专利名称：亲水性聚合物－谷氨酸寡肽与药物分子的结合物、包含该结合物的组合物及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的异端基遥爪亲水性聚合物—谷氨酸寡肽与药物分子的结合物、包含该结合物的药物组合物以及该结合物在制备药物中的用途。
为解决此问题，已广泛地使用聚乙二醇衍生物，使其与蛋白质、肽或其他治疗药物的结合，以延长药物的生理半衰期、降低其免疫原性和毒性。在临床使用中，PEG及其衍生物作为制作药物制剂的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用，而将PEG键合到药物分子的尝试在最近十年里也得到了长足的发展，在许多批准药品中广泛被使用，如PEG-intron，一种α-干扰素与聚乙二醇的键合物就表现出了更长的循环半衰期和更好的治疗效果。紫杉醇与聚乙二醇的键合物也相应的降低了毒性和延长了生物活性。它们在人体内的代谢过程已相当清楚，是一种安全的，无副作用的药物改性剂。
在与药物结合时，常用到一种被称为聚乙二醇(PEGylation)化的工艺，即聚乙二醇两端的一个或二个端基被化学活化后具有一适当的官能团，此官能团对要结合的药物中的至少一个官能团具有活性，能与之形成稳定的键，并可在体内适当的情况下被降解除去，而释放出活性成分。
有报道表明聚乙二醇可以用于和很多药物连接。第5824701和5840900号美国专利以及中国专利CN1283643报道了此类衍生物和紫杉醇键合的前药，在该药物模型中聚乙二醇两端都只键合了一个紫杉醇分子。为了提高对药物分子的负载率，第6153655号美国专利披露了一种链端分支聚乙二醇结构，该结构在聚乙二醇的两端通过氨基连接生成了两个功能基团。但是引进非生物的支链小分子引进了药物的不确定性。第5977163和6262107号美国专利以及中国专利CN1164533公开了一种聚谷氨酸支载的紫杉醇前药，此药物模型中紫杉醇沿聚谷氨酸骨架链随机的连接到谷氨酸的活性羧基上，较宽的聚合率分布以及对聚谷氨酸毒性的不可确知性限制了该发明的使用。
根据本发明的另一个方面，其提供包含上述结合物物作为活性成分的药物组合物。
根据本发明的再一个方面，其提供所述结合物在制备药物药物组合物中的用途。
根据本发明的结合物可改善药物吸收，延长作用时间，增强疗效，降低给药剂量及避免某些毒副作用。
在本发明结合物的结合物中，谷氨酸寡肽的多羧基基团提供了多个结合点，使得对药物分子的负载能力高于普通的线性PEG支载剂。与聚谷氨酸不同之处在于，谷氨酸寡肽在每条寡肽链中具有确定数目的活性羧基。因此，当结合药物如紫杉醇分子时，药物分子的负载率将很容易确认和重复。由于诸如紫杉醇等药物本身的非亲水性，所形成的亲水性聚合物—谷氨酸寡肽—药物分子的结合物在水溶液中将形成以若干分子聚集组成分子团的微球结构。该结构保留了亲水性聚合物良好的亲水性、柔性、抗巨噬细胞吞噬性等优良特性，同时提供了对药物分子的缓释控释，可以极大的延长药物，尤其是天然药物分子，在体内的停留周期。
本发明的一个优点是除了保留有亲水性聚合物如聚乙二醇或其衍生物通常的溶解性、非免疫原性和无毒等特征外，寡肽基团将提供对药物分子的多个负载点，保证了药物分子的有效血药浓度和分步释放。
现在以聚乙二醇衍生物为例，说明本发明中亲水性聚合物与多羧基寡肽的连接。
聚乙二醇衍生物的结构中包括了聚合物支链部分和端基功能团部分，分别描述如下。
聚乙二醇(PEG)，其结构通式如I所示 其中R为H或C1-12烷基，n为任何整数，表征其聚合度。
当R为低级烷基时，R可以是含有1-6个碳原子的任何低级烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基或正己基。当R为环烷基时，R优选为含3-7个碳原子的环烷基，如环丙基、环丁基和环己基。优选的环烷基为环己基。其典型的化合物是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其他聚乙二醇类似物或聚乙二醇共聚物也可用于此发明应用，如聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉等。
对聚乙二醇而言，一般采用分子量予以表示，只要使形成结合物的聚乙二醇的分子量为300～60000道尔顿，这相当于n为大约6～1300。更优选的是，n为28、112和450，这分别相应于分子量为1325、5000和20000。由于通常由其平均分子量而非自重复单元限定的起始PEG化合物的潜在不均一性，优选用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整数n表示PEG聚合物中的自重复单元。各种分子量的起始PEG化合物可以通过本领域中的已知方法制备或者可以从商业来源得到。谷氨酸寡肽(Oligo-GA)，其结构通式如II所示 其中n为2-12的整数，表征其聚合度。
寡肽合成可参照通用的合成办法，使用保护氨基酸，在脱水剂的作用下可得到很好产率的氨基酸聚合物。当然，本发明中使用的寡肽为同多肽，不存在有结构顺序问题，因此可以采用更简便的办法制备，如混合酸酐法、活化酯法、N-羧基内酸酐(NCA)法等。
以N-羧基内酸酐(NCA)法为例 该反应具有如下优点反应速度快，合成周期短；合成结束后，所得到的氨基游离的肽可以不用分离而直接用于第二轮的肽合成；侧链可以较少保护，除NCA的侧链需要保护以外，氨基组分只有Lys和Cys必须保护。
Oligo-GA化合物可以通过本领域中的己知方法制备或者可以从商业来源得到。
本发明为亲水性聚合物—谷氨酸寡肽部分是通过本领域技术人员已知的方法由亲水性聚合物和谷氨酸寡肽合成的。在实际应用中，需要对亲水性聚合物的端基部分予以活化，以保证其能够和寡肽的氨基或者羧基发生反应而将二者结合。针对需要实现的用途，可以采用以下几种方法对端基官能团进行改性a.氨基化，氨基化后的亲水性聚合物，由反应活性较大的氨基取代了羟基，在与一个含羧酸基的分子进行反应形成键合物中尤其重要。
b.羧基化，亲水性聚合物羧基化后，可提高其反应性，使之可以和另一含氨基或羟基的分子反应形成键合物。
c.其他如酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物等改性方式也可适当采用。
这几种方法均可使亲水性聚合物和寡肽上的官能团以化学键的方式连接，以使二者的优良性能各自得到很好的发挥。
在目前使用许多药物、尤其是天然药物成分中都含有氨基、羧基、羟基等官能团，它们在生物体内通常都与单糖、多糖、核苷、多聚核苷、磷酰基等成分结合，以形成在生物体中有活性的药理结构。
因此，亲水性聚合物-谷氨酸寡肽可以通过相同的方式和这些药物分子结合，以替代生物有机分子，并克服生物有机分子在生物体内生理半衰期短的，药效持续时间短的缺陷。本发明的亲水性聚合物-谷氨酸寡肽与药物的结合物具有以下结构式 其中P是水溶性聚合物，其可以是聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉及它们的共聚物等，其中优选聚乙二醇或其共聚物；M是2-12的整数；X是连接基团，优选为(CH2)i、(CH2)iOCO、(CH2)iNHCO、(CH2)iCO等，其中i是1～10的整数；TA为药物分子。
亲水性聚合物上如果有游离羟基，则该游离羟基可用C1-12烷氧基、环烷氧基或芳烷氧基封端，优选是甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基、环丁氧基、环己氧基以及苄氧基。
另外，在该亲水性聚合物上还可连接靶向分子，如抗体等，以便定向转运本发明的结合物。
亲水性聚合物-与药物分子可例如通过酯基合成反应而结合在一起，该过程可简单地如下所示 酯基在生物体中可以通过生物降解的方式除去，而释放出活性成分。
在本发明的结合物中可使用合适的药物分子构成其中的药物部分，其包括氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱等。按照治疗用途，可在本发明中使用的药物包括但不限于镇痛剂和消炎剂、抗酸剂、驱虫药、抗心律不齐药、抗菌剂、抗凝(血)剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、止泻剂、抗癫痫药、防真菌剂、抗痛风药、抗高血压药、抗疟药、抗偏头痛药、抗毒蕈碱剂、抗瘤剂和免疫抑制剂、抗原虫药、抗风湿药、抗甲状腺剂、抗病毒剂、抗焦虑剂、镇静剂、安眼药和安定药、β-受体阻断剂、心脏收缩剂、皮质类甾醇、镇咳剂、细胞毒性剂、减充血剂、利尿剂、酶、抗帕金森氏症药、胃肠道药、组胺受体拮抗剂、油脂调节剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、硝酸酯和抗心绞痛药、营养剂、麻醉性镇痛剂、口服疫苗、蛋白、肽和重组药物、性激素和避孕药、杀精子剂、和刺激剂。
在本发明的结合物中，药物分子部分优选是由天然植物中分离的药物活性成分，如华蟾酥毒基、甘草次酸、和东莨菪内酯。该药物分子部分特别优选是用于治疗肿瘤的天然药物成分，例如紫杉醇、喜树碱、依托泊苷以及它们的衍生物等。
本发明的结合物可以纯化合物形式或适宜的药物组合物进行给药，可采用任何可接受的给药方式或用于类似的用途的试剂进行。组合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活性成分(一种或多种)的本发明的结合物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂等。
通常，根据所需给药方式，药学上可接受的组合物将包含约1至约99重量％的本发明结合物、以及99至1重量％的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约5至75重量％的本发明结合物，其余为适宜的药用赋形剂。
优选的给药途径是注射给药，采用常规日剂量方案，该方案可根据疾病的严重程度进行调整。本发明的结合物或其药学上可接受的盐也可配制成注射用剂，例如使用约0.5至约50％的活性成分分散于可采用液体形式给药的药用辅剂中，实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。
如果需要的话，本发明的药物组合物还可包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，例如柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。
该类剂型的实际制备方法是本领域的技术人员公知的或者显而易见的，例如可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。无论如何，按照本发明的技术，所使用的组合物将含有治疗有效量的本发明结合物，以用于治疗相应的疾病。实施例下面结合实例描述本发明的结合物及其制备方法，它不限制本发明，本发明的范围由权利要求限定。
实施例1甲氧基聚乙二醇谷氨酸寡肽的制备 10克甲氧基聚乙二醇(分子量为5000)和2克N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯溶于100毫升乙睛中，再加入0.5毫升无水吡啶。反应混合物在氮气保护下室温搅拌过夜。多余溶剂通过旋转蒸发除去，产物真空干燥。固体产物加入20毫升无水二氯甲烷中，不溶物通过过滤除去，有机相用醋酸钠缓冲溶液(0.1M，pH5.5)洗涤一次。再用无水硫酸钠干燥，浓缩。产物用乙醚转移，过滤真空干燥。产率9.0克(90％)。NMR(DMSO)3.5(br m，PEG中的氢)，3.24(s，3个氢)，4.45(t，2个氢)，2.82(s，4个氢)。
0.6克谷氨酸二肽(Glu-Glu)溶于50毫升磷酸盐缓冲溶液(0.1M，pH7.4)，在溶液中添加4克上步反应制备的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基碳酸酯(分子量为5000)。溶液室温下搅拌6小时，用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压旋转蒸发除去溶剂，残余物用100毫升异丙醇，过滤，产物真空干燥。产物可通过离子交换色谱纯化。产率3.6克(90％)。NMR(DMSO)3.5(br m，PEG中的氢)，3.24(s，3个氢)，4.41(t，2个氢)，2.32(t，4个氢)。
实施例2甲氧基聚乙二醇谷氨酸寡肽与紫杉醇的结合物的制备 1.25克由实施例1制得的甲氧基聚乙二醇谷氨酸二肽、0.7克紫杉醇、0.1克4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于15毫升无水二氯甲烷中，再添加0.2克二环己基碳二亚胺(DCC)。溶液在氮气保护下，室温过夜搅拌反应。多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加8毫升1，4二氧六环溶解。过滤除去沉淀，溶液浓缩，残余物添加30毫升异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。产率1.6克(80％)。熔点59-62℃。
实施例3甲氧基聚乙二醇谷氨酸寡肽和喜树碱结合物的制备 2.5克由实施例1制得的甲氧基聚乙二醇谷氨酸二肽、0.6克喜树碱、溶于30毫升无水二氯甲烷和20毫升无水吡啶中，再添加0.4克二环己基碳二亚胺(DCC)。溶液在氮气保护下，室温过夜搅拌反应。多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加15毫升1，4二氧六环溶解。过滤除去沉淀，溶液浓缩，残余物添加50毫升异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。产物可通过离子交换色谱纯化。产率2.5g(80％)。熔点60-63℃。
实施例4甲氧基聚乙二醇谷氨酸寡肽和华蟾酥毒基(Cinobufagin)结合物的制备1克甲氧基聚乙二醇谷氨酸二肽(由例1制得)，溶解在10毫升二氯甲烷中。添加60毫克华蟾酥毒基，32毫克4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和40毫克二环己基碳二亚胺(DCC)。溶液在氮气保护下，室温过夜搅拌反应。多余溶剂旋转蒸发除去，残余物添加20毫升1，4二氧六环溶解。过滤除去沉淀，溶液浓缩，残余物添加100毫升异丙醇(IPA)，过滤，产物真空干燥。产率0.8g(60％)。熔点58-80℃。
实施例5甲氧基聚乙二醇谷氨酸寡肽和甘草次酸(Clycyrrhetinic Acid)结合物的制备1克甲氧基聚乙二醇谷氨酸二肽(例1中制得的)，溶解在10毫升二氯甲烷中，溶液中滴加0.2毫升二硫酰氯，溶液搅拌2小时。减压蒸馏除去溶剂和低沸点杂质。再加入含70毫克甘草次酸的二氯甲烷溶液10毫升，搅拌溶解。再添加60毫克的二甲基氨基吡啶(DMAP)。此溶液在室温下氮气保护搅拌12小时，真空浓缩溶剂，剩余物加入20毫升异丙醇(IPA)。过滤收集沉淀再用乙醚洗涤后抽干，真空干燥。产物可通过离子交换色谱纯化。产率0.8g(60％)。熔点60-62℃。
实施例6甲氧基聚乙二醇谷氨酸寡肽和东莨菪内酯(Scopoletin)结合物的制备 5克甲氧基聚乙二醇谷氨酸二肽(例1中制得的)溶在50毫升二氯甲烷中，再加入0.70克的东莨菪内酯，0.12克的1-羟基苯并三氮唑(HOBT)、0.1克的二甲基氨基吡啶(DMAP)和0.82克的二环己基碳二亚胺(DCC)。此溶液在室温下氮气保护搅拌12小时，真空浓缩溶剂，剩余物加入20毫升1，4-二氧六环中，过滤收集沉淀再用乙醚洗涤后抽干。溶液减压蒸除，残余物添加100毫升异丙醇(IPA)。过滤收集沉淀再用乙醚洗涤后抽干。合并沉淀物，真空干燥。产率4g(80％)。熔点58-61℃。
实施例7本实施例说明代表性非胃肠道给药的药物组合物的制备过程，所述组合物包含本发明的结合物。
成分本发明的结合物2g0.9％盐水溶液至100mL将本发明的结合物溶解于0.9％盐水溶液，得到100mL的静脉内溶液，将其通过0.2μ的膜过滤材料过滤，在无菌条件下包装。
权利要求
1.以下式的亲水性聚合物—谷氨酸寡肽与药物分子的结合物 其中P是水溶性聚合物；m是2-12的整数；j为1-6的整数；R1为选自于以下组中的基团H、C1-12烷基、取代芳基、芳烷基、杂烷基、和取代烷基；X是连接基团；以及TA为药物分子。
2.如权利要求1所述的结合物，其中，所述水溶性聚合物选自于聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉以及它们的共聚物。
3.如权利要求2所述的结合物，其中，所述水溶性聚合物是聚乙二醇。
4.如权利要求3所述的结合物，其中，聚乙二醇的分子量为300～60,000。
5如权利要求1所述的结合物，其中，连接基团X是(CH2)i、(CH2)iOCO、(CH2)iNHCO、或(CH2)iCO，而i是0-10的整数。
6.如权利要求1所述的结合物，其中，所述亲水性聚合物上的游离羟基可用C1-12烷氧基、环烷氧基或芳烷氧基封端。
7.如权利要求1所述的结合物，其中，在所述亲水性聚合物上可携带靶向分子以定向转运该结合物。
8.如权利要求7所述的结合物，其中，所述靶向分子是抗体。
9.如权利要求1所述的结合物，其中，药物部分选自于以下类别中的一种氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱。
10.如权利要求9所述的结合物，其中，药物部分选自于以下组中镇痛剂和消炎剂、抗酸剂、驱虫药、抗心律不齐药、抗菌剂、抗凝(血)剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、止泻剂、抗癫痫药、防真菌剂、抗痛风药、抗高血压药、抗疟药、抗偏头痛药、抗毒蕈碱剂、抗瘤剂和免疫抑制剂、抗原虫药、抗风湿药、抗甲状腺剂、抗病毒剂、抗焦虑剂、镇静剂、安眼药和安定药、β-受体阻断剂、心脏收缩剂、皮质类甾醇、镇咳剂、细胞毒性剂、减充血剂、利尿剂、酶、抗帕金森氏症药、胃肠道药、组胺受体拮抗剂、油脂调节剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、硝酸酯和抗心绞痛药、营养剂、麻醉性镇痛剂、口服疫苗、蛋白、肽和重组药物、性激素和避孕药、杀精子剂、和刺激剂。
11.如权利要求9所述的结合物，其中，药物部分是天然药物活性成分。
12.如权利要求11所述的结合物，其中，天然活性成分是华蟾酥毒基、甘草次酸、或东莨菪内酯。
13.如权利要求10所述的结合物，其中，所述药物部分是抗肿瘤剂免疫抑制剂。
14.如权利要求13所述的结合物，其中，所述抗肿瘤剂免疫抑制剂选自于紫杉醇、喜树碱、依托泊苷以及它们的衍生物。
15.一种异端基遥爪聚乙二醇谷氨酸寡肽酯与药物分子的结合物，其结构式为 其中n是10-1200的整数；m是2-12的整数；X是选自于以下组中的连接基团(CH2)i、(CH2)iOCO、(CH2)iNHCO、(CH2)iCO，其中i是0-10的整数；PT为选自于紫杉醇、喜树碱、华蟾酥毒基、甘草次酸、东莨菪内酯以及它们的衍生物的药物。
16.药物组合物，其包含如任一前述权利要求所述的结合物以及药物学是可接受的载体或赋形剂。
17.如权利要求16所述的组合物，其还可包含其他的治疗活性成分。
18.如权利要求16所述的组合物，其为注射用剂、溶液剂、片剂、混悬剂或气雾剂的剂型。
19.如权利要求1-15之一所述的结合物在制备药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种以下式的亲水性聚合物—谷氨酸寡肽与药物分子的结合物其中P是水溶性聚合物；m是2－12的整数；j为1－6的整数；R
文档编号A61K9/08GK1442440SQ0210669
公开日2003年9月17日 申请日期2002年3月5日 优先权日2002年3月5日
发明者嵇世山, 朱德权 申请人:北京键凯科技有限公司