专利名称：由巨噬细胞迁移抑制因子调节细胞毒性淋巴细胞反应的制作方法
技术领域：
本发明涉及在CD4+和/或CD8+T淋巴细胞和抗原接触之前、接触过程中或者接触后，用对其降低或者提高巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)水平的方法来调节(增强或者降低)细胞毒性淋巴细胞对肿瘤相关抗原等抗原的反应的方法和组合物。本发明还涉及通过基于细胞的免疫治疗方法调节细胞毒性淋巴细胞对抗原的反应来预防和治疗疾病特别是肿瘤的组合物和方法。
背景技术：
实验室研究和人体临床实验两方面的数据均表明肿瘤相关抗原足以引发抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞(CTL)反应，该反应能够使肿瘤明显消退(27，28)。在一些实例中，利用基于细胞的免疫治疗策略(肽免疫)来提高CTL细胞毒活性能够使黑色素瘤得到长期的消退(29)。不过，虽然存在递呈给I类MHC的肿瘤特异性抗原，但是很少能够体内检测到强有力的肿瘤杀伤免疫反应。产生肿瘤特异的CTL需要适当的肿瘤抗原加工，由MHC I类分子将肿瘤抗原进行展示、T淋巴细胞表达对识别肿瘤抗原有合适特异性的T细胞受体、并起始向免疫系统进行抗原递呈。仅仅发动CTL反应是不够的，CTL反应必须达到一定强度并能维持下去才能成功抑制肿瘤。
人们已经认识到有几种细胞因子能够在不同方面加强CTL反应。例如，IL-2的早期表达对于具有裂解活性的CTL细胞的增殖和发育起着重要作用(30)。另外，已经证明INFγ(30)、IL-1和IL-6(31)、IL-2和IL-6(32)、IL-7(33)、IL-10(34)、IL-12(35-37)在CTL细胞的激活、增殖和/或分化中扮演一定角色。这些介导物通过增强抗原递呈、CD4+辅助T细胞的功能、巨噬细胞附着或者增加重要的共刺激因子的表达来提高CTL的活性。在带有肿瘤的小鼠中已经观察到了施用重组细胞因子后的抗肿瘤效果，这些细胞因子包括IL-1(38)、IL-2(39)、IL-12(40-42)，IFNα(43，44)，IFNγ(45)、和TNFα(46)。
与此相反，仅有少数细胞因子表现出对CTL分化和裂解活性的抑制作用，包括IL-4(47，48)和TGFβ(49)。IL-4抑制CD8+T细胞分泌IFNγ(50，51)，并且能够限制具有高细胞裂解活性CD8+T细胞的激活和分化(52)。另外，在没有IL-4时进行CTL引发能够在受激发后提高反应潜力。目前尚未完全阐明这几种细胞因子抑制CTL细胞裂解活性的机制。
最近，人们才对巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)这种蛋白质介体的生物学功能进行了详细的研究(在(1)中进行了综述)。虽然在40年前MIF就已经被发现是一种活化的T淋巴细胞产生的可溶性活性产物(2，3)，但是直到发现小鼠垂体前页腺体能够分泌MIF的同源蛋白，人们才再次对MIF提起兴趣(4)。随后发现以前被认做是MIF作用靶点的巨噬细胞在微生物毒素或者细胞因子TNFα和IFNγ的激活下成为产生MIF的重要来源(5)。体内实验也表明MIF在宿主对内毒素的反应中具有重要意义。重组MIF(rMIF)和LPS共同给药后能够增加LPS的致死率。同时抗MIF抗体的中和作用能够保护小鼠不死于致死性的内毒素血症(4)、外毒素血症(6)和腹膜炎。MIF功能研究还表明在T细胞激活反应过程中和B细胞产生抗体过程中，这种蛋白质是IL-2表达所必需的。
最近的2篇报道还发现了MIF在肿瘤生长中具有未曾预料的作用(9，10)。本发明者等人发现对小鼠进行抗MIF抗体(mAb)给药能够显著降低同基因皮下移植B细胞淋巴瘤38C13的生长和血管形成(9)。有证据表明MIF具有这种抗肿瘤效果是(部分)因为MIF是内皮细胞增殖和肿瘤血管生成的必需条件。同样，抗MIFmAb处理接种有人黑色素瘤G361的小鼠后，能够显著降低肿瘤生长和血管新生(10)。
发明简述本发明以本发明人的发现为依据(部分)，即在CTL反应中MIF的表达上调，和在体内和体外用特异性mAb抑制MIF能够提高CTL活性。具体而言，在这里公开实验证据中和MIF能够提高CTL活性、抑制肿瘤生长、增加T淋巴细胞对在体内肿瘤侵袭位点的归巢作用(homing)。因此，下述实施例所示的体外CTL实验的结果表明在体外引发阶段进行MIF免疫中和能够增加CTL培养物的IFNγ产量。因为已经知道活化Th2细胞能够增加MIF的分泌水平，而活化Th1细胞不能提高MIF的分泌水平(8)，因此推测可溶性抗原可能刺激诱导MIF表达，进而通过抑制Th1细胞因子(包括IFNγ)的产生来体内抑制CTL的激活。
以前的实验已经证明MIF对CD4+辅助T细胞介导的对多种有丝分裂原或者可溶性抗原的激活反应方面具有重要作用。有丝分裂原或抗原激活的T细胞表达大量的MIF mRNA和蛋白质，对MIF的免疫中和处理能够在体外抑制IL-2产生和T细胞增殖，并能在体内降低T辅助细胞对可溶性抗原的反应(8)。本研究表明肿瘤抗原刺激后MIF表达上调，并且MIF的中和作用不影响IL-2分泌或者抗原诱导的CD8+T细胞增殖。但是，抗MIF处理能够显著增加IL-2受体γc亚单位的表达，该亚单位是细胞内信号传导所必需的(25)，同时对CD8+T细胞的生存具有重要意义(26)。因此，MIF中和作用能够导致T细胞细胞毒作用增强，不能归因于CD8+T细胞的增殖，而归因于提高细胞毒性CD8+T细胞的生存率。在由CD8+T细胞激发溶细胞活性后，为了成功消退肿瘤，必须维持这种溶细胞作用。因此，抑制MIF能够延长CTL的寿命，在体内和体外表现出CTL抗肿瘤作用。
抗MIF mAb处理EG.7肿瘤小鼠能增强CTL活性并显著抑制肿瘤生长。而且，来自抗MIF处理的带肿瘤的小鼠的迁移的CD8+T细胞在受体小鼠中能够抑制肿瘤生长。因为观察到肿瘤实体中的凋亡细胞数量增加，因此可合理推测增强并维持CTL细胞毒作用直接导致了抗MIF处理的小鼠中的对肿瘤生长的抑制作用。
最近的报道表明肿瘤细胞比非转化细胞能够产生更多的MIF(10，53，54)。肿瘤细胞通过丢失让CTL细胞识别的肿瘤抗原来逃脱CTL细胞的致死作用，或者即使肿瘤细胞表达了能被识别的抗原，它仍然能够通过降低MHC表达水平的方法来耐受CTL介导的裂解作用(55)。虽然EG.7细胞能够组成型分泌MIF(～10ng/ml/106个细胞)，rMIF和抗MIF抗体都不能影响EG.7细胞的I类MHC的表达。有数据表明肿瘤细胞能够通过分泌MIF造成CD8+T数量下降的新机制来逃脱宿主免疫系统反应。
一些研究表明某些肿瘤细胞表达FasL，从而增加了肿瘤成为免疫赦免部位的可能性。例如在表达FasL黑色素瘤和肝细胞癌的原位发现了浸润淋巴细胞的凋亡(57)。不过，最近的体内和体外实验对最初的假说提出了挑战。这些研究表明某些肿瘤细胞不表达FasL(58，59)，并且用FasL cDNA转染某些肿瘤细胞不能促进肿瘤细胞逃脱免疫系统，而是诱导肿瘤细胞的消退(59，60)。进一步的研究表明FasL表达促进迅速产生移植排斥反应(61)和炎症(63)。这项研究没有对肿瘤内的FasL表达进行检测。不过本发现表明在这些系统中检测MIF/抗MIF对FasL表达的影响是有意义的。
此研究还确定了MIF在T细胞运输中的重要作用。实验观察到在抗MIF处理的小鼠肿瘤内出现了CD4+和CD8+T细胞积累增加现象。目前已知肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)引起的肿瘤破坏过程有CD4+和CD8+T细胞参与。用IL-2和TILs处理大鼠乳房肿瘤能通过诱导肿瘤细胞凋亡来促进肿瘤消退(64)，并且在人黑色素瘤中的TILs积累与较好的临床效果相关联(65)。实验观察到抗-MIF抗体能够增强CD4+和CD8+T细胞向肿瘤块的迁移，因此表明抗-MIF抗体能影响抗肿瘤T细胞的功能，这可能涉及到改变趋化因子或趋化因子受体表达等机制。
不仅能调节CTL的活性，MIF在肿瘤形成其它方面也扮演一定角色。两个独立的实验发现MIF中和能显著抑制肿瘤的血管生成(9，10)，Hudson及其合作者最近发现，在成纤维细胞中加入rMIF能够抑制P53的转录活性进而抑制其功能(包括增殖和凋亡)(66)，虽然许多种类的宿主免疫效应细胞参与了杀灭肿瘤的过程，但是肿瘤抗原特异性CTLs在介导肿瘤细胞杀伤过程中具有显著效果，即使在靶细胞表面表达的抗原密度低的时候仍是如此(67)。因此，利用MIF免疫中和来治疗性增加CD8+CTLs为基于细胞的抗肿瘤免疫治疗提供了新基础。
因此，本发明提供了在离体或体内或这两种情况下，在CD4+和/或CD8+T淋巴细胞和抗原接触之前、之中或者之后，用降低或者提高其所暴露的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)水平的方法来调节(增强或者降低)细胞毒性淋巴细胞对肿瘤相关抗原等抗原的反应的方法和组合物。
因此，一方面，本发明提供制备细胞的方法，优选T细胞，尤其优选CD8+T细胞，作为一种癌症治疗法，对癌症患者或者其它需要CTL反应进行有效的免疫治疗的患者进行给药。该方法包括在MIF拮抗剂或者抑制剂存在的条件下培养细胞。在这个方法中，从抗MIF抗体、MIF反义cDNA和MIF配体受体结合的拮抗剂中选择MIF拮抗剂。该方法的优选实施方案包括在含有抗MIF抗体的环境下培养细胞，该抗体能够中和MIF活性或者使MIF失活。本发明方法所用的抗MIF抗体优选为单克隆抗体、并选自人单克隆抗体、人源化的单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和单链单克隆抗体。
另一方面，本发明涉及制备细胞组合物的方法，作为增强CTL反应的免疫治疗药物，优选对癌症患者进行癌症治疗给药，该方法包括在(a)至少有一种所需CTL反应的靶抗原，优选肿瘤抗原和(b)抗MIF抗体存在的条件下孵育组合物的细胞。
另一方面，本发明涉及制备自体同源细胞的方法，用于对癌症患者进行治疗，该方法包括在某种试剂存在的情况下孵育细胞的步骤，该试剂选自抗MIF抗体、其MIF结合片段或者上述2种物质的混合物。本方法的优选实施方案包括在(a)至少一种肿瘤抗原和(b)选自抗MIF抗体、其MIF结合片段或者这2种物质的混合物的试剂存在的情况下孵育细胞的步骤。优选该自体同源细胞包含免疫细胞，尤其优选T细胞，更优选CD8+T细胞。
另一方面，本发明提供细胞组合物，施用于需要增强其对某种抗原的CTK反应的患者，例如癌症患者。此组合物包含用抗MIF抗体培养的细胞。在此细胞组合物的一个实施方案中，以抗MIF抗体培养的细胞还需要用至少一种对其需要增强CTL反应的抗原，例如肿瘤抗原来培养。用抗MIF抗体培养细胞优选为离体培养，并且此细胞组合物可以包含同抗MIF抗体培养后从未结合的抗MIF抗体中分离得到的细胞。此细胞组合物中的细胞还可以从未结合的抗MIF抗体及未结合的抗原，例如肿瘤抗原中分离。本发明中的细胞组合物中细胞优选包括免疫细胞，尤其优选T细胞，且更为优选CD8+T细胞。
图1在体外，抗MIF mAb，而非rMIF或者对照IgG，增强CTL活性。7天前用EG.7细胞引发的C57BL/6小鼠作为脾细胞的来源(见材料与方法)。脾细胞培养物在有rMIF(A)，抗MIF抗体(B)或对照IgG1，(C)存在时用辐射的EG.7细胞刺激5天。在脾细胞中按照不同的E∶T细胞比例加入新鲜的EG.7靶细胞，37培养4小时后，用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒性。(D)比较了脾细胞-辐射EG..7细胞刚开始进行共培养时加入抗体(E∶T＝20∶1)(第0天)和在共培养第2天后加入，抗MIF单克隆抗体对体外CTL活性的影响，和不加入抗体相比，用Student’s t检测p＜0.05。
图2用辐射的EG.7细胞培养引发的脾细胞时MIF和IFNγ分泌增加。脾细胞从EG.7引发的小鼠中分离得到，用或不用辐射的EG.7细胞和同型对照抗体(对照)或抗MIF mAb(抗MIF)(50μLg/ml)刺激1或2天。用特异性ELISA检测培养物上清中的MIF(A)和IFNγ(B)，见材料与方法。TNFα和IL-12的量低于检测线。用Student’st检测对照+EG.7和对照-E.7相比*，p＜0.05。
图3抗MIF mAb处理EG.7肿瘤小鼠增加CTL活性并且抑制肿瘤生长。用EG.7细胞注射C57BL/6小鼠(每组n＝5)，然后每天用PBS或对照IgG1或抗MIF单克隆抗体(0.5mg)处理，在第7天时，收获并分离脾细胞并和辐射的EG.7细胞共培养5天，然后用LDH释放法进行4小时CTL体外检测测定细胞裂解状况(A)。第7天时测定肿瘤体积(B)。抗MIF处理和对照IgG处理的Student’s t检测*，p＜0.05。
图4抗MIF mAb处理EG.7肿瘤小鼠增强T淋巴细胞的肿瘤浸润。小鼠(每组n＝5)，每天用对照IgG或抗MIF mAb处理，连续处理7天。然后切取EG.7肿瘤，用PE-抗-鼠CD4(L3T4)或FITC-抗-鼠CD8(ly-2)单克隆抗体对肿瘤切片进行染色。用荧光显微镜对CD4+和CD8+T细胞计数，计算出和对照IgG处理的动物相比抗MIF mAb处理的动物的肿瘤中免疫反应性浸润细胞数量平均百分比的增加(加减S.D.)。肿瘤切片与荧光标记的同种对照抗体孵育后未表现出免疫反应活性，抗MIEF和对照IgG处理的相比，Student’s t检测同*，p＜0.05。
图5抗MIF mAb处理促进EG.7肿瘤细胞凋亡。用TUNEL方法标记断裂DNA链，在原位检测凋亡细胞。用抗MIF mAb处理的小鼠(A)在其肿瘤组织中能够观察到许多凋亡的EG.7细胞(黑棕色)，相反，用对照IgG处理的小鼠(B)在其肿瘤组织中观察到很少的凋亡小体。图中展示了10个代表性肿瘤组织的切片(放大100倍)(每组n＝5个动物)。
图6体内用抗MIF抗体处理增加IL-2Rγc的表达量。每天用抗MIF或对照IgG处理EG.7肿瘤小鼠，连续处理7天，然后收集其脾细胞和天然小鼠的脾细胞(每组3只小鼠)，每组的脾细胞混合在一起，分选并计算CD8+T细胞数量后对CD8和IL-2Ra(A)、β(B)或γc(C)表面标志物进行染色。阴影柱状图表示被同型对照抗体染色的细胞。
图7用抗MIF抗体处理供体有肿瘤小鼠增加迁移T淋巴细胞向受体有肿瘤小鼠的EG.7肿瘤中迁移的能力，并且促进受体鼠中CD8+T细胞的抗肿瘤活性。经抗MIF或者对照IgG处理8天后(0.5mg×7天)，从正常(对照)或者有肿瘤的小鼠中分离未分级的脾细胞(A)或者纯化的CD8+脾T细胞(B)，并用荧光染料PKH-26标记。标记的细胞经静脉转入有肿瘤的受体小鼠(n＝每组5只)，一天后，切取肿瘤，制备恒温冷冻切片，测定每个高亮区(HPF)荧光细胞的数目(均值±S.D.)，与对照抗体处理小鼠相比Student t检验*，p＜0.05**，p＜0.01(C)。向C57BL/6小鼠注射5×106的EG.7细胞(i.p.)，然后用抗MIF mAb或者对照IgG(0.5mg/天)处理7天。纯化的脾CD8+T细胞转入到受体小鼠中(5×106个细胞/小鼠，i.v.)，该小鼠(每组5只)已在24小时前s.c.接种5×106的EG.7细胞。测定肿瘤重量(平均值±S.D.)。与对照抗体处理的小鼠相比Student t检验p＜0.05。
发明详述本发明涉及在体内或者体外抑制MIF释放和/或活性的组合物和方法，用于治疗任何需要CTL反应的疾病，包括但不限于肿瘤(恶性或者良性)、病毒感染、寄生虫感染，例如包括疟疾和/或细菌感染。
根据本发明，抑制MIF活性的方法有几种，其中包括但不限于使用能够与MIF结合并中和其生物活性的因子；使用MIF受体拮抗剂；使用能够抑制体内细胞释放MIF的化合物；及使用根据MIF编码序列、非编码序列和/或调控序列设计的寡核苷酸抑制或减少MIF的表达。根据相关的条件，可以使用任何一种或几种上述方法来抑制MIF的活性来治疗相关疾病，并且还可以和其它的CTL增强治疗，包括例如肽免疫、细胞因子治疗等联合使用。
在本文中提到的MIF结合伴侣是指能够结合MIF并中和其生物活性的因子，根据本发明它们可被用于需要CTL反应的疾病的治疗。由于肿瘤分泌或者Th2T辅助细胞的激活可能提高MIF蛋白水平，抑制性MIF结合伴侣和MIF蛋白的相互作用能够抑制MIF活性的伴随增加。这些因子可包括但不限于抗MIF抗体、抗体片段、MIF受体和MIF受体片段。
可采用本领域公知的多种方法生产针对重组生产或天然纯化的MIF的抗原表位的抗体(例如采用下文中的重组DNA技术)。在诊断和治疗中优先选择中和性抗体，例如竞争MIF受体结合位点或者造成MIF受体结合位点空间位阻的那些抗体。这类抗体包括但不限于多克隆、单克隆、人源单克隆、嵌合、单链、Fab片段和Fab表达库产生的片段。
为了生产抗体，可以用MIF和/或MIF蛋白的一部分注射免疫多种宿主动物。这些宿主动物包括但不限于兔子、小鼠和大鼠等。针对不同种类的宿主动物，可采用多种佐剂增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质，如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基苯酚以及可用于人体的佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacteriun parvum)。
可采用各种技术方法通过连续培养细胞生产针对MIF的单克隆抗体分子。其中包括但不限于最初由Kohler和Milstein介绍的杂交瘤技术(Nature，1975，256495-497)、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，1983，今日免疫学杂志，Immunology Today，472页；Cote等人，1983，美国国家科学院刊，Proc.Natl.Aad.Sci.，802026-2030页)和EBV杂交瘤技术(Cole等人，1985，单克隆抗体和癌症治疗，MonoclonalAtibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss有限公司，77-96页)。另外，还可使用生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，1984，美国国家科学院刊，816851-6855页；Neuberger等人，1984，自然杂志，Nature，312604-608页；Takeda等人，1985，自然杂志，Nature，314452-454页)，该技术将具有适当抗原特异性的鼠抗体分子基因片段和具有适当生物学活性的人抗体分子基因片段剪接在一起。此外，还可以采用单链抗体生产技术(美国专利第4946778号)制备MIF特异的单链抗体。
杂交瘤技术已经被用于生产抗MIF单克隆抗体。见Bucala等人的美国专利第6,030,615号，此专利的全部内容已经作为参考文献在此处被引用。已经分离了能够分泌直接针对人和鼠MIF的IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于此抗体能中和MIF的生物活性。抗MIF单克隆抗体能够抑制细胞内寄生物刺激的巨噬细胞杀伤作用。抗MIF单克隆抗体还能被用于特异并且灵敏地筛选检测MIF的ELISA反应。
根据现有技术可以制备识别MIF特异表位的抗体片段。例如这些片段包括但不限于胃蛋白酶降解抗体分子得到的F(ab’)2片段和由还原F(ab’)2片段的二硫桥得到的Fab片段。并且，还可以构建Fab表达库(Huse等人，1989，科学杂志，2461275-1281)，快速并简易地鉴定针对MIF的特异性单克隆Fab片段。
根据本发明，MIF受体、MIF受体片段和/或MIF受体类似物可用作为MIF生物活性的抑制剂。这些分子和MIF蛋白结合，可抑制MIF和细胞的MIF受体的结合，进而干扰MIF行使生物学活性的机制。模拟这些分子活性的小的有机分子也包括在本发明的范畴内。MIF受体包括任何能够以氨基酸序列特异性和/或者结构特异性结合MIF的细胞表面分子。MIF受体片段也可以作为MIF的抑制剂，任何能够和MIF特异性结合、并且能够抑制MIF生物学活性的MIF受体的任何氨基端、羧基端和/或内部缺失的片段都包括在本发明范畴之内。氨基和/或羧基端缺失指的是该分子氨基端和/或羧基末端至少有一个氨基酸的缺失。内部缺失指的是分子含有1个或者多个非末端氨基酸的缺失。MIF受体片段是删除了胞质区结构域或者部分胞质区结构域的截短的受体蛋白质，删除胞质和跨膜区结构域可以产生含有全部或部分MIF受体细胞外结构域的可溶性MIF受体片段。
也可以用能够特异结合MIF的MIF受体类似物来抑制MIF活性。这样的MIF受体类似物可包括在氨基酸的氨基末端、羧基末端、或者在MIF受体的任何2个相邻氨基酸残基之间添加一或者多个额外的氨基酸的MIF受体或者受体片段。增加的氨基酸可以是功能性附着于MIF受体蛋白全部或部分而形成MIF受体融合蛋白的异源肽的一部分。例如(但不限于)MIF受体、或者其截短的部分，可以通过遗传工程手段融合所需的免疫球蛋白的Fc片段。MIF受体类似物还包括在天然保守区和非保守区置换了一个或者多个氨基酸的MIF受体或者MIF受体片段。置换保守氨基酸包括使用具有相似电荷、大小和/或者疏水性的氨基酸对一或者多个氨基酸进行替换。例如用谷氨酸(E)替换天冬氨酸(D)。置换非保守性氨基酸包括用具有不同电荷、大小和/或者疏水性的氨基酸对一或者多个氨基酸进行替换。例如用谷氨酸(E)替换缬氨酸(V)。可采用重组DNA技术制备MIF受体、MIF受体片段和/或者类似物。
可以用能够结合MIF进而抑制MIF生物活性的分子治疗需要CTL反应的疾病。这些分子包括但不限于抗MIF受体的抗体和MIF类似物。抗MIF受体的抗体能被生产并用来中和MIF受体功能。可以制备针对整个或者任何部分的MIF受体的抗体，例如根据美国专利No.6080407所记载的技术方法，见上文。
MIF类似物可以包括结合MIF受体但没有生物活性的分子。这些类似物能够和MIF竞争同MIF受体的结合，所以，当在体内使用时，能阻断MIF在细胞因子介导细胞毒过程中发挥作用。可以根据本领域内公知的多种技术设计MIF类似物。重组DNA技术可以用来生产修饰的MIF蛋白，其包括例如插入、删除和/或者替换MIF蛋白中的氨基酸，所产生的MIF类似物具有MIF受体结合能力，却不具有生物活性。另外，可以采用化学方法合成MIF类似物(见，例如Sambrook等人，分子克隆，实验室操作手册，冷泉港出版社，N.Y.(1989))。MIF受体和/或表达MIF受体的细胞系可被用来鉴定和/或者分析潜在的MIF类似物。
如美国专利No.6080407见上文所述，某些类固醇，通常被认为没有活性或是抗甾体的(anti-steroidal)，实际上能够抑制MIF的释放；例如20α氢化可的松。在本发明中可以将这些固醇或者任何其他能够抑制MIF释放的化合物与其他抗MIF药物结合使用。
可以采用本领域内公知的技术对MIF生物活性抑制剂，如抗MIF抗体、MIF受体、MIF受体片段、MIF受体类似物、抗MIF受体的抗体、MIF类似物和MIF释放抑制剂进行给药。优选系统性制剂并给药。制剂和给药的技术可参考Remington药学(Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，1990年，Mack出版公司，Easton，pa.)。适合的给药途径包括口服给药、直肠给药、粘膜给药或者肠给药；肠胃外给药途径包括肌内、皮下、骨髓注射，鞘内、脑室、静脉内、腹膜内、鼻内、眼球内注射等，这里只能列举少数几种。最优选静脉给药。为了实现注射给药，本发明的药物可以配制成水性溶液，优选溶解在生理相容的缓冲液中，例如Hanks′溶液、Ringer′s溶液或者生理盐水。为了实现粘膜给药，在剂型中使用合适渗透屏障的穿透剂。这些穿透剂为技术领域内公知。
可以采用该领域内公知的方法来确定MIF抑制剂化合物的有效浓度和给药次数，需要确定的参数包括生物半衰期、生物有效利用度和毒性。当采用抗MIF抗体时，优选的剂量浓度是从大约0.1mg/每公斤体重到约20mg/每公斤体重，最优选10mg/每公斤体重。对于抗体或者其他循环半衰期长的抑制剂化合物，单次给药就可以维持所需的循环浓度。当使用半衰期短的化合物时，要求多次给药以维持所需的循环浓度。
可以对患者进行MIF抑制剂单独给药或者同其他治疗药物联合给药，其它治疗药物包括顺序或者同时给药的肿瘤或者病毒的抑制剂或者拮抗剂，CTL反应对该肿瘤或病毒治疗是有益的。
本发明中使用抗MIF药物的方法中使用的抗MIF药物还包括寡核糖核苷酸序列，包括能够抑制MIF和/或MIF受体mRNA翻译的反义RNA和DNA分子以及核酶。反义RNA和DAN分子的作用是通过结合靶mRNA来直接抑制蛋白翻译，或者通过抑制核糖体的结合和/或移位，或者通过使mRNA分子本身被核酸酶降解来达到直接抑制蛋白翻译的目的。核酶是一种具有酶活性的RNA分子，该分子能够特异切断RNA。核酶的作用机制涉及与互补的靶RNA序列特异性杂交，然后发挥核酸内切酶活性。在本发明内，基因工程改造的核酶分子的锤头形基元能够特异并且有效的催化内切MIF和/或MIF受体mRNA序列。可以根据该技术领域公知的核酸分子合成技术制备本发明涉及的反义RNA、DNA分子和核酶。其中包括该领域公知的化学合成寡核苷酸技术，例如固相亚磷酰胺(phosphoramidite)化学合成。另外，在体内或者体外转录编码反义RNA分子的DNA也可以得到RNA分子。这样的DNA序列可以整合到多种载体中，该载体整合有适当的RNA聚合酶启动子，例如T7或者SP6聚合酶启动子。另外，组成型或诱导型(由启动子决定)合成反义RNA的反义cDNA构建体可以稳定地导入到细胞系中。
可以对DNA分子进行多种修饰来增加其细胞内的稳定性和半衰期。可以使用的修饰方法包括(但不仅限于)在分子的5’和/或3’端添加核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸翼侧序列、或者在寡脱氧核糖核酸骨架上使用phosphorothioate或者2’-O甲基替代磷酸二酯酶连接。
为了进行抗MIF治疗，寡核苷酸抑制剂可以同细胞一起制剂并且在体外应用，和/或采用不同的方式给药，包括系统性、局部定位性(localize)、或者局部性(topical)给药。制剂制备和给药的技术可以参考Remington′s药学(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack出版公司，Easton，pa.)的最新版。可以采用对体内所需靶器官产生最大输送效率的给药方式。
实施例材料和方法实验动物和细胞系C57BL/6(H-2b)小鼠(雌性，8-12周)购自The JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME)。所有动物实验流程均遵照NSUH实验动物护养和使用委员会的指导按照经验证的流程进行。EG.7细胞(用编码OVA(11)的cDNA转染EL4细胞后得到)和EL4细胞(两种都是II型MHC阴性，H-2b鼠胸腺瘤)，以及YAC-1细胞购自ATCC(Rockville，NM)。
细胞因子和抗体按照上述方法制备得到重组鼠MIF(rMIF)(12；13)(＜1pg内毒素/μg蛋白质)。按照上述方法制备得到中和性抗MIF mAb(XIV克隆.15.5，IgG1，同种型)(9，14)。在相似条件下用杂交瘤5D4-11纯化同种型对照抗体(IgG1)，5D4-11能够分泌特异于3型登革热病毒(ATCC)的抗体。FITC-大鼠抗小鼠CD3Ab、PE-大鼠抗小鼠CD4、PerCp-大鼠抗小鼠CD8Ab、PE-大鼠抗小鼠CD25Ab、PE-大鼠抗小鼠CD28Ab、FITC-大鼠抗小鼠CD44、PE-大鼠抗小鼠CD25(IL-2Rα)、PE-大鼠抗小鼠CD28Ab、FITC大鼠抗小鼠CD44Ab、PE-大鼠抗小鼠CD25(IL-2Rα)、PE-大鼠抗CD122(IL-2Rβ)、PE-大鼠抗小鼠CD132(共享γ链)和PE-大鼠抗小鼠H-2Kb均购自PharMingen公司(圣地亚哥，加拿大)。
产生抗原特异性的CTL上面已经介绍了产生OVA特异性的CTL的方法(11)。简而言之，在1-2周前i.p.注射5×106的EG.7细胞来引发小鼠，然后从中得到脾细胞。分离得到的脾细胞(3×106)和辐射的EG.7细胞(20,000rad；106个细胞)共同孵育5天(在有或无细胞因子或者抗体情况下，如下)。从这些培养物中收集用于体外CTL分析(见下)的效应细胞，并且在H-2Kb中能够识别OVA257-264(SIINFKEL)肽(15)。为了研究MIF的体外中和效果，从肿瘤移植之日起，每天给EG.7引发的小鼠注射抗MIF抗体或者对照IgG(0.5mg，i.p.)，连续一周。按照如下所述方法从抗MIF抗体或对照IgG处理过的小鼠中分离脾细胞，并用来测定体外CTL活性。
细胞介导的细胞毒分析在96孔圆底平板中系列稀释效应脾细胞(按照上述方法制备)，然后添加EG.7靶细胞(5×105/孔)，E∶T比为1∶1到30∶1，同时添加不同浓度的抗MIF mAb、对照IgG、或者纯化的rMIF。37孵育4小时，用CytoTox96°分析(Promega Madison，WI)测定培养物上清(n＝3)中胞质酶、乳酸脱氢酶(LDH)，对细胞毒性进行定量。各个E∶T比例下的“特异性裂解”表达为特异性裂解＝[(实验释放)-(自发释放)/(靶最大值-靶自发释放)。当没有CTL存在时，自发LDH释放值小于去污剂裂解细胞时释放最大值的10％。所有实验操作和分析均重复2次到更多次，结果相似。
NK分析如前所述，用NK敏感YAC-1细胞作为靶细胞进行NK分析(16)。
流式细胞计数分析从实验小鼠中制备去红细胞的脾细胞单细胞悬液，用流式细胞计数仪对其进行分析。所有荧光标记抗体均购自PharMingen公司，并且按照推荐的操作流程进行操作。用含有3％BSA和0.1％odium叠氮化合物(FACS缓冲液)的PBS重悬细胞(106/份)，和荧光标记抗体孵育30分钟(4)，然后用FACS缓冲液洗涤2次，。用FACSCalibur流式细胞仪(Becton，Dickinson，Mountainview，加拿大)获取荧光数据，并且用CELLQuest软件(Becton Dickinson)进行分析。该实验重复过一次并且得到了相似的结果。
细胞因子产物的分析用夹心ELISA对细胞上清进行分析来检测细胞因子产物。该ELISA所用的鼠IFNγ、TNFα、IL-2和IL-12试剂盒均购自R&DSystem公司(Minneapolis，MN)。按照前文中介绍的方法进行针对鼠MIF的ELISA检测(14)。虽然在培养物中存在中和性抗MIF mAb和有生物学活性的MIF复合会导致MIF失活，但是MIF活性仍然能被后续的ELISA检测出来。
体内肿瘤生长按照前述方法(9)在C57BL/6小鼠中检测抗MIF抗体对EG.7肿瘤生长的作用。洗涤培养的EG.7细胞，重悬到PBS中，将5×106个细胞(重悬在0.1ml PBS中)s.c.注射到小鼠(每组n＝5)的上胁腹中。1小时后小鼠接受一次0.3ml的PBS或者IgG1同型对照抗体(0.5mg)或者纯化的抗MIF mAb(0.5mg)的i.p.注射，然后每24小时注射一次，连续注射7天。在第7天用游标卡尺正交线性测量肿瘤的大小，按照公式重量(mg)＝[(宽度，mm)2×(长度，mm)]/2(17)计算重量。重复2次实验得到相似结果。
组织学研究在第7天切除对照IgG和抗MIF处理的小鼠的肿瘤。用PE-CD4(L3T4)和FITC-CD8(Ly-2)mAb(PharMingen)对冷冻肿瘤切片染色。用荧光显微镜对CD8+和CD4+T细胞进行计数，每片肿瘤切片染色细胞平均数和对照IgG处理小鼠组织切片染色细胞平均数相比并计算增加的百分数。每片切片用10x物镜计数10个视野(每组n＝5只小鼠)。用荧光偶联同型对照抗体共同孵育对照切片没有出现免疫反应。
原位凋亡检测根据商家推荐的操作流程(R&DSystems公司)用末端脱氧核糖核酸迁移酶(TdT)介导的dUTP生物素缺口末端标记(TUNEL)方法来检测凋亡细胞。为了进行统计分析，用光学显微镜(100x)对凋亡细胞计数，计算每片肿瘤切片中凋亡细胞的均数(±S.D.)。对每张切片随机挑选5个视野(每只小鼠一张切片，每组5只小鼠)进行分析，用Student’s t检验来检测是否具有显著性(p＜0.05)。
体内淋巴细胞迁移分析按照前述的Zou等人(18)所述的方法对无肿瘤小鼠和具有大小相似的EG.7肿瘤的小鼠(注射肿瘤细胞7天后)每天注射抗MIF抗体(0.5mg/小鼠，i.p.)或者对照IgG，这些鼠作为此分析的细胞来源。得到并且用PKH-26标记未分级的脾细胞或者纯化的脾CD8+T细胞(1×106个细胞/ml)，所用的PKH-26是一种膜嵌入型红色荧光染料(Sigma公司，St.Louis，Mo)。按照前述方法(19)对体内淋巴细胞迁移进行分析(n＝每组5只小鼠)。简而言之，将标记的细胞注射(i.v.)到有肿瘤的受体小鼠中。24小时后切除肿瘤块，并且制备低温冷冻切片。用FITC抗CD4或者FITC抗CD8对切片进行染色，据此确定T细胞的类型。用显微镜对PKH-26荧光供体细胞进行定量，计算肿瘤组织切片每个视野中标记的供体细胞的均数。用10x物镜检测每个切片(每只小鼠一张切片)的10个视野。重复上述实验2次得到了相似的结果。
过继性免疫疗法用5×106EG.7细胞(s.c.)注射C57BL/6小鼠之后，用抗MIF mAb或者对照IgG(0.5mg/天，i.p.)处理，连续处理7天(n＝每组5只)。在最后一次注射的第二天，分离脾细胞，并用CD8+富集柱(R&DSystems公司)纯化CD8+脾T细胞。然后，将未分级的脾细胞或者CD8+T细胞(5×106个细胞/每只小鼠)迁移(i.v.)到受体鼠中，该受体鼠在1天前已经被注射了5×106个EG.7细胞。按照前述方法在第1-13天检测肿瘤的重量。重复上述实验1次，得到相似结果。
结果在体外抗MIF抗体增强CTL活性以前的研究表明MIF蛋白质和mRNA的表达是巨噬细胞和T淋巴细胞激活反应的一部分(5，8，20)。为了评价MIF在宿主对肿瘤侵袭的反应中的作用，发明人员首先检测了rMIF或者中和性抗MIFmAb是否能够在体外影响抗原特异性的细胞毒性T细胞反应。从由移植EG.7细胞引发的小鼠中分离得到脾细胞，在rMIF、中和性抗MIFmAb、或者对照IgG同型抗体存在或不存在的条件下，用辐射EG.7细胞刺激上述脾细胞培养物，连续刺激5天。如图1B所示，当添加抗MIF mAb的量为50μg/ml时，能够显著增强体外CTL反应，添加外源性rMIF(图1A)或者对照IgG(图IC)对CTL活性没有影响。对照实验表明单独用抗MIF mAb处理脾细胞或者EG.7细胞不能影响它们的生存和生长特性，在体外用抗MIFmAb预处理后，不会单独引起非条件(unconditioned)脾细胞培养物产生细胞毒性。
在用EG.7靶细胞分析脾细胞培养物的最后4小时，添加抗MIFmAb或者rMIF，来分析MIF在CTL反应效应期中的可能作用。在这个分析周期中发现这些试剂对体外细胞毒活性没有影响。与之相反，研究发现在为期5天的共培养期间，在第1、2天加入抗MIF mAb能表现出增强体外CTL反应的最大活性(图1D)。
这些数据表明在细胞毒T细胞活化早期MIF免疫中和可以诱导后续的CTL活性。并不意外地发现，在体外，与没有用辐射的EG.7细胞共培养的肿瘤小鼠的脾细胞相比，用辐射的EG.7细胞刺激脾细胞效应细胞能够显著提高培养物上清中MIF的量(图2A)。然而，添加生物活性rMIF到平行的脾细胞培养物中，没有显著影响CTL的活性，认为这些培养物产生的内源性MIF已经刺激细胞反应达到最大值(＞30ng/ml)(图1A)。
一些细胞因子对T细胞细胞毒性的表达有重要作用，本实验还研究了在体外MIF免疫中和对这些细胞因子的表达的影响。用特异性ELISA检测培养物上清中的IFNγ、TNFα、IL-2、IL-12的水平。与对照mAb处理的培养物相比，当抗MIF mAb发挥增强CTL的最大活性时，这些细胞因子中只有IFNγ在两天的共培养阶段表现出明显的浓度增加现象(图2B)。与此相反，与对照IgG处理的培养物相比，EG.7肿瘤小鼠的脾细胞在抗MIF mAb存在的情况下和辐射的EG.7细胞共同孵育后没有显著增加IL-2、IL-12或者TNFα蛋白质的表达。单独培养的EG.7细胞不能产生可检测水平的MIF、IFNγ、TNFα、IL-2或者IL-12。用流式细胞仪分析后发现，无论是rMIF还是抗MIF处理都没有影响共培养物中表面有CD3+、CD4+、CD8+、CD28+、CD44high标记物的细胞的百分比。
体内抗MIF mAb处理增强CTL活性。在体内EG.7肿瘤引发期，与IgG1处理的对照组相比较，研究了从抗MIF mAb处理的小鼠中收集得到的脾细胞的CTL反应。这些实验表明，用EG.7细胞引发后(在第0天)，每天进行抗MIF mAb处理，连续处理1周能以E∶T比为30和10显著增强CTL活性(图3A)。和单独加入PBS或不添加任何试剂的对照组相比，在该实验体系中单独加入对照IgG不能增强CTL活性。
最近的研究已经证明抗MIF mAb对带有38C13B细胞淋巴瘤(9)和G361黑色素瘤(10)的小鼠有显著的抗肿瘤活性。根据这些数据和我们发现的抗MIF抗体能够使CTL活性增强2倍的数据(如上)，我们还发现，与对照IgG或者PBS处理小鼠相比，对带有EG.7淋巴瘤的小鼠进行抗MIF抗体处理一周能使肿瘤体积减小2倍(图3B)。另外，我们发现经抗MIF mAb处理后，肿瘤中渗透的CD8+和CD4+细胞数目增加了近3倍(图4)。
细胞毒性T淋巴细胞通过诱导凋亡(21)杀伤肿瘤靶细胞。实验发现，和抗MIF处理增加宿主CTL活性相一致，和对照IgG处理小鼠(图5B)相比，抗MIF抗体处理能使肿瘤块中凋亡细胞的数目显著增加(4-5倍)(图5A)。用抗MIF抗体和用对照IgG处理的小鼠的肿瘤切片的高能量视野的平均凋亡细胞数进行定量分析比较凋亡差异，前者为194±63个细胞/100x视野，后者为43±22个细胞/100x视野，该结果具有统计学显著性(p＜0.01)。
以前曾经报道过rMIF能够在体外抑制NK细胞活性(22)。因此，抗MIF mAb在体内抑制肿瘤生长的效果可能是因为增强了NK细胞活性的缘故。虽然与对照(无肿瘤小鼠)相比，EG.7肿瘤小鼠制备的全脾细胞的NK活性得到增强，但是用抗MIF抗体处理小鼠后NK活性没有发生变化。
以前的研究表明，在体内抗原驱动的CD4+T细胞激活期间的MIF表达在免疫反应中具有重要作用(8)。因此，需要确定抗MIF mAb处理引起的细胞裂解活性增强是否与增强的抗原诱导CD8+T细胞增殖相关。根据Bacher等人(8)的报道，体内抗MIF mAb处理不会引起T细胞增殖增强。
实验还检测了抗MIF抗体对IL-2受体表达的作用。IL-2受体是多亚基的，由可调节IL-2亲和性的可变表达链(CD25)、及2个信号亚基β(CD122)和γc(CD132)链组成(见23综述)。其中γc亚基(又称为普通γ链)是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15受体共有的亚基。募集γc在细胞内信号传导中是必须的(24，25)，而且γc的表达在体内对于成熟CD8+T细胞的生存具有重要作用(26)。因此，实验检测了抗MIF抗体处理对γc表达的影响。抗MIF mAb处理有肿瘤的小鼠能够显著提高γc链的表达，不过，与用对照IgG处理的肿瘤动物相比，抗MIF mAb处理对CD8+T细胞的IL-2受体的α或β亚基的表达没有影响(图6)。
抗MIF抗体促进T淋巴细胞向肿瘤组织迁移并且增强了CD8+T细胞特异性的抗肿瘤活性。为了进一步证明抗MIF mAb在体内的抗肿瘤效果归因于T细胞的特异性效果，实验研究了抗MIF抗体处理对T淋巴细胞进入肿瘤的影响。对照或者EG.7肿瘤小鼠用抗MIF抗体或者对照IgG处理7天，收集未分级的脾细胞或者纯化的CD8+T细胞，并用PKH-26标记。标记的未分级的脾细胞或者纯化的CD8+T细胞迁移到EG.7肿瘤受体鼠中。24小时后切取肿瘤组织并进行冷冻切片处理，用荧光显微镜对进入到受体鼠肿瘤中的PKH-26标记供体细胞进行定量(分别为图7A和7B)。实验表明，从抗MIF mAb处理的小鼠得到的脾细胞或者纯化的CD8+T细胞进入荷瘤小鼠肿瘤组织中的数量大于(增加了≥2倍)对照mAb处理的肿瘤小鼠。
最后，检测了继承性迁移的CD8+细胞(来自于抗MIF mAb处理的动物)在体内对肿瘤生长的影响。从抗MIF mAb或者对照IgG处理的EG.7肿瘤供体小鼠中分离得到的5百万个未分级脾细胞或者纯化的CD8+脾T细胞(图7C)，将这些细胞迁移到24小时前用EG.7肿瘤细胞s.c.注射过的小鼠中。连续2周检测肿瘤在体内的生长状况。如图7C所示，从用抗MIF抗体处理的有肿瘤小鼠中得到CD8+T细胞并继承性迁移到未经处理的有肿瘤小鼠中后，受体小鼠体内的肿瘤生长受到显著抑制。与此相反，和用对照IgG处理的肿瘤小鼠相比，用抗MIF处理的肿瘤小鼠中得到未分级脾细胞(5×106个细胞，含有CD4+和CD8+T细胞和B细胞)迁移后肿瘤重量没有显著差异。这些数据表明在继承性迁移实验中，需要从抗MIF抗体处理的肿瘤动物中得到的一定数量的CD8+T细胞对有效介导肿瘤生长抑制作用具有重要性。
至此，已经对本发明的内容和细节进行了完全描述(附参考文献)，只要未偏离本发明的精神和范围任何改变和修正都包括在本发明范围内。
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权利要求
1.制备细胞的方法，该细胞可作为癌症疗法对癌症患者给药，该方法包括在MIF拮抗剂存在下培养细胞。
2.权利要求1的方法，其中该MIF拮抗剂选自抗MIF抗体、MIF反义cDNA、和MIF配体受体结合的拮抗剂。
3.制备细胞的方法，该细胞可作为癌症疗法对癌症患者给药，该方法包括在MIF抗体存在的情况下培养细胞。
4.权利要求3的方法，其中抗MIF抗体为单克隆抗体。
5.权利要求4的方法，中抗MIF单克隆抗体选自人单克隆抗体、人源化的单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和单链单克隆抗体。
6.制备细胞组合物的方法，其包括在(a)至少一种肿瘤抗原和(b)抗MIF抗体存在的条件下孵育该组合物中的细胞，该细胞组合物可作为癌症疗法给癌症患者给药。
7.制备自体同源性细胞的方法，其包括在一种试剂存在的情况下孵育该细胞的步骤，所述试剂包括抗MIF抗体、其MIF结合片段或者这两种试剂的混合物，该自体同源性细胞可作为癌症疗法对癌症患者给药。
8.制备自体同源性细胞的方法，其包括在(a)至少一种肿瘤抗原和(b)试剂存在的情况下孵育该细胞的步骤，所述试剂包括抗MIF抗体、其MIF结合片段或者这两种试剂的混合物，该自体同源性细胞可作为癌症疗法对癌症患者给药。
9.权利要求7的方法，其中自体同源细胞包括免疫细胞。
10.权利要求7的方法，其中自体同源细胞包括T细胞。
11.权利要求7的方法，其中自体同源细胞包括CD8+细胞。
12.可作为癌症疗法对癌症患者给药的细胞组合物，其包括用抗MIF抗体孵育的细胞。
13.权利要求12的细胞组合物，其中用抗MIF抗体孵育的细胞也用至少一种肿瘤抗原孵育。
14.权利要求12的细胞组合物，其中用抗MIF抗体孵育是离体进行的。
15.权利要求12的细胞组合物，其与未结合的抗MIF抗体相分离。
16.权利要求13的细胞组合物，其与未结合的抗MIF抗体及未结合的肿瘤抗原相分离。
17.权利要求13的细胞组合物，其中该细胞含有免疫细胞。
18.权利要求13的细胞组合物，其中该细胞含有T细胞。
19.权利要求13的细胞组合物。其中该细胞含有CD8+细胞。
全文摘要
本发明公开了巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)调节CTL活性的表达。在EL4肿瘤鼠模型中，来自于原发肿瘤鼠的培养的脾细胞在体外经抗原刺激后能够高水平分泌MIF。与单克隆抗体处理的对照细胞组相比，用抗MIF单克隆抗体中和处理后，平行脾细胞对肿瘤细胞的CTL反应显著增强，同时IFNγ表达水平上调。肿瘤组织学研究表明，用抗MIF抗体处理动物后，其CD文档编号A61K48/00GK1842346SQ02805080
公开日2006年10月4日 申请日期2002年1月14日 优先权日2001年1月12日
发明者R·阿部, R·布卡拉, C·梅茨 申请人:塞托凯恩药物科学公司