专利名称：具有抑制Ⅰ型单纯疱疹病毒复制功能的蛋白分子及其制备方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种由单纯疱疹病毒结合细胞受体后特异诱导产生的蛋白分子。
一些实验已经提示HSV感染不同细胞后会表现不同的感染过程和不同的感染结局，最为关键的原因就是HSV结合不同的细胞表面的受体后，所诱导的基因反应有一定的差异，而这些各异的基因反应产物对HSVI进入细胞后的感染过程有直接的影响。因此导致了病毒感染可能走向不同结局。
随着分子病毒学研究的深入，对病毒进入细胞过程的各个环节均有了更进一步的认识。因此，可以明确，病毒与宿主细胞之间的相互作用—即感染过程—实际上开始于病毒颗粒与其位于细胞膜上的特异受体相结合之时。而病毒与相应受体的结合，事实上模拟了生理配体与相应受体的结合过程，这个结合过程可以和正常生理配体一样使受体发生活化，并通过激酶反应过程激活信号传导成分，使相应信号导入细胞内，此信号必然会诱导细胞产生一系列的基因反应，而此基因反应将可以产生多种具有基因调控活性的蛋白分子或者某些功能性产物，后者可能以细胞因子或其它形式表现，并对细胞的生物学活性及病毒的复制过程产生一定影响。由于病毒结合受体之后较短时间内即进入细胞，并以其增殖过程破坏细胞，所以，由病毒引起的最具有意义的细胞基因反应属于早期基因反应，对细胞基因反应的研究表明，在细胞对外界信号刺激的反应过程中，早期基因反应具有启动某些次级基因反应的功能，同时还具有向其它细胞传递特殊信号，例如与免疫系统相关的信号因子以及表现某些特定生理作用的功能。因此，可以认为，对病毒与细胞的相互作用研究能够为病毒与细胞相互作用的研究中引入一种综合的观念，即由于病毒对受体的结合，使得细胞产生相应的早期基因反应，已和未经病毒结合的细胞内环境有所差异，而病毒所表现的病理感染结果，实际上是在这样的特定细胞内环境作用下形成的。
对由病毒结合受体所导致的细胞早期基因反应的分析，是目前病毒与细胞相互作用研究领域中的空白点。但这个领域的研究在探索细胞对病毒感染产生的相应反应的机理，和病毒与细胞相互作用的各种可能的生物学意义及结果，以及由此确定的，进一步的病毒感染病理学结局研究，都具有很大的意义和潜力。虽然该领域内的国内外专家均已公认病毒结合受体的确会给细胞导入特定信号，但此信号所导致的基因反应--尤其是早期基因反应对病毒在该细胞或与该细胞相邻的同种细胞中感染过程的各种影响，尚无具体的研究探索。
技术方案1.序列特征编码该蛋白分子基因全长为904bp，其具有完整的5′-非编码区和3′-非编码区，编码区可编码一个由121个氨基酸组成的蛋白质(命名为SR-15)，分子量为14.9KD，该蛋白结构上表现为N端具有一个RS重复区域，在中部具有一个PPLP结构域，并以含有16.5％的精氨酸和12.4％的丝氨酸为基本特征。
2.SR-15基因序列表1GGCGCGCCCG GGACGGAACC TGGGGCGTCA GAACGAAAGG CAGCGGCGCC GCGCTTCCCACCGCGCGGGC CCTGCCTTGG ACCCCGCAGT CTTGCTTTCC GTCGCCGCGG CGCGAAGGGT61GCCGGCCAGC CTCCCGCGCA GCGCCCCGGC CGGAAGCCTC CTCGCCGCCG CTTCCTCTCGCGGCCGGTCG GAGGGCGCGT CGCGGGGCCG GCCTTCGGAG GAGCGGCGGC GAAGGAGAGC121AGAAGGCGCG GGGCGGGCTG TCCGGCCCGC AGGGCGGTCG AGCCCGCGGC GCCATGGCTCTCTTCCGCGC CCCGCCCGAC AGGCCGGGCG TCCCGCCAGC TCGGGCGCCG CGGTACCGAG181ACGTCGGCTC CCGCAAGCGC TCGAGGAGTC GCAGCCGGTC CCGGGGACGG GGGTCGGAAATGCAGCCGAG GGCGTTCGCG AGCTCCTCAG CGTCGGCCAG GGCCCCTGCC CCCAGCCTTT241AGAGAAAGAA GAAGAGCAGG AAAGACACCT CGAGGAACTG CTCGGCCTCC ACATCCCAAGTCTCTTTCTT CTTCTCGTCC TTTCTGTGGA GCTCCTTGAC GAGCCGGAGG TGTAGGGTTC301GTCGCAAGGC CAGCACGGTC CCTGGGGCGG AGGTTCTTCT AGCTCCTCTT CTTCCTCCTCCAGCGTTCCG GTCGTGCCAG GGACCCCGCC TCCAAGAAGA TCGAGGAGAA GAAGGAGGAG361GTCCTCCTCC TCTTCCTCCA GTGATGGCCG GAAGAAGCGG GGGAAGTACA AGGACAAGAGCAGGAGGAGG AGAAGGAGGT CACTACCGGC CTTCTTCGCC CCCTTCATGT TCCTGTTCTC421GAGGAAGAAG AAGAAGAAGA GGAAGAACTG AAGAAGAAGG GCAAGGAGAA GGCGGAAGCACTCCTTCTTC TTCTTCTTCT CCTTCTTGAC TTCTTCTTCC CGTTCCTCTT CCGCCTTCGT481CAGCAGAACA TCATCCGCAA GGTGGTGGAC CCTTAGACGG GGCGCACCAG GCTTATTAAGGTCGTCTTGT AGTAGGCGTT CCACCACCTG GGAATCTGCC CCGCGTGGTC CGAATAATTC541GGAGATGGCG AGGTCCTAGA GGAAATCGTA ACCAAAGAAC GACCCAGAGA GATCAACAAGCCTCTACCGC TCCAGGATCT CCTTTAGCAT TGGTTTCTTG CTGGGTCTCT CTAGTTGTTC601CAACCCACCC GAGGGGACTG CCTGGCCTTC CAGATGCGAA CTGGGTTGCT TCCCTGAGGGGTTGGGTGGG CTCCCCTGAC GGACCGGAAG GTCTACGCTT GACCCAACGA AGGGACTCCC661CCCCCGCTGG CCAAGGCCTG TGGACGACGC TTGCGGCCCA GCCTGGGCAG GTTTCAGGGTGGGGGCGACC GGTTCCGGAC ACCTGCTGCG AACGCCGGGT CGGACCCGTC CAAAGTCCCA721GCCAGTGGGA AGCCTGATGG GTGTTGGTGG CCTTTCCCCG GTGGATTGGT CTCTGGCCCA
CGGTCACCCT TCGGACTACC CACAACCACC GGAAAGGGGc CACCTAACCA GAGACCGGGT781GCCCAGTCTC TTCTAAGGGG CAGGGGGTGG AGGTTGGGGT CACCGGCCTG CTTGGCACCCCGGGTCAGAG AAGATTCCCC GTCCCCCACC TCCAACCCCA GTGGCCGGAC GAACCGTGGG841CCATCTGAAA GAGCAGCACT TCTCAGCTAT TAAAGGCCCC CTGGATAGAA AAAAAAAAAAGGTAGACTTT CTCGTCGTGA AGAGTCGATA ATTTCCGGGG GACCTATCTT TTTTTTTTTT901AAGATTCT3.SR-15蛋白分子的氨基酸序列表1 MAHVGSRKRS RSRSRSRGRG SEKRKKKSRK DTSRNCSAST SQGRKASTVP GAEVLLAPLL61 PPRPPpLPPV MAGRSGGSTR TRGGRRRRRG RTEEEGQGEG GSTAEHHPQG GGPLDGAHQA121 Y
本发明提供了具有抑制I型单纯疱疹病毒复制功能的蛋白分子的制备方法，该法包括以下步骤1、SR-15cDNA的克隆与鉴定-构建HSVI刺激1小时后的KMB-17细胞的cDNA文库；-对经HSVI刺激1小时后的KMB-17细胞进行mRNA差异显示分析；-制备特异的EST差异片段的α-32P-dATP标记探针，对HSVI刺激1小时后的KMB-17细胞的cDNA文库进行杂交筛，获得SR-15cDNA，并测序鉴定；-利用200bp上述基因的片段制备探针对HSVI刺激1小时后的KMB-17细胞及细胞对照进行Northern杂交分析，以探讨该基因的表达与HSVI结合的关系。
2.SR-15编码蛋白的表达纯化及抗体制备-将SR-15cDNA中的编码区序列147bp-536bp，共363nt克隆入pGEX-5T表达载体中进行融合表达；-对融合表达产物进行亲和层析，制备SR-15纯化蛋白，并定量至5μg/ml；-以上述蛋白对小鼠进行肌肉及静脉注射免疫，5周后制备抗血清，即为抗SR-15蛋白抗体本发明具有以下有益效果1.从病毒与细胞受体结合的角度，探索这种结合所诱导产生的细胞早期基因反应产物与病毒之间的相互作用。由此，为病毒与宿主细胞的相互作用关系提供新的探索途径，并通过对HSVI与人成纤维细膜上的相应受体结合所诱导的细胞产物SR-15蛋白的功能分折，为HSVI感染机理和病理学机理提供直接的资料。通过对HSVI等病毒与相应受体结合后细胞早期基因反应差异的初步研究，并克隆到的一个新蛋白分子一SR-15。完成SR-15蛋白对细胞内前RNA剪切过程直接或间接影响的探索分析；以及该蛋白对HSVI复制过程中前RNA剪切过程影响分析。SR-15蛋白作为HSVI诱导人成纤维细胞表达的特异产物对细胞和/或病毒的功能意义分析，并以此为线索，进一步探索HSVI与人成纤维细胞相互作用的可能模式。从而为深入了解HSVI与细胞之间相互作用所形成的特定病理学结果的分子机理，尤其是HSVI感染细胞分子病理学机理提供直接的依据；SR-15蛋白为开发新型抗病毒生物活性因子提供了的可能性，同时也为相应的应用研究提供了基础。
2.本发明的研究工作、已克隆及即将克隆到的与病毒感染过程特异相关的新基因，还包括这些基因产物功能的特定生理学病理学意义，均在病毒与细胞相互作用的研究领域中具有开辟新方向的意义，并从新的角度为病毒与细胞相互作用的研究提供思路和概念，以及更为广阔的研究空间和资料。
3.本发明提示HSVI与其它病毒如脊灰病毒甲型肝炎病毒对同一细胞(人成纤维细胞)的早期感染时(吸附细胞后1小时)，诱导了具有明显差异的基因反应，而HSVI对不同细胞的早期感染过程中，(吸附后1小时)亦能诱导具有明显差异的基因反应，在这些差异的基因反应中，有50％属于作为细胞调控因子的原癌基因产物，另外一些都是具有未知功能的新基因。
4.具有RS重复区域是SR蛋白家族的特征，该蛋白家族是细胞内前mRNA剪切过程中的重要组分，但其结构中的RS重复域位于分子的C-末端，并具有特征性的RNA识别区域(RRM)；PPLP区域是一与Src类蛋白结合的特征结构。在对SR-15蛋白分子序列与部分SR蛋白的同源性分析比较提示，该蛋白在某些特征部位具有与SR家族相似的结构，但整体同源性小于10％。利用该蛋白的原核表达产物所制备的特异抗体，经免疫荧光分析证实该蛋白分布于细胞质中，Northern亦证实了其是由HSVI结合细胞受体后所特异诱导。本发明的研究结果证实，该蛋白质可能在两个方面具有值得进一步探索的潜在意义。其一，该蛋白作为一种由HSVI结合受体后特异诱导的早期基因产物，以其结构特性，可能参与了细胞或者病毒mRNA的剪切过程，但对细胞而言，该过程发生于核内，因此要探索这一点，必须先明确其是否及如何进入核内。另外，由于该蛋白分子表现了一种明显与核酸分子结合的结构特点，同时又具有与Src蛋白类结合的活性域(PLPP)。进一步的研究表明，SR-15蛋白在正常生理条件下并不表达，仅在细胞受到HSVI刺激时产生，仅出现于G1/S期间，这意昧着受病毒感染的细胞很可能通过此蛋白分子对病毒有一定调节细胞前mRNA剪切的作用，并以此机理阻滞HSVI前mRNA剪接而影响病毒的增殖。对本发明所克隆到的新的SR-15蛋白分子在HSVI感染细胞内对细胞生理功能和病毒复制过程的潜在作用影响进行全面的分析，为深入了解HSVI与细胞之间相互作用所形成的特定病理学结果的分子机理，尤其是细胞分子病理学机理提供直接的依据，提供了开发新型抗病毒生物活性因子的可能性，同时也为相应的应用研究提供了基础。
5.SR-15蛋白分子的抗病毒应用意义由于该蛋白的表达与HSVI结合细胞受体有直接的关系，因此在了解该蛋白对细胞的功能之时，将着重了解其对HSVI感染过程中的某些组分的影响。
A.在上述基础上，对不同时相KMB-17细胞的HSVI感染情况的分析，即以同样方法感染G1/S、G1、S、G2期的KMB-17、Hela细胞，进行病毒滴度测定，检测可以感染HSVI的各类细胞，以及不同病毒(如polio)在结合其受体时是否亦有同样蛋白分子表达。如果这一现象为HSVI感染多种细胞所共有，则可以进一步探讨其对HSVI感染影响的共性。若此现象仅为人成纤维细胞所特有，则将该蛋白的基因导入HSVI易感细胞，再从HSVI感染过程的生物学特性，如感染动力学；感染过程中的mRNA剪切效率变化和感染复制过程中的病理学机理等方面确定SR-15的功能意义。
B.研究Gl/S期HSVI的复制抑制与早期基因的特异性产物的相关性，将带有SR-15基因的真核表达载体转染进入某些细胞，如Hela，Hep-2等；检查该基因表达产物对病毒感染的影响，进一步探索SR-15蛋白的功能意义。将SR-15cDNA编码区序列147bp-536bp，共363nt克隆入真核表达载体pcDNA3中转染入Hela细胞后，通过Western blot检测蛋白表达，一天后以HSVI感染，并检测病毒滴度。
C.体外剪切抑制试验，使用T7聚合酶和32P-UTP在重组质粒pHSVP中合成标记的HSVI RL2基因的前体mRNA片段，通过HSVI基因转录过程中的某些基因的体外剪接过程，如即刻早期基因前体mRNA的体外剪切抑制试验研究细胞G1/S期内SR-15蛋白分子剪切调节活性与HSVI的复制抑制关系。
试验例2图2是SR-15在pGEX-5T中的表达。如附图2所示，克隆入pGEX-5T表达载体中的SR-15蛋白得到了较好的融合表达，对融合表达产物进行亲和层析。图中1.SR-15在pGEX-5T中的表达；2.对照；3.蛋白Marker。
试验例3SR-15蛋白的结构特征与功能特征试验研究。SR-15蛋白该蛋白结构上表现为N端具有一个RS重复区域，在中部具有一个PPLP结构域，并以较多的精氨酸和丝氨酸为基本特征。资料表明，具有RS重复区域是SR蛋白家族的特征，该蛋白家族是细胞内前mRNA剪切过程中的重要组分，但其结构中的RS重复域位于分子的C-末端，并具有特征性的RNA识别区域(RRM)；PPLP区域是一与Src类蛋白结合的特征结构(见
图1)。35S和32P免疫沉淀结果显示了SR-15蛋白在HSVI刺激细胞后表达并发生了磷酸化，提示SR-15蛋白作为中介因子介导了病毒感染与细胞周期的关系。其结果见图3。图3是HSVI结合KMB-17后SR-15蛋白的免疫沉淀；在图3中AHSVI结合KMB-17后32P-phosphate and SR-15 labeled by35S-methioine标记的SR-15蛋白的免疫沉淀，1.35S-methioine标记细胞对照；2.Cells in32P-phosphate标记细胞对照；3.HSVI刺激后35S-methioine标记细胞；4.HSVI刺激后32P-phosphate标记细胞。BHSVI结合KMB-17后G1/S，G1，S and G2各时相及细胞对照的32P-phosphate标记的SR-15蛋白的免疫沉淀；1，2，3，4，HSVI结合细胞后G1/S，G1，S and G2时相。5，6，7，8，细胞对照的G1/S，G1，S and G2时相。
试验例4图4是SR-15与人β-蛋白外显子1和外显子2、剪接位点及snRNA的sm结合位点的结合分析。如附图4所示，SR-15与人β-珠蛋白外显子1和2、剪接位点及snRN的sm结合位点的结合分析1.剪切位点；2.sm-结合位点；3.外显子1；4.外显子2。对SR-15蛋白mRNA剪切过程相关的特异序列相结合的特异性的试验结果，表明蛋白内部含有DNA或RNA结合特异性区域-RRR，KKRR，推测该蛋白可能通过与HSVI的基因DNA或mRNA的相互作用影响病毒的复制，同时鉴于SR类蛋白家族与前体mRNA剪切的相关性，表明SR-15蛋白是HSVI前体mRNA的抑制因子。人β-珠蛋白基因外显子1和外显子2及剪接位点的SR蛋白结合位点的结合试验蛋白结果为这一推论提供了证实。
试验例5图5是HSVI结合后不同相收获病毒的滴度结果，图5中HSVI/KMB-17HSVI感染KMB-17细胞后病毒滴度；HSVI/HelaHSVI感染Hela细胞后病毒滴度；PV/KMB-17Polio病毒Sabin株感染KMB-17细胞后病毒滴度。图5中的结果表明，显示在KMB-17细胞G1/S期的滴度明显低于其它时相约4个log，而Hela细胞中未发现明显差异；使用PV感染KMB-17细胞也未发现差异。提示病毒刺激与细胞的特异相关性。
试验例6图6显示了pcDNA-S15转染Hela细胞后对HSVI的复制抑制作用。图中结果表明SR-15基因转染结果显示了Hela细胞内HSVI滴度比未转染SR-15基因的细胞病毒滴度少约2个log，提示SR-15蛋白的确抑制了病毒的复制。
试验例7体外抑制试验表明在HSVI感染的G1/S期KMB-17细胞和Hela细胞的裂解液存在的情况下，SR-15蛋白可以明显抑制HSVI RL2基因的前体mR的剪切。图7是体外SR-15蛋白抑制HSVI RL2基因的前体mRNA的剪切，图7中1.HSVI感染Hela细胞后1小时后的细胞裂解液与含有剪切位点的HSVIRL2基因的mRNA片段共同孵育；2.HSVI感染Hela细胞后1小时后的细胞裂解液和纯化的SR-15蛋白与含有剪切位点的HSVI RL2基因的mRNA片段共同孵育；3.HSVI感染KMB-17细胞后1小时后的细胞裂解液和纯化的SR-15蛋白与含有剪切位点的HSVI RL2基因的mRNA片段共同孵育从图7可以看到SR-15蛋白存在是未能剪切的876nt的样品，以及没有SR-15蛋白时经过剪切的365nt和511nt的样品。
权利要求
1.一种具有抑制I型单纯疱疹病毒复制功能的蛋白分子，该蛋白分子的基因特征是①基因全长为904bp，其具有完整的5′-非编码区和3′-非编码区，编码区可编码一个由121个氨基酸组成的蛋白质(命名为SR-15)，分子量为14.9KD，该蛋白结构上表现为N端具有一个RS重复区域，在中部具有一个PPLP结构域，并以含有16.5％的精氨酸和12.4％的丝氨酸为基本特征；②SR-15基因序列描述为1 GGCGCGCCCG GGACGGAACC TGGGGCGTCA GAACGAAAGG CAGCGGCGCC GCGCTTCCCACCGCGCGGGC CCTGCCTTGG ACCCCGCAGT CTTGCTTTCC GTCGCCGCGG CGCGAAGGGT61 GCCGGCCAGC CTCCCGCGCA GCGCCCCGGC CGGAAGCCTC CTCGCCGCCG CTTCCTCTCGCGGCCGGTCG GAGGGCGCGT CGCGGGGCCG GCCTTCGGAG GAGCGGCGGC GAAGGAGAGC121 AGAAGGCGCG GGGCGGGCTG TCCGGCCCGC AGGGCGGTCG AGCCCGCGGC GCCATGGCTCTCTTCCGCGC CCCGCCCGAC AGGCCGGGCG TCCCGCCAGC TCGGGCGCCG CGGTACCGAG181 ACGTCGGCTC CCGCAAGCGC TCGAGGAGTC GCAGCCGGTC CCGGGGACGG GGGTCGGAAATGCAGCCGAG GGCGTTCGCG AGCTCCTCAG CGTCGGCCAG GGCCCCTGCC CCCAGCCTTT241 AGAGAAAGAA GAAGAGCAGG AAAGACACCT CGAGGAACTG CTCGGCCTCC ACATCCCAAGTCTCTTTCTT CTTCTCGTCC TTTCTGTGGA GCTCCTTGAC GAGCCGGAGG TGTAGGGTTC301 GTCGCAAGGC CAGCACGGTC CCTGGGGCGG AGGTTCTTCT AGCTCCTCTT CTTCCTCCTCCAGCGTTCCG GTCGTGCCAG GGACCCCGCC TCCAAGAAGA TCGAGGAGAA GAAGGAGGAG361 GTCCTCCTCC TCTTCCTCCA GTGATGGCCG GAAGAAGCGG GGGAAGTACA AGGACAAGAGCAGGAGGAGG AGAAGGAGGT CACTACCGGC CTTCTTCGCC CCCTTCATGT TCCTGTTCTC421 GAGGAAGAAG AAGAAGAAGA GGAAGAACTG AAGAAGAAGG GCAAGGAGAA GGCGGAAGCACTCCTTCTTC TTCTTCTTCT CCTTCTTGAC TTCTTCTTCC CGTTCCTCTT CCGCCTTCGT481 CAGCAGAACA TCATCCGCAA GGTGGTGGAC CCTTAGACGG GGCGCACCAG GCTTATTAAGGTCGTCTTGT AGTAGGCGTT CCACCACCTG GGAATCTGCC CCGCGTGGTC CGAATAATTC541 GGAGATGGCG AGGTCCTAGA GGAAATCGTA ACCAAAGAAC GACCCAGAGA GATCAACAAGCCTCTACCGC TCCAGGATCT CCTTTAGCAT TGGTTTCTTG CTGGGTCTCT CTAGTTGTTC601 CAACCCACCC GAGGGGACTG CCTGGCCTTC CAGATGCGAA CTGGGTTGCT TCCCTGAGGGGTTGGGTGGG CTCCCCTGAC GGACCGGAAG GTCTACGCTT GACCCAACGA AGGGACTCCC661 CCCCCGCTGG CCAAGGCCTG TGGACGACGC TTGCGGCCCA GCCTGGGCAG GTTTCAGGGTGGGGGCGACC GGTTCCGGAC ACCTGCTGCG AACGCCGGGT CGGACCCGTC CAAAGTCCCA721 GCCAGTGGGA AGCCTGATGG GTGTTGGTGG CCTTTCCCCG GTGGATTGGT CTCTGGCCCACGGTCACCCT TCGGACTACC CACAACCACC GGAAAGGGGC CACCTAACCA GAGACCGGGT781 GCCCAGTCTC TTCTAAGGGG CAGGGGGTGG AGGTTGGGGT CACCGGCCTG CTTGGCACCCCGGGTCAGAG AAGATTCCCC GTCCCCCACC TCCAACCCCA GTGGCCGGAC GAACCGTGGG841 CCATCTGAAA GAGCAGCACT TCTCAGCTAT TAAAGGCCCC CTGGATAGAA AAAAAAAAAAGGTAGACTTT CTCGTCGTGA AGAGTCGATA ATTTCCGGGG GACCTATCTT TTTTTTTTTT901 AAGATTCT③SR-15蛋白分子的氨基酸序列表1 MAHVGSRKRS RSRSRSRGRG SEKRKKKSRK DTSRNCSAST SQGRKASTVP GAEVLLAPLL61 PPRPPPLPPV MAGRSGGSTR TRGGRRRRRG RTEEEGQGEG GSTAEHHPQG GGPLDGAHQA121 Y
2.一种权利要求1所述的具有抑制I型单纯疱疹病毒复制功能的蛋白分子的制备方法，该法包括以下步骤①SR-15cDNA的克隆与鉴定-构建HSVI刺激1小时后的KMB-17细胞的cDNA文库；-对经HSVI刺激1小时后的KMB-17细胞进行mRNA差异显示分析；-制备特异的EST差异片段的α-32P-dATP标记探针，对HSVI刺激1小时后的KMB-17细胞的cDNA文库进行杂交筛，获得SR-15cDNA，并测序鉴定；-利用200bp上述基因的片段制备探针对HSVI刺激1小时后的KMB-17细胞及细胞对照进行Northern杂交分析，以探讨该基因的表达与HSVI结合的关系。②SR-15编码蛋白的表达纯化及抗体制备-将SR-15cDNA中的编码区序列147bp-536bp，共363nt克隆入pGEX-5T表达载体中进行融合表达；-对融合表达产物进行亲和层析，制备SR-15纯化蛋白，并定量至5μg/ml；-以上述蛋白对小鼠进行肌肉及静脉注射免疫，5周后制备抗血清，即为抗SR-15蛋白的抗体。
3.一种权利要求1所述蛋白分子的用途，具体描述如下①SR-15基因转染Hela细胞后所显示的抗HSVI病毒感染的作用，将SR-15基因转染Hela细胞后，细胞内HSVI滴度比未转染SR-15基因的细胞病毒滴度少约2个log，表明SR-15蛋白抑制I型单纯疱疹病毒的复制；②在HSVI感染的G1/S期的KMB-17细胞和Hela细胞的裂解液中，使用SR-15蛋白的样品存在有876nt的KC2 mRNA分子，而无SR-15蛋白的样品则出现经过剪切的365nt和511nt的分子，该体外抑制试验证明SR-15蛋白可以明显抑制HSVI RLL基因的前体mKNA的剪切。
全文摘要
具有抑制I型单纯疱疹病毒复制功能的蛋白分子及其制备方法。涉及分子生物学技术领域。该蛋白分子基因全长为904bp,其具有完整的5’－非编码区和3’－非编码区,编码区可编码一个由121个氨基酸组成的蛋白质,分子量为14.9KD,该蛋白结构上表现为:N端具有一个RS重复区域,在中部具有一个PPLP结构域,并以含有16.5%的精氨酸和12.4%的丝氨酸为基本特征。本发明从病毒与细胞受体结合的角度,对诱导产生的细胞早期基因反应产物与病毒之间的相互作用进行深入研究,为病毒与宿主细胞的相互作用关系提供新的探索途径。并通过对HSVI与人成纤维细膜上的相应受体结合所诱导的细胞产物SR－15蛋白的功能分折,为HSVI感染和病理学机理提供了直接依据。
文档编号A61P31/22GK1385440SQ02113350
公开日2002年12月18日 申请日期2002年2月6日 优先权日2002年2月6日
发明者李琦涵, 董承红, 王丽春, 刘龙丁, 赵红玲, 姜莉, 孙明, 王炯, 董少忠, 王晶晶, 赵树栋, 胡方, 易红昆 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所