专利名称：一种筛选人组织相容性抗原(hla)的t细胞表面抗原肽的体系,及其在制备mhc-抗原肽多 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选人组织相容性抗原(HLA)的T细胞表面抗原肽的方法，及其在制备MHC-抗原肽多聚体中的应用，属于生物制药领域。
背景技术：
同种组织、器官移植是医学领域的一种重要的治疗技术，已被广泛应用。肾脏、心脏、肝脏、骨髓的同种移植已成功地挽救了大量患者的生命。更为复杂和实用的同种移植(多脏器、胰岛移植等)也在研究应用中。同种移植失败的主要原因是由于宿主T细胞对移植产生攻击，导致移植物被排斥。早已知道T细胞识别的主要抗原是移植物上的HLA抗原，包括I类和II类抗原。移植物与宿主间相适的组织配型是减少移植排斥最有效的途径。然而，由于找到HLA配型完全相符合的机会很低，大多数的器官移植采用的HLA配型的半相合或不相合的器官。宿主对于移植物的排斥反应则通过给予有效的免疫抑制剂而被抑制。因而，器官移植患者将终身使用免疫抑制剂，而由于免疫抑制剂产生的非特异性免疫损害又对患者产生并发症的危险。降低患者生活质量，同时也造成患者很大的经济负担。更为复杂的是当患者出现临床不良反应时，有时很难判断这种反应是由于宿主的免疫排斥反应引起的，还是免疫抑制剂的毒害造成的。而这两种危害的临床解决方案正好是相矛盾的即当出现排斥反应时要加大免疫抑制剂用量，而出现免疫抑制剂损害时要降低免疫抑制剂的用量。因而，发明一种可以精确鉴别上述2种临床不良反应病因的技术产生对于组织器官移植的患者的急救、个体用药指导是极为重要和实用的。对于移植物特异性的T细胞可以作为这种检测的目标细胞当这种细胞升高，提示可能出现排斥反应。而这种细胞消失的情况下出现的临床毒性反应很可能是免疫抑制剂过量造成的。通过检测这类T细胞，可以有效地进行鉴别诊断，指导临床使用合理的方案，同时也可以根据每一患者的个体差异指导其长期合理的用药，从而可在保证移植物长期存活的前提下，提高患者生活质量、减低经济负担。
目前已可以用MHC-肽多聚体技术检测特异性T细胞，并可将其分选、活化、扩增。不但可为临床提供诊断的依据，而且可利用这些T细胞进行生物治疗(增强或抑制免疫反应)。MHC-肽多聚体制备、应用的要点是要采用相应的T细胞识别表位肽，这些肽的大小一般在9-15个氨基酸残基。然而，到目前为止虽然知道移植物上的HLA抗原是T细胞的主要识别对象。只有很少的HLA表位被解析出来，并用于检测特异性T细胞。又由于HLA具有高度的多态性，按照现有的T细胞表位筛选技术筛选相应表位肽是非常困难的。本发明是在我们另一项高效筛选T细胞表位肽用于MHC-肽多聚体筛选体系发明基础上，采用T2样细胞-噬菌体展示技术筛选的-组宿主T细胞识别的HLA抗原肽。这组肽可用于制备MHC-肽多聚体。从而发展出一种高效、特异的，检测、分选、活化、扩增宿主特异性抗同种移植物T细胞的方法，用于同种移植排斥反应及免疫抑制剂个体化治疗的检测。
发明内容
现有的筛选人组织相容性抗原肽的实验步骤繁复，而且要合成大量的人组织相容性抗原肽段，成本很高。
本发明的目的是提供一种筛选人组织相容性抗原肽的方法。
本发明的另一个目的是提供用此体系筛选的人组织相容性抗原肽制备MHC-肽多聚体的应用。
利用本发明的方法可以快速并且大量的筛选到目的肽段。
本发明一种高效筛选T细胞抗原表位肽，制备MHC-肽多聚体(MHC tetramer)的方法，其步骤如下(1)iRNA技术制备表达不同HLA抗原(包括I类和II类抗原)的、内源性抗原肽提呈表达缺陷的T2样细胞系；(2)制备人主要及次要组织相容性抗原的肽链基因库；(3)利用步骤(2)制备的基因库，制备噬菌体肽展示体系；(4)把步骤(1)制备的T2样细胞系与步骤(3)制备的噬菌体混合；(5)洗涤去除不结合的噬菌体；(6)利用抗噬菌体衣壳蛋白抗体检测噬菌体结合的情况和条件；(7)用洗脱液进行梯度洗脱去除亲和性不高的噬菌体；(8)加入噬菌体敏感宿主大肠杆菌使T2样细胞上的噬菌体感染大肠杆菌，并得以扩增；(9)由大肠杆菌中进一步分离噬菌体质粒，并对其中的cDNA克隆测序、筛选出与MHC分子结合的肽段序列；(10)合成所筛选的肽段，结合至T2样细胞用该细胞刺激T细胞反应，确认肽段T细胞表位活性。
具体实施例实施例1制备内源性抗体肽表达缺陷的T2样细胞系制备T2细胞的TAP基因，使用Benitec公司的RNAi试剂盒，根据产品实验说明的步骤，制备出TAP基因缺陷的T2样细胞。
把上述T2样细胞破碎，根据《分子克隆》的方法提取T2样细胞的基因，再用PCR技术用TAP启动子和终止子进行扩增，再进行凝胶电泳，没有发现有TAP基因带。
实施例2制备人组织相容性抗原肽链基因库把T细胞在含有4.5g/L葡萄糖和15％FBS的DMEM中繁殖，用常规方法分离RNA，并用试剂盒把RNA逆转录成cDNA(Indianapolis，Ind)。第一步制备出来的cDNA再用PCR方法扩增。
把制备好的DNA用酶XhoI和SpeI同时进行酶切，并把基因插入到噬菌体展示系统里(Dyax公司生产)。得到含有各种肽段的噬菌体系统。
实施例3筛选亲和性高的噬菌体用PBS洗涤细胞，把没有结合的噬菌体洗去，再增加洗涤液的离子强度，继续洗涤，把结合不紧密的噬菌体洗去，不断增加洗涤液的离子强度，不断进行洗涤去除结合不紧密的噬菌体，最后筛选出和T2样细胞亲和力高的噬菌体。
实施例4扩增筛选出来的和T2样细胞亲和力高的噬菌体加入噬菌体敏感宿主大肠杆菌使T2样细胞上的噬菌体感染大肠杆菌，加入LB培养基，37℃下培养24-48小时，收集大肠杆菌，由大肠杆菌中进一步分离噬菌体质粒，并对其中的cDNA克隆测序、筛选出与MHC分子结合的肽段序列，为YIGEVLVSV、SPSVDKARAEL、SPAVDKAQAEL。
实施例5用人组织相容性抗原肽段合成MHC-肽抗体多聚体水浴或冰冻孵箱预冷1L折叠缓冲液(装于有搅拌子的1L的烧杯中)，在折叠缓冲液加入还原型谷胱酐肽至5mM，氧化型谷胱酐肽至0.5mM，PMSF至0.2mM。计算加入1uM重链、2uM轻链和30mg/L肽的必需量，将重链和轻链加入5ml注射缓冲液中，于室温抽入5ml注射器中。并根据人组织相容性抗原多肽的氨基酸序列(疏水性)于500ul双蒸水或DMSO中稀释人组织相容性抗原多肽。将1L重悬缓冲液放于搅拌器上高速搅拌(避免反应液起泡)，用移液器逐滴加人组织相容性抗原多肽于搅拌的反应液中。用26号针头在尽可能接近搅拌子的位置猛烈将重链和轻链注射于搅拌的反应液中。加入轻链后，折叠缓冲液应变得轻微不透明。存放于10℃，过夜。将复性反应物超滤浓缩至7ml。用Superdex75凝胶过滤纯化MHC-人组织相容性抗原肽单聚体。用SDS-PAGE检测，并用ELISA法鉴定其构象，一抗为BB7.2。
将MHC-I单聚体与制备的荧光标记的卵黄抗体按比例混合，37℃温浴1h，用Superdex200凝胶过滤纯化。FPLC检测。
将MHC-I单聚体与制备的荧光标记的单克隆抗体按比例混合，37℃温浴1h，用Superdex200凝胶过滤纯化。FPLC检测。
实施例6MHC-HLA-A2.1肽多聚体在临床上的应用用上述制备出的MHC-HLA-A2.1肽四聚体或多聚体，并在四聚体或多聚体上结合一个显色因子，把这个四聚体或多聚体与组织、器官移植患者的血清混合，分离并洗涤，洗去没有结合的MHC-人组织相容性抗原肽四聚体或多聚体，用细胞计数器检测T细胞的数量，得知T细胞的浓度变高，提示可能出现排斥反应。从而可以指导临床合理使用免疫抑制剂。
实施例7MHC-HLA-B7肽多聚体在临床上的应用用上述制备出的MHC-HLA-B7肽四聚体或多聚体，并在四聚体或多聚体上结合一个显色因子，把这个四聚体或多聚体与组织、器官移植患者的血清混合，分离并洗涤，洗去没有结合的MHC-人组织相容性抗原肽四聚体或多聚体，用细胞计数器检测T细胞的数量，得知T细胞的浓度变高，提示可能出现排斥反应。从而可以指导临床合理使用免疫抑制剂。
权利要求
1.一种筛选人组织相容性抗原(HLA)的T细胞表面抗原肽的方法，其包括以下步骤(1)用iRNA技术制备表达不同HLA抗原(包括I类和II类抗原)的、内源性抗原肽提呈表达缺陷的T2样细胞系；(2)制备人主要及次要组织相容性抗原的肽链基因库；(3)利用步骤(2)制备的基因库，制备噬菌体肽展示体系；(4)把步骤(1)制备的T2样细胞系与步骤(3)制备的噬菌体混合；(5)洗涤去除不结合的噬菌体；(6)利用抗噬菌体衣壳蛋白抗体检测噬菌体结合的情况和条件；(7)用洗脱液进行梯度洗脱去除亲和性不高的噬菌体；(8)加入噬菌体敏感宿主大肠杆菌使T2样细胞上的噬菌体感染大肠杆菌，并得以扩增；(9)由大肠杆菌中进一步分离噬菌体质粒，并对其中的cDNA克隆测序、筛选出与MHC分子结合的肽段序列；(10)合成所筛选的肽段，结合至T2样细胞用该细胞刺激T细胞反应，确认肽段T细胞表位活性。
2.权利要求1所述的一种高效筛选T细胞抗原表位肽，制备MHC-肽多聚体的方法，其步骤(7)所述的洗脱液为阳离子洗脱剂。
3.权利要求1所述的一种筛选人组织相容性抗原(HLA)的T细胞表面抗原肽的方法，得到的肽链是存在人HLA I类和I类分子上的，可以被T细胞受体(TCR)识别的T细胞抗原表位肽。
4.如权利要求3的一种筛选人组织相容性抗原(HLA)的T细胞表面抗原肽的方法，所述的可以被T细胞受体(TCR)识别的T细胞抗原表位肽为HLA-A2.1，序列为YIGEVLVSV。
5.如权利要求3的一种筛选人组织相容性抗原(HLA)的T细胞表面抗原肽的方法，所述的可以被T细胞受体(TCR)识别的T细胞抗原表位肽为HLA-B7，序列为SPSVDKARAEL。
6.如权利要求3的一种筛选人组织相容性抗原(HLA)的T细胞表面抗原肽的方法，所述的可以被T细胞受体(TCR)识别的T细胞抗原表位肽序列为SPAVDKAQAEL。
7.权利要求4、5或6中的HLA抗原上的T细胞抗原表位肽用于制备MHC四聚体或多聚体，并用于特异性检测同种组织、器官移植患者体内具排斥所移植组织、器官功能的T细胞，从而可用于检测同种移植排斥、并指导临床合理使用免疫抑制剂。
全文摘要
本发明属生物医药领域，是关于一种筛选人组织相容性抗原(HLA)的T细胞表面抗原肽的体系，及其在制备MHC－抗原肽多聚体中的应用。利用该组抗原肽制备的MHC－肽四聚体(MHC tetramer)可用于同种移植排斥反应的监测，并指导临床合理使用免疫抑制剂。
文档编号A61K38/17GK1511958SQ0215997
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月31日 优先权日2002年12月31日
发明者徐小宁, 王小宁 申请人:王小宁