复合骨髓移植材料、方法和试剂盒的制作方法

专利名称：复合骨髓移植材料、方法和试剂盒的制作方法
背景技术：
骨移植被广泛用于治疗骨折、骨不连合和诱导关节固定。自体松质骨——从被移植者的一个部位取出并植入被移植者的另一个部位——是目前最有效的骨移植物。自体松质骨提供了支持骨愈合反应和生成新的软骨或骨的祖代细胞的分布的平台。不过，收获自体骨会导致成本和发病率上升，包括瘢痕、血液损失、疼痛、手术与复原时间延长和感染的风险。此外，移植部位的体积可能超过可利用的自体移植物的体积。
因此，已经开发了自体移植物的替代选择。已经研究或开发了若干提纯或合成的材料，包括陶瓷、生物聚合物、经过加工的同种移植骨和胶原类基质，以充当自体移植物的代用品。FDA已经批准了一种多孔的源于珊瑚的合成羟磷灰石陶瓷，用于包含在有缺陷的骨内。还批准了一种提纯的胶原/陶瓷复合材料，用于急性长骨骨折。尽管这些材料避免了牵涉收获自体移植物的发病，并且消除了与可利用的自体移植物数量有限有关的问题，合成材料的临床有效性仍然普遍不及自体移植物。合成移植材料还已被用作骨髓细胞的载体。在将上述复合材料植入有缺陷的骨骼时，祖代细胞分化为骨骼组织。
在有些情形中，复合植入物是这样制成的，将合成移植材料与相似或较少体积的、从骨髓抽吸物获得的细胞悬液混合。不过，具有分化为软骨、骨、肌肉、纤维组织和其他结缔组织的能力的祖代细胞在骨髓中的含量非常少。存在于1ml骨髓中的祖代细胞数因患者而异，从约100个细胞至20,000个细胞。这代表了有核细胞在骨髓抽吸物中的平均比例为约1∶20,000至1∶40,000。因而，将给定体积的合成移植材料与相当体积的新鲜骨髓混合所制成的复合植入物含有相对少的祖代细胞。
因此，以前已经开发了一种技术，以增加祖代细胞在复合植入物中的相对浓度。这种技术牵涉平板接种骨髓细胞悬液到组织培养皿上，在选定的培养基中培养细胞一天或多天，以实现祖代细胞群的提高，然后从组织培养皿分离出细胞，得到增加了祖代细胞群的细胞悬液。然后将合成陶瓷载体浸渍在这种富集了祖代细胞的悬液中，制成复合植入物。不幸的是，这种制备复合植入物的方法是非常费时的。而且，如果原始的祖代培养细胞是源于从被移植者获得的骨髓抽吸物的，那么被移植者必须经历多个侵入性程序；一个程序取出他或她的骨髓，后一个程序植入复合移植物。所以，被移植者可能面临一次以上的麻醉。
还开发了另一种技术，以生产复合骨移植物基质，它具备培养方法的益处，但是没有那么费时，并且不需要多个侵入性程序。在这种技术中，富集了祖代细胞群的复合基质是这样生产的，使特定体积的基质材料与过量体积的骨髓抽吸物接触(参见美国专利US5,824,084和6,049,026)。在这种技术中，使含有祖代细胞的骨髓抽吸物穿过多孔的基质材料，后者具有选择性与祖代细胞结合的表面，从而将祖代细胞保留在基质内，允许过量的其他细胞(例如血细胞和其他有核的源于骨髓的细胞)穿过。再将富集了祖代细胞的移植物基质植入患者内。
不过，因为祖代细胞如此强烈地和选择性地与一些基质表面(例如同种移植骨基质)结合，它们不均匀地分布在基质内，密集的祖代细胞离散地集中在骨髓抽吸物与基质材料之间的最初接触附近。所以，由这种技术制备的骨移植物受到这样的限制，由于祖代细胞在所植入的基质内的不均匀分布，植入之后的骨愈合也不会均匀地发生。另外，基质植入之后的骨愈合发生得相对缓慢。
因此需要一种制备富集了祖代细胞群的复合骨髓移植材料的新方法，该方法能够在手术内进行，也就是在骨髓从被移植者取出的同时，导致祖代细胞在移植材料内的均匀分布，有利于植入后的加速愈合。
发明概述所提供的复合骨髓移植材料包含多孔的生物相容性可植入基质和凝集材料。复合骨髓移植材料具有富集了的祖代细胞群。还提供了制备复合骨髓移植材料的方法。该方法包括这样的步骤，提供骨髓抽吸物，提供多孔的生物相容性可植入基质，使骨髓抽吸物与基质接触，得到所富集的基质，再机械性地混合所富集的基质，得到复合骨髓移植材料，其中祖代细胞基本上均匀地分布在复合骨髓移植材料内。
还提供了复合骨髓移植材料的制备试剂盒。该试剂盒包括基质容器、第一端帽(endcap)和第一载入注射器。调整第一载入注射器，以匹配第一端帽，在第一载入注射器与基质容器之间提供流体互通。第一端帽可拆装于基质容器上。
附图的简要说明

图1是装有端帽并且含有移植物基质的基质容器的透视图。
图2是装有载入注射器的图1基质容器的透视图。
图2A是骨髓抽吸物的分解图，显示祖代细胞和源于骨髓的有核细胞。
图3是含有移植物基质的基质容器的透视图，该基质具有不均匀分布的祖代细胞。
图3A是已有骨髓抽吸物流经的移植物基质中心区域的分解图。
图3B是已有骨髓抽吸物流经的移植物基质末端区域的分解图。
图4是含有凝集材料和所富集的基质材料的混合碗的透视图。
图5是包含混合碗、漏斗和施用注射器的组件的透视图。
图6是图5组件的透视图，它已被颠倒过来，以实施本发明的图7是包含混合碗、漏斗、基质容器和排放注射器的组件的透视图，用于实施本发明的第二种优选实施方式。
图8是根据本发明的试剂盒的透视图。
本发明优选实施方式的详细说明本文所用的范围，例如5-25或在5与25之间，表示优选为至少5，并且单独和独立地优选为不多于25。本文所用的术语“祖代细胞”表示任意祖代细胞，例如结缔组织祖代细胞和/或干细胞。这种细胞群包含多能性的(pleuripotent)细胞，能够分化为各种组织(例如骨、软骨、脂肪、腱、韧带、肌肉、神经组织、造血组织、内皮与血管组织和肝)。
提供根据本发明的、富集了祖代细胞群的复合骨髓移植材料的方法一般包含下列步骤1、获得骨髓抽吸物；2、使骨髓抽吸物与多孔的生物相容性可植入基质接触(例如使抽吸物流经基质)，得到富集了祖代细胞的基质，其具有所富集的祖代细胞群；3、机械性地混合所富集的基质，使祖代细胞基本上均匀地分布其中；和4、排出基质中的过量液体。优选地，该方法还包括向所富集的基质加入凝集材料的步骤。如此制备的复合骨髓移植材料可植入到患者或被移植者体内，有效诱导骨愈合和/或骨再生。
上述方法步骤包含若干功能要素，现在将加以描述。这类功能要素包括骨髓抽吸物、多孔的生物相容性可植入基质和优选的凝集材料。在这些功能要素的说明之后，是制备本发明的复合骨髓移植物的优选方法和仪器的说明。应当理解，下列说明仅供例证，而非限制。
骨髓抽吸物骨髓抽吸物含有血浆、有核祖代细胞(祖代细胞)、有核造血细胞、内皮细胞、和源于外周血的细胞，包括红细胞和血小板。因为骨髓抽吸物含有外周血，优选的是将抽吸物收集在含有抗凝剂的注射器内。适合的抗凝剂包括肝素、柠檬酸钠和EDTA。优选地，用在本发明方法中的骨髓抽吸物是从将接受移植的患者(被移植者)获得的。次优选地，骨髓抽吸物可以是从另一免疫学上可相容的供体获得的。
多孔的生物相容性可植入基质基质包含多孔的生物相容性可植入基质。优选地，基质具有生物活性表面。具有生物活性表面的、多孔的生物相容性可植入移植物基质材料的实例包括陶瓷，包含磷酸钙，例如羟磷灰石或磷酸三钙，以及去矿化的或矿化的骨基质。其他适合的基质材料包括生物聚合物，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚半乳酸、聚己内酯、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚砜、聚乙烯和聚丙烯。其他适合的基质材料有透明质酸、生物玻璃和胶原，透明质酸可以是经过提纯的，具有或者没有交联的。
更优选地，细胞粘连分子与基质底物的表面结合。术语“细胞粘连分子”包括层粘素、纤连蛋白、玻连蛋白、血管细胞粘连分子(V-CAM)、细胞内粘连分子(I-CAM)、腱生蛋白、血小板反应蛋白、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白、胶原、或任意其他有效促进祖代细胞与底物表面的选择性粘连的分子或组分。
优选地，基质具有足够的多孔性，使可用于祖代细胞粘连的总基质表面积增加至少2倍，优选3倍，优选5倍，优选7倍，优选10倍，相对于具有相同外部尺寸的非多孔固体而言。使用包含粉末、颗粒、纤维、其一定组合的基质底物或单一的高多孔性底物，能够实现这样一种总表面积的增加。优选地，基质的孔径大于20、更优选50、更优选100、更优选500、最优选1000μm，目的是有利于祖代细胞穿过孔进入基质材料的外部体积，由此利用孔内额外的表面积。
特别适合的基质材料包括离体矿化松质骨切片、矿化骨的粉末或颗粒、去矿化松质骨切片、去矿化骨的粉末或颗粒、胍-HCl提取的去矿化骨基质、烧结的密质或松质骨、珊瑚羟磷灰石(由Interpore销售、商品名为Interpore 500或Interpore 200)、颗粒状陶瓷(例如掺入骨移植物代用品由Zimmer出售的Collagraft)、颗粒状或块状陶瓷(例如掺入移植物代用品由Orthovita出售的Vitoss)和丝状海绵(例如由Orquest出售的由胶原制成的那些)。
优选的基质被制成微粒性骨材料与纤维性骨材料的组合。微粒性骨材料优选地是源于人海绵状骨，优选松质骨，例如来自人长骨远端。纤维性骨材料优选地是源于密质骨的。微粒性与纤维性骨材料都能够从骨库中获得，或者可选地从被移植者获得。在从被移植者获得时，在手术室中在手术期间处理骨材料，经由已知的骨处理装置确认所需的微粒性与纤维性特征。
最优选地，所提供的微粒性骨材料是同种移植物的松质骨微粒，它们是大块、薄片或片段的形式，平均直径为1-15、优选2-8mm。最优选地，所提供的纤维性骨材料是同种移植物的去矿化密质骨纤维，长度至少5mm，更优选至少1cm，更优选至少2cm，更优选至少3cm，更优选至少4cm，最优选至少5cm。可选地，所提供的纤维性骨材料是不同长度纤维的混合物，长度范围为5mm-2cm、5mm-3cm、5mm-4cm、5mm-5cm、5mm-15cm或一些其他范围。可选地，纤维性骨材料是作为柔韧性垫而供应的，例如可从Osteotech，Inc得到的Grafton Flex。
将微粒性与纤维性骨材料按下列方式结合构成优选的复合基质。将骨纤维，优选去矿化的密质骨纤维，长度如上所述——与微粒性骨微粒按下列优选比例结合约225、次优选200-300、次优选150-375、次优选100-450、次优选75-500、次优选25-1000mg干重的去矿化密质骨纤维与约10、次优选8-12、次优选6-14、次优选4-16、次优选2-18、次优选1-25cc(总体积)的微粒性骨微粒，后者的平均直径为1-15、优选2-8mm。可选地，去矿化的密质骨纤维可以从包含这类纤维的柔韧性垫获得。在使用这样一种垫子时，首先用等渗溶液洗去任何可能存在的有毒或高渗材料，例如甘油。然后将垫子悬浮在盐水或其他适合的等渗溶液中，以促进单个骨纤维的分离。将所分离的骨纤维与微粒性骨材料按下列比例结合，构成优选的复合基质来自最初尺寸为2.5cm×5cm×约2.5mm(最初体积约3.1cm3)的垫子的纤维与约10cc、次优选8-12cc、次优选6-14cc、次优选4-16cc(总体积)的微粒性骨微粒，后者的平均直径为1-15、优选2-8mm。
应当注意，若不同大小的移植物是必要的，可以按照本发明制备不同大小的复合基质，以符合纤维性与微粒性骨的上述比例。例如，(假定堆积密度均匀)可以将20cc微粒性骨与450mg骨纤维结合，提供优选的复合基质。
凝集材料凝集材料可以是由血液形成的血块，血液从被移植者(或免疫学上相容的供体)的静脉或动脉获得。更优选地，凝集材料是由无抗凝处理的骨髓抽吸物形成的骨髓凝块，骨髓抽吸物最优选地是从被移植者获得的。优选地，形成骨髓凝块的骨髓抽吸物是在移植手术期间从被移植者获得的。次优选地，凝集材料可以是本领域已知的血小板凝胶、血小板浓缩物、纤维蛋白凝集材料和/或纤维蛋白胶。
向富集了祖代细胞的移植物基质加入骨髓凝块(从无抗血处理的骨髓抽吸物获得)惊人地显著提高所得复合骨髓移植材料的功效，相对于没有凝集材料的复合移植物而言。已经观察到，向相似富集了的基质加入骨髓凝块比单独的骨髓凝块多呈递50-70％的有核细胞(包括祖代细胞数量的两倍以上)，所得移植物既优于单独的富集基质，也优于与骨髓凝块结合的非富集基质。因此，向富集了祖代细胞的基质加入骨髓凝块提高了移植物的性能。
在不希望局限于任何特定理论的同时，据信包含骨髓凝块可以提高复合骨移植物的功效，原因是下列的一种或几种。首先，一些对成功的骨愈合过程而言重要的细胞有可能不附着于移植物基质，因此不会充分地集中在移植部位(甚至有可能排除在外)，导致该部位愈合的效率低下或无效。由凝血级联所致纤维蛋白原聚合成纤维蛋白(进一步解释如下)可以提供有价值的补充基质，促进对移植部位愈合反应而言重要的细胞的附着和移行。这类细胞包括移行性内皮细胞，它们增殖生成管状结构，后者对经由血管生成作用生成血管而言是重要的前体。
第二种可能性是在移植部位形成凝块的生理学过程为移植在该部位的成骨细胞创造了优良的环境。具体而言，无抗凝处理的骨髓抽吸物的凝集导致其中所含有的血小板的活化，导致血小板的脱粒。血小板的脱粒继而释放生长因子和亲骨细胞因子，它们可能不存在于移植部位。在这种过程期间所释放的若干重要的生物活性因子包括血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和转化生长因子β(TGF-β)。另外，作为凝血级联的结果，从纤维蛋白原生成纤维蛋白基质可以在直接的术后期间在移植部位提供重要的稳定性。此外，存在于移植物植入之后前几天内的纤维蛋白分解活动的过程在移植物掺入的早期阶段为血管生成因子(例如本领域已知的纤维蛋白分裂产物)提供另外的来源。据信移植部位在植入之后的所得血管生成作用可以增强新血管在该部位中的生成，为新植入的祖代细胞和其他负责骨愈合与生长的细胞提供营养来源，从而加速愈合反应。
优选的实施方式和仪器现在将描述用于提供复合骨移植物的本发明方法的优选实施方式。本文所述的仪器部件优选地是由塑料制成的，优选地是透明的或半透明的。按照本发明的第一种优选实施方式，并首先参照图1，将如上所述制备的复合的生物相容性可植入基质10置于基质容器内，该容器最优选地是柱子12(基质10可以是紧密或松散包装的，这取决于材料和它的结构)。所提供的柱子12可以具有多种内部容积，适合于容纳必要体积的特定移植物的基质。本文所用的基质的容积(或基质容积)表示非多孔性固体的排除容积，该固体的外部尺寸等于特定的基质。例如，可以提供内部容积为5、10、15、20、25或30cc或一些其他内部容积的柱子，以容纳各种基质容积。优选地，柱子12的内部直径为0.5-3.0、更优选1-2、更优选1-1.5cm。优选地，柱子12的长度比它的内部直径大至少1.5、更优选至少2、最优选至少3倍。端帽14可拆装于柱子12，经由丝线连接、按钮连接或任意其他已知的连接装置。
可选地，所提供的端帽14可以带有屏或膜15(见图8)，可允许抽吸物20穿过其中，同时保留基质10的微粒。优选地，这样一种膜具有开口，直径为至少20、优选至少30、优选至少40μm。
骨髓抽吸物20(优选地含有抗凝剂)是经由已知装置、优选地从被移植者获得。然后将抽吸物20装入第一载入注射器28。最初，抽吸物20含有祖代细胞32和其他有核细胞33，比例在1∶20,000与1∶40,000之间(见图2A)。抽吸物还含有血小板、红细胞和血清(包括可溶于或悬浮在血清中的分子)。所提供的载入注射器28带有注射器连接器30，适合于与端帽连接器31匹配，在载入注射器28与柱子12的各自内部容积之间提供流体互通。所提供的第二载入注射器29类似地带有注射器连接器30，适合于与端帽连接器31匹配。如图2所示，然后将第一与第二载入注射器28与29经由上述连接器附加在与端帽14相对的柱子12末端，从而在第一载入注射器28、柱子12与第二载入注射器29的内部容积之间提供流体互通。
然后推压第一载入注射器28，投放抽吸物20至柱子12，在那里抽吸物20流经基质10或者与之接触，之后在柱子12的另一端被收集在第二载入注射器29中。使骨髓抽吸物与基质接触以提供富集基质可以这样进行，使抽吸物流经基质，在抽吸物中培育基质，或者通过本领域已知的其他手段。作为替代选择，使抽吸物20与基质10通过任意已知手段接触，以提供富集基质。祖代细胞有利地和选择性地粘附于基质10的表面，由此留在基质内，而过量的其他细胞、例如血细胞和其他源于骨髓的有核细胞相对自由地流经基质，被收集在第二载入注射器29中。为了在基质10中富集祖代细胞群，流经基质10的抽吸物20的体积优选地超过基质容积。以这种方式，存在于抽吸物体积中的祖代细胞优选地集中在基质容积中，得到富集的基质。本文所用的“富集”意味着祖代细胞与全部有核骨髓细胞之比在基质中大于在原来的骨髓抽吸物中。优选地，富集基质中祖代细胞与全部源于骨髓的有核细胞之比为至少1∶20,000，更优选为至少1∶10,000，更优选为至少1∶5,000，反映了祖代细胞的普遍性或浓度增加了至少2倍，优选至少4倍。更优选地，富集基质的祖代细胞浓度比具有骨髓凝块的非富集基质增加了至少5倍，更优选至少6倍，更优选至少8倍。优选地，抽吸物体积与基质容积之比为至少2∶1，更优选为至少3∶1，更优选为至少4∶1。例如，在使用基质容积为15cc的基质时，穿过基质的抽吸物的总体积优选为至少30cc，更优选为至少45cc，更优选为至少60cc。可选地，最初从柱子12投放至第二载入注射器29的流出物可以在继续该方法之前被弃去。
可选地，通过交替推压第一和第二载入注射器28和29，使抽吸物20在柱子12中反复流经基质10。根据细胞和祖代细胞与特定基质结合的速率，这种使抽吸物20流经基质10的程序重复至少1次，但是优选地可以重复至少2次，优选至少3次，优选至少4次。可选地，在最初的骨髓抽吸物悬液和任意流出物已经穿过基质10之后，使洗涤溶液穿过基质10。优选地，洗涤溶液包含无菌的、等渗的、缓冲的溶液，pH范围为7.3至7.5。适合的洗涤溶液包括磷酸盐缓冲盐水、Hank氏平衡盐溶液、人血清和极限必需培养基。
上述程序之后，从端帽1 4拆下载入注射器28和29。在图3中可以见到，留在基质10中的祖代细胞32均匀分布在基质10内。具体而言，在基质10内存在祖代细胞浓度梯度，由此祖代细胞32集中在柱子12两端附近的区域(见图3A)，而骨髓抽吸物20在进入柱子12后首先与基质材料接触。所以，基质10的中心区域具有低得多的祖代细胞群(见图3B)。这种效应是由于祖代细胞和其他细胞在进入柱子12后迅速粘附于基质表面。因而，机械混合步骤可有效地形成祖代细胞分布更均匀的富集基质。
参照图4，从柱子12除去端帽，在柱子12上安装注射器转接器13，构成施用注射器50。注射器转接器13包含一个活塞，它适合于推压柱子12，并逐出其中的基质材料。从而从柱子12中逐出富集了祖代细胞的基质材料11，与一定体积的凝集材料18一起投放至混合碗40内。凝集材料18优选地是无抗凝处理的骨髓抽吸物，如上所述从已被允许凝血的被移植者获得。可选地，可以在凝血之前将无抗凝处理的骨髓抽吸物与富集基质结合，以便在混合过程期间和之后形成凝块。凝集材料体积与富集了祖代细胞的基质材料体积之比优选为约1∶1，次优选为大约或至少1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1或5∶1。一旦在混合碗40中结合，将富集基质材料11与凝集材料18机械混合在一起，得到异质的可植入复合骨移植物混合物8(见图5)，组成基本上是均匀的。组成基本上均匀意味着复合骨移植物混合物8包含复合基质的纤维性与微粒性骨材料、富集了的祖代细胞群、和凝集材料，它们都基本上均匀地分布在整个混合物内，从而基本上不表现关于任意单一组分的体相浓度梯度。这类机械混合例如可以利用刀具38在混合碗40中进行，或者经由任意其他的已知机械混合装置进行。
参照图5，将漏斗41安装于混合碗40(仍然含有复合骨髓移植材料8)，将施用注射器50安装于漏斗41，如图所示。随后将如图5所示完整的仪器倒置，如图6所示，除去混合碗40的底盖42。可选地，可以将碗内容物倒入或挖入附加于施用注射器50的漏斗41内。然后将可植入复合骨髓移植材料8装填在施用注射器50中，这可以借助刀具38。可选地，刀具38在一个末端装有适合于将材料装填在施用注射器中的活塞，如图所示。一旦装填后，从漏斗41除去施用注射器50，可以用于将可植入复合骨髓移植材料8施用于患者。移植材料8有效地诱导移植部位的骨愈合或骨再生。可选地，复合骨髓移植材料可以通过本领域已知的其他机械装置从混合碗直接转移到患者。
根据本发明的复合骨髓移植材料还可以按照下列第二种优选实施方式加以制备。如上所述分别获得和制备复合基质10和骨髓抽吸物20(优选地含有抗凝剂)，分别放置在混合碗40中，比例类似于上述第一种优选实施方式。然后利用刀具38或一些其他已知的机械混合装置将基质和抽吸物机械混合在一起，得到富集基质。然后如下从富集基质11排出液体抽吸物20。参照图7，连接漏斗41与混合碗40，再连接柱子12与漏斗41，如图所示，单一的端帽14连接在柱子12的对侧末端。端帽14也装有带开口的膜或屏(没有显示)，开口适合于允许抽吸物穿过而留下富集基质11。开口的直径优选为至少20、更优选30、更优选40μm。经由已知的连接装置连接流出注射器45与端帽14，从而在流出注射器45与柱子12各自的内部容积之间实现流体互通。将所述完整的仪器倒置，如图7所示，如果必要的话除去底盖42。抽出或排出混合碗40内的液体，经过柱子12进入流出注射器45。液体可以被推回到柱子12中。这种反复程序可以重复若干次，如上所述。然后弃去所排放的液体。
作为替代选择，通过压缩容器壁(例如混合碗40的基底)与带开口的多孔性屏或膜(没有显示)之间的富集基质，可以从富集基质中排出液体抽吸物20，开口适合于允许抽吸物穿过其中，但是留下受容器壁压缩的富集基质。然后倾泻已经透过膜的液体抽吸物，在容器中留下被压缩在容器壁与多孔性膜之间的富集基质。优选地，容器是在其出口上游装有多孔性膜的注射器，容器壁是注射器活塞。在这种优选的实施方式中，富集基质的压缩是这样实现的，在注射器内将基质推向多孔性膜，由此通过出口逐出抽吸物，而将富集基质留在注射器内。
然后将富集基质11与一定体积的凝集材料18混合，如图4所示，并类似于上述第一种优选实施方式进行该方法，得到可植入的复合骨髓移植材料8，它有效地诱导被移植者的骨愈合或骨再生。
可选地，上述每种优选实施方式还可以有另外一个步骤。在可植入骨移植材料8的植入之前，可以在凝集前向移植材料8投放一定量的无抗凝处理的骨髓抽吸物(例如经由排放)，例如移植材料8位于施用注射器50中。以这种方式，液体抽吸物将渗透移植材料8的空隙体积，最终在其中凝固。抽吸物必须在抽吸之后立即投放至移植材料8，以确保它长时间保留液体足以有效渗透材料。该步骤向可植入移植材料8提供另外的源于骨髓的有核细胞(包括另外的祖代细胞)。
制备复合骨髓移植材料的本发明方法通常仅需不到60分钟即可完成。因而，可以在骨髓供体/被移植者尚处于手术室时即可进行本发明的方法。因此，利用本发明方法能够减少被移植者为接受复合骨移植物而必须经历侵入性程序的场合的次数。
还提供了根据本发明的试剂盒，以帮助外科医生实施本发明的方法。参照图8，这样一种试剂盒将优选地能够按照上述优选实施方式之一实施该方法，并且优选地包含至少下列经过灭菌的器具，优选地由塑料制成，优选地是透明的或半透明的基质容器(例如基质柱子12)；至少一个端帽14，经由已知的连接装置可拆装于基质容器；端帽14上的端帽连接器31，用于与载入注射器实现流体连通；至少一个载入注射器28，具有注射器连接器30，用于与端帽14实现流体连通；混合碗40，带有可除去的底盖42；漏斗41，一端与混合碗40的开口端匹配，另一端与柱子12匹配；注射器转接器13，用于从柱子12转换至施用注射器；和刀具38。最优选地，试剂盒进一步包含第二载入注射器29和第二端帽14，构造类似于上述。可选地，所提供的试剂盒带有多孔的生物相容的植入底物，用作骨移植物基质，和多孔性膜15，以保留基质在基质容器内。可选地，本发明试剂盒可以另外包含肝素化骨髓抽吸注射器、抽吸针头、另外的载入注射器或其他可用于骨移植领域的器具。
下列实施例进一步阐述本发明的各个方面。
实施例1有人已经指出，具有富集基质的骨移植材料表现比非富集移植物改进了的性能(见美国专利No.5,824,084和6,049,026)。下列实验证明了联合有富集基质与抽吸骨髓凝块(ABMC)的移植材料的其他功效。
对22只beagle犬实施脊髓后索融合术。在每只动物中，在三个独立的脊柱融合部位实施局灶性融合(L1-2，L3-4和L5-6)。使用松质骨薄片作为基质材料，制备三种类型的复合骨移植物。在11只犬中，使用去矿化的松质骨薄片，而在其余11只犬中，使用矿化的松质骨薄片。三种复合移植物是单独的富集基质、包括骨髓凝块的非富集基质和包括骨髓凝块的富集基质。将基质材料与过量体积的抽吸物结合，如上所述实现富集。
使用接合得分作为初步结果参数，比较融合效果。利用CT扫描的定量分析，还评估了每个部位的骨体积，在每个部位进行力学测试。表1和表2总结了每种复合材料在每只动物和移植部位中分别关于矿化与去矿化基质的接合得分。
表1每种复合材料在动物和移植部位中关于矿化松质骨基质立方体的接合得分
表2每种复合材料在动物和移植部位中关于去矿化松质骨基质立方体的接合得分
上述数据表明，向骨移植物基质加入骨髓凝集材料显著增强复合移植物的功效。在使用矿化的松质骨基质时，关于富集+ABMC组的接合得分是最大的(平均＝1.9)。此外，富集+ABMC组的接合得分显著大于单独的富集组(平均＝0.6，p＝0.008)。富集+ABMC组在统计学上也优于单独的ABMC组(平均＝1.2，p＝0.04)。这种程度的优越性能是惊人的和意外的。关于三种复合材料富集组+ABMC组、单独的ABMC组和单独的富集组的总体接合率分别是11分之9(81％)、11分之7(63％)和11分之4(36％)。融合得分较高的融合部位聚集在富集+ABMC组。在富集+ABMC组中，11个融合部位有4个(36％)得分3.0或更高。相反，在单独的富集组中11个部位只有1个(8.3％)、在单独的ABMC组中11个部位只有2个(18％)得分近似。
在使用去矿化的松质骨基质时，关于富集+ABMC组的接合得分也是最高的。关于三种材料富集组+ABMC组、单独的ABMC组和单独的富集组的总体接合率分别是11分之7(63％)、11分之6(54％)和11分之5(45％)。融合得分更高的融合部位仍然聚集在富集+ABMC组。在富集+ABMC组中，11个融合部位有5个(45％)得分3.0或更高。相反，在单独的富集组中11个融合部位只有2个(18％)、在单独的ABMC组中11个融合部位只有3个(27％)得分在这个水平上。ABMC与富集骨基质的结合提供了与富集骨基质相比表现更加惊人和意外优越的性能的骨移植物。
对全部样本还进行了力学测试。仅对骨接合产生有限屈服点的那些样本计算了关于最大负载、变形失效和失效能的数据。下列表3和表4分别总结了关于去矿化与矿化样本的力学测试数据。
测量了每个移植部位的强直度，将数据制表，得到关于矿化与去矿化骨基质的三种类型移植物各自的平均与标准偏差值。关于矿化的骨基质，单独的富集、单独的ABMC和富集+ABMC移植物分别表现6.9±2.4、7.9±2.3和8.2±4.2的强直度。关于去矿化的骨基质，单独的富集、单独的ABMC和富集+ABMC移植物分别表现9.1±6.0、9.4±6.2和9.6±4.8的强直度。
关于每种复合移植物，都得到有关融合体积、融合面积和融合物内平均骨密度的CT图象分析数据。表3和表4分别总结了关于矿化与去矿化松质骨基质的数据。从表3和表4可以明显看出，关于富集+ABMC组的融合体积和融合面积都是最大的。
表3使用矿化松质骨基质的每种细胞-基质复合材料的CT数据单独的富集单独的ABMC富集+ABMC(n＝11)(n＝11) (n＝11)融合体积(mm3) 869±196 961±115 1006±185融合面积(mm2) 81±17 91±14 95±27骨密度 1848±62 1840±43 1824±66表4使用去矿化松质骨基质的每种细胞-基质复合材料的CT数据单独的富集单独的ABMC富集+ABMC(n＝11)(n＝11) (n＝11)融合体积(mm3) 872±288 1010±2681115±406融合面积(mm2) 85±31 95±27 98±31骨密度 1901±35 1858±29 1854±77尽管上文所描述的发明实施方式构成优选的实施方式，不过应当理解，可以对其进行修饰而不背离如权利要求书所述发明范围。
权利要求
1.一种复合骨髓移植材料，包含多孔的生物相容性可植入基质和凝集材料，所述复合骨髓移植材料具有富集了的祖代细胞群。
2.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，所述祖代细胞包含结缔组织祖代细胞。
3.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，所述祖代细胞包含干细胞。
4.根据权利要求3的复合骨髓移植材料，所述干细胞包含多能性的干细胞。
5.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，其中所述可植入基质包含微粒性骨材料和纤维性骨材料。
6.根据权利要求5的复合骨髓移植材料，其中所述微粒性骨材料包含同种移植物松质骨微粒。
7.根据权利要求5的复合骨髓移植材料，其中所述纤维性骨材料包含同种移植物去矿化密质骨纤维。
8.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，其中所述基质包含选自下组的基质材料陶瓷材料、生物玻璃、胶原、矿化骨、去矿化骨、透明质酸和合成的生物聚合材料。
9.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，其中所述凝集材料是从骨髓抽吸物衍生的骨髓凝块。
10.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，其中所述凝集材料是血液凝块。
11.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，其中所述凝集材料是选自下组的材料血小板凝胶、血小板浓缩物、纤维蛋白凝集材料和纤维蛋白胶。
12.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，其中祖代细胞与全部源于骨髓的有核细胞之比为至少1∶20,000。
13.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，所述可植入基质与所述凝集材料在所述移植材料中的体积比为5∶1至1∶5。
14.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，所述祖代细胞、所述凝集材料和所述基质都基本上均匀地分布在所述复合骨髓移植材料中。
15.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，其中细胞粘连分子是与所述可植入基质的表面结合的。
16.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，所述移植材料有效地诱导被移植者中的骨愈合。
17.根据权利要求1的复合骨髓移植材料，所述移植材料有效地诱导被移植者中的骨再生。
18.制备复合骨髓移植材料的方法，包含下列步骤a)提供骨髓抽吸物；b)提供多孔的生物相容性可植入基质；c)使所述骨髓抽吸物与所述基质接触，得到富集了的基质；和d)机械混合所述富集基质，得到复合骨髓移植材料，祖代细胞基本上均匀地分布在所述复合骨髓移植材料中。
19.根据权利要求18的方法，进一步包含混合凝集材料与所述富集基质的步骤。
20.根据权利要求18的方法，其中所述可植入基质包含微粒性骨材料和纤维性骨材料。
21.根据权利要求20的方法，其中所述微粒性骨材料包含同种移植物松质骨微粒，所述纤维性骨材料包含去矿化的密质骨纤维。
22.根据权利要求21的方法，其中所述可植入基质包含约1-25cc总体积的微粒性骨微粒和约25-1000mg干重的骨纤维。
23.根据权利要求22的方法，所述骨纤维的长度为5mm-15cm。
24.根据权利要求18的方法，进一步包含向所述富集基质加入无抗凝处理的骨髓抽吸物的步骤。
25.用于复合骨髓移植材料制备的试剂盒，所述试剂盒包含基质容器、第一端帽和第一载入注射器，所述第一端帽可拆装于所述基质容器，所述第一端帽和所述第一载入注射器适合于彼此连接，以在所述第一载入注射器与所述基质容器之间实现流体互通。
26.根据权利要求25的试剂盒，所述试剂盒进一步包含多孔的生物相容性可植入基质。
27.根据权利要求25的试剂盒，所述试剂盒进一步包含肝素化的抽吸注射器和抽吸针头。
28.根据权利要求25的试剂盒，所述试剂盒进一步包含注射器转接器，适合于匹配所述基质容器，以与之构成施用注射器。
29.根据权利要求28的试剂盒，所述试剂盒进一步包含带有可除去的底盖和漏斗的混合碗，所述漏斗适合于在其一端匹配所述混合碗的开口端，在其另一端匹配施用注射器。
30.根据权利要求25的试剂盒，所述试剂盒进一步包含刀具，所述刀具在其一端具有活塞，所述活塞适合于装填移植材料至所述基质容器内。
31.根据权利要求25的试剂盒，所述试剂盒进一步包含多孔膜，可有效保留基质材料在所述容器内。
32.根据权利要求25的试剂盒，其中所述基质容器是基质柱。
33.根据权利要求25的试剂盒，所述试剂盒进一步包含第二载入注射器和第二端帽，所述第二端帽可拆装于所述基质容器，所述第二端帽和所述第二载入注射器适合于彼此连接，以在所述第二载入注射器与所述基质容器之间实现流体互通。
全文摘要
提供了复合骨髓移植材料，它具有富集了的均匀分布的祖代细胞群。移植材料包括优选从无抗凝处理的骨髓抽吸物衍生的凝集材料，它显著提高移植物的功效。还提供了制备这类骨移植材料的方法。还提供了试剂盒，含有经过灭菌的器具，可用于制备富集了的复合骨髓移植材料。
文档编号A61L27/36GK1503683SQ02808675
公开日2004年6月9日 申请日期2002年2月26日 优先权日2001年2月28日
发明者乔治·F·穆施勒, 乔治 F 穆施勒 申请人:克利夫兰临床基金会