专利名称：一种来源于植物的新型、高效免疫佐剂及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，本发明涉及一种从植物中提取的新型、高效免疫佐剂，以及此免疫佐剂的制备方法和用途。本发明还证实了这种植物来源的免疫佐剂对抗原递呈细胞功能的激活作用。具体地说，本发明的免疫佐剂是一种从植物中提取的、能够直接激活抗原递呈细胞功能的新型、高效免疫佐剂。
背景技术：
八十年代初，日本科学家在寻找卡介苗中的抗瘤活性成分时，首先证明了卡介苗的基因组DNA在动物体内具有抗瘤活性，并于1988年提出细菌的基因组DNA具有刺激脾细胞增殖、促进NK细胞功能、诱导干扰素的产生等免疫刺激活性。随后证明了具有Pur-Pur-CpG-Pyr-Pyr基序的DNA或寡核苷酸具有免疫刺激活性。正是由于细菌及其他低等生物的DNA内存在这样的基序，才具有了免疫刺激活性，而哺乳动物等基因组内缺乏这样的基序(“CpG抑制”现象)，因此不具有类似的免疫刺激活性。
含CpG基序的DNA或寡核苷酸(CpG-DNA/ODN)的主要作用对象是机体的抗原递呈细胞(APC，包括树突状细胞、巨噬细胞、B细胞)，刺激APC分泌IL-12和TNF-α，并上调与抗原提呈相关的MHC分子、共刺激分子等，这两种因子刺激T细胞和NK细胞产生IFN-γ。因此CpG-DNA/ODN主要促进Th1型反应的发生，包括增强Th1型细胞免疫反应和引导抗体反应向Th1型发展，同时也可促进机体对抗原的细胞毒活性。
自1996年以来，关于CpG-DNA/ODN的免疫刺激活性的研究已经成为生物医学研究领域的热点，主要是因为作为一种作用明显、制备简便的新型免疫增强剂，在动物体系的多种实验模型中均显示了良好结果，提示了CpG-DNA/ODN广阔而光明的临床应用前景。CpG-DNA可增强单抗瘤抗体在体内对肿瘤细胞的ADCC活性。CpG-ODN与肿瘤相关抗原联合免疫小鼠，可延迟后植肿瘤的生长。存在于载体序列上的CpG基序可以增强基因疫苗的诱导的免疫反应。CpG-ODN可治疗曼氏血吸虫虫卵和乙酰甲基胆碱诱发的哮喘，预防和治疗利什曼原虫引起的变态反应，保护致死剂量Francisella土拉菌或产单核细胞李斯特菌的冲击。CpG-DNA/ODN可促进受照射小鼠造血功能的恢复，与其促进释放的多种细胞因子如IL-12、IL-6等有关。CpG-ODN诱导机体对乙肝表面抗原产生强烈的Th1型体液及细胞免疫反应。
由于上述CpG-DNA/ODN的强烈免疫刺激活性和诱人的应用前景，国外目前有多家医药公司在试图开发出以CpG-DNA/ODN为基础的药物，用于治疗某些与免疫相关的疾病或用作疫苗的佐剂。有关资料显示，类似的开发多注重化学合成的ODN方面。
关于天然存在的DNA的免疫刺激活性，以往多集中在细菌DNA上，近年有报道其他一些物种如昆虫、真菌DNA也由于其低甲基化水平而具有与细菌DNA类似的活性[Sun S，Beard C，Jaenisch R，Jones P，Sprent J Mitogenicity of DNA fromdifferent organisms for murine B cells.J Immunol 1997；1593119-3125；Sun S，Kishimoto H，Sprent J.DNA as an adjuvantcapacity of insect DNA and syntheticoligodeoxynucleotides to augment T cell response to specific antigen.J Exp Med 1998；1871145-1150]。
研究已表明，基因组DNA来源的CpG-DNA以及CpG-ODN作为一种作用明显、制备简便的新型免疫增强剂，能够显著增强机体免疫反应，具有强烈的免疫刺激活性。因此，研究和开发以CpG-DNA/ODN为基础的药物用于治疗某些与免疫相关的疾病或用作疫苗的佐剂具有重要意义和广泛的应用前景。然而，在本申请之前，尚未公开过本发明所涉及的来源于植物的新型、高效免疫佐剂。
发明内容
在本发明的目的是提供新颖的、从植物中分离的DNA免疫佐剂，该免疫佐剂是来源于属于十字花科的常见蔬菜植物-鸡毛菜(Brassica Chinensis，BC)的总DNA。
在本发明的另一目的，是提供所述免疫佐剂的制备方法。
在本发明的另一目的，是提供所述免疫佐剂对抗原递呈细胞功能的激活作用。
在本发明的另一目的，是提供包含所述免疫佐剂的的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种植物免疫佐剂，它是植物总DNA，其纯度大于70％，或其OD260/OD280为1.6-1.8。
在一优选例中，所述的植物选自十字花科，更佳地选自芸苔属，最佳地，所述的植物选自中国白菜(Brassica Chinensis)、黄芽菜、甘蓝、苤蓝、芥菜，或其组合。
在另一优选例中，所述CpG-DNA的甲基化程度高于细菌DNA而低于哺乳动物DNA，且所述纯度大于80％，较佳地大于90％，更佳地大于95％，最佳地大于99％。
在另一优选例中，所述佐剂是通过以下步骤制备的(a)裂解植物样品；(b)氯仿/异戊醇抽提，以去除蛋白质；(c)沉淀总DNA；(d)将总DNA沉淀重新溶解；(e)乙醇沉淀总DNA，并洗涤去除杂质；(f)将总DNA沉淀溶于水中。
在本发明的第二方面，提供了一种制备植物免疫佐剂的方法，包括以下步骤(a)裂解植物样品；(b)氯仿/异戊醇抽提，以去除蛋白质；(c)沉淀总DNA；(d)将总DNA沉淀重新溶解；(e)乙醇沉淀总DNA，并洗涤去除杂质；(f)将总DNA沉淀溶于水中。
在一优选例中，在步骤(a)之前还包括步骤将所述植物烘干，制成粉末；以及在步骤(f)之后还包括步骤(g)通过CsCl超速离心进一步纯化总DNA。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的权利要求1所述的DNA免疫佐剂以及药学上可接受的载体。
在本发明的第四方面，提供了本发明所述的植物免疫佐剂的用途，它被用于制备药物，所述药物用于(a)激活抗原递呈细胞功能而增强机体免疫反应，或(b)治疗感染性疾病、肿瘤、和免疫缺陷性疾病及免疫相关性疾病。
图1是本发明的植物来源的免疫佐剂与其他几种来源的DNA制品的甲基化程度分析，其中E.coli(大肠杆菌)DNA、BC(鸡毛菜)DNA、ZM(玉米)DNA和CT(小牛胸腺)DNA分别以MspI、EcoRI及HpaII酶切。
图2是本发明的植物来源的免疫佐剂对B细胞增殖的激活作用。
图3是本发明的植物来源的免疫佐剂对体液免疫的影响。
图4是本发明的植物来源的免疫佐剂对骨髓来源的树突状细胞(BMDC)表面分子表达的作用。
图5是本发明的植物来源的免疫佐剂对骨髓来源的树突状细胞(BMDC)产生细胞因子的促进作用。其中5A为IL-12产生；5B为IL-6产生。
图6是本发明的植物来源的免疫佐剂对骨髓来源的树突状细胞(BMDC)和脾脏巨噬细胞抗原递呈活性的作用。
图7是甲基化对本发明的植物来源的免疫佐剂的免疫刺激活性的影响。其中7A显示甲基化的植物DNA对HpaII酶切具有抗性；7B为甲基化的植物DNA不能刺激巨噬细胞和脾细胞的抗原递呈功能。
图8是本发明的植物来源的免疫佐剂对肿瘤生长和转移的抑制作用。其中8A为瘤内注射对肿瘤生长的抑制作用；8B为腹腔注射对肿瘤转移的抑制作用。
图9是本发明的植物来源的免疫佐剂对荷瘤小鼠血清中IFN-γ水平的影响。
具体实施例方式
基于以下几点因素，本发明人认为某些植物DNA可能同样具有免疫刺激活性第一，多数植物对CpG的利用没有抑制现象，一般双子叶植物基因组DNA中G+C含量约为46％，单子叶植物更高达60-70％。
第二，在许多植物品系中，基因组DNA均处于未甲基化或低甲基化状态。
第三，一般公认植物叶绿体DNA是非甲基化的，每个绿色植物细胞内叶绿体可达700～1200拷贝，每拷贝长度为1.25×105碱基，所以细胞内叶绿体DNA可占细胞总DNA的很大一部分。若从植物细胞中提取总DNA(包括染色体DNA和叶绿体DNA)或只应用叶绿体DNA，应当可以测到其免疫刺激活性。
对于DNA具有免疫刺激活性的常用植物，尤其是食用蔬菜，用于开发该类佐剂或药物，除了经济效益方面的优势外，尚基于以下考虑。DNA大分子虽一直被认为是弱抗原，但近年来的研究表明其引起抗体产生的机理与蛋白抗原相似。这样在蛋白抗原中的一些基本概念同样适用于DNA抗原。而蔬菜是人类自幼开始食用的主要养素之一，成熟机体已产生对植物DNA的耐受。因此即使大量使用来源于植物DNA的CpG制剂，也不会产生针对DNA的抗体反应。
基于上述因素，本发明人经过广泛而深入的研究，从常见蔬菜植物-鸡毛菜的总DNA中分离到了一种新型免疫佐剂，证实其CpG-DNA的甲基化程度较低，高于细菌DNA而低于哺乳动物DNA和玉米DNA。进行了研究，并初步证明其具有免疫刺激活性。此植物DNA免疫佐剂可呈剂量依赖性刺激B细胞增殖，促进树突状细胞的表达共刺激分子和分泌IL-12和IL-6，增强树突状细胞和巨噬细胞的抗原递呈能力。体内实验可抑制原位肿瘤生长和肿瘤转移。因此，本发明的植物来源免疫佐剂可直接激活包括树突状细胞、B细胞和巨噬细胞在内的抗原递呈细胞的功能，可能在抗感染、抗肿瘤、免疫缺陷性疾病和过敏性疾病等免疫相关性疾病等多个领域的免疫治疗方面具有重要的开发和应用价值。
如本文所用，“DNA纯度”指DNA相对于样品中的蛋白质、脂类、糖类和核酸类物质的总重量而言的纯度。
OD260/OD280是表征DNA纯度的常用指标。本发明植物DNA佐剂的OD260/OD280通常为1.6-1.8，较佳地为1.7-1.8。
可用于制备本发明佐剂的植物包括任何植物。优选的植物是十字花科(Cruciferae)，尤其是芸苔族(Brassiceae)芸苔属(Brassica L.)的植物，例如(1)食用蔬菜小白菜(Brassica chinensis L.)，又称鸡毛菜、青菜，(2)北方人常用的黄芽菜(结球白菜)等白菜类植物，(3)甘蓝(比如甘蓝、菜花)、(4)苤蓝、(5)芥菜(包括雪里红、榨菜等)。上述蔬菜均为中国的常用蔬菜。
可用于制备本发明佐剂的原料没有特别限制，可以是任何富含植物DNA的部分，例如叶、茎、根、芽、花、果实等。原料可以是新鲜的原料，也可以经过预处理的原料，例如干燥处理过的原料，以及磨成粉末的远离。
制备本发明佐剂的方法与常规的提取DNA的方法很相似，其中裂解细胞、氯仿/异戊醇抽提去除DNA、乙醇沉淀等步骤都是本领域熟知的。需指出的是，本发明的发明点并不在于具体的DNA提取步骤，相反，许多等价的DNA提取步骤都可用于本发明。本发明的发明点在于发现植物(如芸苔属)总DNA的CpG-DNA的甲基化程度高于细菌(如大肠杆菌)DNA而低于哺乳动物(牛)DNA，因而适合用作免疫佐剂。
一种优选的制备方法包括以下步骤以植物为原料，置于70℃烤箱中烘烤风干，磨成粉末，通过溴化十六碳烷基三甲铵(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)沉淀法，经氯仿/异戊醇抽提、乙醇沉淀等步骤选择性地沉淀大分子量DNA，去除多糖(包括LPS)等其他污染，得到DNA溶液，即本发明的植物免疫佐剂。
本发明的植物免疫佐剂的剂型没有特别限制，可以是溶解于各种溶剂(或缓冲液)中的溶液、冻干粉剂、或片剂等。
利用本发明佐剂，通过各种常规筛选方法，可选出与本免疫佐剂发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。本发明免疫佐剂及其抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。
通常，可将本发明的佐剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中。配制好的佐剂可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的免疫佐剂可用于疾病治疗，例如，用于感染、炎症、肿瘤、免疫缺陷性疾病和过敏性疾病等免疫相关性疾病等方面的治疗。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明免疫佐剂(或其激动剂、拮抗剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。使用药物组合物时，将安全有效量的本免疫佐剂施用于哺乳动物和人体，具体剂量应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
将普通玉米(Zea may)(ZM)用25℃水浸泡3小时，暗处萌发过夜，在医用纱布上铺成疏散的一层，用两层湿纱布覆盖，在室温下培养，及时洒水以保证种子和芽苗顺利生长。约待芽叶长至5厘米长度，齐根剪下。同上处理。
烘干材料用家用搅肉机磨成粉末，保存于密封容器。为防潮，在其中放入数粒变色硅胶。(2)植物DNA的提取参照Murray和Thompson(1980)等人的溴化十六碳烷基三甲铵(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)沉淀法提取植物DNA，程序如下。该法的优点在于除了选择性地沉淀大分子量DNA外，CTAB还可有效地去除多糖(包括LPS)等其他污染。
植物粉末+抽提缓冲液a(比例为100mg∶1mL)↓50～60℃放置30分钟，时常轻轻混匀↓加等量氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀↓
13000g离心10分钟↓上清加1/10体积等渗液b↓重复氯仿/异戊醇抽提↓水相上清加沉淀液c↓室温放置30分钟↓离心2000g×5分钟↓沉淀溶于2mL TE中↓常规方法用乙醇沉淀、洗涤↓沉淀溶于水中a)抽提缓冲液0.7M NaCl，1％CTAB，50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，1％2-巯基乙醇b)等渗液0.7M NaCl，1％CTABc)沉淀液1％CTAB，50mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA.
(3)细菌基因组DNA的制备离心收获100mL～300mL DH5α大肠杆菌过夜培养物↓悬于3.75mL 25％蔗糖缓冲液(用50mM Tris-HCl pH8.0配制)↓加1.25mL溶菌酶溶液(10mg/mL)↓冰上放置5分钟加1.25mL 0.5M EDTA pH8.5
↓混匀，冰上放置5分钟加0.5mL 25％SDS↓60℃ 5分钟加5M NaCl至1M终浓度↓用等体积氯仿/异戊醇抽提3次↓水相于室温对1L 5mM EDTA透析24小时↓用乙醇沉淀DNA溶于2mL 0.7M NaCl溶液，加入220μL等渗液↓充分混匀用氯仿/异戊醇抽提↓重复CTAB、氯仿/异戊醇抽提，直至中间相消失↓沉淀DNA(4)植物或细菌DNA的进一步纯化为对DNA进行准确定量以比较细菌、植物、小牛胸腺DNA的活性强度，对植物、细菌DNA进行CsCl超速离心纯化。
(5)小牛胸腺(calf thymus，CT)DNACalbiochem公司产品，用酚/氯仿抽提两遍后，常规方法进行沉淀和溶解。
所有DNA制品均以10mg/mL浓度溶于TE，冻存于-20℃。临用前融化，用PBS稀释至适当浓度(如100ug/ml)。于沸水中煮沸10分钟(同时完成消毒和变性)，然后立即置于冰上。实施例2植物DNA甲基化的分析了解DNA甲基化的粗略方法是检测DNA的酶切情况。尽管不同的结构和位点发生甲基化的倾向不同，目前仍主要联合使用识别1C2CGG位点的二种限制性内切酶，HpaII和MspI，二者均识别1C2CGG位点。当其中的1C、2C中任何一个发生甲基化时，HpaII即不能切割该位点；而无论2C是否发生甲基化，MspI均可顺利切割。由于已知2C位点的甲基化可以使CpG的免疫刺激活性消失，因此通常采用DNA对HpaII切割的敏感性反映其甲基化程度。分别取鸡毛菜(BC)DNA、玉米(ZM)DNA、E.coli DNA和小牛胸腺(CT)DNA 2μg在20μL体系内用3单位HpaII、MspI或EcoRI酶消化2小时，于0.8％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。同时设置不酶切对照。
对所用的几种DNA制品进行酶切分析，可以看出E.coli DNA可被HpaII顺利切割成小片段，而BC DNA仅能被部分切割，CT DNA则几乎完全不能被切割，表明BC DNA的甲基化程度确实较低(图1)。根据对HpaII作用的敏感性从高到低依次为E.coli DNA、BC DNA、ZM DNA和CT DNA。实施例3植物DNA对小鼠脾细胞增殖反应的影响经无菌钢网研磨Balb/c小鼠脾脏制备的全脾细胞，用Tris-NH4Cl法去除红细胞。37℃培养2小时后，将细胞分成黏附和非黏附细胞群。非黏附细胞与单克隆145-2C11(抗CD3)、2.43(抗CD4)、和GK1.5(抗CD8)混合细胞上清以及兔补体在37℃孵育1小时，用培养基洗涤后得到的即为B细胞。非黏附细胞与B220(抗B细胞)上清及补体共育1小时可得到纯化的T细胞。
将Balb/c小鼠脾单个核细胞悬液、纯化的B细胞和T细胞分别以2～10×106/mL×100μL/孔接种于96孔板，加入DNA、ConA或LPS溶液至一定终浓度。于37℃培养36小时后，每孔加入3H-TdR 1μCi。继续培养8小时后收获细胞，用液闪仪测定3H-TdR掺入量。
与所报道的其它CpG制品一致，结果显示BC和ZM DNA均可呈剂量依赖性刺激全脾单核细胞增殖。用DNA制品分别作用于分离的B细胞和T细胞，发现E.coli、BC和ZM DNA仅能影响B细胞增殖，而对T细胞无作用(图2)。提示植物DNA促进B细胞增殖。实施例4植物DNA对体液免疫的影响用OVA作为抗原进行免疫监测小鼠体液免疫反应。200μg OVA(以1mg/mL溶于PBS)与400μg DNA(2mg/mL，溶于PBS)或200μL福氏完全佐剂(CFA)或PBS混合，于颈背部和尾根部皮下各注射200μL。免疫后第三天开始常规取尾静脉血，用ELISA法测定血清中抗OVA IgG抗体滴度。用OVA包被96孔酶联板(20μgOVA/mL×100μL/孔，溶于0.1M NaHCO3，PH8.5)，置4℃过夜。用PBS/0.05％Tween-20洗涤五遍，每孔加3％ BSA(PBS配制)于37℃阻断一小时，洗涤五遍。按2复孔/样本加入100μL系列稀释的血清样本，酶联免疫板于4℃放置5小时。洗涤酶联免疫板，加辣根过氧化物酶标记的大鼠抗小鼠IgG抗体。室温置45分钟后，洗涤5遍，加入酶底物(ABTS)，室温反应20分钟，于405nm读取OD值。
结果显示，BC DNA可增强蛋白抗原特异性抗体的产生(图3)，提示植物DNA能够激活B细胞，是一种有效的免疫佐剂。实施例5抗原递呈功能的分析小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)使用GM-CSF+IL-4的方法制备。培养6天后，DNA制品(200μg/ml)与OVA(200μg/ml)一起加入细胞悬液中。于37℃ CO2孵箱培养过夜后。收集上清检测细胞因子的分泌，收集细胞，用FITC标记的抗Ia、CD40、B7-2分子的单克隆抗体标记细胞表面分子，并用FACS检测表型和分析功能。
结果显示，植物DNA与培养第6天BMDC共育18小时，可以增加Ia+细胞的比例，促进共刺激分子(CD86)、CD40的表达(图4)，提高培养上清中IL-12和IL-6的分泌(图5)。
小鼠BMDC与DNA和OVA共育12小时，用培养基洗涤三遍，经60Co照射后以每孔103个细胞铺于96孔培养板。每孔加入5×104个脾脏初始型T细胞。于37℃ CO2孵箱培养36小时后，每孔加入3H-TdR 1μCi。继续培养12小时后收获细胞，用液闪仪测定3H-TdR掺入量。
结果显示，E.coli和BC DNA明显增强BMDC对初始型T细胞的抗原递呈能力，而CT DNA无此作用(图6)。实施例6甲基化对植物DNA免疫刺激活性的影响以可以特异性甲基化CpG中胞嘧啶的SssI甲基化酶处理BC DNA，分别取甲基化和未甲基化的BC DNA2μg，在20μL体系内用3单位HpaII或MspI酶消化2小时，于0.8％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。同时设置不酶切对照。分别以甲基化和未甲基化的BC DNA，用3H-TdR掺入法测定植物DNA对巨噬细胞和脾细胞抗原递呈活性的影响。
结果显示，甲基化BC DNA对HpaII酶消化不再敏感(图7A)。同时，甲基化BC DNA不能促进脾脏巨噬细胞的抗原递呈功能(图7B)。实施例7植物DNA对小鼠肿瘤生长的抑制作用小鼠原位肿瘤的复制及处理小鼠右后髂部用8％ Na2S脱毛后在某一固定部位用苦味酸标记，将Balb/c小鼠结肠腺癌细胞系CT26细胞以4×105/只剂量皮下接种于该标记点。肿瘤接种日为“0天”。第4天时开始进行DNA处理，(100μg/0.1mL/只，注射于标记点，每组4只)，每2天注射一次，共6次。进行DNA注射处理时均同样尽量准确地注射于标记处。在荷瘤后第15天时，放血处死小鼠，取出肿瘤结节并称重。
肿瘤肺转移模型的复制及处理Balb/c小鼠于0天时经尾静脉注射CT26细胞1×105/只(5×105/mL×0.2mL/只)，作为结肠腺癌肺转移模型。荷瘤前2天(-2天)开始进行DNA处理(200μg/只，i.p.，每组4只)。每2天注射一次，共6次。荷瘤后第15天，放血处死小鼠，收集血清检测细胞因子的分泌，计数肺表面肿瘤结节。
结果显示瘤内注射植物DNA可以延缓肿瘤的生长(图8A)。腹腔注射植物DNA阻碍处于血液循环内的肿瘤细胞定位并在肺部形成结节(图8B)。同时E.coli DNA和BC DNA增强了小鼠血清中IFNγ的分泌(图9)。提示植物DNA抑制肿瘤生长和抗肿瘤转移的能力可能与增强细胞免疫相关。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种植物免疫佐剂，其特征在于，它是植物总DNA，其纯度大于70％，或其OD260/OD280为1.6-1.8。
2.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述的植物选自十字花科芸苔属。
3.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述的植物选自中国白菜(BrassicaChinensis)、黄芽菜、甘蓝、苤蓝、芥菜，或其组合。
4.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述CpG-DNA的甲基化程度高于细菌DNA而低于哺乳动物DNA，且所述纯度大于90％。
5.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述佐剂是通过以下步骤制备的(a)裂解植物样品；(b)氯仿/异戊醇抽提，以去除蛋白质；(c)沉淀总DNA；(d)将总DNA沉淀重新溶解；(e)乙醇沉淀总DNA，并洗涤去除杂质；(f)将总DNA沉淀溶于水中。
6.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该佐剂的剂型选自下组水剂，冻干粉剂。
7.一种制备植物免疫佐剂的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)裂解植物样品；(b)氯仿/异戊醇抽提，以去除蛋白质；(c)沉淀总DNA；(d)将总DNA沉淀重新溶解；(e)乙醇沉淀总DNA，并洗涤去除杂质；(f)将总DNA沉淀溶于水中。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(a)之前还包括步骤将所述植物烘干，制成粉末；以及在步骤(f)之后还包括步骤(g)通过CsCl超速离心进一步纯化总DNA。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的DNA免疫佐剂以及药学上可接受的载体。
10.如权利要求1所述的植物免疫佐剂的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于(a)激活抗原递呈细胞功能而增强机体免疫反应，或(b)治疗感染性疾病、肿瘤、和免疫缺陷性疾病及免疫相关性疾病。
全文摘要
本发明涉及了一种从植物中提取的新型、高效免疫佐剂，它是植物大分子DNA。本发明提供这种免疫佐剂的制备方法及其生物学和免疫学性质。这种植物来源的免疫佐剂对抗原递呈细胞功能的激活作用。本发明还公开了此免疫佐剂的用途，特别可用于感染、肿瘤、免疫缺陷性疾病和过敏性疾病等免疫相关性疾病的治疗。
文档编号A61P31/00GK1463748SQ02112128
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月19日 优先权日2002年6月19日
发明者曹雪涛, 王宜强, 王闻雅, 李楠, 于益芝 申请人:第二军医大学免疫学研究所