IFNα-17基因的新的多核苷酸和多肽的制作方法

专利名称：IFNα-17基因的新的多核苷酸和多肽的制作方法
相关申请本发明要求对2001年4月24日提交的法国专利申请0105516的优先权，名为《Nouveaux polynucléotides et polypeptides du gèneIFNα-17》。
背景技术：
发明领域本发明涉及来源于IFNα-17基因核苷酸序列的包含新的SNP的新的多核苷酸、来源于天然野生型IFNα-17蛋白质的包含这些SNP所致突变的新的多肽及其治疗用途。
相关技术干扰素α17基因，以下简称IFNα-17，描述于文献-Olopade等人″Mapping of the shortest region of overlap ofdeletions of the short arm of chromosome 9 associated with humanneoplasia″；Genomics；14437-443；1992.
-Lawn R.M.等人；″DNA sequence of two closely linked humanleukocyte interferon genes″；Science 212(4499)，1159-1162(1981).
该基因的核苷酸序列可得自GenBank数据库登录号V00532。
已知IFNα具有细胞抗增殖作用，并与抗病毒和抗寄生虫反应有关。
还已知IFNα抑制几种其它细胞因子在造血干细胞水平的表达，并抑制某些肿瘤的细胞增殖。
还已知IFNα降低肾癌中EGF受体的表达，抑制某些线粒体基因表达，抑制成纤维细胞、单核细胞和B淋巴细胞增殖，特别是在体外，以及阻断B淋巴细胞的抗体合成。
还已知IFNα诱导肿瘤细胞表面上肿瘤特异性抗原的表达，并通过作用于ISRE的特异性转录因子而诱导位于ISRE型(干扰素刺激性反应元件)启动子区控制下的基因。
众所周知，IFNα与各种病症(disorder)和/或人类疾病有关，例如各种癌症，诸如恶性肿瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和肝癌、颈癌、头癌和肾癌，心血管疾病，诸如与免疫系统无关的代谢疾病，例如肥胖症，传染病，例如乙型和丙型肝炎以及AIDS，肺炎，溃疡性结肠炎，中枢神经系统疾病，例如阿尔茨海默氏病、精神分裂症和抑郁症，组织或器官移植的排斥，创伤愈合，透析患者的贫血，变态反应，哮喘，多发性硬化，骨质疏松症，银屑病，类风湿性关节炎，克罗恩氏病(Crohn’s disease)，自身免疫疾病和病症，胃肠机能病乃至与化学治疗有关的疾病。
IFNα可特别用于治疗某些白血病、转移性肾癌以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，例如AIDS情况下的Kaposi肉瘤。IFNα还有效对抗其它类型肿瘤以及某些病毒性传染。FDA(食品和药品管理局)确认IFNα还可治疗生殖器疣或性病。
然而，IFNα特别是IFNα-17用于药物组合物具有很多副作用，例如急性超敏反应(荨麻疹、支气管收缩、过敏性休克等)、心率不齐、低血压、癫痫发作、甲状腺功能问题、流感样综合症(发热、出汗、肌痛)等。
此外，用IFNα治疗的患者可以产生中和该分子的抗体，从而降低其效率。
本发明人发现IFNα-17基因的新的多肽和新的多核苷酸类似物，其能够具有不同于天然野生型IFNα-17蛋白质的功能性。
这些新的多肽和多核苷酸可以特别用于治疗或预防前述病症或疾病，并避免其所具有的全部或部分缺点。
发明简述本发明的首个目的在于，因其包含一个或几个SNP(单核苷酸多态性)而不同于参考的野生型IFNα-17基因核苷酸序列的新的多核苷酸。
参考的人野生型IFNα-17基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1由1873个核苷酸组成，包含核苷酸639(起始密码子)-1208(终止密码子)的570个核苷酸的编码序列。
申请人已经鉴定了参考的野生型IFNα-17基因核苷酸序列中的2个SNP。
这些SNP如下g771c、808Ins(a)。
应当理解，在本发明意义上，前面定义的SNP的相应位置编号是相对于核苷酸序列SEQ ID NO.1的编号而言。
字母a、t、c和g分别对应于含氮碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤。
第一个字母对应于野生型核苷酸，而最后一个字母对应于突变的核苷酸。
因此，例如SNP g771c对应于参考的野生型IFNα-17基因核苷酸序列SEQ ID NO.1中的771位核苷酸鸟嘌呤(g)突变为胞嘧啶(c)。
SNP 808Ins(a)对应于在参考的野生型IFNα-17基因核苷酸序列SEQ ID NO.1中808位插入核苷酸腺嘌呤(a)。
本申请人利用申请人于2000年12月6日提交的名为″Process forthe determination of one or several functional polymorphism(s)in thenucleotide sequence of a preselected functional candidate gene and itsapplications″的专利申请FR 00 22894(此处引用以供参考)中所述测定方法，鉴定出了这些SNP。
该专利申请中所述方法可以从随机群体中的至少一个个体中鉴定一个(或几个)已经存在的SNP。
在本发明范围内，在随机选取的群体中的不同个体中分离例如包含编码序列的IFNα-17基因的核苷酸序列片段。
在DHPLC分析(″变性高效液相层析″)之后，对某些具有异质双链性质(即性质不同于参考的野生型IFNα-17基因序列)的样品测序这些片段。
然后将这样测序的片段与参考的野生型IFNα-17基因片段的核苷酸序列作比较，并鉴定与本发明相符的SNP。
因此，该SNP是天然的，其中每一个均存在于世间群体的某些个体中。
参考的野生型IFNα-17基因编码对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的189个氨基酸的未成熟蛋白质，通过断裂包括前23个氨基酸的信号肽而转变为166个氨基酸的成熟蛋白质。
本发明的编码SNP，即g771c和808Ins(a)，引起IFNα-17基因核苷酸序列编码的蛋白质在氨基酸序列水平的改变。这些改变如下-编码SNP g771c引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-17基因的未成熟蛋白质的45位氨基酸甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)，其位于成熟蛋白质的22位。在本发明的说明书中，根据分别涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而将该SNP编码的突变任意记为G22R和G45R。
-SNP 808Ins(a)引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-17基因的未成熟蛋白质的57位氨基酸组氨酸(H)突变为谷氨酰胺(Q)，并位于成熟蛋白质的34位。此外，腺嘌呤在核苷酸序列808位的插入引起蛋白质翻译移码，从而导致氨基酸序列的58位出现终止密码子。因此，SNP 808Ins(a)导致翻译于谷氨酰胺57之后停止。因此，产生的未成熟蛋白质变短，仅由57个氨基酸构成。该多态性也称为H57Qframe 57。在本发明的说明书中，根据分别涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而将该SNP编码的突变任意记为H34Q frame 34和H57Qframe 57。
氨基酸序列SEQ ID NO.3对应于包含SNP 808Ins(a)的核苷酸序列ID SEQ NO.1编码的突变型未成熟蛋白质(H57Q frame 57)。
本发明的每个SNP均引起本发明的多肽与野生型参考IFNα-17基因核苷酸序列编码的多肽相比，其空间构象改变。
按照本领域技术人员熟知的方法，通过计算机分子模建(modeling)，例如借助de novo(例如SEQFOLD/MSI)、同源性(例如MODELER/MSI)、最小化势场(例如DISCOVER、DELPHI/MSI)和/或分子动力学(例如CFF/MSI)模建工具，可以观察到这些改变。
下文实验部分给出了上述模型的实施例。
计算机分子模建表明，突变型成熟蛋白质的突变G22R包含一个改变以及22位附近AB环的替代，从而导致氢键消失。


图1A和1B表明，AB环未折叠并且突出。
天然野生型IFNα-17的G22残基非常接近于R144残基。已知该R144残基与干扰素α-2(IFNα-2)结合其受体有关。IFNα-2和IFNα-17的结构非常相似，IFNα-17中的R144残基很可能与结合其受体有关。
因此，G22R突变型蛋白质具有不同于天然野生型IFNα-17蛋白质的三维构象。
计算机分子模建还可以预测，22位氨基酸精氨酸的存在涉及天然野生型蛋白质IFNα-17的结构和功能、特别是在IFNα-17与其受体结合的水平的显著改变。
本发明的多核苷酸可以按此方式进行基因分型，以便确定这些多核苷酸在群体中的等位频率。
通过测定生物活性，可以同样进行本发明多肽的功能性测定。
在此方面，例如有可能测定符合本发明的多肽的信号转导、树突状细胞成熟、T淋巴细胞释放细胞因子、单核细胞释放细胞因子、体外或体内抗病毒活性、对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性、对TF-1细胞系的细胞抗增殖活性，并与野生型IFNα-17、或与选作商品化产物Intron A代表的野生型IFNα-2作比较。
本发明目的还在于符合本发明的多核苷酸和多肽、以及从这些多核苷酸和多肽开始而获得和/或鉴定的治疗性分子的用途，特别是用于预防和治疗某些人类病症和/或疾病。
附图简述图1A表示包含SNP G45R的本发明编码蛋白质和野生型IFNα-17蛋白质的模型。图1B表示图1A所示每种蛋白质下部模型的详图。
在图1A和1B中，黑色条带代表野生型IFNα-17蛋白质的结构，而白色条带代表G22R突变型IFNα-17蛋白质的结构。
图2表示测定G45R突变型IFNα-17对TF-1细胞系的抗增殖作用的测试结果。在此图中，横坐标对应IFNα浓度(ng/ml)，纵坐标对应细胞增殖抑制作用(％)。将G45R突变型IFNα-17(黑色菱形)的抗增殖作用与野生型IFNα-2(白色方块)相比。
图3表示测定G45R突变型IFNα-17对Daudi Burkitt细胞系的抗增殖作用的测试结果。在此图中，横坐标对应IFNα的浓度(ng/ml)，纵坐标对应细胞增殖抑制作用(％)。将G45R突变型IFNα-17(黑色菱形)的抗增殖作用与野生型IFNα-2(白色方块)相比。
图4表示预先经VSV病毒感染、并经G45R突变型IFNα-17蛋白质处理的小鼠的存活率与经野生型IFNα-2处理、或未经处理的小鼠相比。
在此图中，横坐标对应存活时间(天)，纵坐标对应VSV感染小鼠的相对存活率。黑色菱形表示经G45R突变型IFNα-17处理的VSV感染小鼠的数据，黑色方块表示经野生型IFNα-2处理的VSV感染小鼠的数据，而空三角形表示未处理的VSV感染小鼠的数据。
发明详述定义″参考野生型基因的核苷酸序列″应理解为人IFNα-17基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1。
该基因的核苷酸序列可得自GenBank数据库登录号V00532，并描述于Olopade等人″Mapping of the shortest region of overlap ofdeletions of the short arm of chromosome 9 associated with humanneoplasia″；Genomics；14437-443；1992.
-Lawn R.M.等人；″DNA sequence of two closely linked humanleukocyte interferon genes″；Science 212(4499)，1159-1162(1981).
″天然野生型IFNα-17蛋白质″或″野生型IFNα-17蛋白质″应理解为由参考的野生型IFNα-17基因的核苷酸序列编码的成熟蛋白质。天然野生型未成熟IFNα-17蛋白质对应于SEQ ID NO.2所示肽序列。
″多核苷酸″应理解为多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，可以是改变或未改变的DNA或RNA。
术语多核苷酸包括，例如单链或双链DNA、由一个或几个单链区以及一个或几个双链区的混合物组成的DNA、单链或双链RNA以及由一个或几个单链区以及一个或几个双链区的混合物组成的RNA。术语多核苷酸还可以包括包含一个或几个三链区的RNA和/或DNA。多核苷酸同样可理解为因稳定性或其它原因而改变骨架的、包含一个或几个修饰的碱基的DNA和RNA。修饰碱基可理解为，例如诸如次黄苷等稀有碱基。
″多肽″应理解为包含通过正常或修饰的肽键(例如在同型空间配位肽的情况下)彼此互联的至少两个氨基酸的肽、寡肽、寡聚体或蛋白质。
多肽可以由遗传密码定义的20个氨基酸以外的氨基酸组成。多肽同样可以由利用本领域技术人员熟知的天然加工(诸如翻译后成熟加工)或化学加工而修饰的氨基酸组成。文献中充分详述了这些修饰。这些修饰可以出现在多肽的任何位置肽骨架、氨基酸链乃至羧基或氨基末端。
多肽可以是泛素化之后的分支状，或者有或无分支的环状。这类修饰可以是本领域技术人员熟知的天然或合成的翻译后加工的结果。
例如，多肽修饰可理解为包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价定位、血红素的共价定位、核苷酸或核苷酸衍生物的共价定位、脂质或脂质衍生物的共价定位、磷脂酰肌醇的共价定位、共价或非共价交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化包括聚乙二醇化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、seneloylation、sulfatation、氨基酸加成，诸如精氨酸化或泛素化。文献中充分详述了这些修饰PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，第二版，T.E.Creighton，New York，1993，POST-TRANSLATIONALCOVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983，Seifter等人″Analysis for proteinmodifications and nonprotein cofactors″，Meth.Enzymol.(1990)182626-646，以及Rattan等人″Protein SynthesisPost-trahslationalModifications and Aging″，Ann NY Acad Sci(1992)66348-62。
″分离的多核苷酸″或″分离的多肽″应理解为从人体中分离或利用技术加工产生的、分别如前面定义的多核苷酸或多肽。
″同一性″应理解为测定核苷酸或多肽序列的同一性。
同一性是本领域技术人员熟知的术语，在文献中有详述。参见COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M.，Ed.，Oxford University Press，New York，1998；BIOCOMPUTINGINFORMATICS AND GENOME PROJECT，Smith，D.W.，Ed.，Academic Press，New York，1993；COMPUTER ANALYSIS OFSEQUENCE DATA，PART I，Griffin，A.M.和 Griffin H.G.，Ed，Humana Press，New Jersey，1994；以及SEQUENCE ANALYSIS INMOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，Academic Press，1987。
文献中同样详述了一般用于确定两个序列间同一性和相似性的方法。参见GUIDE TO HUGE COMPUTER，Martin J.Bishop，Ed，Academic Press，San Diego，1994，以及Carillo H.和Lipton D.，Siam JApplied Math(1988)481073。
例如，与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有至少95％同一性的多核苷酸是与该序列相比，每100个核苷酸包含至多5个突变点的多核苷酸。
这些突变点可以是一个(或几个)核苷酸的一个(或几个)替换、添加和/或缺失。
同样，例如与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少95％同一性的多肽是与该序列相比，每100个氨基酸中包含至多5个突变点的多肽。
这些突变点可以是一个(或几个)氨基酸的一个(或几个)替换、添加和/或缺失。
分别不完全等同于以下序列的本发明的多核苷酸和多肽
-包含至少一个下列SNPg771c和808Ins(a)的核苷酸序列SEQID NO.1-包含SNP G45R的氨基酸序列SEQ ID NO.2-可能包含SNP G45R的氨基酸序列SEQ ID NO.3被认为是这些序列的变体。
本发明的多核苷酸通常与包含至少一个SNPg771c和808Ins(a)的核苷酸序列SEQ ID NO.1具有相同或几乎相同的生物活性。
同样，本发明的多肽通常与以下序列具有相同或几乎相同的生物活性-包含SNP G45R的氨基酸序列SEQ ID NO.2，和/或-可能包含SNP G45R的氨基酸序列SEQ ID NO.3。
例如，通过定点诱变或直接合成，可以获得本发明的变体。
″SNP′可理解为核苷酸序列中碱基的任何天然变异。核苷酸序列的SNP可以是编码、沉默或非编码型。
编码SNP是包括在核苷酸序列的编码序列内、涉及该核苷酸序列所编码氨基酸序列中的氨基酸改变的一种多态性。在此情况下，术语SNP经外延同样适用于氨基酸序列的突变。
沉默SNP是包括在核苷酸序列的编码序列内、不涉及该核苷酸序列所编码的氨基酸序列中的氨基酸改变的一种多态性。
非编码SNP是包括在核苷酸序列的非编码序列中的一种多态性。该多态性特别发现于内含子、拼接区、转录启动子或增强子位点序列中。
″功能性SNP″可理解为如前面定义的、包括在核苷酸序列或氨基酸序列中的具有功能性的SNP。
″功能性″可理解为多肽或多核苷酸的生物活性。
本发明的多肽或多核苷酸的功能性可以是保留、增加、降低或抑制野生型参考基因的核苷酸序列编码的多肽、或后者核苷酸序列的生物活性。
本发明的多肽或多核苷酸的功能性同样可以是野生型参考基因的核苷酸序列编码的多肽、或后者核苷酸序列的生物活性的本质改变。
生物活性可以特别涉及本发明的多肽与受体有或没有亲和力。
多核苷酸本发明的首个目的在于分离的多核苷酸，其包含a)与序列SEQ ID NO.1或其编码序列(核苷酸639-1208)具有至少90％同一性、优选至少95％同一性、更优选至少99％同一性的核苷酸序列，应当理解该核苷酸序列包含至少一个以下编码SNPg771c和808Ins(a)，或b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
依照本发明，a)中核苷酸序列可能包含SNP g771c、或SNP808Ins(a)、或SNP g771c和808Ins(a)两者。
应当理解，在本发明意义上，该编号对应于该SNP在核苷酸序列SEQ ID NO.1中的定位。
本发明同样涉及分离的多核苷酸，其包含a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或其编码序列，应当理解其中每个序列均包含至少一个以下编码SNPg771c和808Ins(a)，或b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸优选由序列SEQ ID NO.1或其编码序列组成，应当理解其中每个序列均包含至少一个以下编码SNPg771c和808Ins(a)。
根据本发明，前面定义的多核苷酸包含选自g771c和808Ins(a)的单个编码SNP。
本发明还涉及分离的多核苷酸，其由部分的下列序列组成a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或其编码序列，应当理解其中每个序列均包含至少一个以下SNPg771c和808Ins(a)，或b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
该分离的多核苷酸由至少10个核苷酸组成。
如上定义的分离的多核苷酸优选由10-40个核苷酸组成。
本发明的目的还在于分离的多核苷酸，其编码的多肽包含
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列，应当理解，a)和b)中每个序列均包含下列编码SNPG45R。
应当理解，在本发明意义上，SNP G45R的相应位置编号是相对于氨基酸序列SEQ ID NO.2的编号而言。
本发明的目的还在于分离的多核苷酸，其编码的多肽包含a)氨基酸序列SEQ ID NO.3，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.3中24-57位之间所含氨基酸的氨基酸序列，前面定义的多肽的a)和b)中的每个氨基酸序列也可能包含SNPG45R。
根据本发明的优选目的，前面定义的多肽包含如上定义的单个编码SNP。
更优选地，本发明分离的多核苷酸编码包含氨基酸序列SEQ IDNO.2的全部或部分、并具有编码SNP G45R的多肽。
更优选地，本发明分离的多核苷酸编码包含氨基酸序列SEQ IDNO.3的全部或部分、可能还具有编码SNP G45R的多肽。
本发明优选的多核苷酸由DNA或RNA分子组成。
本发明的多核苷酸可以利用标准的DNA或RNA合成方法获得。
从IFNα-17基因的核苷酸序列开始，通过定点诱变将核苷酸序列SEQ ID NO.1中771位野生型核苷酸鸟嘌呤(g)改变为突变型核苷酸胞嘧啶(c)，同样可以获得包含SNP g771c的本发明的多核苷酸。
从IFNα-17基因的核苷酸序列开始，通过定点突变在核苷酸序列SEQ ID NO.1的808位添加腺嘌呤核苷酸(a)，同样可以获得包含SNP808Ins(a)的本发明多核苷酸。
可以这样应用的定点诱变方法为本领域技术人员熟知。特别提到的是文献TA Kunkel，1985″Proc.Natl.Acad.Sci.USA″82488。
分离的多核苷酸同样可以包括，例如编码前、原或前原蛋白质氨基酸序列、或诸如六组氨酸肽等标志氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸同样可以连接编码其它蛋白质或蛋白质片段的核苷酸序列，以获得融合蛋白质或其它纯化产物。
本发明的多核苷酸同样可以包括诸如5′和/或3′非编码序列的核苷酸序列，例如转录或非转录序列、翻译或非翻译序列、拼接信号序列、多腺苷酸化序列、核糖体结合序列乃至稳定mRNA的序列。
与核苷酸或多核苷酸序列互补的核苷酸序列可定义为，可以在严格条件下与该核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
″严格杂交条件″一般但不一定理解为允许具有至少80％、优选大于或等于90％、更优选大于或等于95％、最优选大于或等于97％的同一性的核苷酸序列杂交的化学条件。
可以按照本领域技术人员熟知的方法获得严格条件，例如将多核苷酸在包含50％甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH＝7.6)、5x Denhardt液、10％硫酸葡聚糖和20μg变性鲑精DNA的溶液中，于42℃温育，然后于0.1x SSC、65℃洗涤滤膜。
在本发明范围内，如果该严格杂交条件可使具有100％同一性的核苷酸序列杂交，则认为该核苷酸序列与a)中所述核苷酸序列严格互补。
应当理解，在本发明的涵义中，与一个核苷酸序列互补的核苷酸序列包含至少一个本发明的反义SNP。
因此，举例来说，如果该核苷酸序列包含SNP g771c，则其互补核苷酸序列在相当于771的位置包含核苷酸g。
包含SNP的多核苷酸的鉴定、杂交和/或扩增本发明的目的还在于以下全部或部分的用途a)与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性(优选至少90％同一性、更优选95％同一性、特别优选100％同一性)的多核苷酸，和/或b)包含至少一个SNP的本发明多核苷酸以鉴定、杂交和/或扩增与核苷酸序列SEQ ID NO.1或必要时其编码序列(核苷酸639-1208)具有80-100％同一性(优选至少90％同一性、更优选95％同一性、特别优选100％同一性)的多核苷酸的全部或部分，应当理解其中每个序列包含至少一个下列SNPg771c、808Ins(a)。
基因分型并测定SNP频率本发明的目的同样在于以下全部或部分的用途a)与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性(优选至少90％同一性、更优选95％同一性、特别优选100％同一性)的多核苷酸，和/或b)包含至少一个SNP的本发明多核苷酸用于与核苷酸序列SEQ ID NO.1或必要时其编码序列(核苷酸639-1208)具有80-100％同一性(优选至少90％同一性、更优选95％同一性、特别优选100％同一性)的多核苷酸的全部或部分的基因分型，应当理解其中每个序列包含至少一个下列SNPg771c、808Ins(a)。
根据本发明，可以对个体或个体的群体进行基因分型。
在本发明涵义中，基因分型可定义为用于测定个体或个体群基因型的方法。基因型由存在于一个或多个特定座位的等位基因构成。
″个体群″可理解为以随机或非随机方式选择的一群个体。这些个体可以是人、动物、微生物或植物。
个体群通常包含至少10个个体，优选100-300个个体。
可以根据种族或表现型选择个体，特别是受以下病症和/或疾病影响的表现型恶性肿瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和肝癌、颈癌、头癌和肾癌、心血管疾病、诸如与免疫系统无关的代谢疾病，例如肥胖症，传染性疾病，特别是病毒性传染，如乙型肝炎、丙型肝炎和AIDS，肺炎、溃疡性结肠炎、中枢神经系统疾病，例如阿尔茨海默氏病、精神分裂症和抑郁症，组织或器官移植排斥、创伤愈合、透析患者的贫血、变态反应、哮喘、多发性硬化、骨质疏松症、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、自身免疫疾病和病症、胃肠机能疾病乃至与化学治疗有关的疾病。
优选在个体群中进行本发明功能性SNP的基因分型。
现有许多可以用来进行SNP基因分型的技术(特别参见KwokPharmacogenomics，2000，卷1，95-100页，″High-throughputgenotyping assay approaches″)。这些技术基于以下四原理之一等位基因特异性寡核苷酸杂交、任选在脱氧核苷酸存在下通过双脱氧核苷酸的寡核苷酸延伸、等位基因特异性寡核苷酸的连接或等位基因特异性寡核苷酸的断裂。其中每个技术都可与检测系统相结合，例如直接或偏振荧光测定、或质谱分析。
利用热ddNTP(由不同荧光基团标记的两种不同的ddNTP)和冷ddNTP(两种不同的非标记的ddNTP)的微型测序，结合偏振荧光扫描仪，可以特别进行基因分型。本领域技术人员熟知利用读取偏振荧光的微型测序方法(FP-TDI技术或荧光偏振模板-直接染料-终止物参入)。
它可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增每一个体DNA后获得的产物进行。选择PCR产物，以涵盖包含所研究SNP的多核苷酸基因区域。在PCR热循环仪的最后步骤之后，将平板置于偏振荧光扫描仪，利用荧光基团特异性激发和发射滤器读取标记碱基。按图表报告标记碱基的强度值。
就本发明SNP的PCR扩增而言，本领域技术人员很容易根据本发明SNP的定位，分别选择有义和反义引物。
例如，用于PCR扩增引物的有义和反义核苷酸序列可以分别为SEQ ID NO.4有义引物TTCAAGGTTACCCATCTCAASEQ ID NO.5反义引物TTAGTCAATCAGGATCATTGC该核苷酸序列可以扩增具有核苷酸序列SEQ ID NO.1中核苷酸591-1245的655个核苷酸长度的片段。
然后对个体群中由包含SNP的基因编码的每个等位基因的频率(等位频率)进行统计分析，确定其影响的重要性及其在不同亚群、特别是必要时在构成该个体群的不同种群中的分布。
分析基因型数据，以便估计在所研究群体中观察到的不同等位基因的分布频率。借助于软件，例如SAS-suite(SAS)或SPLUS(MathSoft)，计算等位频率。利用软件ARLEQUIN和SAS-suite，可以比较本发明SNP在个体群中不同种群的等位分布。
本发明SNP作为遗传标志鉴于修饰的基因功能性序列的SNP(例如启动子、拼接位点、编码区)很可能与疾病易感性或抗性直接有关，所有SNP(不论功能性与否)均可能提供用于鉴定与疾病状态有关的一个或几个基因的重要标志，从而可能间接与该疾病状态有关(参见Cargill等人(1999).NatureGenetics 22231-238；Riley等人(2000).Pharmacogenomics 139-47；Roberts L.(2000).Science 2871898-1899)。
因此，本发明还涉及包含IFNα-17基因多核苷酸中至少一个下列SNPg771c、808Ins(a)的数据库。
应当清楚理解，所述SNP按核苷酸序列SEQ ID NO.1编号。
可分析该数据库，确定以下两者之间的统计学相关性(i)IFNα-17基因多核苷酸中至少一个下列SNPg771c、808Ins(a)，与(ii)疾病或疾病抗性。
更优选地，本发明涉及确定IFNα-17基因中选自g771c、808Ins(a)的至少一个SNP与疾病或疾病抗性之间的统计学相关性的方法，其包含a)对一群个体进行基因分型；b)确定该疾病或疾病抗性在该个体群中的分布；c)将基因型数据与该疾病或疾病抗性的分布作比较；以及d)对上述比较进行统计学相关性分析。
本发明还涉及IFNα-17基因多核苷酸中的至少一个下列SNPg771c、808Ins(a)的用途，用于开发疾病或疾病抗性的诊断/预后试剂盒。
如上定义的本发明SNP可直接或间接与疾病或疾病抗性有关。
优选地，这些疾病可能是上述定义的疾病。
表达载体和宿主细胞本发明目的还在于包含至少一个本发明多核苷酸的重组载体。
可以使用多种表达系统，包括而不限于染色体、附加体和衍生病毒。更特别而言，所用重组载体可来自于细菌质粒、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒诸如杆状病毒、乳头状瘤病毒诸如SV40、痘苗病毒、腺病毒、狐痘病毒(fox pox viruses)、假狂犬病毒、逆转录病毒。
这些重组载体同样可以是粘粒或噬菌粒衍生物。可以利用本领域技术人员熟知的方法，例如MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL，Sambrook等人，第四版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)中所述，将核苷酸序列插入重组表达载体。
该重组载体可以包括控制多核苷酸表达调节的核苷酸序列、以及可以表达和转录本发明多核苷酸、翻译本发明多肽的核苷酸序列，根据所用宿主细胞选择这些序列。
因此，例如可以将合适的分泌信号整合到重组载体，以便将本发明多核苷酸编码的多肽导向内质网腔、周质间隙、膜或细胞外环境。
本发明目的还在于包含本发明重组载体的宿主细胞。
按照本领域技术人员公知的方法，例如BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，Davis等人，第二版，McGraw-HillProfessional Publishing，1995和MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL(同上)中所述方法，例如磷酸钙转染、DEAE葡聚糖转染、转染、显微注射、阳离子脂质转染、电穿孔、转导或感染，可以将重组载体引入宿主细胞。
宿主细胞可以是例如，细菌细胞，诸如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌或枯草杆菌细胞，真菌细胞，诸如酵母细胞和曲霉属、链霉属细胞，昆虫细胞诸如果蝇S2和Spodoptera Sf9细胞，动物细胞诸如CHO、COS、HeLa、C127、BHK、HEK 293细胞，以及所治疗患者的人类细胞乃至植物细胞。
例如，可用来表达本发明多肽或药物组合物中活性产物的宿主细胞参见下文。
多肽本发明目的还在于分离的多肽，其包含与以下序列的全部或部分具有至少80％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、更加优选至少99％同一性的氨基酸序列a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列，应当理解，a)和b)中每个氨基酸序列均包含下列编码SNP:G45R。
本发明的多肽同样可以包含全部或部分的a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列，应当理解，a)和b)中每个氨基酸序列均包含下列编码SNP:G45R。
本发明的多肽可以更特别由全部或部分的下列序列组成a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列，应当理解，a)和b)中每个氨基酸序列均包含下列编码SNP:G45R。
本发明目的还在于分离的多肽，其包含与以下序列的全部或部分具有至少80％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、更加优选至少99％同一性的氨基酸序列a)氨基酸序列SEQ ID NO.3，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.3中24-57位之间所含氨基酸的氨基酸序列，应当理解，a)和b)中每个氨基酸序列均包含下列编码SNP:H57Qframe 57。
本发明的多肽同样可以包含全部或部分的a)氨基酸序列SEQ ID NO.3，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.3中24-57位之间所含氨基酸的氨基酸序列。
本发明的多肽可以更特别由全部或部分的下列序列组成a)氨基酸序列SEQ ID NO.3，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.3中24-57位之间所含氨基酸的氨基酸序列。
所述多肽的a)和b)中的每个氨基酸序列也可能包含SNP G45R。
优选地，本发明的多肽包含选自G45R、H57Q frame 57的单个编码SNP。
更优选地，本发明多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的24-189位氨基酸、并具有编码SNP G45R。
更优选地，本发明多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.3的24-57位氨基酸。
本发明的目的同样在于制备上述多肽的方法，其中在培养基中培养前面定义的宿主细胞，并从该培养基中分离所述多肽。
按照本领域技术人员熟知的方法，例如利用诸如盐(特别是硫酸铵)、乙醇、丙酮或三氯乙酸等离液剂沉淀；酸提取；离子交换层析；磷酸纤维素层析；疏水作用层析；亲合层析；羟基磷灰石层析或排阻层析，可以从宿主细胞的培养基开始，纯化该多肽。
″培养基″可理解为从中分离或纯化本发明多肽的培养基。该培养基可以由细胞外培养基和/或细胞裂解物组成。如果所述多肽的构象在分离或纯化期间改变，同样可以利用本领域技术人员熟知的方法，使其恢复该多肽的活性构象。
抗体本发明的目的还在于获得免疫特异性抗体的方法。
″抗体″可理解为单克隆、多克隆、嵌合、单链、人源化抗体以及Fab片段，包括Fab或免疫球蛋白表达文库产物。
利用本发明的多肽免疫动物，可以获得免疫特异性抗体。
本发明还涉及先前定义的本发明多肽的免疫特异性抗体。
本发明的多肽、其片段之一、类似物、其变体之一或表达该多肽的细胞，也可以用来产生免疫特异性抗体。
术语″免疫特异性″是指该抗体对于本发明的多肽比现有技术已知的其它多肽具有更好的亲和力。
按照本领域技术人员熟知的方法，将本发明的多肽、其片段之一、类似物或表位片段、或表达该多核苷酸的细胞给予哺乳动物、优选非人哺乳动物，可以获得免疫特异性抗体。
为制备单克隆抗体，可以从细胞系开始，使用抗体制备的典型方法，例如杂交瘤技术(Kohler等人，Nature(1975)256495-497)，三源杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunology Today(1983)472)以及EBV杂交瘤技术(Cole等人，″The EBV-hybridoma technique and its application to human lungcancer，″in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (27卷，UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology，New Series)(R.A.Reisfeld和S.Sell编著)，77-96页，Alan R.Liss，Inc.N.Y.，1985，77-96页)。
同样可以使用单链抗体制备技术，例如美国专利4,946,778所述。
转基因动物，例如小鼠，同样可以用来制备人源化抗体。
与本发明多肽相互作用的物质(agent)本发明的目的同样在于鉴定活化或抑制本发明多肽的物质的方法，其包含a)制备包含含有至少一个SNP的本发明多核苷酸的重组载体，b)制备包含a)中重组载体的宿主细胞，c)b)中宿主细胞接触待测物质，以及
d)确定待测物质产生的活化或抑制作用。
本发明的多肽还可以用于筛选与其互作的化合物的方法。
这些化合物可以是本发明多肽固有活性的活化剂(激动剂)或抑制剂(拮抗剂)。这些化合物同样可以是本发明多肽的配基或底物。参见Coligan等人，Current Protocols in Immunology 1(2)，第5章(1991)。
一般而言，为实施上述方法，最理想的是制备表达本发明多肽的合适的宿主细胞。上述细胞可以是，例如哺乳动物、酵母、昆虫(例如果蝇)或细菌(例如大肠杆菌)的细胞。
然后将这些细胞或这些细胞的膜提取物置于待测化合物存在下。
然后观察该待测化合物与本发明多肽的结合力以及对功能性反应的抑制或活化作用。
使用直接或间接标记的待测物质，可以进行上述方法的步骤d)。还可以包括一个使用标记或非标记的物质以及标记的竞争剂的竞争试验。
同样可以利用根据待检信号而适当选择的检测方法，确定待检物质是否对表达本发明多肽的细胞产生活化或抑制信号。
例如，上述活化或抑制剂可以是多核苷酸、在某些情况下是寡核苷酸或多肽，例如蛋白质或抗体。
本发明的目的还在于鉴定受本发明多肽活化或抑制的物质的方法，其包含a)制备包含含有至少一个SNP的本发明多核苷酸的重组载体，b)制备包含a)中重组载体的宿主细胞，c)将b)中宿主细胞置于待测物质存在下，以及d)确定该多肽对待测物质产生的活化或抑制作用。
受本发明多肽活化或抑制的物质是在该多肽存在下，分别具有活化或抑制反应的物质。
受本发明多肽直接或间接活化或抑制的物质可以包含多肽例如膜或核受体、激酶并更优选酪氨酸激酶、转录因子或多核苷酸。
疾病检测本发明目的还在于分析受试者中本发明多核苷酸和/或本发明多肽的生物学特性的方法，其包含以下至少一项a)确定受试者基因组中存在或缺少本发明的多核苷酸；b)确定受试者中本发明的多聚核苷酸的表达水平；c)确定受试者中存在或缺少本发明的多肽；d)确定受试者中本发明多肽的浓度；和/或e)确定受试者中本发明多肽的功能性。
可分析受试者或受试者样品的这些生物学特性。
这些生物学特性可进行遗传诊断和确定受试者是否患有与存在本发明多核苷酸和/或本发明多肽有关的疾病、不适或病症，或处于患所述病的危险之中，或反之具有对所述疾病形成的部分抗性。
这些疾病可以是病症和/或人类疾病，例如癌症和肿瘤、传染病、生病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、以及与化学治疗有关的异常。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移性肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞样白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、传染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症还可能包括创伤愈合、透析患者的贫血以及骨质疏松症。
该方法还可遗传诊断与受试者中存在本发明SNP编码的等位基因突变体有关的疾病或疾病抗性。
优选在步骤a)中检测包含前面定义的至少一个编码SNP的多核苷酸的存在与否。
可以从所研究受试者的生物样品(例如细胞、血液、尿、唾液)、或其活检或尸检样品开始，检测该多核苷酸。例如，可以使用基因组DNA直接、或于PCR扩增后进行检测。
同样可按类似方式使用RNA或cDNA。
然后可能将本发明多核苷酸的核苷酸序列与受试者基因组中检测到的核苷酸序列作比较。
可以通过测序、DNA杂交方法、DNA片段在有或无变性剂的电泳凝胶中的迁移率差异、或解链温度差异，进行核苷酸序列的比较(参见Myers等人，Science(1985)2301242)。利用核酸酶保护试验(例如RNase和S1核酸酶)、酶促消化、或者还有化学裂解剂，同样可以揭示核苷酸序列精确位点的上述结构改变。参见Cotton等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1985)854397-4401。同样可以利用包含本发明多核苷酸片段的寡核苷酸探针进行筛选。
可以使用本领域技术人员熟知的多种方法，确定本发明多核苷酸的表达，并鉴定该多核苷酸的遗传变异性(参见Chee等人，Science(1996)，274卷，610-613页)。
在步骤b)中，按照本领域技术人员熟知的方法，例如PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern印迹及其它杂交方法，定量该多核苷酸编码的RNA(及编码多肽)的水平，可测定该多核苷酸的表达水平。
在步骤c)和d)中，利用公知的方法，例如放射免疫测定、竞争生结合试验、Western印迹和ELISA试验，可以测定本发明多肽在受试者或受试者样品中存在与否及其浓度。
步骤d)之后，可以将测定的本发明多肽的浓度与通常在受试者中发现的天然野生型蛋白质的浓度作比较。
本领域技术人员借助于现有技术文献或诸如前述常规试验或测定，可以确定对以上所致疾病、不适或病症表现出敏感性或反之抗性的高低阈值。
在步骤e)中，利用本领域技术人员熟知的方法，例如上述体外试验，或使用表达本发明多肽的宿主细胞，可以测定本发明多肽的功能性。
治疗性化合物及疾病治疗本发明的目的还在于包含本发明多肽作为活性剂的治疗性化合物。
本发明还涉及本发明多肽的用途，用于制备意在预防或治疗各种人类病症和/或疾病的治疗性化合物。这些疾病可以是病症和/或人类疾病，例如癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、以及与化学治疗有关的病症。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移性肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞样白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、传染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症还可能包括创伤愈合、透析患者的贫血以及骨质疏松症。
本发明的多肽优选还可以用于制备意在预防或治疗各种人类病症和/或疾病的治疗性化合物，例如某些病毒性传染，如乙型和丙型慢性肝炎，白血病例如毛样细胞白血病和慢性髓细胞样白血病，多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、类癌瘤、恶性黑色素瘤、转移性肾癌、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，例如在AIDS情况下的Kaposi肉瘤、以及生殖器疣或性病。
可以获得本发明多肽的某些化合物、以及通过该多肽或从其中获得或鉴定的化合物同样可以用于治疗人体，即作为治疗性化合物。
正因为如此，本发明的目的还在于包含含有至少一个先前定义的编码SNP的本发明多核苷酸、先前定义的重组载体、先前定义的宿主细胞、和/或先前定义的抗体作为活性剂的药物。
本发明还涉及包含含有至少一个先前定义的编码SNP的本发明多核苷酸、先前定义的重组载体、先前定义的宿主细胞、和/或先前定义的抗体的用途，用于制备意在预防或治疗各种人类病症和/或疾病的药物。这些疾病可以是病症和/或人类疾病，例如癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、以及与化学治疗有关的病症。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移性肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞样白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、传染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症还可能包括创伤愈合、透析患者的贫血以及骨质疏松症。
本发明优选涉及包含至少一个先前定义的SNP的本发明多核苷酸、先前定义的重组载体、先前定义的宿主细胞、和/或先前定义的抗体的用途，用于制备意在预防或治疗各种人类病症和/或疾病的药物，例如某些病毒性传染，如乙型和丙型慢性肝炎，白血病例如毛样细胞白血病和慢性髓细胞样白血病，多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、类癌瘤、恶性黑色素瘤、转移性肾癌、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，例如在AIDS情况下的Kaposi肉瘤，以及生殖器疣或性病。
本发明用作活性剂的多肽和其它化合物的剂量取决于所选择的化合物、治疗适应症、给药方式、制剂性质、受试者性质及医生的判断。
用作活性剂时，一般按1-15M IU(国际单位)的剂量给予本发明的多肽。可能通过皮下或肌内途径给予推荐剂量，每周1-5次，进行1-12个月。
本发明的目的还在于药物组合物，其包含至少一种上述化合物，例如本发明的多肽、包含至少一个前面定义的SNP的本发明多核苷酸、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体作为活性剂，以及药物可接受的赋形剂。
该活性剂优选以生理有效剂量存在于这些药物组合物中。
例如，这些药物组合物可以是固体或液体，并以目前用于人类医学的药物形式存在，例如简单或包衣片剂、软胶囊、颗粒剂、焦糖剂、栓剂、优选可注射用制剂和可注射用粉末。可以按照常用方法制备这些药物形式。
活性剂可以掺入通常用于药物组合物的赋形剂，例如滑石粉、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、葡萄糖、甘油、乙醇、硬脂酸镁、可可脂、含水或无水载体、动物或植物来源的脂质、石蜡衍生物、乙二醇、各种湿润剂、分散剂或乳化剂、防腐剂。
本发明的活性剂可以单独使用或与其它化合物例如治疗性化合物联用，诸如白细胞介素或干扰素等其它细胞因子。
根据给药方式，调整该药物组合物的不同剂型。
可以通过本领域技术人员已知的不同给药途径，给予该药物组合物。
本发明的目的同样在于诊断性组合物，其包含至少一个上述化合物作为活性剂，例如本发明的多肽、本发明多核苷酸的全部或部分、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体、以及合适的药物可接受的赋形剂。
该诊断性组合物可包含，例如一般用于诊断性组合物的合适的赋形剂，诸如缓冲液和防腐剂。
本发明的目的同样在于下列物质的用途a)治疗有效量的本发明多肽，和/或b)本发明的多核苷酸，和/或c)前面定义的来自所需治疗受试者的宿主细胞，以制备意在增加本发明多肽在受试者中表达或活性的治疗性化合物。
因此，为治疗需要增加本发明多肽表达或活性的受试者，可能有几种方法。
可能给予受试者治疗有效量的本发明多肽，连同药物可接受的赋形剂。
同样可能通过给予受试者本发明的多核苷酸，增加本发明多肽的内源性生成。例如，可以将该多核苷酸插入逆转录病毒表达载体。利用包含编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体感染细胞，以使转导细胞产生包含目的基因的感染性病毒颗粒，可以从该细胞开始分离上述载体，参见Human Molecular Genetics，Strachan和Read，第20章，Gene Therapy and other Molecular Genetic-based TherapeuticApproaches，BIOS Scientifics Publishers Ltd(1996)。
根据本发明，优选使用前面定义的包含至少一个编码SNP的多核苷酸。
同样可能给予受试者属于自身的宿主细胞，预先取出这些宿主细胞，并如前所述进行修饰，使其表达本发明多肽。
本发明同样涉及以下物质的用途a)治疗有效量的前面定义的免疫特异性抗体，和/或b)可抑制本发明多核苷酸表达的多核苷酸，以便制备意在降低本发明多肽在受试者中表达或活性的治疗性化合物。
因此，可能给予受试者治疗有效量的诸如前面定义的抑制剂和/或抗体，有可能联用，以及药物可接受的赋形剂。
同样可能通过给予受试者可抑制本发明多核苷酸表达的本发明的互补多核苷酸，降低本发明多肽的内源性生成。
优选使用包含前面定义的至少一个编码SNP的互补多核苷酸。
本发明还涉及IFNα-17蛋白质在制备药物中的用途，用于预防或治疗具有IFNα-17变体所致病症或疾病的患者，该病症或疾病与该患者基因组中存在的、与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有至少95％同一性(优选97％同一性、更优选99％同一性、特别优选100％同一性)的核苷酸序列有关，只要该核苷酸序列包含下列SNP之一g771c、808Ins(a)。
该药物优选用于预防或治疗选自癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和异常、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病以及与化学治疗有关的疾病之一的疾病。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移性肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞样白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、传染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症还可能包括创伤愈合、透析患者的贫血以及骨质疏松症。
包含本发明SNP g771c的IFNα-17多肽的类似化合物本发明还涉及具有与下列多肽基本类似的生物活性的新化合物a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列；只要a)和b)中所述氨基酸序列包含SNP G45R。
例如，如实验部分所述，通过测定树突状细胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴细胞释放细胞因子、单核细胞释放细胞因子、体外或体内抗病毒活性、对TF-1细胞系的细胞抗增殖活性、或对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性，可评价所述生物活性。
如实验部分所述，与野生型IFNα-2相比，G45R突变型IFNα-17具有-较强的刺激CD4+T淋巴细胞释放IFN-γ的能力-较强的刺激CD8+T淋巴细胞释放IFN-γ和IL-10的能力-较低的刺激单核细胞释放IL-10和IL-12的能力-类似的对TF-1细胞的抗增殖活性-较高的对Daudi Burkitt细胞系细胞的抗增殖活性-较高的在VS感染的细胞培养中的体外抗病毒活性-较高的在EMCV小鼠模型中的体内抗病毒活性。
亦如实验部分所述，与野生型IFNα-17相比，G45R突变型IFNα-17对Daudi Burkitt细胞系具有较低的细胞抗增殖活性。
前面定义的本发明的新化合物可能具有与G45R突变型IFNα-17基本类似的生物活性。
所述化合物可能还具有甚至高于G45R突变型IFNα-17的生物活性，例如CD4+或CD8+T淋巴细胞释放IFN-γ、CD8+T淋巴细胞释放IL-10、体外抗病毒活性、或体内抗病毒活性。
所述化合物可能还具有甚至低于G45R突变型IFNα-17的生物活性，例如单核细胞释放IL-10和IL-12。
该化合物可能是生物化学化合物，例如多肽或肽，或有机化学化合物，例如合成肽类似物。
本发明还涉及包含G45R SNP的本发明多肽在鉴定如上定义的化合物中的用途。
本发明还涉及鉴定本发明化合物的方法，其包含以下步骤a)确定待测化合物的生物活性，例如树突状细胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴细胞释放细胞因子、单核细胞释放细胞因子、对TF-1细胞系的细胞抗增殖活性、对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性、体外或体内抗病毒活性；b)比较i)步骤a)测定的待测化合物的活性，与ii)氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽的活性，或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列的活性；只要所述氨基酸序列包含G45R SNP；以及c)根据步骤b)中进行的比较，确定该待测化合物是否具有与氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列基本类似、或更低、或更高的活性；只要所述氨基酸序列包含G45R SNP。
优选该待测化合物可能预先鉴定自合成肽组合文库、高通量筛选、或由计算机辅助药物设计而设计，以具有与氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列相同的三维结构；只要该氨基酸序列包含G45R SNP。
鉴定和设计化合物的方法为本领域技术人员所熟知。
例如，关于这些方法的文献可能有-Silverman R.B.(1992).″Organic Chemistry of Drug Design andDrug Action″.Academic Press，lst edition(January 15，1992).
-Anderson S和Chiplin J.(2002).″Structural genomics；shapingthe future of drug design″Drug Discov.Today.7(2)105-107.
-Selick HE，Beresford AP，Tarbit MR(2002).″The emergingimportance of predictive ADME simulation in drug discovery″.DrugDiscov.Today.7(2)109-116.
-Burbidge R，Trotter M，Buxton B，Holden S.(2001).″Drugdesign by machine learningsupport vector machines forpharmaceutical data analysis″.Comput.Chem.26(1)5-14.
-Kauvar L.M.(1996).″Peptide mimetic drugsa comment onprogress and prospects″14(6)709.
本发明的药物可用于制备意在预防或治疗选自癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病以及与化学治疗有关的疾病之一疾病的药物。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移性肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞样白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、传染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症还可能包括创伤愈合、透析患者的贫血以及骨质疏松症。
优选本发明的化合物可能用于制备意在预防或治疗选自下列疾病的药物，某些病毒性感染，如乙型和丙型慢性肝炎，白血病例如毛样细胞白血病和慢性髓细胞样白血病，多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、类癌瘤、恶性黑色素瘤、转移性肾癌、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，例如在AIDS情况下的Kaposi肉瘤，以及生殖器疣或性病。
实验部分实施例1包含SNP G45R的核苷酸序列的多核苷酸编码的蛋白质以及野生型参者基因的核苷酸序列编码的蛋白质的模建。
第一步，从得自PDB数据库(编码1ITF)的IFNα-2结构开始，利用软件Modeler(MSI，San Diego，CA)，构建IFNα-17的三维结构。
然后修饰该成熟多肽的片段，以便复制突变G45R。
利用程序AMBER和DISCOVER(MSIMolecular SimulationsInc.)，对该突变片段进行1000次分子最小化步骤。
然后利用相同程序和相同势场，进行两次分子动态运算。
在所有情况下，于300°K计算50,000步，由300个平衡步终止。
该模建结果由图1A和1B所示。
实施例2在酵母中表达天然野生型IFNα-17和G45R突变型IFNα-17a)在真核表达载体pPicZα-topo中克隆天然野生型IFNα-17以及突变型IFNα-17利用来自该SNP杂合子个体的基因组DNA为模板，PCR扩增编码天然野生型IFNα-17成熟部分以及G45R突变型IFNα-17的核苷酸序列。
可以进行该扩增的PCR引物为SEQ ID NO.6有义引物TGTGATCTGCCTCAGACCCAC
SEQ ID NO.7反义引物TCAATCCTTCCTCCTTAATATTTTTTGC将PCR产物插入真核表达载体pPicZα-TOPO，位于可甲醇诱导的杂合启动子AOX1控制下(TOPOTM-cloning；Invitrogen Corp.)。
该载体可使真核蛋白质在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中异源表达。
在核对载体编码重组蛋白质区域的核苷酸序列之后，利用Pme1限制酶将载体线性化，并利用该重组表达载体转化巴斯德毕赤氏酵母菌株(Invitrogen)。
b)野生型IFNα-17和G45R突变型IIFNα-17蛋白质在巴斯德毕赤氏酵母中的异源表达及纯化将包含编码野生型IFNα-17蛋白质或编码G45R突变型IFNα-17蛋白质的克隆的两个50ml BMGY培养基(2％蛋白胨、1％酵母抽提物、1.34％YNB、1％甘油、100mM磷酸钾、0.4mg/L生物素pH6.0)的饱和前培养物在30℃、200转/分(rpm)振荡培养24-48小时。
当培养物达到饱和细胞密度时(相当于波长600nm下所测光密度12)，用来按5OD/mL接种到250ml BMMY培养基(2％蛋白胨、1％酵母抽提物、1.34％YNB、0.5％甲醇、100mM磷酸钾、0.4mg/L生物素pH6.0)。
然后利用终浓度1％的甲醇，将培养瓶于180转/分振荡下30℃诱导蛋白质表达24小时。
由于在编码序列上游存在″α因子″信号肽序列，酵母将蛋白质分泌于培养基中。α因子在加工过程中自然断裂。
将悬浮液离心，从所获上清开始，利用HPLC纯化蛋白质。
在开始前步骤中，超滤(Labscale，截留5000Da，Millipore)后透析可使酵母上清在50mM Tris-Cl pH9.0、25mM NaCl的缓冲液中浓缩10倍。
第一个层析步骤可利用蓝色琼脂糖凝胶柱(Amersham Pharmacia)的亲和力回收蛋白质。一方面通过SDS PAGE型电泳，另一方面通过针对IFNα-17蛋白质的特异性抗体的免疫检测，证实该蛋白质存在于收集组分中。
在此步骤，目的蛋白质的纯度高于75％。
在第二个纯化步骤中，凝胶过滤可使对应于IFNα-17蛋白质的收集组分通过50mM Tris pH9.0、25mM NaCl更换缓冲液。
最后的纯化步骤包括利用离子交换层析柱分离蛋白质。
将包含重组蛋白质的组分注入预先用Tris 50mM pH9、NaCl25mM缓冲液平衡的阴离子交换柱(ResourceQ 6.0mL，Pharmacia)。通过Tris 50mM pH9缓冲液中0，025-1M NaCl梯度的移动，进行蛋白质洗脱。
利用SDS/PAGE凝胶估计目的蛋白质的纯度，利用光密度法(Quantity one，Biorad)和BCA分析(二辛可宁酸和硫酸铜，Sigma)测定蛋白质浓度。
按照此方案获得纯化的野生型IFNα-17以及G45R突变型IFNα-17蛋白质，最后按比例放大，生产大量蛋白质，用于下述功能测试。
实施例3.评价天然野生型IFNα-17以及G45R突变型IFNα-17的免疫调节活性IFN I型(IFNα和IFNβ)能够调节免疫系统的某些功能。已经证明它们可增强树突状细胞(DC)成熟增强MHC I类(HLA-ABC)和II类(HLA-DR)分子的表达，增强与T淋巴细胞共刺激有关的分子、CD80、CD86和CD83分子的表达，并增强T淋巴细胞的刺激功能。
a)G45R突变型IFNα-17对树突状细胞成熟的作用首先研究G45R突变型IFNα-17对树突状细胞成熟的免疫调节活性，并与选作商品化Intron A产物代表的野生型IFNα-2作比较。
为此，首先从利用GM-CSF和IL-4细胞因子培养的成人外周血单核细胞中生成树突状细胞。利用CD 14+细胞纯化试剂盒纯化以后，将这些树突状细胞置于100ng/ml野生型IFNα-2或G45R突变型IFNα-17存在下，通过FACS分析确定其表现型，目的在于探询MHCI类和II类分子以及CD40、CD80、CD86、CD83和CD1a标志的表达。
这些树突状细胞的成熟状态也与未经IFNα处理所得树突状细胞相比，以提供未刺激树突状细胞的对照。
每个标志及3次实验条件下测定的荧光强度平均值按任选单位表示，如下表所示
该测试结果表明，G45R突变型IFNα-17蛋白质能够刺激树突状细胞成熟。
b)G45R突变型IFNα-17对T淋巴细胞释放细胞因子的作用将T淋巴细胞置于突变型IFNα-17蛋白质以及有或没有强抗原(SEB)的存在下，以模拟抗侵袭免疫应答，通过测定T淋巴细胞释放的细胞因子，还可研究G45R突变型IIFNα-17的免疫调节活性。
还在用作对照并选作Intron A商品化产物代表的野生型IFNα-2存在下进行该测试。
为此，从健康供体分离外周血单核细胞(PBMC)，在包含抗CD3和抗CD28抗体或SEB的合适培养基中刺激16小时。每个培养物中加入4μg/mL野生型IFNα-2或G45R突变型IFNα-17。刺激之后，利用抗CD3、抗CD4和抗CD69抗体、或抗CD3、抗CD8和抗CD69抗体细胞外标记T淋巴细胞，利用针对Th1型细胞因子(IFN-γ)或Th2型细胞因子(IL-10)的特异性抗体进行细胞内标记。利用FACScalibur和CellQueSt软件分析荧光细胞。
所得结果表明，G45R突变型IFNα-17蛋白质和野生型IFNα-2在缺少SEB时不刺激IL-10和IFN-γ的释放，因而并不活化T淋巴细胞。
相反，G45R突变型IFNα-17和野生型IFNα-2刺激SEB活化的T淋巴细胞释放细胞因子(IL-10和IFN-γ)，如下表所示。该表显示T淋巴细胞在SEB存在下释放细胞因子，分别表示为CD4+CD69+细胞或CD8+CD69+细胞对于CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的百分比，以及CD69+细胞占总细胞的百分比。
这些结果清楚表明，G45R突变型IFNα-17强烈刺激经SEB抗原预先活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞释放细胞因子(IFNγ和IL-10)。在该测试中，CD4+T淋巴细胞在G45R突变型IFNα-17存在下产生的干扰素γ高于野生型IFNα-2存在条件下，CD8+T淋巴细胞在G45R突变型IFNα-17存在下产生的干扰素γ和IL-10高于野生型IFNα-2存在条件下。
c)G45R突变型IFNα-17对单核细胞释放细胞因子的作用最后，通过在有或无细菌性毒剂(LPS)存在下测定单核细胞释放的细胞因子，研究G45R突变型IFNα-17的免疫调节活性。还在用作对照并选作Intron A商品化产物代表的野生型IFNα-2存在下进行该测试。
为此，从健康供体分离人外周血单核细胞(PBMC)，分析其表现型，以确定CD64+CD4dim细胞的相对含量(CD64和CD4dim是血液单核细胞的标志)。过夜培养之后，将这些PBMC在单独的培养基(未刺激的细胞)或LPS存在下(刺激的细胞)培养。在每个培养物中加入4μm/mL野生型IFNα-2或G45R突变型IFNα-17。培养后，利用抗CD64和抗CD4dim细胞外标记细胞，并利用针对Th1型细胞因子(TNF-α)、IL-12和IL-10的特异性抗体细胞内标记细胞。
利用FACScalibur和CellQuest软件分析荧光细胞。
所得结果表明，在缺少LPS时，G45R突变型IFNα-17和野生型IFNα-2不刺激细胞因子(IL-10、IL-12和TNF-α)的释放。
相反，单核细胞在存在LPS时释放细胞因子。单核细胞在LPS存在下释放的IL-10和IL-12，在存在野生型IFNα-2时进一步增加，存在G45R突变型IFNα-17时则不然，如下表所示。该表显示单核细胞在存在LPS时释放的细胞因子，表示为CD64+CD4dim细胞的百分比以及CD4dim CD64+细胞占总细胞的百分比。
因此，在G45R突变型IFNα-17和LPS存在下未观察到协同作用，提示G45R突变型IFNα-17可能具有免疫抑制作用。
实施例4.评价G45R突变型IFNα-17对TF-1红白血病细胞系的体外抗增殖活性还评价了G45R突变型IFNα-17对TF-1红白血病细胞系的作用。同样在用作对照并选作IntronA商品化产物代表的野生型IFNα-2存在下进行该测试。
为此，将TF-1细胞接触浓度递增的突变型IFNα-17或野生型IFNα-2(0.001-1000ng/ml)，并测定细胞增殖。
图2所示结果表明，G45R突变型IFNα-17对TF-1细胞具有弱的抗增殖作用，该作用类似于野生型IFNα-2，提示G45R突变型IFNα-17的血液学毒性并不高于野生型IFNα-2。
实施例5.评价G45R突变型IFNα-17诱导人Daudi Burkitt淋巴癌细胞系抗增殖的能力对两种不同的IFNα-17蛋白质、即G45R突变型IFNα-17和天然野生型IFNα-17进行测试。将预先在RPMI 1640培养基中(补充有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺)培养的细胞(人Daudi Burkitt淋巴瘤细胞系，下文称为″Daudi细胞″)按细胞密度4.104细胞/孔接种于96孔板。
各孔中的Daudi细胞接触浓度递增的天然野生型IFNα-17或G45R突变型IFNα-17蛋白质。
所研究IFNα-17(天然野生型或突变型蛋白质)的浓度为0.003pM-600nM(每孔终浓度)。
然后将Daudi细胞在37C、5％CO2下培养66小时，其后在培养物中加入Uptiblue试剂(Uptima)。再温育4小时以后，测定590nm处发射的荧光(激发560nm)，定量细胞增殖速率。
天然野生型IFNα-17或G45R突变型IFNα-17的抗增殖活性是根据IC50的测定，即对应于抑制50％细胞生长的IFNα-17的皮摩尔(pM)浓度。
进行4次类似实验，每次重复4遍。每次实验的IC50值如下表所示
野生型IFNα-17测定的平均IC50值为0.49pM，而G45R突变型IFNα-17测定的平均IC50值为5.31pM。因此，对应于突变型IFNα-17与天然野生型IFNα-17的IC50值平均比值达到10.80(标准差为3.46)。
该测试表明，G45R突变型IFNα-17比野生型IFNα-17强烈抑制细胞抗增殖活性(大约低5-15倍)。
还利用野生型IFNα-2进行了类似独立实验，以便比较G45R突变型IFNα-17与野生型IFNα-2对Daudi细胞增殖的抗增殖作用。为此，在0.001-10ng/ml浓度的G45R突变型IFNα-17或野生型IFNα-2的存在下培养Daudi细胞。
类似实验进行3次。一次典型实验的结果如图3所示。
这些结果表明，G45R突变型IFNα-17对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性高于野生型IFNα-2。
实施例6.评价G45R突变型IFNα-17的抗病毒活性IFN在抗病毒防护中具有重要作用。IFN的抗病毒活性部分应归于IFN诱导的酶系统，例如-可催化腺苷酸寡聚物合成的2′5′寡腺苷酸合成酶。这些寡聚物可活化RNase L，一种一旦活化，便可破坏病毒RNA的核糖核酸内切酶。
-抑制病毒转录本合成和/或成熟的Mx蛋白质(GTP酶)。该活性主要作用于流感病毒。
-由双链RNA活化的PKR蛋白质(或p68激酶)。活化的PKR可抑制蛋白质合成。
也可通过其它机制诱导IFN的抗病毒活性，例如对于逆转录病毒而言，抑制病毒颗粒进入细胞、复制、结合、颗粒排出以及病毒颗粒的传染力。
最后，IFN通过调节免疫系统的某些功能、特别是促进细胞介导的应答(包括增加MHC I类和II类分子、增加IL-12和IFN-γ生成、增加CTL活性等)，而发挥间接的抗病毒活性。
已经在体外细胞培养以及体内小鼠模型中评价了G45R突变型IFNα-17的抗病毒活性。两个测试均利用用作对照并选作Intron A商品化产物代表的野生型IFNα-2平行进行。
a)细胞培养物体外抗病毒活性该测定可以利用水泡性口膜炎病毒(VSV)，评价G45R突变型IFNα-17以及野生型IFNα-2在细胞培养物中的抗病毒活性。
为此，在浓度递减的G45R突变型IFNα-17或野生型IFNα-2存在下培养WISH人上皮细胞24小时。然后利用水泡性口膜炎病毒(VSV)再感染细胞24-48小时，测定细胞溶解作用。
通过比较IC50值，即对应于抑制50％VSV诱导的细胞溶解作用的IFN浓度，确定所测各种IFNα的抗病毒作用。
类似实验进行两次，典型实验中测定的IC50值如下表所示
因此，G45R突变型IFNα-17在受VSV感染的细胞培养物中显示抗病毒活性，该抗病毒活性高于野生型IFNα-2。
b)小鼠模型体内抗病毒活性在EMCV(脑心肌炎病毒)小鼠模型中进行体内测试。
人IFN在小鼠中显示剂量依赖性抗病毒活性，一般比相同数量的小鼠IFN低100-1,000倍(Meister等人；(1986).J.Gen.Virol.67，1633-1644)。
利用脑心肌炎病毒(EMCV)腹膜内注射小鼠，引起以有关中枢神经系统和脑炎为特征的快速渐进性致命疾病(Finter NB(1973).FrontBiol.2295-360)。已经证明，小鼠和人干扰素-α均有效保护小鼠抵抗致命的EMCV感染(Tovey和Maury(1999).J.IFN Cytokine Res.19145-155)。
利用100x LD50EMCV腹膜内(ip)感染20只6周龄的Swiss小鼠组，1小时后利用2μg G45R突变型IFNα-17或野生型IFNα-2制剂处理，以后每天一次，进行3天。对照组只利用赋形剂处理动物。每天追踪动物存活率，进行21天。
结果如图4所示，表明G45R突变型IFNα-17处理小鼠的相对存活率相比未处理小鼠高很多，甚至高于利用野生型IFNα-2处理小鼠所观察的结果。这些数据表明，G45R突变型IFNα-17在小鼠模型中具有强烈的体内抗病毒活性。
所有这些结果证明，G45R突变型IFNα-17具有独特的生物学特性。
序列表<110>Genodyssee<120>IFNα-17基因的新多核苷酸和多肽<130>IFNa-17<140>
<141>
<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1873<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<400>1agcttcatac actaagagaa aaattttaaa aaattattga ttcttatttt caggagtttt 60gaatgatcag gtatgtaatt atattcatat tattaatgtg tatttatata gatttttatt 120ttgcacaggt actttgatac aaaatttaca tgaacaaatt acactaaaag ttatttcaca 180aatatactta tcaagttaag ttaaatgcaa tagctttaaa cttagatttt aatttaactt 240tttctatcat cattctttac attaaataaa aaaagcaaac tttatagttt ttatctataa 300agtagaggta tacatagtat acataaatac atatgccaaa tctgtgttat taaaacttca 360tgaagatttc gattacaaaa aaataccgta aaagactttg agtgcagaag aaaaatgggc 420aatgatgaaa aacaatgaaa aacattctta aacacatgta gagagtgcaa aaagaaagca 480aaaacagaca tagaaagtaa aactagggca tttagaaaat ggaaattagt atgttcacta 540tttaaggcct atgcacagag caaagtcttc agaaaaccta gaggccaaag ttcaaggtta 600cccatctcaa gtagcctagc aacatttgca acatcccaat ggccctgtcc ttttctttac 660tgatggccgt gctggtgctc agctacaaat ccatctgttc tctaggctgt gatctgcctc 720agacccacag cctgggtaat aggagggcct tgatactcct ggcacaaatg ggaagaatct 780ctcctttctc ctgcctgaag gacagacatg actttggact tccccaggag gagtttgatg 840gcaaccagtt ccagaagact caagccatct ctgtcctcca tgagatgatc cagcagacct 900tcaatctctt cagcacagag gactcatctg ctgcttggga acagagcctc ctagaaaaat 960tttccactga actttaccag caactgaata acctggaagc atgtgtgata caggaggttg 1020ggatggaaga gactcccctg atgaatgagg actccatcct ggctgtgagg aaatacttcc 1080aaagaatcac tctttatcta acagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg gaggttgtca 1140gagcagaaat catgagatct ctctcttttt caacaaactt gcaaaaaata ttaaggagga 1200aggattgaaa actggttcaa catggcaatg atcctgattg actaatacat tatctcacac 1260tttcatgagt tcctccattt caaagactca cttctataac caccacgagt tgaatcaaaa 1320ttttcaaatg ttttcagcag tgtaaagaag cgtcgtgtat acctgtgcag gcactagtac 1380tttacagatg accatgctga tgtctctgtt catctattta tttaaatatt tatttaatta 1440tttttaagat ttaaattatt tttttatgta atatcatgtg tacctttaca ttgtggtgaa 1500tgtaacaata tatgttcttc atatttagcc aatatattaa tttccttttt cattaaattt 1560ttactataca aaatttcttg tgtttgttta ttctttaaga taaaatgtcg aggctgactt 1620tacaacctga cttaaaaata tatgatttaa ttaagttatc tatcataatt ttattcaagt 1680tattaaaaaa acatttttct gttactggtt atatgttgcc ttcaagatat aaacgtgaac 1740ataaaatata cagtccctgt tctcttgtat ctttgatttt tgtcaggaaa gaaatctaaa 1800aacaataata atgctgaatt aatatcagtg atgctaactg ctataatgtg aggaagtaaa 1860atacaatgaa ttc 1873<210>2<211>189
<212>PRT<213>人类<400>2Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr1 5 10 15Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu20 25 30Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser35 40 45Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu50 55 60Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Thr Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu phe Ser Thr Glu Asp Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu100 105 110Tyr Gln Gln Leu Asn Asn Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly115 120 125Met Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg130 135 140Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser145 150 155 160Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser165 170 175Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys Ile Leu Arg Arg Lys Asp180 185<210>3<211>57<212>PRT<213>人类<400>3Met Ala Leu Ser phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr1 5 10 15Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu pro Gln Thr His Ser Leu20 25 30Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly ArgIle Ser35 40 45Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Gln
50 55<210>4<211>20<212>DNA<213>人类<400>4ttcaaggtta cccatctcaa 20<210>5<211>21<212>DNA<213>人类<400>5ttagtcaatc aggatcattg c 2权利要求
1.分离的多核苷酸，其包含全部或部分的a)核苷酸序列SEQ ID NO.1，只要该核苷酸序列包含至少一个选自g771c、808Ins(a)的SNP；或b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO.1的639-1208位核苷酸，只要该序列包含至少一个选自g771c、808Ins(a)的编码SNP。
3.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由至少10个核苷酸组成。
4.分离的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有编码SNP G45R的多肽。
5.分离的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO.3的全部或部分的多肽。
6.权利要求5的多核苷酸，其特征在于，所述氨基酸序列还包含下列编码SNP:G45R。
7.鉴定或扩增与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性的多核苷酸的全部或部分的方法，其包含所述多核苷酸在合适的杂交条件下与权利要求1的多核苷酸杂交。
8.与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性的多核苷酸的全部或部分的基因分型方法，其包含以下步骤扩增受试者或受试者群体基因组DNA的目的区域，并确定位于核苷酸序列SEQ ID NO.1中选自771、808的至少一个位点的等位基因。
9.权利要求8的方法，其中基因分型通过微型测序进行。
10.包含权利要求1的多核苷酸的重组载体。
11.包含权利要求10的重组载体的宿主细胞。
12.分离多肽的方法，其包含在培养基中培养权利要求11的宿主细胞，并从培养基中分离所述多肽。
13.由权利要求1的分离的多核苷酸编码的多肽。
14.分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有SNP G45R。
15.权利要求13的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位氨基酸、并具有SNP G45R。
16.分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.3的全部或部分。
17.权利要求16的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.3的24-57位氨基酸。
18.权利要求16的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.3中24-57位氨基酸、并具有编码SNP G45R。
19.获得免疫特异性抗体的方法，其包含利用权利要求13的多肽免疫动物，并从该动物收集所述抗体。
20.权利要求19的方法所产生的免疫特异性抗体。
21.在一种或多种待测化合物中鉴定活化或抑制分离多肽活性的物质的方法，该分离的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有SNP G45R，所述方法包含a)提供包含权利要求10的重组载体的宿主细胞；b)所述宿主细胞接触待测化合物，c)确定对所述多肽活性的活化或抑制作用，从而鉴定活化剂或抑制剂。
22.在一种或多种待测化合物中鉴定其活性受分离多肽增强或抑制的物质的方法，该分离的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有SNP G45R，所述方法包含a)提供包含权利要求10的重组载体的宿主细胞；b)所述宿主细胞接触待测化合物，c)确定对所述物质活性的增强或抑制作用，从而鉴定所述的被增强或抑制的物质。
23.在一种或多种待测化合物中鉴定活化或抑制分离多肽活性的物质的方法，该分离的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.3的全部或部分、可能还具有编码SNP G45R，所述方法包含a)提供包含权利要求10的重组载体的宿主细胞；b)所述宿主细胞接触待测化合物，c)确定对所述多肽活性的活化或抑制作用，从而鉴定活化剂或抑制剂。
24.在一种或多种待测化合物中鉴定其活性受分离多肽增强或抑制的物质的方法，该分离的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.3的全部或部分、可能还具有编码SNP G45R，所述方法包含a)提供包含权利要求10的重组载体的宿主细胞；b)所述宿主细胞接触待测化合物，c)确定对所述物质活性的增强或抑制作用，从而鉴定所述的被增强或抑制的物质。
25.分析受试者生物学特征的方法，其包含进行至少一个下列步骤a)确定受试者基因组中存在或缺少权利要求1的多核苷酸；b)确定受试者中权利要求1的多核苷酸的表达水平；c)确定受试者中存在或缺少权利要求13的多肽；d)确定受试者中权利要求13的多肽的浓度；或e)确定受试者中权利要求13的多肽的功能性。
26.包含一种或多种化合物的治疗剂，该化合物选自包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分的分离的多核苷酸，只要该核苷酸序列包含至少一个选自g771c、808Ins(a)的SNP，或者与该核苷酸序列互补的核苷酸序列；包含该多核苷酸的重组载体；包含该重组载体的宿主细胞；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有SNP G45R的分离的多肽；包含氨基酸序列SEQ ID NO.3的全部或部分、可能还具有编码SNP G45R的分离的多肽；特异性针对所述多肽之一的抗体。
27.用于预防或治疗个体疾病的方法，所述疾病选自癌症和肿瘤、传染病、免疫和自身免疫相关疾病、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病以及化学治疗相关疾病，所述方法包含给予该个体治疗有效量的权利要求26的治疗剂，外加药物可接受的赋形剂。
28.权利要求27的方法，其中所述癌症和肿瘤包含转移性肾癌、黑色素瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞性白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤。
29.权利要求27的方法，其中所述代谢疾病包含非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
30.权利要求27的方法，其中所述传染病包含病毒性传染，包括慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、传染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
31.权利要求27的方法，其中所述中枢神经系统疾病包含阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症以及抑郁症。
32.权利要求27的方法，其中所述免疫和自身免疫相关疾病包含组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
33.预防或治疗个体疾病的方法，所述疾病选自创伤愈合、透析患者的贫血和/或骨质疏松症，所述方法包含给予该个体治疗有效量的权利要求26的治疗剂，外加药物可接受的赋形剂。
34.增加或降低受试者中权利要求13的多肽活性的方法，其包含给予治疗有效量的一种或多种包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分的分离的多核苷酸，只要该核苷酸序列包含至少一个选自g771c、808Ins(a)的SNP，或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列；包含该多核苷酸的重组载体；包含该重组载体的宿主细胞，其中该宿主细胞可得自待治疗的所述受试者；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有SNP G45R的分离的多肽；包含氨基酸序列SEQ ID NO.3的全部或部分、并可能还具有编码SNP G45R的分离的多肽；特异性针对所述多肽之一的抗体；以及药物可接受的赋形剂。
35.预防或治疗个体疾病的方法，该疾病与所述个体基因组中存在权利要求1的多核苷酸有关，所述方法包含给予治疗有效量的一种或多种包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分、并具有选自g771c、808Ins(a)的至少一个SNP的分离的多核苷酸，或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列；包含所述多核苷酸之一的重组载体；包含所述重组载体的宿主细胞；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有SNP G45R的分离的多肽；包含氨基酸序列SEQ ID NO.3的全部或部分、可能还具有编码SNP G45R的分离的多肽；特异性针对所述多肽之一的抗体；以及药物可接受的赋形剂。
36.确定IFNα-17基因中选自g771c、808Ins(a)的至少一个SNP与疾病或疾病抗性之间的统计学相关性的方法，其包含a)对一群个体进行基因分型；b)确定该疾病或疾病抗性在该个体群中的分布；c)将基因型数据与该疾病或疾病抗性的分布作比较；以及d)对上述比较进行统计学相关性分析。
37.诊断或确定疾病预后或疾病抗性的方法，其包含检测IFNα-17基因中至少一个选自g771c、808Ins(a)的SNP。
38.在一种或多种待测化合物中鉴定与G45R突变型IFNα-17基因产物具有基本类似的生物活性的化合物的方法，所述方法包含以下步骤a)确定所述化合物的生物活性，例如树突状细胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴细胞释放细胞因子、单核细胞释放细胞因子、对TF-1细胞系的细胞抗增殖活性、对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性、体外或体内抗病毒活性；b)将步骤a)确定的所述化合物的活性与G45R突变型IFNα-17基因产物作比较。c)根据步骤b)进行的比较，确定所述化合物是否具有与G45R突变型IFNα-17基因产物基本类似、或更低、或更高的活性。
39.权利要求38的方法，其中所述待测化合物鉴定自合成肽组合文库、高通量筛选、或通过计算机辅助药物设计而设计，以具有与SEQID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的24-189位所含氨基酸的氨基酸序列相同的三维结构，只要该氨基酸序列包含G45RSNP。
40.利用权利要求39的方法鉴定的化合物。
41.用于预防或治疗个体疾病的方法，所述疾病选自癌症和肿瘤、传染病、免疫和/或自身免疫相关疾病、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病以及化学治疗相关疾病，所述方法包含给予该个体治疗有效量的权利要求40的化合物，外加药物可接受的赋形剂。
42.权利要求41的方法，其中所述癌症和肿瘤包含转移性肾癌、黑色素瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性髓细胞性白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤。
43.权利要求41的方法，其中所述传染病包含病毒性传染，包括慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
44.权利要求41的方法，其中所述免疫和自身免疫相关疾病包含组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
45.权利要求41的方法，其中所述中枢神经系统疾病包含阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症以及抑郁症。
46.权利要求41的方法，其中所述代谢疾病包含非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
47.预防或治疗个体疾病的方法，所述疾病选自创伤愈合、透析患者的贫血和/或骨质疏松症，所述方法包含给予该个体治疗有效量的权利要求40的化合物，外加药物可接受的赋形剂。
全文摘要
本发明涉及来源于IFNα－17基因核苷酸序列的包含新的SNP的新的多核苷酸、来源于天然野生型IFNα－17蛋白质的包含至少一个本发明SNP所致突变的新的多肽及其治疗用途。
文档编号A61K35/76GK1509337SQ02810219
公开日2004年6月30日 申请日期2002年4月23日 优先权日2001年4月24日
发明者J－L·埃斯凯利, J-L 埃斯凯利 申请人:吉恩奥迪塞公司