专利名称：壳寡糖在抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗癌药物的制备和应用，具体地说是壳寡糖在抗癌药物中的应用。
背景技术：
癌症由于其病程短、危害大、流行广，是危害人民生命健康的重要疾病之一。目前尚缺乏理想的治疗药物；根据29个省市自治区8亿多人口的调查，我国每年约有大于几十万人死于九大常见癌症；对于癌症的治疗主要有外科手术、化疗、放疗、基因治疗、中医药治疗及介入治疗；但是由于癌症常合并严重并发症或者在体内播散，手术切除率仅为5％左右，近95％的患者确诊时已失去手术机会，大多依赖药物治疗；所以，开发研究治疗癌症的药物具有特别重要的意义；中国科学院大连化学研究所于2000年1月5日提出一发明专利申请，申请号为00110009.2一种酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法；该发明将膜分离技术与酶法降解壳聚糖相结合，即采用中空纤维或平板膜超滤器对降解反应液原位分离，及时分离出具有生理活性的壳寡糖，有效地控制活性壳寡糖在酶作用下的进一步降解，也可以防止降解产物对反应的抑制作用，由于实现连续操作，酶可重复使用，提高降解酶的使用效率。超滤膜的滤出液再经纳滤，除去低聚合度的无活性的寡糖和大量的水，使超滤液得到浓缩，获得生理活性高的某聚合度范围的壳寡糖产品。如今，发展具有我国自主知识产权的壳寡糖(即氨基寡糖)抗癌新药的研究开发；它将对人类健康、经济和社会发展以及环境的改善具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供壳寡糖在抗癌药物中的应用，其肝癌抑制率较高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为利用申请号为00110009.2的反应分离耦合技术，将纳米膜技术应用于壳寡糖的浓缩及纯化中；然后通过乙醇分级沉淀，制备聚合度为2～50医药级壳寡糖，其中聚合度为4～30含量不低于50％，不包含水分含量的壳寡糖的纯度＞98％，用于抗癌药物中；可制成水剂、粉剂、片剂和滴丸等多种剂型。
其中所述壳寡糖制备过程如下首先将壳聚糖溶解在1～10％的醋酸溶液中，加入底物重1～10％的壳聚糖酶，升温搅拌至20～60℃恒温，10～60小时后开始超滤，小于截留分子量(300)的部分透过膜，大于截留分子量(6000)的分子返回反应釜继续降解，超滤透过液再通过纳滤器，透过部分为水、醋酸和小分子糖，未透过部分被浓缩成为10～50％聚合度为2～50壳寡糖，然后经过70～100％的乙醇沉淀，过滤，上清经过喷雾干燥，形成2～50药级壳寡糖。
本发明具有如下优点1.本发明采用的壳寡糖对体外培养的多种人肿瘤细胞株(经过大量实验发现)，如壳寡糖对人肝癌、大肠癌、宫颈癌、红白血病、淋巴白血病等肿瘤细胞的抑瘤率比较性研究显示其对肝癌的抑制作用最强，抑瘤率为79％(0.1mg/ml)。初步观察到壳寡糖抗癌作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。
2.本发明医药级壳寡糖和壳寡糖药物具有抑制癌细胞、抑制癌细胞转移、抑制癌毒素的作用。
3.本发明是在国家科技部“九五”攻关项目的支持下，采用酶反应分离耦合技术和酒精沉淀方法制备聚合度为2～50用壳寡糖的新工艺。
图1.药用壳寡糖制备的工艺流程图。
具体实施例方式
下面通过实例对本发明的技术进一步说明实施例1药用壳寡糖制备首先将5％的壳聚糖溶于4％醋酸溶液中，加入底物(相对于壳聚糖)重5％的壳聚糖酶，升温搅拌至30℃下反应，60小时后开始超滤，小于截留分子量(300)的部分透过膜，大于截留分子量(6000)的分子返回反应釜继续降解，超滤透过液再通过纳滤器，透过部分为水、醋酸和小分子糖，未透过部分被浓缩成为50％聚合度为2～50壳寡糖，然后经过75％的乙醇沉淀，过滤，上清经过喷雾干燥，形成2～50药级壳寡糖；其中聚合度为4～30含量65％，不包含水分含量的壳寡糖的纯度98.5％。其工艺流程如图1所示。
将所获得产品应用于以下的抗癌疗效试验实施例2低聚几丁糖对癌细胞DNA合成的抑制作用表1.低聚几丁糖对癌细胞DNA合成的抑制作用
从表1可以看出，壳寡糖对癌细胞DNA合成的抑制作用比对照(清水)高的多。
实施例3壳寡糖对多种肿瘤细胞体外抗肿瘤作用表2.壳寡糖对多种肿瘤细胞体外抗肿瘤作用
宫颈癌(Hela)、白血病(K562)、人巴白血病(Raji)、小鼠肝癌腹水(Hepa)从表2可以看出，壳寡糖对肝癌细胞有明显抑制作用，同时对白血病和鼠肝癌腹水细胞也有一定抑制作用。
实施例4壳寡糖体外抑制小鼠HCa-F瘤的实验表3.壳寡糖体外抑制小鼠HCa-F瘤的实验
从表3可以看出，壳寡糖对高淋巴道转移癌细胞系Hca-F具有较强的体外杀灭能力，100μg/ml壳寡糖的抑瘤能力强于10μg/ml顺铂，50μg/ml壳寡糖的抑瘤能力稍弱于10μg/ml顺铂。壳寡糖的溶剂乙酸不具有抑瘤能力。
实施例5壳寡糖对S-180的抑制及与甘露寡糖活性比较表4.壳寡糖对S-180的抑制及与甘露寡糖活性比较
小鼠腹水癌(S-180)从表4可以看出，三种寡糖比较试验结果表明壳寡糖抑制S-180的效果最好，其次是甘露寡糖和磺化甘露寡糖。
实施例6壳寡糖对肝癌细胞生长抑制作用表5.壳寡糖对肝癌细胞生长抑制作用
从表5可以看出，本实验进一步证实壳寡糖对肝癌细胞有明显抑制作用，实验所用非氧化型和氧化型壳寡糖溶液与对照组相比，均对肝癌细胞有明显抑制作用，且呈量效关系，尤其以氧化型壳寡糖作用更明显。
实施例7壳寡糖对实体瘤小鼠瘤重的影响表6.壳寡糖对实体瘤小鼠瘤重的影响
*与对照组比较有显著性差异(p＜0.05)μ***与对照组比较有极显著性差异(p＜0.001)从表6可以看出，经口给予小鼠不同剂量的低聚几丁糖30天后，与对照组比较，中剂量组(6.7mL/kg.bw)的荷腹水瘤小鼠存活时间延长34％，重复实验延长37％；荷实体瘤小鼠瘤重降低63％，重复实验降低30％。高剂量组(20.0mL/kg.bw)的荷腹水瘤小鼠存活时间延长35％，重复实验延长36％；荷实体瘤小鼠瘤重降低76％，重复实验降低67％。
实施例8对正常小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响表7.对正常小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
由表7可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天后，与对照组比较，各剂量组的碳廓清指数均无显著差异(p＞0.05)。
实施例9低聚几丁糖对小鼠活性NK细胞的影响表8.低聚几丁糖对小鼠活性NK细胞的影响
淋巴细胞(NK细胞)由表7可见，中剂量组和高剂量组与对照组比较碳廓清指数、NK细胞活性均无显著差异(p＞0.05)。实验结果表明口服中剂量或高剂量壳寡糖作用，在服用期间不会对机体免疫系统造成损伤。
权利要求
1.壳寡糖在抗癌药物中的应用，其特征在于壳寡糖的聚合度为2～50，其中聚合度为4～30含量不低于50％，不包含水分含量的壳寡糖的纯度＞98％。
2.按照权利要求1所述壳寡糖在抗癌药物中的应用，其特征在于其中所述壳寡糖制备过程如下首先将壳聚糖溶解在1～10％的醋酸溶液中，加入底物重1～10％的壳聚糖酶，升温搅拌至20～60℃恒温，10～60小时后开始超滤，膜的孔径为300～6000，小于截留分子量的部分透过膜，大于截留分子量的分子返回反应釜继续降解，超滤透过液再通过纳滤器，透过部分为水、醋酸和小分子糖，未透过部分被浓缩成为10～50％聚合度为2～50壳寡糖，然后经过70～100％的乙醇沉淀，过滤，上清经过喷雾干燥，形成2～50药级壳寡糖。
3.按照权利要求1所述壳寡糖在抗癌药物中的应用，其特征在于其中所述壳寡糖抗癌药物可制成抑制肝癌、大肠癌、宫颈癌、红白血病、淋巴白血病的水剂、粉剂、片剂和滴丸。
全文摘要
本发明涉及抗癌药物，是壳寡糖在抗癌药物中的应用；其中壳寡糖的聚合度为2～50其中聚合度为4～30含量不低于50％，不包含水分含量的壳寡糖的纯度＞98％；本发明采用的壳寡糖对体外培养的多种人肿瘤细胞株，如壳寡糖对人肝癌、大肠癌、宫颈癌、红白血病、淋巴白血病等肿瘤细胞的抑瘤率比较性研究显示其对肝癌的抑制作用最强，抑瘤率为79％(0.1mg/ml)，初步观察到壳寡糖抗癌作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关；医药级壳寡糖和壳寡糖药物具有抑制癌细胞、抑制癌细胞转移、抑制癌毒素的作用。
文档编号A61P35/00GK1506067SQ0214470
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月6日 优先权日2002年12月6日
发明者杜昱光, 白雪芳, 曲天明, 李曙光, 顾开春, 陆海峰, 赵小明 申请人:中国科学院大连化学物理研究所