲和力。
4.如权利要求1所述的抗HVI药物，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是ATF。
5.如权利要求1所述的抗HIV药物，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是ATF的片段或类似物，这种片段或类似物具有对CD87的特异性结合亲和力。
6.如权利要求1所述的抗HIV药物，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是抗CD87抗体。
7.如权利要求1所述的抗HIV药物，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是抗CD87抗体的片段或类似物，这种片段或类似物具有对CD87的特异性结合亲和力。
8.一种抗HIV的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含活性成分ATF或其具有对CD87特异性结合亲和力的片段或类似物。
9.一种筛选抗HIV药物的方法，其特征在于，所述方法包括分别将待测试的化合物与CD87接触，并从这些化合物中挑选出能特异性结合CD87的化合物。
10.一种制备抗HIV药物制剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤分别将待测试的化合物与CD87接触，从这些化合物中挑选出能特异性结合CD87的化合物，证明所选出的化合物具有抗-HIV活性，并将这种已证明具有抗HIV活性的化合物作为抗-HIV药物以给予人的药物制剂形式提供。
11.一种筛选抗HIV药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤提供一种由HIV慢性感染细胞和未感染细胞组成的共培养系统，将已知浓度的待测试化合物加到此共培养系统中后，分别进行共培养，测定释放到共培养上清液中的HIV颗粒的量，将测得的HIV颗粒的量与不加任何测试化合物进行共培养的上清液中释放的HIV颗粒的量进行比较，根据比较的结果选出显示能抑制HIV颗粒释放的测试化合物作为抗HIV药物。
12.一种制备抗-HIV药物的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤提供一种由HIV慢性感染细胞和未感染细胞组成的共培养系统，将已知浓度的待测试化合物加到此共培养系统中后分别进行共培养，测定释放到共培养上清液中的HIV颗粒的量，将测得的HIV颗粒的量与不加任何测试化合物进行共培养的上清液中释放的HIV颗粒的量进行比较，根据比较的结果选出显示能抑制HIV颗粒释放的测试化合物作为抗HIV药物，并将此抗HIV药物以给予人的药物制剂形式提供。
13.一种通过抑制人体中HIV的复制来治疗HIV感染的人的方法，其特征在于，所述的方法包括将HIV复制抑制量的能结合CD87的配体分子给予所述的人。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是高分子量的尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是高分子量尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂的片段或类似物，这种片段或类似物具有对CD87的特异性结合亲和力。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是ATF。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是ATF的片段或类似物，这种片段或类似物具有对CD87的特异性结合亲和力。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是抗CD87抗体。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是抗CD87抗体的片段或类似物，这种片段或类似物具有对CD87的特异性结合亲和力。
20.一种结合CD87的配体分子的用途，其特征在于，可用于制备抑制HIV感染的人体中的HIV复制的药物组合物。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是高分子量的尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂。
22.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是高分子量尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂的片段或类似物，这种片段或类似物具有对CD87的特异性结合亲和力。
23.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是ATF。
24.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是ATF的片段或类似物，这种片段或类似物具有对CD87的特异性结合亲和力。
25.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是抗CD87抗体。
26.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述结合CD87的配体分子是抗CD87抗体的片段或类似物，这种片段或类似物具有对CD87的特异性结合亲和力。
全文摘要
公开了抗－HIV药物。该药物包含有作为活性成分之一的结合CD87的配体分子。这种配体分子的例子包括高分子量尿激酶类血纤蛋白溶酶原激活剂、其氨基端片断、它们的类似物和抗－CD87抗体。
文档编号A61P31/00GK1371747SQ0210515
公开日2002年10月2日 申请日期2002年2月20日 优先权日2001年2月20日
发明者和田学, 和田直子 申请人:日本化学研究株式会社