用于治疗过敏症的含过敏原的乳的制作方法

专利名称：用于治疗过敏症的含过敏原的乳的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗过敏症的含过敏原的乳，具体地，本发明涉及将包括异源非乳过敏原的乳组合物给予个体以抑制该个体中过敏原特异性IgE的产生。
螨过敏与哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎等疾病的关系是公知的。台湾、澳大利亚和西欧的主要螨种类是Dermatophagoidespteronyssinus，而Dermatophagoides farinae则是美国、日本和欧洲大陆等许多区域的主要螨种类。
对螨过敏的患者血清中的IgE与许多成分反应。如通过Western印迹所确定，这一相互作用可导致从1或2个至超过14个不同螨种类的特异性结合。Der p1，Der p2和Der p5过敏原通常以高滴度与约80％的过敏血清反应，并经cDNA克隆以及与单克隆抗体的结合及其它免疫化学程序鉴定。
目前主要的疗法即过敏原免疫治疗针对过敏症的病因而修饰或负调节免疫应答。如果使用正确，过敏原免疫治疗既有效又相对安全，并且是过敏症管理的必需部分。
过敏原免疫治疗典型通过过敏原注射剂而施予，其它施用途径如口服、舌下、鼻内和支气管途径也已经尝试。给予实验动物的口服和舌下免疫治疗表明摄取过敏原可诱导耐受。另外，舌下免疫治疗已显示降低可减轻过敏症状和/或药物需求。其功效与在儿童中进行的皮下注射免疫治疗类似。
在免疫治疗中，具有真三级结构的重组过敏原显示与天然存在的过敏原类似的功效和安全性分布图。
因此，本发明涉及一种转基因哺乳动物，其遗传组成包括一核酸序列，该核酸序列包括(1)编码过敏原的编码序列，和(2)可操纵地与该编码序列连接的异源启动子。该启动子指导编码序列在乳腺细胞中表达。过敏原可以是来自通常的尘螨的过敏原，如来自Dermatophagoides pteronyssinus，D.fdrinae，D.microceras，Tyophagusputesentiae，Lepidoglyphus domesticus，L.destructor，Acarus siro，Euroglyphus maynei，和Biomia tropicalis的过敏原；或其它空气传播的过敏原(气源性过敏原)如花粉，霉菌，动物皮屑，和昆虫。过敏原可以是具有与SEQ ID NO1，2或3有至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或99％相同性的氨基酸序列的多肽。过敏原可以是Der p1，Der p2和Der p5蛋白可用于表达过敏原的启动子包括α-乳清蛋白，β-乳清蛋白，乳清酸性蛋白，α-、β-、γ-、或κ-酪蛋白的基因的启动子。启动子也可被间接控制以指导编码序列在乳腺细胞中表达。例如，启动子可以是诱导型启动子，例如四环素激活启动子。例如，当也存在四环素时，可在乳腺细胞中选择性地表达四环素调控的转录因子以表达编码序列。核酸序列可整合入染色体。
转基因哺乳动物的遗传组成可包括至少第二种核酸序列，例如编码第二种过敏原以在乳腺细胞中表达。
在某些情况下，转基因哺乳动物每升乳可产生至少100mg、500mg、1g、10g或20g过敏原。
转基因哺乳动物可以是雄性或雌性的。在雄性转基因哺乳动物的情况下，核酸能够指导过敏原在该雄性转基因哺乳动物的雌性后代的乳腺细胞中表达。在雌性转基因哺乳动物的情况下，核酸能指导过敏原在雌性转基因哺乳动物的乳腺细胞中表达，或在该雌性转基因哺乳动物的雌性后代的乳腺细胞中表达。
本发明还涉及哺乳动物生殖细胞，例如卵细胞或精细胞，其遗传组成包括本文所述核酸序列。
本发明还涉及含有非乳异源过敏原和酪蛋白即内源性酪蛋白的乳。所述乳还可含有足够减轻个体的呼吸道炎症和高反应性的过敏原。所述乳还可含有至少第二种过敏原。所述酪蛋白可以是例如天然存在的牛或羊酪蛋白，即来自奶牛或山羊的乳。所述乳可得自本文所述的转基因哺乳动物，或者当将过敏原多肽作为分离的多肽组合物加入到乳中时，所述乳可以得自非转基因哺乳动物。
本发明还包括一种在接触过敏原的个体中降低IgE产生的方法，其包括给予该个体含有足够量的非乳异源过敏原的乳，从而口服摄取所述乳的个体将变得对所述过敏原耐受。因此，当个体在随后接触过敏原时会抑制过敏原特异性IgE的产生。在某些实施方案中，个体缺乏完全发育的免疫系统，例如个体是新生儿或婴儿。本发明还涉及减轻个体支气管肺部充血的类似方法。
在另一方面，本发明涉及提供来自转基因哺乳动物的乳的包括非乳过敏原的制剂的方法，包括从转基因哺乳动物中获得乳以获得所述制剂，该转基因哺乳动物在其种系中引入了一种非乳过敏原蛋白编码序列，该编码序列与一种启动子序列可操纵地连接，从而导致该蛋白编码序列在乳腺上皮细胞中表达，由此将该非乳过敏原分泌进该哺乳动物的乳中。所述方法进一步包括从乳中分离过敏原或者对乳进行加工，例如巴氏灭菌、浓缩或干燥。
“过敏原”是指一种导致I型中间高反应性反应的物质。
“气源性过敏原”定义为至少具有以下特性引起活性反应素应答的特异性抗原定群，与其环境接触水平即可导致敏感个体体内明显组织变化。气源性过敏原是经空气传播的颗粒，可导致呼吸道，皮肤或结膜过敏症。例如豚草花粉的水溶部分可影响呼吸道和结膜粘膜，豚草花粉的脂溶部分可对接触的皮肤产生典型的接触性皮炎。
“分离的核酸”是具有非天然存在序列的核酸，或具有部分或全部天然存在基因的序列，但是不含天然存在该感兴趣基因的生物体的基因组中侧翼于该感兴趣的天然存在基因的基因的核酸。因此该术语包括掺入载体、自主复制质粒或病毒、或原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA。
本文所用“同源性”或“相同性百分比”是指两个多肽分子之间的序列相似性，或两个核酸分子之间的序列相似性。当第二个序列的相应位置被与第一个序列的该位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则这两个分子在该位置是同源的(即本文所用氨基酸或核酸“同源性”相当于氨基酸或核酸“相同性”)。两个序列之间的同源性百分比是这些序列共享的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/总位置数×100)。通常是在两个序列进行排列以给出最大同源性或序列相同性的情况下进行比较。
序列比较和确定两个序列之间的同源性百分比可用数学算法进行。用于比较序列的数学算法的一优选非限制性例子是Karlin andAltschul的算法(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-68，其修改见Karlin and Altschul(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-77。这种算法被并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序，score＝100，wordlength＝12进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序，score＝50，wordlength＝3进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得缺口序列对比用于比较目的，可如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述用缺口(Gapped)BLAST进行。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
“在严格条件下杂交”是指与固定化参考核酸在含有0.2×SSC(1.75g/lNaCl，0.88g/l二水合柠檬酸三钠，pH7.0)和0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠的杂交溶液中于68℃经碱基配对而进行的特异性非共价平衡结合。如果需要洗涤以实现平衡，则洗涤用杂交溶液进行。
“可操纵地连接”是指基因与调节序列之间的连接关系，以此方式当适当的分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时，基因能得以表达。
“启动子”是一种核苷酸序列，例如当其在细胞中可操纵地连接于异源序列时，其能以至少一种前后序列效应指导转录。换而言之，启动子可不需下游待转录序列而存在，只要当以不同前后序列置于异源序列的上游时，启动子序列能指导转录即可。
本文所用术语“个体”包括人和非人动物。所述个体典型是人，例如患有过敏性疾病的病人。
“耐受”是指哺乳动物在接触一或多种过敏原时不发生过敏性免疫反应的状态。
本文所用术语“转基因”是指一种DNA序列，其包括一或多个选择的DNA，该DNA部分或全部异源于转基因动物，或部分或全部同源于转基因动物的内源性基因，但其被设计为插入动物基因组的与天然基因不同的位置。一个转基因包括一或多个启动子和表达所选择的DNA所需的任何其它DNA如内含子，其均与所选择的DNA可操纵地连接，并可包括增强子序列。
“转基因的”是指包括一种DNA序列的任何细胞，该DNA序列人工插入细胞，并成为从该细胞发育成的生物体基因组的一部分。
本文所用术语“转基因哺乳动物”是指包括一种转基因的哺乳动物或这种哺乳动物的后代，该转基因插入胚胎细胞并成为从该细胞发育成的哺乳动物的至少某些细胞的基因组的一部分，“乳”和“乳组合物”包括哺乳动物乳腺的分泌物或其任何衍生物，例如干燥的组合物如乳粉、浓缩乳等。
可由本发明治疗的过敏性疾病包括但不限于鼻炎，鼻窦炎，哮喘，过敏性肺炎，外源过敏性牙龈炎，结肠炎，风疹，湿疹，皮炎，过敏反应，血管神经性水肿，过敏性偏头痛，和涉及由IgE介导的过敏症的某些胃肠道疾病。
通过以下详细阐述和所附权利要求书，将显而易见本发明的其它特点和优点。
发明详细描述本发明涉及可治疗性用于治疗过敏性疾病的转基因乳。
使用乳腺特异性启动子，在啮齿动物、猪和乳制品业动物中已表达了许多感兴趣的生物药物蛋白(Echeland(1996)Current Opinionin Biotechnology 7536；Houdebine(2000)Transgenic Research 9505；Meade et al.(1999)Chapter 14 in Gene Expression SystemsUsing Naturefor the Art of Expression Academic Press，page399)。将包含与乳启动子基因融合的编码感兴趣靶蛋白的基因的表达载体通过微注射导入单细胞胚胎的原核中。经过种系整合和表达，所述转基因成为显性孟德尔遗传特征，而遗传给建立者动物的子代。
转基因后代表达该靶蛋白，产生含有每升含量高至几克量级的靶蛋白的乳。最通常的是靶蛋白呈可溶乳清蛋白形式。哺乳动物乳腺上皮细胞能够进行具有翻译后修饰和折叠的复杂蛋白合成。转基因家畜的乳成为人用诊断或药物活性和治疗性蛋白质的起始材料，这些蛋白质可用熟知技术进行纯化。
通过转基因对乳组合物进行操作主要集中于将乳腺作为生物反应器而生产随后被纯化的药物。本发明的改进却是利用乳腺机制生产本身对消费者即有益的治疗乳。因此，可完全避免蛋白质纯化所需时间和成本。另外，由于治疗包含在乳中，因此其可被输送至个体，而个体完全不知其存在。
待表达以治疗特定过敏症的特异过敏原当然基于该不希望的免疫应答是否针对蛋白质过敏原。如果已经鉴别了触发此类应答的蛋白质过敏原，熟练技术人员可将编码该过敏原的核苷酸序列克隆入乳特异性表达载体中，然后将此表达载体用于产生转基因哺乳动物并获得雌性个体。这种雌性的乳被给予个体，以改善或预防随后的过敏症特征性症状(例如皮炎或支气管肺炎)。评价和定量呼吸道高反应性的实验方法见下述。本领域熟知评价支气管肺炎的其它方法。过敏性哮喘特点是呼吸道高反应性和炎症均存在。呼吸道高反应性可通过肺部试验改变测定(介入或非介入方法)。呼吸道炎症可通过呼吸道中炎性细胞尤其嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的浸润，及通过病理学改变测定。
关于过敏原及其生理作用的进一步阐述见Aas等，Allergy333，1978；Goldin等，Br.J.Nut.80S203-S207，1998；和Kailasapathy等，J.Immunol.Cell Biol.7880-88，2000。
通常，过敏原在一核酸构建体中可操纵地与乳启动子连接以提供用于口服免疫治疗的过敏原。所述构建体还包括用于经乳腺上皮细胞分泌过敏原的信号序列，和其它序列如转录终止子，内含子，5＇非翻译区或聚腺苷酸化位点。所述构建体可包括附加的标记以促进哺乳动物细胞的转化，例如用于阳性和/或阴性选择的标记。
所述构建体随后被导入细胞，例如成纤维细胞或胚胎干细胞，并使构建体整合进细胞的基因组中。例如，将所述构建体微注射进哺乳动物胚胎的原核中，随后将胚胎转移进假孕雌性中。用PCR筛选和Southern印迹杂交，鉴别具有转基因的后代。在与正常哺乳动物交配后，产生F1雌性后代。这些雌性后代产生的转基因乳可用于治疗过敏性疾病。另外，转基因乳也可用于一级预防，即将其给予由于其父母一方或双方患有过敏性疾病而高危患过敏性疾病的婴儿。
转基因动物也可用于繁殖转基因，例如形成动物群。可用已知方法从这种动物群的雌性个体中常规获得乳。
涉及构建体的通常方法可包括下述特征细节过敏原任何一或多个多肽过敏原可用本文提供的方法输送。例如，多肽过敏原可以是植物、真菌或动物编码的多肽。植物过敏原通常是花粉、汁液、叶和植物毒素(例如有毒长春藤分泌物等)。真菌过敏原包括曲霉或其它霉菌产生的多肽。动物过敏原包括例如昆虫产生的多肽，例如尘螨的排泄物过敏原，和哺乳动物产生的多肽，例如猫的皮屑。
编码过敏原的核酸序列可用各种方法鉴别。可用来自过敏个体的IgE筛选cDNA表达文库(Lin et al(1994)J Allergy Clin Immunol94989-96)，鉴别阳性克隆并测序。可鉴别编码区并进行翻译而确定过敏原的多肽序列。编码区可用于在本文所述核酸中表达过敏原。
多肽过敏原的特定例子包括Dermatophagoides pteronyssinus的Der p过敏原。Der p5多肽序列如下MKFIIAFFVATLAVMTVSGEDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQEQINHFEEKPTKEMKDKIVAEMDTIIAMIDGVRGVLDRLMQRKDLDIFEQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV(SEQID NO1)，也见于Lin等，J Allergy Clin Immunol 94989-96(1994)。
Der p1多肽序列如下MKIVLAIASLLALSAVYARPSSIKTFEEYKKAFNKSYATFEDEEAARKNFLESVKYVQSNGGAINHLSDLSLDEFKNRFLMSAEAFEHLKTQFDLNAETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNVNKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL(SEQ ID NO2)Der p2多肽序列如下MMYKILCLSLLVAAVARDQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKVMGDDGVLACAIATHAKIRD(SEQ ID NO3)。乳特异性启动子目前有许多优先激活在乳腺上皮细胞中的转录的转录启动子，这些启动子包括控制编码乳蛋白如酪蛋白、β-乳球蛋白(Clark etal.(1989)Bio/Technology7487-492)、乳清酸性蛋白(Gordon etal.(1987)Bio/Technology 51183-1187)和乳清蛋白(Soulier et al.(1992)FEBS Letts.29713)的基因的启动子。酪蛋白启动子可衍生自任何哺乳动物物种的α-、β-、γ-、κ-酪蛋白基因；优选的启动子衍生自山羊β-酪蛋白基因(DiTullio(1992)Bio/Technology 1074-77)。
许多这些启动子的DNA序列是可获得的，例如在GenBank和在科学出版物中，如Richards et al.(1981)J.Biol.Chem.256，526-532(大鼠α-乳清蛋白)；Campbell et al.(1984)Nucleic Acids Res.128685-8697(大鼠WAP)；Jones et al.(1985)J.Biol.Chem.2607042-7050(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee & Rosen(1983)J.Biol.Chem.25810794-10804(大鼠γ-酪蛋白)；Hall(1987)Biochem.J.242，735-742(人α-乳清蛋白)；Stewart(1984)Nuleic Acid Res.12，389(牛αsl和κ-酪蛋白cDNA)；Gorodetsky et al.(1988)Gene 6687-96(牛β-酪蛋白)；Alexander et al.，Eur.J.Biochem.178395-401(1988)(牛κ-酪蛋白)；Brignon et al.，(1977)FEBS Lett.188，48-55(牛αs2酪蛋白)；Jamieson etal.，(1987)Gene61，85-90，Ivanov et al.，(1988)Biol.Chem.Hoppe-Seyler369，425-429，Alexander et al.，(1989)Nuleic Acid Res.17，6739(牛β-乳球蛋白)；Vilotte et al.，(1987)Biochimie 69，609-620(牛α乳清蛋白)。也参见Mercier & Vilotte(1993)J.Dairy Sci.76，3079-3098的综述。为了额外的调控或严格性，可用这些启动子序列作探针筛选基因组文库而从这些基因或其它哺乳动物同源基因中获得其它调节序列，例如相邻序列。信号序列核酸构建体还可包括信号序列，特别是乳特异性基因的信号序列。乳特异性信号序列可以是用于该构建体的所选乳特异性启动子天然存在的信号序列，如下所述。例如，可使用来自编码酪蛋白，例如α-、β-、γ-、κ-酪蛋白，β-乳球蛋白，乳清酸性蛋白和乳清蛋白的基因的信号序列。转基因转基因哺乳动物也可通过将导入感兴趣核酸例如编码过敏原的核酸的转基因细胞系核转移至胚胎干细胞而产生。将外源DNA导入哺乳动物的方法包括微注射和核移植方法。例如，目前已有生产转基因山羊、猪、大鼠、奶牛和绵羊的方案，例如参见，Ebert et al.(1994)Bio/Technology 12699；PCT申请WO98/30683；White and Yannoutsos，Current Topics in Complement Research64thForum in Immunology，pp.88-94；US专利5,523,226；US专利5,573,933；PCT申请WO93/25071；PCT申请WO95/04744；Bader and Ganten，Clinical and ExperimentalPharmacology and Physiology，Supp.3S81-S87，199；US专利5,741,957，PCT申请WO98/30683；Transgenic Animal Technology，A Handbook，1994，ed.，Carl A.Pinker，Academic Press，Inc.；PCT申请WO97/07669；Transgenic Animal Technology，A Handbook，1994，ed.，Carl A.Pinker，Academic Press，Inc.
构建体可经常规转化或转染技术如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等导入细胞(例如参见，Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nded.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)。
不用再详细阐述，基于以上揭示本领域技术人员可使用下述转基因乳进行有效治疗，将本发明方法最佳程度地利用。以下实施例只是举例说明技术人员怎样能产生和使用转基因动物来合成治疗乳，无任何限制本发明之意。所引用的文献以其全文并入参考。
将纯化的转基因(例如见

图1)微注射进来自杂交繁殖ICR品系超排卵雌性小鼠的受精卵雄性原核中，并转移至受体假孕雌性中，如Chen et al.，Science1994；2651237-40所述。经PCR扩增尾DNA而快速筛选所得幼仔中的转基因，结果经Southern印迹分析进一步证实。
PCR筛选和Southern印迹杂交用限定跨越αLA启动子和Der p5cDNA连接序列的一580bp区域的一套引物pαLA-124(+)5＇-CTCTCTTGTCATCCTCTTCC-3＇(SEQ ID NO8)和pDer p5(-)5＇-ACTCGAGTGATGAAGGCAAGAAG-3＇(SEQ ID NO9)进行PCR快速筛选。
分别用StuI和XbaI限制酶在37℃过夜消化10微克基因组DNA，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，并转移至Durose膜(Stratagene，LaJolla，CA)。用Der p5特异性cDNA的XhoI配对(0.5kb)作为放射性探针以杂交膜。印迹在-20℃冰箱中进行放射自显影1周。
哺乳期小鼠乳腺组织的免疫组织化学分析将来自D15哺乳期转基因和非转基因小鼠的新鲜切下的乳腺根据Sasson et al.(1988)Development104155-164的方法在低聚甲醛中固定。
用苏木精和曙红B染料将组织切片(5-10微米)染色并在光学显微镜(Axiovert135；Carl Zeiss，德国)下照相。根据Gruskin-Lemerand Trinkaus-Randall(1991)Curr Eye Res1075-85所述进行免疫组织化学分析。将兔抗螨Der p5多克隆抗体1∶30稀释(1％牛血清白蛋白(BSA)于磷酸缓冲盐水(PBS)中)，取50微升与抗Der p5或正常兔血清(NRS；1∶10)在37℃保温30分钟。用10体积BSA-PBS缓冲液洗涤后，将乳腺玻片与1∶100稀释(1％BSA于PBS中)的亲和纯化的缀合有异硫氰酸荧光素(FITC；Boehringer-Mannheim，德国)的山羊抗兔IgG抗体在37℃保温30分钟。洗涤后，玻片在装配有落射荧光光学元件的Nikon Optiphot显微镜下观察玻片。
转基因小鼠乳免疫印迹分析如前所述(Simons et al.(1987)Nature328530-532)从哺乳期雌性中收集乳，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。在含有5％2-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液中稀释收集自不同哺乳期的在75mM Tris-HCl缓冲液pH6.8中10-20倍稀释的乳，并在7.5％凝胶上电泳。为估计产量水平，在正常小鼠乳中将纯化的重组Der p5标准稀释至10微克/毫升，并与转基因乳样品一起电泳。将蛋白质从凝胶上电转移至PVDF膜(NEN Life Science Products，Boston，MA)。用识别Der p5的2-10微克/毫升一级抗体探查印迹，并用含有0.1％Tween-20的磷酸缓冲盐水(PBS-T)洗涤。印迹与0.2微克/毫升辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级抗体反应。随后用化学发光ECLTM检测系统(Amersham，UK)显色印迹并在X-光胶片上曝光。通过光密度计比较条带密度。
动物和研究方案年龄为21天的雌性LCR得自台湾大学医学院动物育种中心(源自Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)，将其分为3组进行每一实验(表1)。将动物用含有Der p5的转基因乳或仅用乳喂养4周。将动物通过腹膜内注射10μg用已知方法纯化的重组Der p5而活性致敏。在致敏21天后，将动物接触0.1％Der p5-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白20分钟或PBS的气雾剂。在吸入攻击8小时后，测定肺部抗性50分钟，并收集支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清。
呼吸道反应性的非侵入性测定方法使用气压全身体积描记仪(WBP；Buxco，Troy，NY)，用常规方法对有意识的不受限制的小鼠吸入乙酰甲基胆碱的反应进行测定。在取读数之前，将1ml空气快速注射到主腔中，以从WBP装置中获得1mv信号，由此校准盒。通过确定吸气初和吸气末记录吸气和呼气情况，作为在0点交叉的盒压力/时间曲线。吸气初是通过从盒压力信号的上升吸气相的两个水平处绘制的直线外推确定的。吸气时间(Ti)是指从吸气初至吸气末的时间。呼气时间(Te)是指从吸气末至下一吸气初的时间。一次呼吸期间在正负方向发生的最大盒压力信号，分别定义为峰值吸气压力(PIP)和峰值呼气压力(PEP)。记录每10次呼吸推断每分钟的呼吸频率。松弛时间(Tr)是指达到36％总呼气压力信号(在呼气中盒压力信号之下的区域)的时间。此阈值用于将体积信号的衰减时间常数与在被动呼气中峰值体积衰减36％相关。间歇(pause)和增强的间歇(enhanced pause，Penh)限定如下间歇＝(Te-Tr)/TrPenh＝(PEP/PIP)×间歇测定Penh的增加作为呼吸道反应指数。测量小鼠并取3分钟的平均值。将气雾化盐水，接着是增加浓度的乙酰甲基胆碱(从1-100mg/ml)喷雾吸入3分钟。在每一喷雾后，取读数并取3分钟平均值。呼吸道反应性以每剂乙酰甲基胆碱的Penh表示。
统计学分析为评价Der p5攻击后肺部抗性的改变、细胞因子浓度、IgE、IgG水平及BALF中的细胞，进行ANOVA重复测量，以对比各组之间的不同。通过方差分析，使用Duncan多范围检验来区分实验组和对照组之间的差异。p＜0.05认为有统计学意义。结果在体内抑制呼吸道高反应性(AHR)观察到用转基因乳口服喂养动物会抑制过敏原诱导的AHR。对气雾化乙酰甲基胆碱的呼吸道应答是在最后吸入攻击8小时后的有意识的不受限制的小鼠中测定的。对于所有小鼠，绘制对1-100mg/ml的乙酰甲基胆碱的完整剂量应答曲线。在所有组的小鼠中，基础Penh值和气雾化盐水所致的Penh值没有明显不同。在模拟(C组)处理的小鼠中，与基础值相比，Derp5吸入攻击诱导明显提高的对乙酰甲基胆碱的呼吸道反应性。相反，用转基因乳处理(A组)Der p5致敏的小鼠意想不到地抑制10-100mg/ml乙酰甲基胆碱范围的AHR。
表1三个实验组的特征及每组所进行的程序组 处理a致敏b吸入攻击cA含Der p5的乳 Der p5+B含Der p5的乳氢氧化铝 +C 乳 Der p5+a用含有Der p5的乳喂养28天b用10ugrDer p5和4mg Al(OH)3腹膜内注射c0.1％Der p5吸入攻击15分钟在C组中隔片被大量炎性细胞(淋巴细胞、巨噬细胞和一些嗜酸性粒细胞)浸润，特别是在细支气管和毛细管周围。肺部炎症典型地是存在巨细胞。肺泡空间中充满粘膜分泌物。炎性水平很严重。
另一方面，在A组中进行的组织病理学研究揭示仅有一些炎性细胞浸润细支气管和毛细管。隔片没有增厚，肺泡空间是透明的。相应地炎性水平是轻度的。这些观察还证实与仅用乳治疗的动物相比，用含有Der p5的转基因乳治疗抑制Der p5诱导的特异性呼吸道炎症的发展。其它实施方案应理解的是尽管本发明已结合上述详细描述而阐述，但是上述描述仅是举例性的，并非限制本发明范围，本发明范围由权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修改属于权利要求书范围。
权利要求
1.一种制备转基因哺乳动物的方法，包括将一种外源核酸导入哺乳动物，筛选获得转基因哺乳动物，所述外源核酸包括(1)编码过敏原的编码序列，和(2)可操纵地与该编码序列连接的异源启动子，其中该异源启动子指导过敏原在该动物或其雌性子代的乳腺细胞中表达。
2.权利要求1的制备转基因哺乳动物的方法，其中过敏原是尘螨过敏原。
3.权利要求2的制备转基因哺乳动物的方法，其中尘螨是Dermatophagoides pteronyssinus或Dermatophagoides farinae。
4.权利要求3的制备转基因哺乳动物的方法，其中过敏原包括具有与SEQ ID NO1、2或3有至少70％相同性的氨基酸序列的多肽。
5.权利要求4的制备转基因哺乳动物的方法，其中过敏原包括具有与SEQ ID NO1、2或3相同的氨基酸序列的多肽。
6.权利要求1的制备转基因哺乳动物的方法，其中启动子是酪蛋白或乳清蛋白的启动子。
7.权利要求6的制备转基因哺乳动物的方法，其中启动子是α-乳清蛋白启动子。
8.权利要求1的制备转基因哺乳动物的方法，其中该哺乳动物是奶牛、山羊或绵羊。
9.权利要求1的制备转基因哺乳动物的方法，其中过敏原是蛋白质过敏原。
10.一种乳组合物，包括一种异源非乳过敏原；和一种酪蛋白，其中当口服给予该组合物时，其会降低在随后接触该过敏原的个体体内过敏原特异性IgE产生。
11.权利要求10的乳组合物，其中过敏原是昆虫过敏原。
12.权利要求11的乳组合物，其中过敏原是尘螨过敏原。
13.权利要求12的乳组合物，其中尘螨是Dermatophagoidespteronyssinus或Dermatophagoides farinae。
14.权利要求13的乳组合物，其中过敏原是Der p5，Der p1或Der p2。
15.权利要求10的乳组合物，其中酪蛋白是牛或羊酪蛋白。
16.权利要求10的乳组合物，其中该组合物是干态的。
17.权利要求10的乳组合物，其中过敏原是蛋白质过敏原。
18.权利要求10的乳在制备减轻呼吸道炎症和高反应性的药物中的应用。
19.权利要求12的乳在制备减轻呼吸道炎症和高反应性的药物中的应用。
20.权利要求13的乳在制备减轻呼吸道炎症和高反应性的药物中的应用。
21.权利要求15的乳在制备减轻呼吸道炎症和高反应性的药物中的应用。
22.权利要求10的乳在制备降低接触过敏原的个体体内IgE产生的药物中的应用。
23.一种核酸，包括(1)编码过敏原的编码序列；和(2)可操纵地与该编码序列连接的异源启动子，其中该异源启动子指导过敏原在乳腺细胞中表达。
24.权利要求23的核酸，其中过敏原是尘螨过敏原。
25.权利要求24的核酸，其中尘螨是Dermatophagoidespteronyssinus或Dermatophagoides farinae。
26.权利要求24的核酸，其中多肽具有与SEQ ID NO1至少70％相同的氨基酸序列。
27.权利要求25的核酸，其中过敏原包括具有与SEQ ID NO1、2或3相同的氨基酸序列的多肽。
28.权利要求23的核酸，其中启动子是酪蛋白或乳清蛋白的启动子。
29.权利要求28的核酸，其中启动子是α-乳清蛋白启动子。
30.权利要求23的核酸，其中过敏原是蛋白质过敏原。
31.哺乳动物生殖细胞，其是权利要求1的制备转基因哺乳动物的方法制备的转基因哺乳动物的生殖细胞，其中该生殖细胞包括该核酸。
全文摘要
本发明涉及将包括异源非乳过敏原的乳组合物给予个体以抑制该个体中过敏原特异性IgE的产生。
文档编号A61K39/35GK1406467SQ0212021
公开日2003年4月2日 申请日期2002年5月16日 优先权日2001年6月8日
发明者许清祥, 郑登贵, 陈全木 申请人:台岳生物科技股份有限公司