专利名称：磷脂蛋白质复合膜、胶囊、及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物兼容的复合膜、胶囊、及其制备方法，尤其涉及一种磷脂蛋白质复合膜、胶囊、及其制备方法。
与本发明相关的背景技术生命科学正日益成为现代社会的热门话题，也是科学界的研究焦点。生物膜是生物体的基本组成，许多重要的生物过程都直接或间接地与生物膜有关，因此，对于生物膜结构性质的研究十分重要。由于生物膜的组成和结构极其复杂，因此，人们通常采用化学模拟的方法去寻找和建立各种比较简单的模拟体系。这些两亲分子聚集体内的分子排列所提供的微环境与天然膜具有相似性，因而有可能模拟生物膜具有的某些功能和特征。在许多领域，如对反应速度、反应途径、和对产物构象的控制，以及在催化、指向性药物的可控释放、和太阳能转化等方面均有重要用途。
蛋白质/磷脂复合膜在物理结构和化学性质方面，与生物膜有许多相似之处，可以用来模拟生物体内分子水平上的信息与能量传递。
现有技术有大量的关于气/液界面上的蛋白质与磷脂的相互作用研究，例如Bougis.P.等所著Biochemistry 1981，20，4915-4921，还有对乳液中的蛋白质和磷脂相互作用的研究，参见Eldem，T.Speiser，P.(1989)Acta Pharm.Techn.，35，109。与气/液界面的研究相比，对于液/液界面上蛋白质与磷脂相互作用以及所获的产品报道较少，原因是现有技术在液/液界面，特别是在弯曲的液/液界面上制备分子聚集体的方法很少。
另外，仿生材料的制备及在分子水平上对生物活性组织如细胞与细胞膜认识的提高，使得关于蛋白质复合膜的研究日趋深入。在医学上作为药物的有机载体，利用复合膜材料包裹药物分子，对人体发病器官和组织实施定向治疗，实现药物缓释和靶向释放，是复合膜研究的应用背景。这其中要求膜材料组分具有良好的生物兼容性，并在活性体系中和流体界面上稳定。天然的生物材料比人工合成的材料更具有良好的生物兼容性。磷脂与蛋白质的结合是典型的生物兼容体系，其复合物可用作药物释放载体，为新药制备、药物设计提供更多的选择。
现有技术有脂质体包埋类药物释放体系的报道，参见Sharms，A.等的Liposomes in Drug Delivery；Progress and Limitation Int.J.Pharmaceutics.1997，154，123.，以及Betageri，G.V.；Jenkins，S.A.；Parson，D.L.Liposome Drug Delivery Systems，Lancaster.PennsylvaniaTechnic Publishing Company，Inc.1993。但是，脂质体药物释放体系存在局限性，原因是脂质体的酯键易水解和化学稳定性差。虽然脱水后的干燥脂质体稳定性大大提高，但是由于会在体内凝聚而造成药物泄露，以及药物在达到患病部位前就被释放，导致疗效下降。化学不稳定性和物理不稳定性成为限制脂质体广泛使用的主要原因。
因此，一方面，为更好地发展生物膜的模拟技术，需要理想、有效的在液/液界面上制备分子聚集体的手段。另一方面，制备磷脂蛋白质胶囊化复合物，可以为胶囊智能化，如对应外界的环境如pH值、温度变化做出反应，从而控制药物释放的时间和释放部位等应用，提供更好的选择。
发明内容
发明要解决的技术问题基于上文所述，为弥补现有技术的不足，以及进一步开发新的胶囊制品，发明人进行了在两种互不相溶的液体界面上进行蛋白质/磷脂复合膜的有序组装工作，成功地实现了曲面制备蛋白质与磷脂复合膜，并获得蛋白质与磷脂胶囊。本发明的技术方案本发明的目的之一是提供一种制备磷脂蛋白质胶囊化复合膜的方法，包括以下步骤a)将溶有磷脂的油性溶液通过毛细管泵入蛋白质缓冲溶液中；b)在所述缓冲溶液中形成油相液滴；c)所述蛋白质从所述缓冲液以及所述磷脂从所述油性溶液中分别吸附到缓冲溶液/油性溶液的界面上成膜；d)调节适当的PH及离子强度；以及e)形成磷脂蛋白质胶囊化复合膜。
本发明的另一目的是根据上述方法进一步获得一种磷脂蛋白质胶囊。
根据上述本发明的方法，其中蛋白质选自由人血清蛋白、乳球蛋白、和酪蛋白组成的组。
根据上述本发明的方法，其中磷脂选自由自由双十六烷酰磷脂酰胆碱(DPPC)、双十四烷酰磷脂酰胆碱(DMPC)、双十八烷酰磷脂酰胆碱(DSPC)、双十六烷酰磷脂酸(DPPA)、双十四烷酰磷脂酸(DMPA)、双十八烷酰磷脂酸(DSPA)、双十六烷酰磷脂乙醇胺(DPPE)、双十四烷酰磷脂乙醇胺(DMPE)和双十八烷酰磷脂乙醇胺(DSPE)组成的组。
根据上述本发明的方法，其中的缓冲溶液体系为Na2HPO4-NaH2PO4体系。
根据上述本发明的方法，其中的油性溶剂是烷烃或不溶性脂类。
本发明还有一个目的，是提供一种蛋白质/磷脂在液/液界面上吸附得到胶囊化复合膜，以及一种蛋白质/磷脂胶囊。
本发明提供了一种新颖的蛋白质磷脂界面膜的制备方法，为模拟生物膜技术的进一步发展提供了新的选择，构筑了新的膜制备与研究的模型。磷脂蛋白质复合物的形成，受离子强度、pH值等条件的影响，其聚沉和解离可以通过外界条件的改变加以调控，有可能实现蛋白质的pH响应释放，并保持蛋白质的活性，因而为对胶囊体进行智能化提供了更好的选择。本发明实现了在脂质体的外层包裹多层蛋白质，可以解决化学不稳定性和物理不稳定性对脂质体应用的限制，同时也保证了胶囊的生物兼容性及细胞亲和力。
为了更容易理解本发明的目的及实施，在下文提供了更详细的描述，以及优选实施例和附图
。应当明了的是，对本发明的详细描述是为了解释本发明的原理，不能构成对本发明的限制。
图2是采用本发明方法获得的在界面上形成的复合膜，以及随着油相液滴体积的减小而得到的胶囊。
图3是用原子力显微镜观察的结果，证明本发明的复合膜为一种多层膜结构。
在室温下(约20℃)，将溶有磷脂的有机溶剂(优选氯仿)利用泵50和注射器60泵入毛细管70，并使其在毛细管70末端形成一个液滴，该液滴的体积由一精密注射器60和泵50控制。在石英槽80中有蛋白质溶液，将此液滴浸入该蛋白质溶液中。磷脂从氯仿溶液，蛋白质从缓冲液中分别吸附到氯仿/水界面。这样的安排使得小分子表面活性组分磷脂与蛋白质接触的唯一机会是在界面上，可以防止杂质分子的引入，确保界面混合层就是蛋白质与磷脂之间形成的复合膜。如图2a所示，一段时间后，由于界面上蛋白质分子之间的相互作用，蛋白质与磷脂之间的相互作用，吸附在界面上的蛋白质形成了一个稳定的多层膜。调节适当的pH值及离子强度，进而，如图2f所示，吸附一定时间后，油/水界面上形成的复合膜，随着胶囊内有机溶剂的挥发而减少，胶囊体积变小，原来胶囊表面稳定平滑的复合膜出现“皮肤”状褶皱。随后，胶囊脱离毛细管掉入蛋白质溶液中形成完全封闭的胶囊。如图3所示原子力显微镜观察的结果，证明本发明的复合膜为一种多层膜结构。该膜将液滴包裹起来，形成了一个如图2f所示的胶囊。II原料选用磷脂可以分别选用双十六烷酰磷脂酰胆碱(DPPC)、双十四烷酰磷脂酰胆碱(DMPC)、双十八烷酰磷脂酰胆碱(DSPC)、双十六烷酰磷脂酸(DPPA)、双十四烷酰磷脂酸(DMPA)、双十八烷酰磷脂酸(DSPA)、双十六烷酰磷脂乙醇胺(DPPE)、双十四烷酰磷脂乙醇胺(DMPE)和双十八烷酰磷脂乙醇胺(DSPE)。
氯仿为ARCOR公司产品。考虑到氯仿在水中的轻微溶解度，使用前将氯仿在蒸馏水中浸泡24小时。用饱和的氯仿用来配置磷脂溶液。
蛋白质可采用了乳球蛋白(β-Lactoglobulin)，酪蛋白(β-Casein)，以及人血清蛋白(HSA)，购自Sigma公司。蛋白质溶液的pH值由Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液调节，溶液中总的离子强度为0.01III采用不同蛋白质制备胶囊采用上述的方法，分别用三种纯蛋白质乳球蛋白、酪蛋白和人血清蛋白，浓度为1.2mg/L，在经历一定的吸附时间后，在氯仿/水的液滴表面上均能形成“皮肤状”的褶皱膜。此折叠膜具有较强的力学性质。随着吸附时间的延长，液滴体积收缩、变小，最终形成一稳定的胶囊。将此胶囊转移到固体支持物上，干燥后用AFM(原子力显微镜)测量，如图3所示，证实液滴上的褶皱膜为多层膜。相同条件下人血清蛋白，乳球蛋白形成胶囊的时间较短，酪蛋白需要时间明显要比另外两种蛋白质时间长。IV不同浓度乳球蛋白制备胶囊下表记录一组不同乳球蛋白的浓度下，所制备液滴表面开始出现皮肤状褶皱的时间。t1是液滴表面开始出现皮肤状褶皱的时间，t2是液滴最终完全收缩并落下的时间。
V复合膜的性质本发明皮肤状的复合膜具有较好的弹性力学性质。复合膜在形成之后，一定程度的干扰和外界刺激不会导致膜结构破坏，表现出良好的稳定性。膜结构一旦被破坏，重新调节体系和环境所处的状态，复合膜可以再现。尽管这种重复出现的现象不能用“可逆”来描述，但说明弯曲界面上的磷脂/蛋白质复合膜具有稳定特性。原子力显微镜的结果证实了该复合膜为多层膜。
对工艺熟悉的技术人员，对本发明的各种调整和变化亦非常熟悉，但这些并不背离本发明的范围和宗旨。即便本发明是与其适宜的特殊实施例一起阐述的，应该明了的是，权利要求的发明不应该被不适当地限制在这些特殊实施例里。对说明书所描述的实施本发明模式的各种调整，都在随后所附的权利要求范围内。
权利要求
1.一种制备磷脂蛋白质胶囊化复合膜的方法，包括以下步骤a)将溶有磷脂的油性溶液通过毛细管泵入蛋白质缓冲溶液中；b)在所述缓冲溶液中形成油相液滴；c)所述蛋白质从所述缓冲液以及所述磷脂从所述油性溶液中分别吸附到所述缓冲溶液/油性溶液的界面上成膜；d)调节适当的pH值及离子强度；以及e)形成所述磷脂蛋白质胶囊化复合膜。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白质选自由人血清蛋白、乳球蛋白、和酪蛋白组成的组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的磷脂选自由双十六烷酰磷脂酰胆碱、双十四烷酰磷脂酰胆碱、双十八烷酰磷脂酰胆碱、双十六烷酰磷脂酸、双十四烷酰磷脂酸、双十八烷酰磷脂酸、双十六烷酰磷脂乙醇胺、双十四烷酰磷脂乙醇胺和双十八烷酰磷脂乙醇胺组成的组。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲溶液体系为Na2HPO4-NaH2PO4体系。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述油相溶剂为化学惰性且易挥发的有机溶剂。
6.根据权利要求6所述的方法，其中所述有机溶剂是氯仿。
7.根据权利要求1至7中任何一项权利要求所述的方法，进一步包括步骤f)形成所述磷脂蛋白质胶囊。
8.一种蛋白质/磷脂在液/液界面上吸附得到胶囊化复合膜。
9.根据权利要求8所述的胶囊化复合膜是一种起褶皱的多层膜。
10.根据权利要求8或9所述的复合膜构成的一种蛋白质/磷脂胶囊。
全文摘要
本发明涉及一种生物兼容的复合膜、胶囊、及其制备方法，尤其涉及一种磷脂蛋白质复合膜、胶囊、及其制备方法。本发明完成了两种互不相溶的液体界面上进行蛋白质/磷脂复合膜的有序组装工作，实现了曲面制备蛋白质与磷脂复合膜，为新药制备和药物设计提供更多的选择。
文档编号A61K9/50GK1476827SQ0213026
公开日2004年2月25日 申请日期2002年8月22日 优先权日2002年8月22日
发明者李峻柏, 张翼, 卢刚 申请人:中国科学院化学研究所