酿脓链球菌的表面蛋白的制作方法

专利名称：：酿脓链球菌的表面蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明总的涉及0-溶血性链球菌多肽和多核苷酸，具体是酿脓链球菌(&r印^cocc^;^oge77es)的多肽和多核苷酸。更具体地本发明涉及位于表面的酿脓链球菌的多肽，以及这些多肽的抗体。本发明还涉及编码酿脓链球菌的多肽的核苷酸序列，以及包括这些核苷酸序列的表达载体。本发明进一步涉及免疫原性组合物，和用于针对和减少e-溶血性链球菌感染的方法。本发明还涉及检测这些核苷酸和多肽以及在一个生物学样品中检测e-溶血性链球菌和酿脓链球菌的方法。
背景技术：
：传统的用于链球菌分类的表型标准包括溶血反应和Lancefield血清分群。然而，随着分类学的进展，现在已知不相关的e-溶血性(定义为在琼脂平板中羊的红血球的完全溶解)链球菌种类可产生相同的Lancefield抗原，而在种的水平上遗传相关的菌株可具有异源的Lancefield抗原。尽管对于传统的链球菌分类的规则有这些例外，溶血反应和Lancefield血清试验在临床分物的鉴定中仍可作为第一步用于将链球菌分成粗略的类别。Ruoff，K.L.，R.A.Whiley，和D.Beighton.1999.Streptococcus.P,R.Murray,E.J.Baron,M.A.Pfaller，F.C.Tenover,和R.H.Yolken(编)的临床微生物学手册(ManualofClinicalMicrobiology)美国微生物学出版协会AmericanSocietyofMicrobiologyPress,WashingtonD.C。具有Lancefield组A、C或G抗原的P-溶血性分离物可再细分为两组:大-菌落(直径>0.5mm)和小-菌落(直径<0.5mra)菌类。大-菌落-构成的组A(酿脓链球菌)、C、和G菌株是富有各种有效毒性机制的"化脓性"链球菌。无乳链球菌((Str印tococcusagalactiae)(组B)仍为Lancefield组B抗原的生产或其它表型性状可靠地鉴定。存在开发改进和预防由包括A、B、C和G类群的e-溶血性链球菌引起的感染的组合物和方法的需要。这些种类中的相似性不仅包括毒力因子，还包括疾病的表现形式。包含于后者中的是肺炎、关节炎、脓肿、鼻咽炎、子宫炎、产后脓毒病、新生儿败血病、伤口感染、脑膜炎、腹膜炎、蜂窝组织炎、脓皮病、坏死性筋膜炎、中毒性休克综合症、败血病、感染性心内膜炎、心包炎、肾小球肾炎和骨髓炎。酿脓链球菌是位于人的咽和皮肤上的革兰氏阳性双球菌，该位置充当这种生物的最初的储存器。作为一种专性寄生物，该细菌或者通过呼吸性分泌的直接接触或者通过手与口之间的接触传播。大多数的酿脓链球菌感染是相对轻微的疾病，例如咽炎或脓疱病。目前，仅在美国就有2000万到3500万咽炎的病例，约2亿美元用于看病和其它相关的费用。另外，例如风湿热、猩红热和肾小球肾炎等非化脓性后遗症产生于酿脓链球菌感染。在全球范围内，急性风湿热(ARF)是小儿心脏病最普遍的原因(文献条目1)。从最初进入的入口，咽和皮肤，酿脓链球菌可传播到不常发现细菌的身体其它部分，例如血液、深层肌肉和脂肪组织，或肺，并可引起侵害性的感染。侵害性酿脓链球菌疾病的最严重但最不普遍的两种形式是坏死性筋膜炎和链球菌中毒性休克综合症(STSS)。坏死性筋膜炎(媒体中描述为"吃肉的细菌")是肌肉和脂肪组织的破坏性的感染。STSS是一种引起对例如肾、肝和肺等内部器官休克和损伤的快速发展的感染。这些损伤许多是由于毒血症而不是由于细菌的生长造成的局部的损伤。在1995年，侵害性化脓链球菌感染和STSS开始批准为可报道的疾病。与无数患有咽炎和脓疱病的个体形成对比，美国疾病控制和防治中心(U.S.CentersforDiseaseControlandPrevention(CDC))批准的病例报道表明1997年在美国有15，000到20，000的侵害性酿脓链球菌疾病的病例，结果超过2，000人死亡(l)。其它的报道估计每年每100,000人中有高达10-20人患有侵害性疾病(62)。更具体地，在15,000到20，000个侵害性疾病的病例中，1，100到1，500个是坏死性筋膜炎的病例，1，000到1,400个是STSS病例，分别具有20%和60%的死亡率。还包含于严重的侵害性疾病的是肌炎病例，它具有80%到100%的致死率。另外具有其它形式的侵害性A组链球菌疾病的10%到15%的个体死亡。自从病例报告自1995年开始这些数字已经增加了，并反映出在过去的十年或二十年间出现的一个普遍的趋势。另外，人们通常认为病例定义的严格性导致较低的令人误解的数字，在这种情况下，由于在满足定义前的早期诊断和治疗使许多病例得以成功治愈。当酿脓链球菌保持对青霉素及其衍生物敏锐的敏感性时，治疗不需要根除有机体。尽管使用了抗生素疗法，大约5%到20%的人群保持取决于季节的载体(62)。这个理由不完全清楚，可能涉及各种机制。在严重的侵害性感染的情况下，治疗通常需要侵略性的外科介入。对于那些涉及STSS或相关疾病的病例，氯洁霉素(一种蛋白质合成抑制剂)是优选的抗生素，由于它很好地渗透组织并防止外毒素的产生。有一些对于四环素、磺胺和最近的红霉素的抗性的报道。无疑地，仍需要预防和治疗e-溶血性感染的组合物。对于酿脓链球菌已鉴定了大量的毒力因子，一些分泌的和一些位于表面的。虽然它是包被的，被膜由透明质酸组成，并且不适合作为包含于免疫原性组合物的候选抗原，因此它通常由晡乳动物细胞表达并是非免疫原性的(14)。T抗原和碳水化合物类群是其它候选者，但也可对心脏组织发出交叉反应抗体。脂磷壁质酸存在于酿脓链球菌表面，但与LPS相似提高了人们对其安全性的关注。由于它们结构相似，最丰富的表面蛋白属于被称做M或"M-样"蛋白的蛋白质家族。而这一类别的成员在抑制吞噬作用中具有相似的生物学作用，它们各个具有独特的基质结合特性。这一家族中最具特色的蛋白质是螺旋状M蛋白。指向同源的M菌株的抗体显示出调理性和保护性(12、13、16)。M蛋白作为候选抗原使用的复杂化是由于大约100种不同血清型的M蛋白被鉴定具有更多不能归类的种类的事实。典型地，頂类型的血清型，通过血清型M1、M3、M6、M12和M18举例说明，与咽炎、猩红热和风湿热有关，并不表达免疫球蛋白结合蛋白。IIM类型的血清型，例如M2和M49与更普遍的局限性皮肤感染和后遗症的肾小球肾炎有关，并不表达免疫球蛋白结合蛋白(54)。注意到M血清型的异源性交叉反应的抗体如果有，也是很少的是重要的。同等重要的是这些抗体在风湿热种所起的作用。引发抗体与宿主心脏组织交叉反应的M蛋白质的具体部位引起或至少与细胞的损伤相关(ll，57)。M和M-样蛋白属于表面局部蛋白的一个大家族，它由分类酶(sortase)-定向的LPXTG基序定义(38,64)。该基序，位于蛋白质的羧基末端附近，首先在LPXTG基序的苏氨酸和甘氨酸残基之间由分类酶酶切。一旦酶切，蛋白质通过苏氨酸的羧基与肽聚糖中的氨基酸交联桥的游离酰氨基共价连接，因此永久地将蛋白粘附在细菌细胞的表面上。包含于这一分类酶-定向蛋白家族的是C5a肽酶(6，7)、纤连蛋白的粘附素(9、19、23、24)、玻连蛋白、和IV型胶原蛋白、和其它结合纤溶酶原、IgA、IgG和清蛋白的M-样蛋白质(31)。已描述了许多分泌蛋白，其中一些被认为是毒素。大多数酿脓链球菌从严重的侵害性疾病的病例中分离，并且链球菌中毒性休克综合症(STSS)产生链球菌致热性外毒素(SPE)A和C(8)。在Oklahoma大学也已完成了基因组酿脓链球菌序列中其它致热性外毒素的鉴定，提交给GenBank并确定编号为AE004092，并已表征(55)。其它毒素例如毒性休克样综合症毒素、链球菌超抗原(58)和有丝分裂因子(66)在疾病中起较小的限定作用。链球菌溶血素O也可被考虑为一种可能的候选抗原，因为它引起IL-e的释放。另外，还鉴定了各种分泌的酶，它包括半胱氨酸蛋白酶(35，37)、链激酶(26，48)和透明质酸酶(27，28)。给出己知由酿脓链球菌生产的毒力因子的数目，很清楚成功的P-溶血性链球菌的免疫原性组合物的重要特征是其刺激在感染过程中预防或限制早期的定居的反应的能力。该保护反应或者阻止粘着和/或通过调理吞噬作用增加细胞的清除。已显示M蛋白的抗体具有调理素的作用，并以大致相似的方式提供克服蛋白质抗吞噬特性的机制(30),以这种方式抗-血清型B荚膜抗体证实防止由流感嗜血杆菌B(泡柳o;M^s众/7wewaeB)引起的疾病(36)。另外，对蛋白质F具有特异性的抗体显示阻止粘附并由组织培养细胞内在化(34)。仍需要进一步鉴定免疫原性组合物，和预防或改善e-溶血性链球菌集群或感染的方法。还需要进一步鉴定酿脓链球菌的表面蛋白和编码酿脓链球菌多肽的多核苷酸。还需要检测P-溶血性链球菌和酿脓链球菌集群和感染的方法。发明综述为了满足这些和其它需要，和鉴于其目的，本发明提供预防或改善e-溶血性链球菌集群和感染的组合物和方法。本发明还提供酿脓链球菌多肽和多核苷酸、重组材料和它们生产的方法。本发明的另一方面涉及使用这种酿脓链球菌的方法多肽和多核苷酸的方法。本发明的多肽包括含有任何一个偶数的SEQIDN0S:2-668中的至少一个氨基酸序列的分离的多肽。本发明还包括对于任何一个偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列具有至少70%的同一性的氨基酸序列，以及任何偶数的SEQIDN0S:2-668中氨基酸序列的成熟的多肽。本发明进一步包括这些多肽的免疫原性片段和生物等价物。还提供的是与本发明的多肽免疫特异性结合的抗体。本发明的多核苷酸包括含有编码本发明的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸。这些多核苷酸包括含有任何一个奇数的SEQIDN0S:1-667中的至少一个核苷酸序列的分离的多核苷酸，作为遗传密码简并的结果还包括其它的核苷酸序列，该核苷酸序列还编码本发明的多肽。本发明还包括含有核苷酸序列的分离的多核苷酸，该核苷酸序列与编码本发明的多肽的核苷酸序列具有至少70%的同一性，分离的多核苷酸含有与奇数的SEQIDN0S:1-667中的任何核苷酸序列具有至少70%的同一性的核苷酸序列。另外，本发明分离的多核苷酸包括在严格杂交条件下与编码本发明的多肽的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，在严格杂交条件下与任何奇数的SEQIDN0S:1-667的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，和与这些多核苷酸完全互补的核苷酸序列。而且，本发明包括含有这些多核苷酸的表达载体和宿主细胞。本发明进一步提供生产本发明多肽的方法。在一个实施例中，该方法包括步骤(a)在适合于产生本发明多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞和(b)从培养物中回收多肽。本发明还提供兔疫原性组合物。在一个实施例中，该免疫原性组合物含有至少一种成分的免疫原性的量，该成分含有在一个易感哺乳动物中预防或改善0-溶血性链球菌集群或感染的有效量的本发明的多肽。该成分可含有多肽本身，或可含有多肽和任何其它物质(例如一种或多种化学试剂、蛋白质等)，该物质可辅助P-溶血性链球菌集群或感染的预防和/或改善。这些免疫原性组合物可进一步含有与肽、多肽或蛋白质或多糖任选地结合或连接的至少一部分多肽。在另一个实施例中，该免疫原性组合物含有包含本发明的多肽的成分的免疫原性的量，该成分具有在易感哺乳动物中预防或改善P-溶血性链球菌集群或感染的有效的量。该成分可含有多核苷酸本身，或可含有多核苷酸和任何其它物质(例如一种或多种化学试剂、蛋白质等)，该物质可辅助e-溶血性链球菌集群或感染的预防和/或改善。在另一个实施例中，该免疫原性组合物含有包含本发明的多核苷酸的载体。本发明的免疫原性组合物还可包括有效量的佐剂。本发明还包括保护易感哺乳动物免遭e-溶血性链球菌集群或感染的方法b在一个实施例中，该方法包括给予哺乳动物有效量的含有免疫原性量的本发明的多肽的免疫原性组合物，其量可有效预防或改善易感哺乳动物中e-溶血性链球菌的集群或感染。在另一个实施例中，该方法包括给予哺乳动物有效量的含有本发明的多肽的免疫原性组合物，其量可有效预防或改善易感哺乳动物中0-溶血性链球菌的集群或感染。本发明的免疫原性组合物可通过常规途径给予，例如通过皮下或肌肉内注射、口服或通过鼻输入。本发明进一步包括在具有P-溶血性链球菌集群或感染的哺乳动物中至少减少e-溶血性链球菌的数量及其生长的组合物和方法。在一个实施例中，该组合物含有本发明的一个抗体。在另一个实施例中，该组合物含有能够阻止编码本发明的多肽的核苷酸序列表达的反义寡核苷酸。还提的是减少由P-溶血性链球菌感染在哺乳动物中引起的副作用的方法。在一个实施例中，该方法包括归于哺乳动物有效量的含有本发明的抗体的组合物，其量至少有效地减少哺乳动物中6-溶血性链球菌的数量和生长。在另一个实施例中，该方法包括给予哺乳动物有效量的含有能够阻遏编码本发明的多肽的核苷酸序列表达的反义寡核苷酸的组合物，其量至少有效地减少晡乳动物中P-溶血性链球菌的数量和生长。还提供的是检测和/或鉴别生物学样品中e-溶血性链球菌的方法。在一个实施例中，该方法包括(a)在允许互补碱基对杂交的条件下将生物学样品与本发明的多核苷酸接触，和(b)检测样品中杂交混合物的存在，其中杂交混合物的检测显示生物学样品中e-溶血性链球菌的存在。在另一个实施例中，该方法包括(a)在适合于免疫混合物形成的条件下将生物学样品与本发明的抗体接触，和(b)检测样品中免疫混合物的存在，其中免疫混合物的检测显示生物学样品中P-溶血性链球菌的存在。在另一个实施例中，该方法包括(a)在适合于免疫混合物形成的条件下将生物学样品与本发明的多肽接触，和(b)检测样品中免疫混合物的存在，其中免疫混合物的检测显示生物学样品中3-溶血性链球菌的抗体的存在。本发明进一步提供了免疫原性组合物。在一个实施例中，免疫原性组合物包含至少一种本发明的多肽。在另一个实施例中，免疫原性组合物含有至少一种本发明的多核苷酸。在另一个实施例中，免疫原性组合物含有至少一种本发明的抗体。还提供的是含有一个核苷酸序列的分离的多核苷酸，该核苷酸序列与编码本发明的多肽的核苷酸序列具有至少70%的同一性，多核苷酸通过如下步骤鉴定(a)获得衍生自编码任何SEQIDN0S:2-668的成熟多肽的核苷酸的第一和第二PCR引物，其中第一和第二引物能够在PCR条件下以向外的方式起始核酸合成，并且这里第一引物能够在反义方向延伸而第二引物能够在有义方向延伸，和(b)在适合于从第一和第二引物合成核苷酸序列的PCR条件下，将第一和第二PCR引物与含有多核苷酸的cDNA文库结合。本发明还提供使用聚合酶链反应(PCR)延伸本发明的多核苷酸的方法，该方法包括步骤(a)获得衍生自多核苷酸的第一和第二PCR引物，其中第一和第二PCR引物能够在PCR条件下以向外的方式其实核酸合成，并且这里第一PCR引物能够在反义方向延伸，而第二PCR引物能够在有义方向延伸，和(b)在适合于从第一和第二PCR引物合成核苷酸序列的PCR条件下，将第一和第二PCR引物与包含于cDNA文库的多核苷酸结合，从而延长多核苷酸。应理解前面一般的描述和下面详细的描述是示范性的，而不是限制本发明。附图的简要描述图1.描述可读框(ORF)鉴定的图示。图2.描述了用胰蛋白酶消化后酿脓链球菌的低压扫描电子显微照相(LV-SEM)，其中保持了细胞的完整性和平滑的单分子层存在。一条等于lnm。图3.描述用胰蛋白酶消化前和消化后酿脓链球菌的LV-SEM。A组显示(左边的组)胰蛋白酶消化前的细胞，其中细胞较大并显示表面物质。B组(右边的组)显示消化后的细胞，其中细胞较小并显示缺乏任何表面蛋白。一条等于lura。图4.描述由0RF218编码的酿脓链球菌表达蛋白的LV-SEM。图5.描述由0RF554编码的酿脓链球菌表达蛋白的LV-SEM。图6.描述由0RF1191编码的酿脓链球菌表达蛋白的LV-SEM。图7.描述由ORF2046编码的酿脓链球菌表达蛋白的LV-SEM。图8.描述由0RF2601编码的酿脓链球菌表达蛋白的LV-SEM。图9.描述由ORF1316编码的酿脓链球菌表达蛋白的LV-SEM。图10.描述由ORF1224编码的酿脓链球菌表达蛋白的LV-SEM。图11.描述一些酿脓链球菌菌株的PCR分析，以说明跨菌株的基因保守性。图12.描述选择的酿脓链球菌的ORF的定量PCR分析，以证实检验的所有ORF在体外和体内转录。图13.描述显示具有ORF基因产物的人血清活性的点印迹。图14.描述与其它SPE相比SPEI诱导兔脾细胞增殖的能力。图15.描述与由抗CD3抗体引起的剌激(中空的条带)相比，由SPEI诱导的人T细胞受体刺激(黑条带)图表。发明的详细描述本发明提供了改善和预防由包括A、B、C和G类群的所有e-溶血性链球菌引起的感染的组合物和方法。为了鉴定用于改善和预防由e-溶血性链球菌引起的感染的多核苷酸和多肽，使用两种策略——种基因组法和一种蛋白质法鉴定位于表面的酿脓链球菌蛋白。该基因组法包括使用一些设计用于鉴定和表征编码表面固定蛋白的基因的算法进行酿脓链球菌基因组的广泛的基因组分析。蛋白质法是进行鉴定存在于酿脓链球菌表面的蛋白质。依赖两种方法对于克服每一种方法的缺陷是重要的。基因组寻找(mining)提供遗传能力，但是对于实际的表型表达给出很少的信息。相反，蛋白分析鉴定固定于细胞表面的实际的蛋白质，但是蛋白质表达可被调节，并且在培养细菌细胞的特定条件下可影响鉴定的蛋白质组。结合基因组和蛋白质法的结果，并且感兴趣的ORF被分类为四组中的一组(i)编码由蛋白质法鉴定的表面固定蛋白的ORF(表I，奇数的SEQIDNOS:1-147);(ii)编码推定的脂蛋白的ORF(表II，奇数的SEQIDNOS:1-149-181，669);(iii)编码含有LPXTG基序的推定的多肽的ORF(表III，奇数的SEQIDNOS:183-187);和(iv)编码其它推定的表面固定多肽的ORF(表IV，奇数的SEQIDNOS:189-667)。包含于表I-IV中的0RF是非重复的，即表I-IV列出的每一个ORF出现一次，尽管许多ORF拥有与另一个表相配的特征。因此，例如，列于表I中的ORF(由蛋白质法鉴定的编码表面固定蛋白的ORF)也可在一个或多个表II-IV中分类，但是它们不包含于那些表中。表I.编码由蛋白质法鉴定的表面固定蛋白的可读框(ORF)SECJIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SE(3IDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SBQ1DNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:I(ORF66)3(ORF102)5(ORF145)7(ORF232)9(ORF238)II(ORF436)13(ORF516)15(ORF554)17(ORF589)19(ORF661)21(ORF668)23(ORF678)25(ORF704)27(ORF743)29(ORF825)31(ORF850)33(ORF934)35(ORF993)37(ORF1036)39(ORF1140)41(ORF1157)43(ORF1191)45(ORF1218)47(ORF1224)49(ORF1234)SEQIDNO:51(ORF1237)SB3IDNO:53(ORF1238)SEQIDNO:55(ORF1253)SEQIDNO:57(ORF1284〉SEQE)NO:59(ORF1316)SEQIDNO:61(ORF1330)SEQIDNO:63(ORF1358)SEQIDNO:65(ORF1487)SEQIDNO:67(ORF1495)SEQIDNO:69(ORF1557)SEQIDNO:71(ORF1638)SEQIDNO:73(ORF1650)SEQIDNO:75(ORF1654)SEQE)NO:77(ORF1659)SEQIDNO:79(ORF1698)SEQIDNO:81(ORF1788)SEQIDNO:83(ORF1794)SEQIDNO:85(ORF1816)SEQIDNO:87(ORF1818)SEQIDNO:89(ORF1819)SEQIDNO:91(ORF1850)SEQIDNO:93(ORF1854)SEQIDNO:95(ORF1878)SEQIDNO:97(ORF1902)SEQIDNO:99(ORF1943)SEQIDNO:101(ORF1975)SEQIDNO:103(ORF2019)SEQIDNO:105(ORF2064)SEQIDNO:107(ORF2086)SEQIDNO:109(ORF2106)SEQIDNO:111(ORF2116)SEQIDNO:113(ORF2120)SEQIDNO:115(ORF2123)SEQIDNO:117(CF2202)SEQIDNO:119(ORF2214)SEQIDNO:121(ORF2330)SEQIDNO:123(ORF2354)SEQIDNO:125(ORF2377)SEQIDNO:127(ORF2379)SEQIDNO:129(ORF2387)SEQIDNO:131(ORF2417)SEQIDNO:133(ORF2420)SEQIDNO:135(ORF2422)SEQIDNO:137(ORF2450)犯QIDNO:139(ORF2459)SBQIDNO:141(ORF2477)SEQIDNO:143(ORF2586)SEQIDNO:145(ORF2593)SEQIDNO:147(ORF2601)表n.编码推定的脂蛋白SEQIDNO:149(ORF68)SEQIDNO:151(ORF309)SEQIDNO:153(ORF347)SEQIDNO:155(ORF540)SEQIDNO:157^ORF601)SEQIDNO:159(ORF664)叮读框(ORF)SEQIDNO:161(ORF685)SEQIDNO:163(ORF729)SEQIDNO:165(ORF747)SEQIDNO:167(ORF1202)SEQIDNO:169(ORF1723)SEQEDNO:171(ORF1755)SEQIDNO:173(ORF1789)SEQIDNO:V75(ORFl幼2)SEQIDNO:177<ORF1918)SEQIDNO:179(ORFl诉3)SEQIDNO:181(ORF2452)SEQIDNO:669(ORF1664)表III.编码含有LPXTG基序的推定的多肽可读框(ORF)。SEQIDNO:183(ORF433)SBQIDNO:185(ORF967)SEQIDNO:187(ORF2497)表IV.编码其它推定的表SEQIDNO:189(ORF4)SEQIDNO:191(ORF5)犯QBDNO:193(ORF11)犯QIDNO:195(ORF17)SEQIDNO:197(ORF18)SEQIDNO:199(ORF20)SEQIDNO:201(ORF25)SEQIDNO:203(ORF49)SEQIDNO:205(ORF64)SEQIDNO:207(ORF65)SEQIDNO:209(ORF67)SEQIDNO:211(ORF69)SEQIDNO:213(ORF72)SEQIDNO:215(ORF73)SEQIDNO:217(ORF75)SEQIDNO:219(ORF98)SEQ1DN0:221(0RF99)SEQIDNO:223(ORF130)SEQIDNO:225(ORF133)SEQIDNO:227(ORF141)SEQIDNO:229(ORF151)SEQIDNO:231(ORF165)SEQIDNO:233(ORF172)SEQIDNO:235(ORF184)SEQIDNO:237(ORF189)SEQIDNO:239(ORF199)SEQIDNO:241(ORF209)SEQIDNO:243(ORF218)SEQIDNO:245(ORF220)SEQIDNO:247(ORF223)SEQIDNO:249(ORF227)固定多肽的可读框(ORF)。SEQIDNO:349(ORF741)SEQIDNO:351(ORF754)SEQIDNO:353(ORF774)SEQIDNO:355(ORF783)SEQIDNO:357(OFF788)SEQIDNO:359(ORF805)SEQIDNO:361(ORF814)SEQIDNO:363(ORF818)SEQIDNO:365(ORF844)SEQIDNO:367(ORF848)SEQIDNO:369(ORF858)SEQIDNO:371(ORF859)SEQIDNO:373(ORF860)SEQIDNO:375(ORF871)SEQIDNO:377(ORF877)SEQIDNO:379(ORF896)SEQIDNO:381(ORF908)SBQIDNO:383(ORF909)SEQIDNO:385(ORF910)SEQIDNO:387(ORF920)SEQIDNO:3的(ORF921)SEQIDNO:391(ORF926)SEQIDNO:393(ORF928)SEQIDNO:395(ORF929)SEQIDNO:397(ORF933)犯QIDNO:399(ORF952)SEQIDNO:401(ORF961)SEQIDNO:403(ORF975)SEQIDNO:405(ORF983)SEQIDNO:407(ORF991)S3SQIDNO:409(ORF1015)SEQIDNO:251(ORF241)SEQIDNO:253(ORF252)SEQIDNO:255(ORF264)SEQID1^0:257(ORF265)SEQIDNO:259(ORF291)SEQIDNO:261(ORF292)SEQIDNO:263<ORF306)SEQEDNO:265(ORF307)SEQIDNO:267(ORF313)SEQIDNO:269(ORF350)SEQIDNO:271(ORF352)SEQIDNO:273(ORF353)SEQIDNO:275(ORF368)SEQIDNO:277(ORF401)SEQIDNO:411(ORF1018)SEQIDNO:413(OkF1020)SEQIDNO:415(ORF1021)SEQIDNO:417(ORF1026)SEQEDNO:419(ORF1058)SEQIDNO:421(ORF1110)SEQIDNO:423(ORF1132)SEQIDNO:425(ORF1152)犯QIDNO:427(ORF1156)SEQIDNO:429(ORF1188)SEQIDNO:431(ORF1200)SEQIDNO:433(ORF1203)SEQIDNO:435(ORF1205)SEQIDNO:437(ORF1210)SEQIDNO:509(ORF1682)SEQIDNO:511(ORF1683)SEQIDNO:513(ORF1720)SEQIDNO:515(ORF1725)SEQIDNO:517(ORF1726)SEQIDNO:519(ORF1732)SEQIDNO:521(ORF1736)SEQIDNO:523(ORF1771)SEQIDNO:525(ORF1772)SEQIDNO:527(ORF1775)SEQIDNO:529(ORF1776)SEQIDNO:531(ORF1777)SEQIDNO:533(ORF1783)SEQEDNO:535(ORF1785)S￡QIDNO:537(ORF1786)SEQEDNO:539(ORF1814)SEQIDNO:541(ORF1820)SEQIDNO:543(ORF1828)SEQIDNO:545(ORF1833)SEQIDNO:547(ORF1834)SEQIDNO:549(ORF1839)SEQIDNO:551(ORF1873)SEQIDNO:553(ORF1875)SEQIDNO:555(ORF1876)SEQIDNO:557(ORF1888)犯QIDNO:559(ORF1909)SEQIDNO:561(ORF1917)SEQIDNO:563(ORF1931)SEQIDNO:565(ORF1970)SEQIDNO:567(ORF1972)SEQIDNO:鄉(ORF1979)SEQIDNO:571(ORF1987)SBQIDNO:573(ORF1993)SEQIDNO:575(ORF2013)SEQIDNO:577(ORF2014)SEQIDNO:579(ORF2015)SEQIDNO:581(ORF2020)SEQIDNO:583(ORF2023)SEQIDNO:585(ORF2046)SEQIDNO:587(ORF2048)SEQIDNO:589(ORF2050)SEQIDNO:591(ORF2069)SEQIDNO:593(ORF2070)SEQIDNO:595(ORF2091)SEQIDNO:597(ORF2148)SEQIDNO:279(ORF405)SEQIDNO:281(ORF421)SEQIDNO:283(ORF491)SEQIDNO:285(ORF510)SEQIDNO:287(ORF511)SEQIDNO:289(ORF519)SEQIDNO:291(ORF523)SEQIDNO:293<ORF535)SEQIDNO:295(ORF551)SEQIDNO:297(ORF567)SEQIDNO:299(ORF570)SEQIDNO:301(ORF594)SEQIDNO:303(ORF597)SEQIDNO:305(ORF602)SEQIDNO:307(ORF613)SEQIDNO:309(ORF627)SEQIDNO:311(ORF639)SEQIDNO:313(ORF644)SEQIDNO:315(ORF650)SEQIDNO:317(ORF653)SEQIDNO:319(ORF665)SEQIDNO:321(ORF670)SEQIDNO:323(ORF671)SEQNO:325(ORF672)SEQIDNO:327(ORF674)SEQIDNO:329(ORF676)SEQIDNO:331(ORF688)SEQIDNO:333(ORF699)SEQIDNO:335(ORF702)SEQIDNO:337(ORF705)SEQIDNO:339(ORF706)SEQIDNCh341(ORF721)SEQIDNO:343(ORF731)SEQIDNO:345(ORF733)SEQIDNO:347(ORF737)SEQIDNO:439(ORF1216)SEQIDNO:441(ORF1228)SEQIDNO:443(ORF1231)SEQIDNO:445(ORF1265)SEQIDNO:447(ORF1267)SEQIDNO:449(ORF1269)SEQIDNO:451(ORF1272)SEQIDNO:453(ORF1275)SEQIDNO:455(ORF1292)SEQIDNO:457(ORF1300)SEQIDNO:459(ORF1310)SEQIDNO:461(ORF1311)SEQIDNO:463(ORF1318)SEQIDNO:465(ORF1321)SEQIDNO:467(ORF1362)SEQIDNO:469(ORF1395)SEQIDNO:471(ORF1497)SEQIDNO:473(ORF1500)SEQIDNO:475(ORF1512)SEQIDNO:477(ORF1513)SEQIDNO:479(ORF1525)SEQIDNO:481(ORF1527)SEQIDNO:483(ORF1548)SEQIDNO:485(ORF1573)SEQIDNO:487(ORF1585)SEQIDNO:489(ORF1586)SEQIDNO:491(ORF1593)SEQIDNO:493(ORF難)SEQBONO:495<ORF1661)SEQIDNO:497(ORF1667)SEQIDNO:499(ORF1671)SEQIDNO:501(ORF1672)SEQIDNO:503(ORF1678)SEQIDNO:505(ORF1680〉SEQIDNO:507(ORF1681)SEQIDNO:599(ORF2170^SEQIDNO:601(ORF2201)SEQIDNO:603(ORF2222)SEQIDNO:605(ORF2231)SEQIDNO:607(ORF2236)SEQIDNO:609(ORF2240)SEQIDNO:611(ORF2245)SEQIDNO:613(ORF2247)SEQIDNO:615(ORF2250)SEQIDNO:617(ORF2258)SEQIDNO:619(ORF2266)SEQIDNO:621(ORF2273)SEQIDNO:623(ORF2289)SEQIDNO:625(ORF2291)SEQIDNO:627(ORF2300)SEQIDNO:629(ORF2319)SEQIDNO:631(ORF2342)SEQIDNO:633(ORF2391)SEQIDNO:635(ORF2398)SEQIDNO:637(ORF2399)SEQIDNO:639(ORF2411)SEQIDNO:641(ORF2414)SEQIDNO:643(ORF2428)SEQIDNO:645(ORF2429)SEQIDNO:647(ORF2437)SEQIDNO:649(ORF2457)SEQIDNO:651(ORF2458)SEQIDNO:653(ORF2473)SEQIDNO:655(ORF2482)SEQIDNO:657(ORF2488)SEQIDNO:659(ORF2508)SEQIDNO:661(ORF2521)SEQIDNO:663(ORF2534)SEQIDNO:665(ORF2562〉SEQIDNO:667(ORF2583)基因组法完全细菌基因组序列的有效性普遍地在通过基因组法、转录做图、和蛋白质法结合生物信息学的信息加工能力鉴定免疫原性组合物的候选物中起重要作用(39-41，53，60，65)。基因组法以在从Oklahoma大学的网站下载的酿脓链球菌的未注明的序列中鉴定可读框(0RF)开始。有报道该基因组序列被提交给GenBank并指定编号为AE004092。报道菌株MlGAS被提交给ATCC并给与编号为ATCC700294。本文定义的ORF具有三个可能的起始位点密码子ATG、GTG或TTG中的一个，以及三个可能的终止密码子TM、TAG或TGA中的一个。使用ORF的这一定义，分析酿脓链球菌的基因组以使用三种0RF探测器算法""GLIMMER(59)、GeneMark(34)和由发明者的受让人开发的算法鉴定0RF。通常使用全部三种算法鉴定736个0RF。不同0RF探测器之间结果的差异主要归因于由各个程序使用的具体的起始密码子，然而，Glimmer还掺入一些对SD筐(Shine-Dalgarnobox)的评价。给予所有具有共同的终止密码子的0RF以相同的0RF名称，并好象它们是相同的ORF—样进行处理。为了评价测定的0RF的精确性，使用一种本领域已知作为离散的余弦变换(DiCTion)的离散的数学余弦函数以确定每个0RF的得分。一个具有DiCTion得分〉1.5的0RF被认为具有编码蛋白质产物的较高的概率。由三种找寻0RF的算法预测的0RF的最短长度确定为225个核苷酸(包括终止密码子)，它将编码具有74个氨基酸的蛋白质。作为对剩余的0RF的最后的寻找，使用tBLASTn针对公共蛋白质数据库寻找>75个核苷酸所有非编码区以鉴定含有移码(42)或可在引起抗原变异中起作用的基因片段的基因区域。将这些剩余的0RF加入到获得的0RF中。由发明者的受让人开发的图解分析程序用于显示所有六个阅读框和预测的ORF相对于基因组序列的位置。这帮助除去与其它0RF具有大的重叠的0RF，尽管已知具有0RF完全嵌入其它0RF中的情况(25，33)。使用BLASTv.2.0Gapped检索算法、BLASTp进行这些酿脓链球菌0RF的最初的注解，以鉴定同源的序列。任何〈e—1()的界限"e"值被认为是显著的。还使用了其它检索算法，包括FASTA和PSI-BLAST。用于同源检索的非重复的蛋白质序列数据库包括GenBank、SWISS-PR0T、PIR和每天更新的TREMBL数据库序列。具有〉e-10的BLASTp结果的0RF被认为对于酿脓链球菌是唯一的。目前，细菌基因组中全部0RF的大约60%与其功能已经确定的蛋白质有一些匹配。剩余的约4(m的基因组0RF仍未表征。完全Blast结果的关键字检索使用已知或待检的候选靶基因以及鉴定蛋白质的位置或功能的词完成。另外，进行与最初的Blast结果相关的所有MEDLINE参考的关键字检索，以寻找关于0RF的额外的信息。关键字检索包括，例如，如下检索项:粘着因子；纤连蛋白；纤维蛋白原；胶原蛋白；转运蛋白；输出蛋白；细胞外的；转移酶；表面；和粘合的。0RF的Blast分析导致列出的1005个0RF未分类，284个0RF似乎对酿脓链球菌具有特异性，因为它们仅用从这种有机体获得的蛋白质产生Blast相似性，和676个0RF与Medline参考有关。对于DNA分析，鉴定了各个基因中的先G+C的含量。计算一个ORF的％G+C含量作为一个0RF中所有密码子的第三个核苷酸位置的(G+C)含量。对于所有在有机体中发现的0RF，报告的值是不同于获得的这种值的算术平均值的值。认为绝对值》8对于进一步分析是重要的，由于这些0RF正如从"pj^orj'获得的cag致病性岛的情况中所显示的可从水平转移中出现(2)，一种保持许多其它的致病性岛的模式(22)。其G+C含量显著不同的ORF总数为289个。进一步测定这些0RF对毒力因子的相似性，该毒力因子通过水平转移从另一个有机体中获得。使用一些参数以确定预测蛋白质的分配。用于跨细胞质膜易位的蛋白质编码前导信号(也称做前导序列)，该前导信号包括以带正电荷的残基在N-末端位于侧面的中央疏水性区域(56)。使用程序SignalP鉴定信号肽和它们的酶切位点(46)。在表达过程中，信号肽被酶切以产生成熟的肽。另外，为了在细菌中预测蛋白质的位置，使用软件PS0RT(44)。PSORT使用神经网络算法预测细胞质、外周胞质、和/或革兰氏阳性菌的细胞质膜以及革兰氏阴性菌的外膜中的蛋白质位置。PS0RT鉴定预测的40个0RF暴露于细胞的表面(表V)。表V.编码推定的胞外蛋白的可读框(0RF)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>另外，使用软件程序TopPred2分析蛋白质的跨膜结构域。该程序预测疏水性的蛋白质区域，它可潜在地跨越双分子脂膜。使用TopPred2分析蛋白质疏水性区域，该区域可潜在地跨越鉴定的48个0RF的双分子脂膜，该0RF编码具有三个或更多的跨膜结构域的推定的蛋白(表VI)，并因此认为与膜结合。表VI.编码具有三个或更多跨膜结构域的推定的蛋白的可读框(ORF)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>使用多顺序的蛋白质结构域或保守的蛋白质区域的隐藏马尔可夫模型(HiddenMarkovModel)(HMM)Pfam数据库(61)鉴定可能属于现存的蛋白质家族的酿脓链球菌的蛋白质。该结果检索的关键字用于鉴定可能由Blast检索标准遗漏的蛋白质。HMM模型也是由发明者的受让人开发。开发了一种计算机算法，HMMLipo，以使用132个生物学表征的非-酿脓链球菌细菌脂蛋白从超过30个有机体中预测脂蛋白。这一训练组从试验证实的原核生物的脂蛋白产生。NMMLipo鉴定的30个ORF是推定的脂蛋白(表VII)。表VII.编码推定的脂蛋白的可读框(ORF)68601747165917891983309678115716641818241734768512021723翻245254070412841755188224595547291495178819182601另外，预测15个ORF具有LPXTG基序并被分类为可由分类酶定向的蛋白质(表VIII)。表VIII.编码推定含有LPXTG基序的蛋白质的可读框(ORF)433121818542450608131620192477967133024342497119116982446SEQIDN0S:669-674分别含有蛋白质Grab(ORF608)、M蛋白(ORF2434)和ScpA(0RF2446)的核苷酸和氨基酸序列。而且，使用约70个已知含有LPXTG细胞壁分类信号的原核细胞的蛋白质，开发一种HMM以预测锚定在肽聚糖层的细胞壁蛋白(38，45)。使用的模型不仅是LPXTG序列，还包括下游序列的两个部分，疏水性跨膜结构域和带正电荷的羧基末端。由于它们独立于分类酶以非共价的方式与肽聚糖层潜在地结合，5个蛋白质被鉴定(表IX)。表IX.编码推定肽聚糖结合蛋白的可读框(ORF)8981569167522662311还评价了由鉴定的ORF编码的蛋白质的其它特征。一个串联的重复探测器鉴定含有例如在MACRAMM中发现的那些重复的DNA序列和脑膜炎奈瑟球菌的相转变表面蛋白的0RF。发现23个编码含有这种重复区域的蛋白质的0RF(表X)。表X.编码推定含有重复区域的蛋白质的可读框(ORF)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>另外，含有Arg-Gly-Asp(RGD)附着基序的蛋白质，以及用作它们的受体的整合蛋白构成细胞粘着的主要识别系统。RGD识别是一种通过微生物使用的机制，以获得进入真核生物的组织(29，63)。鉴定了65个编码含有RGD的蛋白质的0RF。表XI.编码推定含有RGD基序的蛋白质的可读框(ORF)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>基因组分析和0RF鉴定结果的图表显示描述与图1中。蛋白质法如上所述，蛋白质法也用于鉴定酿脓链球菌的表面固定蛋白。为了鉴定仅固定于细胞表面的那些蛋白质，用胰蛋白酶小心制备和消化酿脓链球菌的细胞。在加入胰蛋白酶前和消化完成时取出细胞样本，通过活菌计数和LV-SEM测定细胞的完整性。消化后，未处理的细胞明显地聚集和附着在试管的侧面，而处理的细胞形成均匀的细胞悬浮液。活菌计数显示样品之间没有明显差异，实际上由于未处理细胞的聚集处理的细胞的活菌计数稍高。LV-SEM证实了这一结果(图2)。消化的细胞均匀地和个别地分布于盖片上，而未处理的细胞显示大块的细菌。高度放大的未处理的细菌细胞的局部解剖测定显示大量典型的酿脓链球菌的表面物质。然而，当细胞显示赤裸并缺乏任何表面物质时，胰蛋白酶消化的样品中的各个细胞显示所有可观察的表面蛋白的减少。图3描述了用胰蛋白酶消化酿脓链球菌前(左边的组，A组)和后(右边的组，B组)的LV-SEM。细胞用胰蛋白酶消化前(A组)较大并显示表面物质。LV-SEM的消化后的细胞的B组)较小并显示缺乏任何表面蛋白。为了鉴定复合的表面消化混合物的肽的成分，使用一种分析技术在大浓度的范围内分离和测定具有高度敏感性的多肽的序列。已显示串联质谱仪(MS/MS)是分析凝胶和溶液中的蛋白质的有力的方法(17)。MS/MS首先使用质量分析仪从离子混合物中分离肽离子，然后使用第二步或质量分析仪活化和解离感兴趣的离子。这一方法，被称做碰撞诱导解离(C:ID)，引起在氨基酸之间的肽键处肽解离为片段，并因此使用肽的断裂模式确定其氨基酸序列。另外，使用SEQUEST计算机算法针对蛋白质或翻译的核苷酸序列数据库直接寻找试验断裂光谱。对于大小超过约800-900Da的肽，一个单一的光谱可专一地鉴定一种蛋白质。为了从复合的混合物中测定多肽的序列，反向层析系统与电喷射离子阱质谱仪结合使用。在这一系统中，已知通过使流速和柱的直径最小化浓縮洗脱体积并指导尽可能多的柱流出液进入质谱仪的检测口以获得高的敏感性(下至次-飞摩尔(sub-femtomole)水平)。最初的试验使用1%乙腈/分钟的反相梯度分离肽。为了提高层析分离，后来使用下至0.28%乙腈/分钟的较长的梯度，和较慢的流速(50n1/分钟)。为了最大化存在于样品中的蛋白质的优势度，使用依赖数据获得的离子阱的特征。一旦对于具体的m/z值获得光谱，便使用动态排阻法预防离子的串联质谱的重新获得。同位素排阻功能排除与从定名为MS/MS的离子列表中获得的肽的同位素"C相关的离子。选择一个3-u质量宽度窗用于这一目的。使用这些依赖数据的特征大大提高了选择用于CID分析的肽离子的数量。上文描述的LC-MS/MS数据获得条件典型地导致每次运行中超过2000个肽离子的断裂数据。使用SEQUEST算法，针对含有从酿脓链球菌翻译的ORF的组成的蛋白质序列数据库检索这一数据，该酿脓链球菌与非重复的蛋白质序列数据库OWL结合。使用的SEQUEST检索条件改善胰蛋白酶的选择能力，并允许对甲硫氨酸差异地检索+16Da以解释甲硫氨酸氧化的原因。由SEQUEST鉴定的后选的配比使用如下人工方法证实。选择那些具有大于2.5的Xcoit值(试验的ms/ms数据于从序列数据库产生的数据的相似性的测定)和大于0.1的delCn值(delCn测定第一和第二配比的Xcorr值之间的正常差异)的配比用于进一步的分析。检査从好的配比中获得的断裂光谱的合理的信号/噪声，并测定配比离子的列表的合理的连贯性。如果由相同的样品产生其它证实ms/ms的数据，那么包括单独不被接受的一些配比。通过这一蛋白质法获得的PRF显示于表XII中。鉴定了65个编码含有RGD的蛋白质的0RF。表XII.由胰蛋白酶消化鉴定的可读框(ORF)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>一些鉴定的0RF被克隆和表达。首先通过ELISA使用相同的制剂分析产生纯化蛋白质的小鼠抗血清的反应性，该制剂作为包被抗原用于小鼠免疫。为了定量酿脓链球菌的表面上的蛋白质表达，这些血清在全部细胞的ELISA中使用。为了限制特异性蛋白的蛋白质表达，全部酿脓链球菌细胞用免疫金标记并用LV-SEM观察。对于某些鉴定的0RF，观察到编码的蛋白质以依赖于生长阶段的方式表达(对数中期(mid-log)对静止期)。这一类的例子是0RF218(图4)、ORF554(图5)和ORF1191(图6)。在某些情况下，对数生长中期中表达水平较高，而其它的情况是静止的细胞中表达较多。由其它ORF编码的蛋白质不论生长阶段如何以较低水平表达(ORF2064、2601和1316)(分别显示于图7-9中)，而其它蛋白质独立于生长阶段以高水平表达(ORF1224)(图10)。由于已知抗-C5a肽酶血清被表达和定位于酿脓链球菌的细胞壁上，它被用作一个阳性对照。所有的抗血清显示比各个预-免疫对照血清反应性提高。基因组法和蛋白质法的结合然后将表V-XII中鉴定的ORF归类为四组中的一组:编码由蛋白质法鉴定的表面固定蛋白的ORF(表I);编码推定的脂蛋白质的ORF(表II);编码含有LPXTG基序的推定的多肽的ORF(表III);和编码其它推定的表面固定多肽的ORF(表IV)。前面提供了表I-IV。应该很明显包含于表I-IV中的ORF是非重复的，即，在表I-IV中列出的各个ORF仅出现一次，尽管许多0RF拥有与另一个表匹配的特征。表I的核苷酸序列编码通过蛋白质法鉴定的多肽为表面固定的酿脓链球菌的蛋白。表II-IV的核苷酸序列编码由描述的基因组法鉴定的推定的多肽为表面固定的酿脓链球菌的蛋白。具体地，表II的核苷酸序列编码推定的蛋白，表III的核苷酸序列编码具有LPXTG细胞壁分类信号的推定的蛋白，表IV的核苷酸序列编码包括至少一个或几个如本文描述的标准的推定的表面固定蛋白，包括与其它其功能和细胞位置已事先鉴定的蛋白的相似性，与一个蛋白质家族相匹配(例如Pf卿)，和跨膜结构域的结合分析，Psort和sigP的值，和预测的蛋白质的分子量。基数的SEQIDN0S:1-667中的每一个编码依照核苷酸序列连续编号的氨基酸序列。这样，例如，SEQIDN0:1的核苷酸序列编码SEQIDN0:2的氨基酸序列，而SEQIDN0:3的核苷酸序列编码SEQIDN0:4的氨基酸序列等。多肽本发明提供表面固定的酿脓链球菌的多肽。具体地，本发明的多肽包括含有任何偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列的分离的多肽，即SEQIDN0:2，4,6，8，10，12，14，16,18,20，22，24，26,28，30，32，34，36，38，40，42,44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72;74，76，78，80，82，84，86，88，90，！32，94，96，98，100，102，104，106，108，110,112，114，116，118，120;122，124，126，128,130，132，134，136;138，140，142，144,146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260,262，264，266，268，270，272，274，276,278，280，282，284，286，288，290,292，294，296，298，300，302,304，306,308，310，312，314,316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336,338，340，342，344，346，348，350，352，354，356,358，360，362，364,366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386，388，390，392，394，396,398，400，402，404，406，408，410，412,414，416，418，420，422，424，426，428，430，432,434，436，438，440，442，444，446，448，450，452，454，456，458，460，462，464，466，468，470，472，474，476，478，480，482，484，486，488，490，492，494，496，498，500，502，504，506，508，510，512，514，516，518,520，522,524，526，528，530，532，534，536，538，540，542，544，546,548，550，552，554，556，558，560，562，564，566，568，570，572，574，576，578，580，582,584，586,588，590，592，594，596，598，600，602，604，606，608，610，612，614，616，618，620,622，624，626，628，630，632，634，636，638，640，642，644,646，648，650，652，亂脇，亂亂GS4，MG或亂本发明的多肽还包括基本上由上述氨基酸序列组成的分离的多肽以及由上述氨基酸序列组成的分离的多肽。术语"分离的"意为由人手改变自然状态。事实上如果一个"分离的"组合物或物质出现，它已被从其最初的环境中改变或除去，或两者皆有。例如，自然存在于活的动物体中的多肽或多核苷酸是不"分离的"但是从其自然状态共存的物质中分离的相同的多肽或多核苷酸是"分离的"，如本文使用的术语。如本文所使用的，术语"分离的"设想一种多肽(或其它成分)，该多肽从其自然原料中分离和/或使用重组技术制备。本发明的多肽序列可与偶数的SEQIDN0S:2-668中的参考序列相同，即100%相同，或者在与参考序列比较时它可包括某些整数数量的氨基酸改变，这样同一性%小于100%。这种改变包括至少一个氨基酸缺失、取代，包括保守的和非保守的取代，或插入。这种改变可在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置间的任何地方发生，或者在参考的氨基酸序列的氨基酸中单独地散布，或者散布于参考的氨基酸序列的一个或多个连续的基团中。因此，本发明还提供与包含于序列表中的氨基酸序列具有序列同一性的分离的多肽(即偶数的SEQIDN0S:2-668)。根据具体的序列，序列同一性的程度较佳地大于50%(例如60%，70%，80%，90%，95%，97%，99%或更高)。这些同源蛋白质包括突变体和等位基因变体。"同一性"，如本领域已知的，是通过序列比较确定的两种或多种多肽序列之间或两种或多种多核苷酸序列之间的关系。本领域中，"同一性"还指多肽或多核苷酸序列之间序列相关的程度，如通过这种序列串之间的配比确定的情况。"同一性"和"相似性"可通过已知的方法容易地计算，包括但不限于描述于文献中的那些方法(计算分子生物学(ComputationalMolecularBiology)，Usk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988;生物计算信息学和基因组计划，(Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects),Smith,D.W.编，学术出版社，纽约，1993;序列数据的计算机分析，部分.I,(ComputerAnalysisofSequenceData,PartI)，Griffin,A.M.,和Griffin,EG.编，Humana出版社，新泽西，1994;分子生物学的序歹U分析(SequenceAnalysisinMolecularBiology),vonHeinje，G.，学术出版社，1987;和序列分析引物(SequenceAnalysisPrimer,Gribskov，M.和Devereux，J.编，MStockton出版社，纽约，1991;和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAMJ.应用数学(AppliedMath.)，48:1073(1988)。设计确定同一性的优选的方法以获得检测的序列之间的最大的匹配。在公开获得的计算机程序中编纂确定同一性和相似性的方法。在两个序列之间确定同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN、HFASTA(Altschul，S.F.等，1990。BLASTX程序是从NCBI和其它来源公开购得的(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBINLMNIHBethesda,Md.20894;Altschul，S.等，1990)。还可使用熟知的SmithWaternan算法确定同一性。例如，对于一个给定％同一性的氨基酸改变的数量可通过将偶数的SEQIDN0S:2-668中的一个序列中的总的氨基酸数量与相应的同一性百分率(除以100)的数值百分数相乘，然后从所述偶数的SEQIDN0S:2-668中的一个序列中的氨基酸总数中减去该乘积计算，或na《Xa-(Xa*y)其中ria是氨基酸改变的数目，Xa是SEQIDN0S:2-668的一个序列中的氨基酸总数，y是，例如，0.70对70%,0.80对80%，0.85对85%等，并且其中Xa和y的任何非整数乘积在将其从Xa中减去之前被四舍五入为最接近的整数。本发明设想整个P-溶血性链球菌的菌株基本上保守的分离的多肽。并且，本发明还设想了整个e-溶血性链球菌的菌株基本上保守的分离的多肽和在可疑的受检者中有效预防或改善e-溶血性链球菌集群或感染的分离的多肽。如本文所使用的，术语"保守的"指例如不经历插入、取代和/或缺失的氨基酸的数量作为蛋白质中氨基酸总数的百分比。例如，如果一个蛋白质是55%保守的并具有例如263个氨基酸，那么蛋白质中在144个氨基酸的位置上氨基酸不经历取代。同样地，如果蛋白质是90%保守的，并例如，具有约280个氨基酸，那么在28个氨基酸的位置上氨基酸可进行取代，而在252个(即280减去28)氨基酸位置上氨基酸不经历取代。根据本发明的一个实施例，分离的多肽在整个e-溶血性链球菌的菌株上较佳地至少约80%是保守的，更佳地整个菌株至少约85%是保守的，甚至更佳地整个菌株至少约90%是保守的，最佳地整个菌株至少约95%是保守的，没有限制。在偶数的SEQIDN0S:2-668的多肽的结构中可进行修饰和改变，并获得具有e-溶血性链球菌和/或酿脓链球菌活性和/或抗原性的分子。例如，某些氨基酸可取代序列中的其它的氨基酸而不会导致可觉察的活性和/或抗原性的损失。由于多肽的相互作用的能力和特性，限定多肽的生物功能活性，某些氨基酸序列的取代可在多肽序列中进行(当然，或者是其基础的DNA编码序列)并仍然获得具有相似特性的多肽。本发明包括任何分离的多肽，该多肽是提供如本文是描述的所欲反应性的生物学等价物。术语"所需的反应性"指将为本领域熟练的技术人员识别的作为用于本发明目的的有用的结果的反应性。这里描述了所需的反应性的例子，包括但不限于，所需的蛋白质水平、所需的抗体效价、所需的调理素噬菌细胞活性和/或所需的交叉反应性，这些将为本领域熟练的技术人员识别对本发明的目的是有用的。当通过相对于负控制减少OPA中的集落生成单位(CFU)测定时，所需的调理素噬菌细胞活性以杀死细菌的百分比表示。没有对它进行限制，所需的调理素噬菌细胞活性较佳地至少约15%，更佳地至少约20%，甚至更佳地至少约40%，甚至更佳地至少约50%和最佳地至少约60%。本发明包括多肽，该多肽是含有SEQIDN0S:2-668的氨基酸序列的多肽的变体。如本文使用的术语"变体"，包括一种不同于参考的多肽但保留其本质特征的多肽。通常，差别是有限的，因此参考多肽和变体的序列总体上非常相似，在许多区域是同一的(即生物学等价)。变体和参考多肽由于一个或多个取代、增加或以任何组合缺失氨基酸序列可能不同。取代或插入的氨基酸残基可能是或不是遗传密码编码的氨基酸。多肽的变体例如等位基因变体可自然发生，或者它可以是不知其自然发生的变体。非-自然发生的多肽变体可通过直接合成或通过诱变技术制备。在进行这种改变时，可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在给予多肽相互作用的生物学功能中的重要性通常为本领域的技术人员所理解(Kyte和Doolittle，1982)。已知某些氨基酸可取代其它具有相似的亲水性指数或得分的氨基酸并依然产生具有相似的生物活性的多肽。各个氨基酸根据其疏水性和电荷特性被赋予亲水性指数。那些指数如下列于各个氨基酸后的圆括号:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙胺酸(+1.8);甘氨酸(+0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);，谷氨酸(_3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);精氨酸(-4.5)。人们认为氨基酸残基的相对的亲水特征决定获得的多肽的二级和三级结构，反过来它限定多肽与其它分子的相互作用，例如酶、底物、受体、抗体、抗原等。本领域已知氨基酸可由另一个具有相似亲水性指数的氨基酸所取代，并仍获得功能上等价的多肽。在这种改变中，其亲水性指数在+/-2内的氨基酸的取代是优选的，那些亲水性指数在+/-1内的氨基酸是特别优选的，那些亲水性指数在+/-0.5内的氨基酸是更佳特别优选的。相似氨基酸的取代还可根据亲水性进行，特别是这里因此产生生物功能等价的多肽或肽设想用于免疫学实施例。本文引用作为参考的美国专利4,554，101号阐明如由其邻近的氨基酸的亲水性控制的最大的多肽的局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与多肽的生物学特性相关。如美国专利4，554，101号所详细描述的，如下亲水性被賦予氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0士l);谷氨酸(+3.0土l);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);脯氨酸(-0.5±1);苏氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。人们理解一个氨基酸可取代另一个具有相似的亲水性值的氨基酸并仍获得生物学等价物，具体地说一个免疫学等价物、多肽。在这种改变中，其亲水性值在土2内的氨基酸的取代是优选的，那些亲水性指数在土l内的氨基酸是特别优选的，那些亲水性指数在±0.5内的氨基酸是更佳特别优选的。如上文所概括的，因此氨基酸取代通常取决于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的典型的取代是本领域熟练的技术人员熟知的并包括:精氨酸和赖氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。如下面表XIII中所示，适当的氨基酸取代包括如下表XIII:原来的残基典型残基的取代<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>因此，本发明包括含有一个或多个氨基酸取代物的SEQIDNOS:2-668的多肽的功能或生物学等价物。多肽的生物学或功能等价物还可使用定点诱变制备。定点诱变是一种用于通过基础DNA的专一性诱变衍生自其序列的第二代多肽或生物学、功能上等价的多肽的技术。如上文所提示的，当氨基酸取代是理想的时，这种改变是令人满意的。该技术进一步提供制备和检验序列变体的现成的能力，例如，通过向DNA中引入一个或多个核苷酸序列的改变，掺入一个或多个前述的因素。定点诱变通过编码所欲突变的DNA序列的特异性寡核苷酸以及足够数量的邻近的核苷酸的使用允许突变体的产生，以提供足够大小的引物序列和序列复合物，在被切断的缺失连接两边形成稳定的双螺旋结构。典型地，长度为17-25个核苷酸的引物是优选的，在被改变的序列连接的两边具有约5个到10个氨基酸。通常，定点诱变技术是本领域熟知的。应理解，该技术典型地使用可存在于单链和双链形式中的噬菌体载体。典型地，据此定点诱变首先通过获得单链载体进行，该单链载体包含其序列内的一个DNA序列，该序列编码选择的所有或部分酿脓链球菌多肽序列。例如，通过熟知的技术(例如合成)制备一个具有所需的突变序列的寡核苷酸引物。然后该引物退火成为单链的载体，并通过使用例如大肠杆菌G.cWi)聚合酶IKlenow片段的酶延长，以完成具有突变的链的合成。这样，异源双链形成，其中一个链编码原来的非-突变的序列，而第二个链具有所需的突变。然后该异源双链载体用于转化适当的细胞，例如大肠杆菌细胞，并选择包括具有突变的充足载体的克隆。商业购得的试剂盒提供必要的试剂。推测本发明的多肽和多肽抗原包括与含有任何SEQIDN0S:2-668的氨基酸序列的多肽具有实质上的序列相似性、结构相似性、和/或功能相似性的任何多肽。另外，本发明的多肽或多肽抗原不限于具体的来源。因此，本发明为通常的检测和从各种来源中分离多肽做准备。可优选地将本发明的多肽切成片段用于进一步的结构或功能分析，或用于例如酿脓链球菌相关多肽和酿脓链球菌特异性抗体等反应物的产生。这可通过用例如内切蛋白酶(end叩roteinase)glu-C等肽酶处理纯化的或未纯化的本发明的多肽完成(Boehringer，Indianapolis,IN)。用CNBr处理是另一种方法，通过这种方法可从自然的酿脓链球菌的多肽生产肽片段。重组技术也可用于生产酿脓链球菌多肽的特异性片段。另外，本发明设想可配制与具体的酿脓链球菌多肽抗原的空间结构相似的化合物以模仿肽结构的主要部分，本领域中称做肽模仿(p印tidomimetics)。模仿物是模仿蛋白质二级结构的要素的含肽分子。使用肽模仿背后的基本原理是蛋白质肽主链存在主要用于定向氨基酸的负链，以这种方式促进分子的相互作用，例如受体和配体的分子。本发明还包括含有至少-一个本发明的多肽的融合蛋白。"融合蛋白"指由两种、常常是不相关的融合基因或其片段编码的蛋白质。例如，融合蛋白含有免疫球蛋白分子恒定区的各个部分以及另一个已描述的人蛋白或其部分。在许多情况下，使用免疫球蛋白Fc区域作为融合蛋白的一部分对于用于治疗和诊断是优选的，导致例如改善的药物代谢动力学特性(见，例如，EP-A02302621)。另一方面，对于某些用途希望在融合蛋白被表达、检测和纯化后能够除去Fc区域。本发明的多肽可以是"成熟"蛋白的形式或可以是较大蛋白例如融合蛋白的一部分。包含一个附加的氨基酸序列常常是优选的，该序列包含，例如，分泌或前导序列、原序列、辅助纯化的序列例如多组氨酸残基或在重组生产过程中用于稳定的附加的序列。酿脓链球菌多肽的片段也包含于本发明中。一个片段是具有一个氨基酸序列的多肽，该序列纯粹与氨基酸序列的部分而不是全部相同。该片段可含有，例如，至少7个或更多(例如8、10、12、14、16、18、20或更多)偶数的SEQIDN0S:2-668的任何的氨基酸序列的连续的氨基酸。片段可以是"独立的"(freestanding)或者包含于形成一个部分或区域的较大的多肽之中，最佳地作为一个单一的、连续的区域。在一个实施例中，该片段包括成熟多肽序列的至少一个表位。本发明的多肽可以任何适当的方式制备。这种多肽包括自然发生的多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽、和通过这些方法的结合产生的多肽。制备这种多肽的方法是本领域熟知的。多核苷酸本发明还提供含有编码本发明的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸，以及与其密切相关的多核苷酸。这些多核苷酸包括(i)含有奇数的SEQIDN0S:1-147中的任何一个的核苷酸序列的分离的多核苷酸(表I);(ii)含有奇数的SEQIDN0S:149-181中的任何一个的核苷酸序列的分离的多核苷酸(表II);(iii)含有奇数的SEQIDN0S:183-187中的任何一个的核苷酸序列的分离的多核苷酸(表III);和(iv)含有奇数的SEQIDN0S:189-667中的任何一个的核苷酸序列的分离的多核苷酸(表iv);编码本发明的多肽的多核苷酸可与包含于表i-iv中的核苷酸序列相同，或者它们可具有变体序列，该序列作为遗传密码冗余(简并)的结果也编码本发明的多肽。此外，本发明提供与seqidn0s:1-667的核苷酸序列具有同一性的序列的分离的多核苷酸。根据具体的序列，序列同一性的程度较佳地大于70%(例如80%、90%、95%、97%、99%或更多)如上面所讨论的，"同一性"，如本领域已知的，是通过比较序列确定的两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。"同一性"可通过已知的方法容易地计算。例如，本发明的多核苷酸序列可与奇数的seqidnos:1-667的参考核苷酸序列具有同一性，更确切地说100%地同一，或者当与参考核苷酸序列相比较时，它可包括达某一整数的核苷酸改变。这种改变包括至少一个核苷酸缺失、取代，包括转换和易位，或插入。该改变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或这些末端位置之间的任何地方，或者在参考序列中的核苷酸之中单独地散布，或者在参考核苷酸序列内的一个或多个连续的基团中分布。通过将奇数的seqidn0s:1-667的一个序列中的核苷酸的总数与各自的百分数同一性(除以100)的数量百分比相乘，然后用所述奇数的seqidnos:1-667的任何一个的参考核苷酸序列的核苷酸总数减去这一乘积。例如，对于一个与奇数的seqidnos:1-667的一个核苷酸序列具有至少70%的同一性的多核苷酸，多核苷酸在奇数的seqidnos:1-667的一个全长核苷酸序列的可包括达nn个核酸改变，其中r^用下式计算nn《Xn-(Xny)，其中X。是奇数的SEQIDNOS:卜667的核苷酸序列的核苷酸的总数，y具有0.70的值，而其中在从Xn中减去该乘积前将任何Xn和y的非整数的乘积四舍五入为最接近的整数。当然，y还可具有0.80对80%、0.85对85%、0.90对90%、0.95对95%等的值。本发明还包括编码含有seqidn0s:2-668的氨基酸序列的多肽的多肽变体的多核苷酸，其中一个或多个氨基酸残基被取代、缺失或加入，以任何组合而保持天然多肽的生物学活性。如本文所使用的术语"变体"，是一种不同于参考多核苷酸的多核苷酸，但保持基本的性质。变体核苷酸序列的改变可以或不可以改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸改变可导致在由参考序列编码的多肽中氨基酸的取代、增加、缺失、融合以及平截。多核苷酸的变体可自然发生例如等位基因变异，或者它可以是不知其自然发生的变体。多核苷酸的非-自然发生的变体可通过诱变技术或通过直接合成制备。本发明还包括在降低严格程度的条件，更佳地是严格条件，而最佳的是高度严格的条件下能够与本文描述的多核苷酸杂交的多核苷酸。严格条件的例子显示于下面的严格条件表:高度严格条件是那些至少与例如A-F的条件一样严格的条件;严格条件是至少与例如G-L的条件一样严格的条件；降低严格程度的条件是至少与例如M-R的条件一样严格的条件。表XIV-严格条件表<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>bp、杂交长度是预期的杂交的核苷酸的杂交区域的长度。当多核苷酸与不知其序列的目标多核苷酸杂交时，假定杂交长度为杂交的核苷酸的长度。当已知序列的多核苷酸杂交时，杂交长度可通过排列多核苷酸的序列并鉴定最佳的序列互补性的区域确定。缓冲液H:SSPE(lxSSPE是0.15MNaCl，10mMNaH2P04,和1.25raMEDTA，pH7.4)可在杂交和洗涤缓冲液中取代SSC(lxSSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后洗涤进行15分钟。TB到K:预期用于长度少于50个碱基对的杂化物的杂交温度应比杂化物的解链温度CO少5-10EC，这里L根据如下的公式确定。对于长度少于18个碱基对的杂化物，TjECh2(A的ft+T碱基)+(G的frfC碱基)。对于长度在18和49个碱基对之间的杂化物，Tn(EC)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N),其中N是杂化物中碱基的数量，而[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于lxSSC[Na+]=0.156M)。对于多核苷酸杂交，严格条件的另外的例子提供于Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，分子克隆试验室指南，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，9和11章，和分子生物学现代流程(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，1995，F.M.Ausubel等编，JohnWiley和Sons,Inc.,2.10和6.3-6.4节，本文引入作为参考。本发明还提供与这些多核苷酸完全互补的多核苷酸，还提供反义序列。本发明的翻译序列还指反义寡核苷酸，包括内部产生和外部给予的序列，该序列阻断编码本发明的多肽的多核苷酸的表达。本发明的反义序列含有，例如约15-20个碱基对。可设计反义序列抑制转录，例如，通过防止启动子与上游非翻译序列结合或通过防止核糖体结合防止编码本发明的多肽的转录物的翻译。本发明的多核苷酸以多种方法制备(例如，通过从DNA文库、从有机体本身化学合成)并可采取各种形式(例如单链的、双链的、载体、探针、引物)。术语"多核苷酸"包括DNA和RNA，以及例如包含修饰主链的它们的类似物。当本发明的多核苷酸用于多肽的重组生产时，该多核苷酸可包括成熟多肽或其片段的编码序列，自动地，阅读框架中成熟多肽或片段的编码序列具有其它的编码序列，例如编码前导或分泌序列、前-、原-或前原-蛋白质序列或其它融合蛋白部分的序列。例如，促进融合多肽纯化的标记物序列可与编码序列连接。多核苷酸还可含有非-编码5'和3'序列，例如转录的、非-翻译的序列、剪接和聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点和稳定raRNA的序列。表达系统和载体对于重组生产，宿主细胞通过基因工程掺入表达系统、其部分或本发明的多核苷酸。多核苷酸引入宿主细胞为，例如，许多标准实验室指南中所描述的方法影响，例如Davis等，分子生物学的基本方法(BASICMETHODSINMOLECULARBIOLOGY)(1986)和Sambrook等，分子克隆实验室指南(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL)，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、微注射、超声、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、刮擦装入(scrapeloading)、弹果引入或传染。适当宿主的代表性的例子包括细菌细胞(链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草杆菌细胞)、酵母细胞(例如，Pichia，酵母菌)、哺乳动物细胞(例如，非洲绿猴肾细胞系、中国仓鼠卵巢细胞、鸡胚成纤维细胞、BHK细胞、人SW13细胞)和昆虫细胞(例如Sf9、Sf21)。重组产生的多肽通过已知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，方法包括高效液相色谱、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。使用了多种多样的表达系统。这种系统包括，其中，染色体的、游离的和病毒衍生的系统，例如衍生自细菌质粒、减毒的细菌的载体，例如来自噬菌体的沙门菌属(Salmonella)(美国专利号4，837，151)、来自转座子、来自酵母游离体，来自插入因子、来自酵母染色体成分，来自病毒例如牛痘和其它痘病毒、新培斯病毒、腺病毒、杆状病毒、乳多泡病毒，例如SV40、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒、ct病毒例如委内端拉马脑脊髓炎病毒(美国专利号5，643，576),不分节段的负链RNA病毒例如水泡性口膜炎病毒(美国专利号6，168，943)，和衍生自它们的组合物的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传因子的那些载体，例如粘粒和噬菌粒。表达系统应包括调节引起表达的对照的区域，例如启动子和其它调节元件(例如一个多腺苷酸化信号)。通常可使用适合于保持、增殖或表达多核苷酸的任何系统或载体以在宿主中产生多肽。适当的核苷酸序列可通过任何各种已知和常规技术插入表达系统，例如，那些在Sambrook等，分子克隆，实验室指南(见上文)所提出的。本发明还提供包含多核苷酸或本发明的多核苷酸的载体(例如表达载体、测序载体、克隆载体)，具有本发明载体的基因工程宿主细胞，以及通过重组技术进行本发明多肽的生产。也可利用无细胞翻译系统使用从本发明的DNA构建物得来的RNA生产这种蛋白质。较佳的载体是病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺-伴随病毒、牛痘病毒、杆状病毒、和其它具有所需的细胞向性的重组病毒。因此，编码功能或突变体蛋白或多肽或其片段的基因可使用病毒载体或通过直接引入DNA体内、来自体内或体外引入。在指定的组织中的表达可为指导转基因载体到特定的细胞所影响，例如用病毒载体或受体配基，或通过使用组织特异性启动子或二者。指定基因的传递描述于PCT出版号WO95/28494。通常用于体内或来自体内的定向和治疗过程的病毒载体是DNA-基础的载体和逆转录病毒载体。用于构建和使用病毒载体的方法是本领域已知的(例如Miller和Rosman，生物技术(BioTechniques)1992，7:980-990)。较佳地，病毒载体是病毒缺陷型的，即，它们在靶细胞中不能自主复制。较佳地，复制缺陷型病毒是最小的病毒，即它仅保留对于包被基因组以产生病毒颗粒所必需的基因组的序列。DNA病毒载体包括减毒的或缺陷型DNA病毒，例如但不限于，单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、EB病毒(EBV),腺病毒、腺伴随病毒(MV)等。完全或几乎完全缺乏病毒基因的缺陷型病毒是优选的。缺陷型病毒在引导进入细胞后不具有传染性。缺陷型病毒载体的使用允许在特定的、固定的区域给予细胞，而不用考虑载体会感染其它细胞。因此，一个特定的组织可被具体地指定。具体载体的例子包括，但不限于，缺陷型疱疹病毒1(HSVl)载体(Kaplitt等，Molec.Cell.Neurosci.，1991，2:320-330)缺陷型疱疹病毒载体缺乏醣蛋白L基因，或其它缺陷型疱疹病毒载体(PCT出版号W094/21807和WO92/05263);减毒的腺病毒载体，例如由Stratford-Perricaudet等描述的载体(J.Clin.Invest.，1992，90:626-630;还见LaSalle等，Science,1993，259:988-990);和缺陷型腺病毒伴随载体(Samulski等，J.Virol.，1987，61:3096-3101;S羅lski等，J.Virol.，1989，63:3822-3828;Lebkowski等，Mol.Cell.Biol.，1988，8:3988-3996)。各个商业生产病毒载体的公司，包括但不限于，Avigen，Inc.(Alameda,California;AAV载体)，CellGenesys(FosterCity,California;逆转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)，Clontech(逆转录病毒和杆状病毒载体)，Genovo，Inc.(SharonHill,Pennsylvania;腺病毒和AVV载体)，Genvec(腺病毒载体)，IntroGene(Leiden，Netherlands;腺病毒载体)，MolecularMedicine(逆转录病毒、腺病毒、AVV、和疱疹病毒载体)，Norgen(腺病毒载体)，OxfordBioMedica(Oxford,UnitedKingdom;慢病毒载体)，和Transgene(Strasgourg，France;腺病毒、牛痘、逆转录病毒和慢病毒载体)。腺病毒是可被修饰以有效地传递本发明的核苷酸到各种细胞类型的真核的DNA病毒。存在各种血清型的腺病毒。这些血清型中，参考中给出在本发明的范围内使用2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或动物起源的腺病毒(见，PCT出版号WO94/26914)。那些可在本发明的范围内使用的动物起源的腺病毒包括犬、牛、鼠(例如Mavl，Beard等,Virology,1990，75-81)绵羊、猪、鸟、和猿(例如SAV)起源的腺病毒。较佳地，动物起源的腺病毒是犬的腺病毒，更佳地S是CAV2腺病毒(例如Manhattan或A26/61菌株，ATCCVR-800)。已描述了各种复制缺陷型腺病毒和最小的腺病毒载体(伊j如PCT出版号W094/26914，W095/02697，W094/28938，WO94/28152，WO94/12649，W098/02697，W096/22378)。根据本发明复制缺陷型重组腺病毒可通过本领域熟练的技术人员已知的任何技术制备(例如，Levrero等，Gene，1991，101:195;欧洲出版号(EuropeanPublicationNumber)EP185573;Graham,EMBOJ.，1984，3:2917;Graham等，J,Gen.Virol.，1977，36-59)。使用本领域普通的技术人员熟知的标准分子生物学技术回收和纯化重组腺病毒。腺伴随病毒(AVV)是相对小的DNA病毒，它可以稳定的定点的方式整合进入它们感染的细胞的基因组。它们能够感染广谱的细胞而不引起对细胞生长、形态或分化等的任何影响，并且它们似乎不会涉及人的病理学。AAV基因组被克隆、测序和表征。已描述了衍生自用于在体外和体内转移基因的MV的载体的使用(见PCT出版号W091/18088和W093/09239;美国专利号4，797，368和5，139，941;欧洲出版号EP488528)。根据本发明复制缺陷型重组MV可通过将含有由两个MV末端反向重复(ITR)区从侧面包围的感兴趣的核酸序列的质粒和携带AVV被囊基因的质粒(r印和cap基因)共转染进入用人辅助病毒(例如，腺病毒)感染的细胞系。然后用标准方法纯化产生的MV重组。在另一个实施例中，基因可被引入一个逆转录病毒的载体，例如，描述于美国专利号5,399,346;Mann等，Cell,1983:33:153;美国专利号4,650,764和4,980,289;Markowitz等，J.Virol.，1988，62:1120;美国专利号5,124,263;欧洲出版号EP453242和EP178220;Bernstein等，Genet.Eng.，1985，7:235;McCormick，BioTechnology，1985，3:689;PCT出版号WO95/07358;和Kuo等,Blood，1993，82:845。逆转录病毒是感染正在分裂的细胞的整合型病毒。逆转录病毒的基因组包括LTR，一个被囊的序列，和三个编码区(gag，pol和env)。在重组逆转录病毒载体中，gag、pol和erw基因通常全部或部分缺失，并为感兴趣的异源核酸序列所替代。这些载体可从不同类型的逆转录病毒构建，例如HIV、MoMuLV("莫洛尼鼠类白血病病毒")、MSV("莫洛尼鼠类肉瘤病毒")、HaSV("Harvey肉瘤病毒")、SNV("脾脏坏死病毒")、RSV("劳斯肉瘤病毒")和弗罗德病毒。己描述了适当的包装细胞系，具体是细胞系PA317(美国专利号4,861,719)、PsiCRIP细胞系(PCT出版号WO90/02806)，和GP+envAm-12细胞系(PCT出版号WO89/07150)。另外，该重组逆转录病毒载体可在LTR内包含用于抑制转录活性的修饰以及可包括一部分gag基因的扩大的被囊序列。重组逆转录病毒载体通过本领域普通的技术人员已知的标准技术纯化。逆转录病毒载体可被重组以作为感染性的颗粒行使功能或进行单轮的转染。在以前的例子中，病毒被修饰以除那些导致致癌性转化特性的基因外保留所有的基因，和表达异源性基因。操纵非-传染的病毒载体以破坏病毒包装信号，但保留需要的结构基因以包装通过基因工程含有异源基因和包装信号的共诱导的病毒。因此，产生的病毒颗粒不能产生另外的病毒。逆转录病毒载体还可通过DNA病毒引入，它允许一轮的逆转录病毒复制并放大转染的效果(见，PCT出版号WO95/22617、WO95/26411、WO96/39036和WO97/19182)。在另一个实施例中，慢病毒载体在一些组织类型中可用作用于直接传递和转基因持续表达的试剂，这些组织类型包括脑、视网膜、肌肉、肝、和血液。这些载体可在这些组织中有效地转导分裂的和未分裂的细胞，并保持感兴趣的基因的长期表达。关于综述，见Naldini，Curr.Opin.Biotechnol.,1998，9:457-63;还见Zufferey等，J.Virol.，1998，72:9873-80。慢病毒包装细胞系是可获得的并是本领域通常已知的。它们促进用于基因疗法的高效价的慢病毒载体的生产。一个例子是四环素诱导的VSV-G假型慢病毒包装细胞系，它至少3-4天能够产生效价高于106IU/ml的病毒颗粒(Kafri等，J.Virol.，1999，73:576-584)通过可诱导的细胞系产生的载体可根据需要被浓縮用于在体外和体内有效地转导非分裂的细胞。在另一个实施例中，载体可通过脂转染体内引入，如裸DNA，或随其它转染促进剂引入(肽、多聚体等)。可使用合成的阳离子脂类制备用于编码标记物的基因的体内转染的脂质体(Feigner等，P潔.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1987，84:7413-7417;Feigner和Ringold,Science,1989，337:387-388;Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988，85:8027-8031;Ulmer等，Science,1993，259:1745-1748)。对于核酸转移有用的脂类化合物和组合物描述于PCT专利出版号WO95/18863和WO96/17823以及美国专利号5,459,127中。为了寻靶，脂类可与其它分子化学接合(见Mackey等，见上文)。耙定的肽，例如激素或神经递质，和蛋白质例如抗体，或非肽分子可与脂质体化学接合。人们还可在活体内引入载体作为裸露的DNA质粒。可通过本领域已知的方法将用于基因疗法的裸露的DNA载体引入所需的宿主细胞，这些方法例如电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀，使用基因枪，或使用DNA载体转运蛋白(例如Wu等，J.Biol.Chem.，1992，267:963-967;Wu和Wu，J.Biol.Chem.，1988，263:14621-14624;加拿大专利申请号2，012，311;Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991，88:2726-2730)。还可使用受体介导的DNA传递方法(Curiel等，Hum.GeneTher.，1992，3:147-154;Wu和Wu，J.Biol.Chem.，1987，262:4429-4432)。美国专利号5,580,859和5，589，466公开了在哺乳动物中不含有转染促进剂的外源DNA序列的传递。最近，描述了一种称做电转移的相对低压、高效的体内DNA转移技术(Mir等，C.P.Acad.Sci.，1988,321:893;PCT出版号W099/01157;W099/01158;W099/01175)。其它分子对于促进体内核酸的转染也是有用的，例如阳离子寡肽(例如，PCT专利出版号WO95/21931)，衍生自DNA结合蛋白的肽(例如，PCT专利出版号W096/25508)，或阳离子聚合体(例如PCT专利出版号W095/21931)，或丁哌卡因(b叩ivacaine)(美国专利号5，593，972)。本发明分离的多肽可使用活载体传递到哺乳动物中，特别地使用活的重组细菌、病毒或其它活的介质，这些活载体含有对于与异种多肽一样的多肽和免疫原性片段的表达所必需的遗传物质。具体地，定居在胃肠道的细菌，例如沙门氏菌、志贺菌、耶尔森氏菌、弧菌、埃希氏杆菌和BCG,已开发为牛痘载体，并且Holmgren等(1992)和McGhee等(1992)讨论了这些和其它的例子。如下可用作部分列举的RNA载体，其中可插入一个或多个免疫原性候选蛋白。有序的Mononegavirale的无分节、反义、单链RNA病毒的分类。副粘病毒科副粘病毒亚科副粘病毒属仙台病毒(小鼠副流感病毒l型)人副流感病毒(PIV)1型和3型牛副流感病毒(BPV)3型Rubulsvirus属猿猴病毒5(SV)(犬副流感病毒2型)腮腺炎病毒新城疫病毒(NDV)(禽副粘病毒1)人副流感病毒(PIV-2型、4a和4b型)麻疹病毒属麻疹病毒(MV)海豚麻疹病毒犬瘟热病毒(CDV)Peste-des-petits-ruminants病毒海豹瘟热病毒牛瘟病毒未分类的Hendra病毒Nipah病毒肺病毒亚科肺病毒属人呼吸道合胞病毒(RSV)牛呼吸道合胞病毒小鼠肺炎病毒Metapneumovirus属人metapneumovirus鸟肺病毒(从前的火鸡鼻气管炎病毒)棒状病毒科狂犬病病毒属狂犬病病毒水泡性病毒属水泡性口炎病毒Ephemerovirus属牛三曰烧(ephemeralfever)病毒线状病毒科线状病毒属马尔堡病毒RNA病毒载体基本上是一个分离的核酸分子，它含有编码有序的Mononegavirale的非分节的、反义的、单链的RNA病毒的至少一个基因组或反基因组的序列。分离的核酸分子可含有编码基因组、反基因组或其修饰的型式的多核苷酸序列。在一个实施例中，多核苷酸编码可操作地连接的启动子、所需的基因组或反基因组、以及转录的终止子。在本发明的一个较佳的实施例中，多核苷酸编码己通过核苷酸插入、重排、缺失或取代从野生型RNA病毒修饰的基因组或反基因组。该基因组或反基因组序列可从人或非人病毒获得。多核苷酸序列还可编码嵌合基因组，该基因组从来自两个或多个来源的重组连接的基因组或反基因组形成。例如，插入从A组RSV获得的一个或多个基因代替B组RSV相应的基因；或插入从牛PIV(BPIV)、PIV-1或PIV-2获得的一个或多个基因代替PIV-3相应的基因；或者RSV可取代PIV的基因等。在另一个实施例中，多核苷酸编码OrderMononegavirale的RNA病毒的基因组或反基因组，该病毒是人、牛或鼠的病毒。既然通过本发明的方法形成的重组病毒用于治疗或预防的目的，该多核苷酸还可编码选择的减毒或传染型的RNA病毒。在许多实施例中，多核苷酸编码减毒的、传染型的RNA病毒。在具体的较佳的实施例中，多核苷酸编码OrderMononegavirale的非分节的、反义、单链RNA病毒的基因组或反基因组，该基因组在3'基因组启动子区具有至少一个减毒的突变并在RNA聚合酶基因中具有至少一个减毒的突变，如由出版的国际专利申请WO98/13501所描述的，本文引入作为参考。如载体一样，编码如上文描述的修饰型的所欲基因组和反基因组的多核苷酸序列还编码本发明的免疫原性蛋白的一个或多个基因或核苷酸序列。另外，如所希望的，一个或多个异源基因还可用于形成所需的免疫原性组合物/载体。根据所需的重组病毒的应用，该异源基因可编码辅因子、细胞因子(例如白细胞介素)、T-辅助表位、限制性标记物、佐剂或不同的微生物病原体的蛋白(例如病毒、细菌或真菌)，特别是能够引起保护免疫反应的蛋白。还可使用该异源基因提供用于基因疗法的试剂。在一个较佳的实施例中，该异源基因编码细胞因子，例如选择用于改善重组病毒的预防或治疗特征的白细胞介素-12。抗体本发明的多肽，包括偶数的SEQIDN0S:2-668的氨基酸序列、它们的片段、及其类似物或表达它们的细胞，还可用作产生对本发明的多肽具有特异性的抗体的免疫原。本发明包括对p-溶血性链球菌和酿脓链球菌多肽具有免疫专一性的抗体以及使用这种抗体检测或测定细胞、细胞或组织提取物或生物液体中|3-溶血性链球菌和酿脓链球菌多肽的存在或其数量或浓度。本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、和抗-特应抗体。多克隆抗体是衍生自用抗原免疫的动物血清的抗体分子的异源类群。单克隆抗体是与特异性抗原基本上同源的抗体类群。单克隆抗体可通过本领域熟练的技术人员已知的方法获得，例如，Kohler和Milstein，1975，Nature256:495-497和美国专利号4,376，110。这种抗体可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD的任何免疫球蛋白类和其任何的亚类。嵌合抗体是其不同的部分衍生自不同的动物种类的分子，例如那些具有可变区的抗体衍生自鼠科动物的单克隆抗体和人的免疫球蛋白恒定区。嵌合抗体和其生产方法是本领域已知的(Cabilly等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3273-3277;Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855;Boulia騰等，1984，Nature312:643-646;Cabilly等，欧洲专利申i青125023(1984年11月14日出版)；Taniguchi等，欧洲专利申请171496(1985年2月19日生产)；Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日出版)；Neuberger等，PCT申i青WO86/01533(1986年3月13日出版)；Kudo等，欧洲专利申请184187(1986年6月11日出版)Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日生产)；Sahagan等，1986，J.Immunol.137:1066-1074;Robinson等，PCT/US86/02269(1987年3月7日出版);Liu等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443;Sun等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214-218;Better等，1988，Science240:1041-1043)。这些文献本文引入作为参考。抗独特性(抗-Id)抗体是一种识别通常与抗体的抗原结合位点缔合的单一决定子的抗体。通过免疫相同种类或遗传类型(例如小鼠菌株)的动物作为具有正在制备抗-Id的单克隆抗体的单克隆抗体的来源制备抗-Id抗体。免疫的动物将通过产生这些个体决定簇的抗体(抗-Id抗体)识别和对免疫抗体的个体决定簇作出反应。相应地，针对本发明的多肽产生的单克隆抗体可用于在适合的动物中诱导抗-Id抗体。从这样免疫的小鼠中获得的脾细胞可用于生产分泌抗-Id单克隆抗体的抗-Id杂交瘤。而且，该抗-Id抗体可与例如匙孔血蓝蛋白(KLH)等载体接合并用于免疫另外的BALB/c小鼠。从这些小鼠中获得的血清将包含抗-抗-Id抗体，它包含对R-PTP酶表位具有特异性的最后的mAb的结合特性。因此抗-Id抗体具有它们的独特性表位，或与评估的表位结构相似的"独特位"，例如酿脓链球菌的多肽。术语"抗体"还指包括能够与抗原结合的完整的分子以及象Fab那样的片段。Fab片段缺乏完整抗体的Fc片段，从循环中更快速地清除，并可能比完整抗体具有更少的特异性组织结合(Wahl等，1983，J.Nucl.Med.24:316-325)。应理解根据完整抗体分子的方法，在本发明中使用的抗体的Fab和其它片段可用于检测和定量酿脓链球菌的多肽。抗-Id抗体还可用作"免疫原"以在另一个动物中诱导免疫反应，产生所谓的抗-抗-Id抗体。抗-抗-Id可与诱导抗-Id的原始的mAb表位同一。因此，通过对mAb的个体决定簇使用抗体，可能鉴别表达具有相同的特异性的抗体的其它克隆。例如为了证实蛋白质被表达或确定蛋白质在哪里被表达，以各种方式使用抗体。例如，标记的抗体(例如荧光标记FACS)可与完整的细菌一起培养并以细菌表面上标记的存在确定蛋白质的位置。针对本发明的多肽产生的抗体可通过使用常规方案给予动物多肽或携带表位的片段、类似物或细胞获得。为了制备单克隆抗体，使用了提供由持续的细胞系培养物生产的抗体的任何技术。免疫原性组合物本发明还提供的是免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物可用于治疗动物中的链球菌感染，例如人(较佳地)和非人动物。例如，这些动物可以是牛、犬、马、猫、和猪。注意到SEQIDN0:415(0RF1201)与也出现于5".e^/j'中的蛋白质一致。相应地，可在免疫原性组合物中使用这一序列治疗马的感染，以及在其它动物或人中的感染。具体的应用包括，但不限于，治疗扼死(strangle),马科动物的彝咽和排泄的(draining)淋巴结的一种高度传染的疾病，和在牛、马和猪中呼吸传染和乳腺炎的治疗。本发明的免疫原性组合物或者可以是预防的(S卩，预防传染或减少传染的发病)或者是治疗的(即治疗疾病或传染后由传染引起的副作用)。该免疫原性组合物可包括本发明的多肽。为了做到这一点，调整一个或多个多肽到适当的浓度，并可用任何适当的佐剂、稀释剂、载体或它们的任何组合配制。可使用生理学可接受的介质作为载体和/或稀释剂。这些包括，但不限于，水、等渗的介质、甘油、乙醇和其它常规的溶剂，磷酸盐缓冲液等。如本文所使用的，"佐剂"是一种用来增强抗原的免疫原性的物质，或者它是一种多肽或是一种多核苷酸。因此，佐剂常常用来增强免疫应答并为熟练的技术人员所熟知。适当的佐剂包括，但不限于，铝盐(alum)，例如磷酸铝和氢氧化铝、结核杆菌(补c血"e"'咖t〃^erc"7肌's)、百曰咳杆菌(》aro^e7Za;erti/ssj's)、细菌的脂多糖、磷酸氨垸基葡糖胺化合物(AGP)或它们的衍生物或类似物，它们可从Corixa(Hamilton，MT)购得，并且它们描述于美国专利号6，113,918中，本文引用作为参考。一种这样的AGP是2-乙基2-脱氧-4-0-膦酰基-3-0"2-b-D-吡喃葡萄糖苷，它也被称做529(以前称做RC529)。该529佐剂作为一种含水形式或作为一种稳定的乳液配制。其它佐剂是描述于美国专利号4，912，094中的MPL(3-0-脱酰基的单磷酰基脂A)(Corixa)，合成的多核苷酸例如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207，646，皂角甙例如QuilA或STIMUL0NQS-21(Antigenics，Framingham，Massachusetts),描述于美国专利申请5,057，540,—种百日咳毒素(PT)，或一种大肠杆菌热不稳定毒素(LT),具体是LT-K63、LT-R72、CT_S109、PT-K9/G129;见例如国际专利申请第WO93/13302和WO92/19265号，霍乱毒素(或者以野生型或者是突变型，例如，其中氨基酸位置29上的谷氨酸为另一个氨基酸所取代，根据出版的国际专利申请号WO00/18434，较佳地是组氨酸)。各种细胞因子和白细胞介素适合用作佐剂。一种这样的佐剂是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),它具有描述于美国专利号5,078,996中的核苷酸序列，该文献本文引入作为参考。含有GM-CSFcDNA的质粒转化为大肠杆菌，并用美国模式培养物保藏所(AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，10801UniversityBoulevard,Mavassas，VA20110-2209，在编号39900下lt存。细胞因子白细胞介素-12(IL-12)是另一种佐剂，它描述于美国专利号5，723,127中，该文献为本文引入作为参考。其它细胞因子或白细胞介素显示具有免疫调节活性，包括，但不限于白细胞介素l-a、l-p、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18，干扰素-a、13和y、粒细胞集落刺激因子，和肿瘤坏死因子a和p，并适合于用作佐剂。该多肽还可包括至少一部分任选地接合或连接肽、多肽或蛋白质或多糖的多肽。本发明的免疫原性组合物可进一步包括公开于美国专利号4,673,574、4,902，506、5，097，020和5，360,897(转让给Rochester大学)中的免疫原性接合物，本文引用这些文件作为参考。这些专利讲授了免疫原性接合物，这些接合物是具有还原端的免疫原性荚膜聚合体片段的还原氨基化产物，并衍生自细菌病原体和细菌毒素或类毒素的细菌荚膜聚合体。本发明还包括含有引起人体产生有效水平的抗-荚膜聚合体抗体的这些接合物的免疫原性组合物。通过包含两种或多种本发明的多肽，以及通过将一种或多种本发明的多肽与一种或多种已知的酿脓链球菌的多肽结合提供组合的免疫原性组合物，包括，但不限于C5a肽酶、M蛋白、粘附素等等。本发明的免疫原性组合物还包含与控制基因表达的调节序列操作性地缔合的本发明的多核苷酸序列。操纵感兴趣的多核苷酸序列进入表达载体，例如质粒，在调节因子的控制下它将促进DNA的表达，也就是，启动子和/或增强子元件。在一个较佳的实施例中，使用人巨细胞病毒介导的-早期启动子/增强子(美国专利号5，168，062)。该启动子可以是细胞特异性的，并允许仅在预设的细胞中多核苷酸的基本转录。或者作为"裸露的"DNA(美国专利号5，580，859)或者配制在具有促进免疫的试剂的组合物中，多核苷酸直接引入宿主，这种试剂例如丁呱卡因和其它局部麻醉剂(美国专利号5，593,972)和阳离子多胺(美国专利号6,127,170)。在这一多核苷酸免疫过程中，在体内瞬时的基础上表达本发明的多肽；没有遗传物质插入或整合进入宿主的染色体。这一过程区别与基因疗法，后者的目的是插入或整合感兴趣的遗传物质进入染色体。使用一种分析证实通过免疫给予的多核苷酸没有提高宿主中转化的表型(美国专利号6，168,918)。一旦合成，本发明的免疫原性组合物可直接给予受试者，来自体内地传递给衍生自受试者的细胞，或体外用于重组蛋白质的表达。为了直接传递给受试者，给予可通过任何常规的形式进行，例如鼻内地、肠胃外地、口腔地、腹膜内地、静脉内地、皮下地或局部地应用于任何粘膜表面，例如鼻内、口腔、眼、肺、阴道或直肠表面，例如通过烟雾剂喷射。受试者可以是哺乳动物或鸟类。受试者还可以是人。一种免疫学有效量的免疫原性组合物以适当的剂量给予受试者引起免疫应答。本文使用的免疫有效量是指给予哺乳动物宿主的量(较佳地是人)，或者以单一的剂量或者作为系列剂量的一部分，至少足以引起被处理的个体的免疫系统产生减少细菌感染的临床影响的应答。可通过单一剂量的免疫原性组合物给予保护，或可能需要给予几种剂量，除激发剂量外后来的时间里保持保护。该剂量可从最小限度的减少细菌的含量到预防感染的范围内变化。理想地，被治疗的个体将不显示更严重的e-溶血性链球菌感染的临床表现。该剂量可依赖于个体的具体条件而变化，例如年龄和体重。这一剂量可通过本领域熟练的技术人员已知的方法以常规试验确定。使用各种检验评估本发明的多肽的体外免疫原性。例如，多肽可重组地表达或化学合成并通过免疫印迹用于筛选受试者血清。受试者和受试者血清之间的阳性反应表明受试者预先对被讨论的多肽发动免疫应答，即该多肽是一种免疫原。这种方法还可用于鉴定免疫显性多肽。ELISA分析也可用于评估体外免疫原性，其中感兴趣的多肽抗原包被在平板上，例如96孔平板，并且从或者免疫的或者自然暴露的动物(例如人)获得的检验血清与包被抗原反应。是否存在任何对检验的多肽抗原具有特异性抗体，可通过本领域熟练的技术人员已知的标准方法检测。另外，相同的血清可与全部酿脓链球菌细胞反应。然后存在于血清中的反应抗体可使用胶体金接合抗体检测并通过LV-SEM显现。疫苗抗原的功效可使用两种动物的攻击试验模型检验。第一个显示粘膜免疫性。遵循已建立的方法用候选疫苗经肠胃外或粘膜活体免疫小鼠。然后通过鼻内给予用野生型酿脓链球菌攻击小鼠。然后存在于小鼠的鼻/咽腔中的酿脓链球菌可使用标准技术测定。通过细菌从动物的咽喉清除的增强反应其功效。另外，随后进行活体肠胃外免疫，针对全身性感染的保护可通过皮下注射酿脓链球菌细胞评估。通过死亡的减少和/或在注射位点减少的组织病理学测定功效。样品中的检测本文还提供了在一个生物学样品中检测和鉴别3-溶血性链球菌和酿脓链球菌的方法。在一个实施例中，该方法包括步骤(a)在允许互补的碱基对杂交的条件下将生物学样品与本发明的多肽接触，和(b)检测样品中杂交混合物的存在。在另一个实施例中，该方法包括步骤(a)在适合于免疫复合物形成的条件下将生物学样品与本发明的抗体接触，和(b)检测样品中免疫复合物的存在。在另一个实施例中，方法包括步骤(a)在适合于免疫复合物形成的条件下将生物学样品与本发明的多肽接触，和(b)检测样品中免疫复合物的存在。在免疫测定中使用本发明的抗原或其抗原片段以检测抗体的水平或，相反地，使用抗-酿脓链球菌抗体检测抗原水平。可开发基于意义明确的、重组抗原的免疫测定以取代侵袭性诊断方法。可检测生物样品中本发明的多肽的抗体，包括例如血液或血清样品。用于免疫测定的方案可基于，例如竞争，或直接反应，或夹层式分析。方案也可使用例如固相支持体，或可通过免疫沉淀法。本发明的多肽还可用于受体-配体研究。下面的实施例说明本发明，但并以此限制本发明。实施例1细菌、介质和试剂大肠杆菌培养和保存在含有适当抗生素的SOB中(0.5%酵母提取物、2.0%Tryp、10nM氯化钠、2.5mM氯化钾、10mM氯化镁、10mM硫酸衝。使用浓度为100ng/mL的氨苄青霉素，30叫/mL的氯霉素、和50pg/inL的卡那霉素。酿脓链球菌菌株SF370(ATCC编号700294)培养于30g/L的ToddHewiU、5g/L酵母提取物(THY)的培养液中。生物信息学/基因采集酿脓链球菌Ml菌株的染色体组的、未注释的序列从Oklahoma大学的网站上下载并分析以鉴定可读框(ORF)。据报道该基因组序列被提交给GenBank并指定编号为AE004092，而据报道菌株M1GAS被提交给ATCC并给予编号ATCC700294。定义ORF具有三个潜在的起始位点密码子ATG、GTG或TTG中的任何一个以及三个潜在的终止密码子TTA、TAG、TGA中的任何一个。使用三个ORF探测器算法的一组提高确定所有ORF的效率:GLIMMER(59);GeneMark(34);发明者的受让人开发了第三种算法。为了评价确定的ORF的精确性，使用本领域已知的具有离散余弦变换(DiCTion)的离散数学余弦函数给予各个ORF—个得分。具有DiCTion〉1.5的ORF被认为具有编码蛋白质产物的高的可能性。由三种ORF测定算法预测的ORF的最小长度确定为225个核苷酸(包括终止密码子)，它编码74个氨基酸的蛋白质。作为对剩余的ORF最后的寻找，使用tBLASTn针对公开的蛋白质数据库(下文描述)搜寻所有〉75个核苷酸的非编码区。这帮助鉴定含有可能具有引起抗原变异(21)的作用的移码(42)或基因片段的基因区域。将这里发现的任何剩余的ORF加入酿脓链球菌的ORF数据库。使用一种内部图解分析程序显示所有6个读码框以及预测的ORF相对于基因组序列的位置。这帮助消除那些与其它PRF具有大的重叠的0RF，尽管已知具有0RF完全包含于其它0RF之中的情况(25,33)。使用BLASTv.2.0Ga卯ed检索算法，BLASTp，进行酿脓链球菌ORF的最初注释以鉴定同源的序列。具有任何〈e-w的截断的"e"值被认为是显著的。还使用了包括FASTA和PSI-BLAST的其它检索算法。用于同源性检索的非-冗余蛋白质序列数据库包括GenBank、SWISS-P0RT、PIR、和每日更新数据库序列的TREMBL。BLASTp结果〉e-^的ORF被认为对于酿脓链球菌是独特的。使用已知或待检的疫苗靶基因以及鉴定蛋白质位置或功能的词进行完全'Blast结果的关键词检索。另外，进行所有与最初的Blast结果结合的MEDLINE参考的关键词检索以找寻关于ORF额外的信息。对于DNA分析，鉴定了各个基因中的免G+C的含量。ORF的W+C含量计算为ORF内的所有密码子的第三个核苷酸位置的(G+C)含量。对于在有机体中发现的所有0RF，报道的值是这种获得的值的算术平均值的差值。认为任何绝对值》8对进一步分析是重要的，由于这些ORF如从H.pylori获得的cag致病性岛的例子中所显示的从水平转移中产生(2)，该水平转移是保持许多其它致病性岛的模式(22)。使用一些参数测定预测蛋白质的分配。预定用于跨越细胞质膜易位的蛋白质编码前导信号(也称做信号序列的)，该信号包括在N-末端的側面由带阳电荷的残基包围的中央疏水性区域(56)。使用SignalP鉴定信号肽和它们的酶切位点(46)。为了在细菌中预测蛋白质的位置，使用软件PS0RT(44)。该程序使用神经网络算法预测蛋白质对革兰氏阳性菌的细胞质、外周胞质和细胞质膜以及革兰氏阴性菌的外膜的位置。使用软件程序TopPred2分析蛋白质的跨膜(TM)结构域(10)。这一程序预测可潜在地跨越双分子脂膜的蛋白质的疏水性区域。外膜蛋白质典型地不具有a-螺旋状的TM结构域。蛋白质结构域或保守的蛋白质区域多重排列的HiddenMarkovModel(HMM)Pfam数据库用于鉴定可能属于现有蛋白质家族的酿脓链球菌的蛋白质。使用检索这一结果的关键词帮助鉴定可能为Blast检索标准遗漏的表面固定的酿脓链球菌的蛋白质。HMM模型也是由发明者的受让人开发的。开发了一种计算机算法，HMMLipo，以使用从超过30个有机体获得的132个生物学表征的非-酿脓链球菌细菌脂蛋白预测脂蛋白。该训练组从试验证实的原核脂蛋白产生。从蛋白质的起始到半胱氨酸的蛋白质序列加上紧接着的两个附加的氨基酸用于产生HMM。使用含有LPXTG细胞壁类别信号的约70个已知的原核生物的蛋白质，开发HMM(15)以预测锚定在肽聚糖层上的细胞壁蛋白(38,45)。使用的模型不仅有LPXTG序列，还包括下游序列的两个特征，疏水性跨膜结构域和带正电荷的羧基末端。还有许多相互作用、非共价连接、具有肽聚糖层并与上文描述的LPXTG蛋白质类不同的蛋白质。这些蛋白质似乎在它们的羧基末端具有共有序列(32)。开发了这一区域的HMM并用于鉴定属于这一类别的酿脓链球菌的蛋白质。还可评估由酿脓链球菌鉴定的0RF编码的蛋白质的其它特征。一个串联重复探测器(5)鉴定含有例如在MSCRAMM中发现的重复的DNA序列(20)以及奈瑟氏脑膜炎菌d"sen'a配/lt'/^7')的相变异表面蛋白的0RF(51)。含有Arg-Gly-Asp(RGD)附着基序的蛋白质，连同用作它们的受体的整合蛋白，构成用于细胞粘着的主要识别系统。RGD识别是由微生物使用以进入真核生物组织的一种机制(29，63)。然而，并不是所有含RGD的蛋白质介导细胞粘着。已显示在羧基末端具有脯氨酸的包含RGD(RGDP)的肽在细胞粘着测定中是失活的，并且因此被排除在外。使用Geanfammer软件将蛋白质聚集为同源的家族(50)。家族分类的初步分析提供了具有疫苗候选组的新的ORF以及定义潜在的蛋白质功能。酿脓链球菌的胰蛋白酶消化酿脓链球菌的引子培养物在37。C的THY、5%的C02或空气中的02中培养过夜。然后各个引子培养物在200mL的新鲜THY中以1:25稀释,并培养至1-1.3的0D490，或分别在C02或空气中的02中。然后收集细胞在4，OOOg离心15分钟，并在lOmL20mM的Tris、pH8.0、150mMNaCl的缓冲液中洗涤3次。最后一次洗涤后，各个沉淀在2mL含有0.8M蔗糖的相同的缓冲液中重悬浮，并均等地分布到两个试管中。向各个生长条件的一个试管中加入40ug的胰蛋白酶；其它的试管用作阴性消化对照。该细胞悬浮液在37'C摇动4小时。取各个悬浮液的样品用于活细胞计数和通过低压扫描电子显微镜(LV-SEM)观察。然后离心悬浮液，收集悬浮物并通过低蛋白结合、2uM的滤器过滤。微细管HPLC界面在自动化的微量电喷射反相HPLC上分析肽提取物。微量电喷射界面包括Picofrit融合的硅喷雾针，50cm长，75咖ID、8uM孔径(NewObjective,CambridgeMassachusettes)用lOiimC18反相珠(YMC，Wilmington,NorthCarolina)包装至10cm的长度。Picofrit针安装在固定在质谱检测仪前面底部的纤维光学固定器中(MellesGriot，Irvine,California)。柱的后部通过肽联合垂直，为电喷射界面提供一个电连接。该联合通过一定长度的融合的硅毛细管(FSC)连接到与HPLC溶剂泵(ABI140C，Perkin-Elraer，Norwalk，Connection)连接的FAM0S自动取样器(LC-Packings，SanFrancisco,California)。该HPLC溶剂泵输送50uL/分钟的流量，使用PEEKmicrotight分解三通(UpchurchScientific,OakHarbor,Washington)将流量降低为250nL/分钟，然后使用FSC输送管输送到自动取样器。LC泵和自动取样器分别使用它们的内部用户程序控制。样品加入塑料自动取样器管，密封，并使用5nl的进样环路注入。微细管HPLC-质谱分析从表面消化液提取的肽使用SavantSpeedVac浓縮器(ThermoQuest，Holdbrook，NewYork)浓缩IO倍，然后使用50分钟的0-50%的溶剂B的梯度(A:O.1MHoAc，B:90%MeCN/0.1MHoAc)通过微量电喷射HPLC系统分离。在喷射电压为1.5kV下操作，并使用温度为125'C的加热的毛细管，在FirmiganLCQ-DECA离子阱质谱仪(ThermoQuest,SanJose，California)进行肽的分析。使用由设备提供的数据获取软件以自动的MS/MS模式获得数据。获取的方法包括IMS扫描(375-600m/z)，随后MS/MS扫描在MS扫描中顶部的2个最丰富的离子。设备然后进行第二次MS扫描(600-1000m/z)，随后MS/MS扫描在MS扫描中顶部的2个最丰富的离子。使用动态排阻和同位素排阻功能提高分析的肽离子的数量(设定:3am『排阻宽度，3分钟=排阻持续时间，30秒=预-排阻持续时间，3am『同位素排阻宽度)。数据分析使用结合进入Fi皿iganBioworks数据分析包(ThermoQuest，SanJose，California)的SEQUEST计算机算法(17)进行MS/MS数据的自动分析，该FinniganBioworks数据分析包使用衍生自酿脓链球菌的完全基因组的蛋白质数据库。克隆和蛋白质表达设计引物组用于所需的0RF的PCR扩增，这样正向5'引物将在预测的成熟蛋白质的起始处退火。对于脂蛋白，设计5'正向引物恰好在编码成熟蛋白质的半胱氨酸残基的密码子之后退火以最小化二硫键。相反的反向3'引物的设计取决于预测蛋白质的类型。对于含有LPXTG的那些蛋白质，设计引物如此它可在细胞壁锚定区域的起始点(5'末端)退火。对于所有其它预测的蛋白质，设计它们如此它们可以在0RF的3'末端退火。另外，最初设计5，-正向引物允许与具有相反的3，-反向引物的硫氧还蛋白框内融合，该3，-反向引物允许连读以包括下游的his-patch和V5表位(pBAD/thio-T0P0，Invitrogen，Carlsbad,California)。PBAD载体使用阿拉伯糖诱导型启动子。平行地，这些相同的PCR产物还克隆进入pCRT7T0P0(Invitrogen,Carlsbad,California)。这允许N-末端与Xpress表位和his-tag融合用于纯化。所有PCR反应如模板一样使用酿脓链球菌Ml菌株，SF370(ATCC编号700294)。PCR产物转化为大肠杆菌宿主，TOP10，并在含有100ng/mL氨节靑霉素的SOB上铺板。使用载体特异性5'引物和退火为基因插入物的特异性3'反向引物通过PCR扩增筛选菌落。菌落被接种到含有50pL50%甘油的96孔微量滴定板的孔中。每个基因的10-12个菌落接种在滴定板的一排上。在第二个96孔PCR平板中，设立对感兴趣的基因具有特异性的50pL的反应。悬浮于甘油中的lpL的细胞用作PCR反应的模板。进一步分析产生预期大小的带的反应。将S0B介质加入接种于50%的甘油的细胞中并在37'C培养5-8小时并在-7(TC冷冻。PCR阳性菌落接种至2mL的培养物中过夜生长。部分培养物用于制备质粒DNA,该质粒DNA通过限制性消化分析一证实插入片段的存在，而使用另一部分接种10mL的表达培养物(对于pBAD质粒)用于表达。对数中期培养物用0.5%的L-阿拉伯糖诱导2小时。筛选前T7/NT质粒转化为表达菌株BLR(DE3)pLysS。T7/NT培养物通过加入lmM的IPTG诱导并培养2小时。诱导的培养物的全部溶菌产物进行SDS-PAGE一式两份。一块凝胶用考马斯蓝染色另一块转移到硝化纤维并用相应的表位标记物的抗体探测。阳性克隆在l-2L体积中生长并诱导大范围的纯化。重组蛋白质的溶解性和表达水平通过细胞的冷冻-融化溶解，随后DNA酶/RNA酶消化并在RC5B冷冻离心机(sorbol,Dupont，Wilnington，Delaware)中以9000g离心15分钟进行评估。从不溶的物质中除去可溶的部分，并通过SDS-PAGE将二者分离和评价蛋白质的位置和表达。通过将溶解细胞的可溶部分经过Ni-NTA(QiagenInc.，Valencia,California)树脂并用异吡唑洗提结合的蛋白纯化可溶的融合蛋白。洗提的蛋白质在PD-IO交换柱上缓冲交换(AraershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NewJersey)。洗涤不可溶的重组蛋白质并在PBS、0.1%的TRITON-X100中离心3次。然后内含体溶解于PBS4M尿素并通过PD-10交换柱(AmershamPharmacia,Piscataway,NewJersey)缓冲交换至PBS、0.01%TRITON-X100，0.5MNaCl。通过Lowry测定定量蛋白质并使用SDS-PAGE检验纯度和浓度。多克隆抗血清的产生SwissWebster小鼠(每组5只)在0、3和5周用5ug上述制备的纯化的蛋白质、100ugAlP04和50ugMPL⑧免疫，然后在第8周取血。酿脓链球菌和LV-SEM的免疫金标记如以前所描述的标记细菌细胞(49)。简言之，晚期对数期(late-logphase)细菌培养物洗涤两次，并在10mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH7.4)中重悬浮到IX10S细胞/ml的浓度并放置在包被有玻璃盖片的聚-L-赖氨酸上。过量的细菌从盖玻片小心地洗去并且未标记的样品放入固定剂中(2.0%戊二醛，存在于含有7.5%的蔗糖的0.1M二甲胂酸钠缓冲液中)30分钟。以胶体金标记的细菌用含有0.5%的牛血清清蛋白的PBS洗涤,并且上述制备的预-免疫或超-免疫的小鼠多克隆抗体在室温下应用1小时。然后小心地洗涤细菌，接合18nm的胶体金颗粒(JacksonI咖unoReseaxchLaJhoratories，Inc.，WestGrove，Pennsylvania)山羊抗-小鼠的1:6稀释液在室温下使用10分钟。最后，所有的样品用PBS小心洗涤，并放入上述固定剂中。在O.1M二甲胂酸钠缓冲液中，从样品中洗涤固定剂两次IO分钟，并在含有iy。四氧化锇的0.1M二甲胂酸钠中在固定30分钟。然后用O.1M二甲胂酸钠洗涤样品两次，乙醇脱水，由使用Samdri-780A(Tousimis，Rockville，Maryland)的Anderson0)2方法干燥到临界点，并用1-2nm的铂不连续层包被。酿脓链球菌细胞用在低加速电压(1-4.5keV)操作下的LE01550场致发射扫描电子显微镜观察，使用次级电子探测器用于常规的局部解剖成像，和使用高分辨率的Robinson反向散射探测器通过原子数目对比增强胶体金的显示。实施例2-免疫和攻击小鼠的肠胃外免疫6周大的雌性CD1(CharlesRiverBreedingLaboratories,Inc.，Wilnington，Mass.)或SwissWebster(TaconicFarmInc.Gennantown，NewYork)小鼠在0、4和6周时用混合50ngMPL⑧(Corixa，Hamilton,MT)的5吗感兴趣的蛋白质免疫，然后用最终体积为200pL的每剂100吗A1P04的盐溶液皮下(s.c.)注射小鼠。对照小鼠用5n破伤风类毒素混合相同的佐剂注射。所有的小鼠在最后一次免疫后的7天取血；然后分离血清并在-2(TCjie存。小鼠鼻内攻击模型最后一次免疫后10天，攻击酿脓链球菌菌株(1X10S到9X108菌落形成单位(CFU))16小时的培养物，在含有20%的正常家兔血清的Todd-Hewitt/酵母液体培养基中生长，并重悬浮于10ml的PBS中，鼻内给予25g的雌性CD1(CharlesRiverBreedingLaboratories，Inc.，Wilmington，M.ass)或SwissWebster(TaconicFarmsInc.,Germantown，NewYork)小鼠。通过在血液琼月旨平板上将稀释的培养物铺板确定活菌计数。用1.2mg的盐酸开他敏(ketamineHC1)(FortDodgeAnimalHealth,Ft.Dodge,Iowa)通过i.p.注射麻醉各个小鼠。细菌悬浮液接种到麻醉小鼠的鼻孔(每小鼠10pL)。攻击后16小时，杀死小鼠，除去鼻子并在3-ml无菌盐水中用组织匀浆器(Ultra-TuraxT25，Janke和KimkelIka-Labortechnik，Staufen，Germany)匀化。该匀浆在盐水中以10-倍序列稀释并在含有200mg链霉素/ml的血液琼脂平板上铺板。37。C过夜培养后，计数平板上的e-溶血性菌落。所有的攻击菌株以链霉素耐受性标记以将它们与可能存在于正常菌群中的0-溶血性细菌相区别。皮下小鼠攻击模型五周大的(20-30g)远系繁殖的、具有免疫能力的、无毛的雄鼠(菌株Crl:SKHl-hrBR)(CharlesRiver，Wilmington,Massachusetts)用于皮下注射。在人为的安乐死后收集组织样品。收获如实施例1所描述的生长的酿脓链球菌，并用无菌冰冷的无致热原的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤一次。光密度调整到600nm(OD6oo)以获得所需的接种物。0.lml的酿脓链球菌(1X10SCFU)用结核菌素注射器皮下注射到各个动物的右胁腹。对照小鼠用相同体积的PBS处理。对于各个试验每只小鼠接种的CFU的量通过在含有5先的绵羊血的胰蛋白琼指平板(BectonDickinson,Cockeysville,Md.)上的菌群计数证实。观察免疫后的小鼠21天。从经心脏穿剌杀死的各个动物收集血液并在血液琼指平板上培养。组织釆集和组织学接种前，动物用随机数量发生器分成几组，提取血液样本建立基础的血液学数据。接种后24、48和72小时收集血液和组织样品。对于所有的时间点用于血液和组织收集的方法是相同的。从动物的后眼眶窦获得血液样品，并使用具有种特异性软件的TechniconH*l(Tarryt0Wn，N.Y.)血液学分析仪进行完全的血液计数分析。通过在脓肿或注射位点周围宽边界地切除收集皮肤样品。这些样品总是包括来自注射位点的组织以及用于比较的邻近的大概正常的组织。小心地保存样品的解剖定位。还从心脏、肝、脾和肺获得组织样品。全部组织固定在添加了氯化锌的10%的中性缓冲福尔马林水溶液中(Antech,Ltd.,BattleCreek，Michigan)。整个的肺首先用福尔马林水溶液浸泡，然后连同其他器官一起通过浸没固定。样品放置于福尔马林中18到24小时，然后在加工前转移到70%的酒精中。使用以上行梯度的酒精进行脱水、在二甲苯中清洗、和石蜡渗透包埋的标准的组织学方法。石蜡块用手摇切片机加工成4罔的切片。该组织学切片用曙红和苏木精染色并封固。将选择的组织进行切片并用组织革兰氏染色剂染色。小鼠测定在GAS接种前称重小鼠。接种后12小时和此后第一个星期的每天测定小鼠的重量和脓肿的大小。然后在整个的21天里每周观察动物一次。脓肿的大小用卡规测量；使用长度")和宽度(的值计算脓肿的体积[^4/3ita/2"X(/T/2)]和面积[^Jta/2)X(/f/2)]，使用椭球形的方程。实施例3最初选择77个0RF用于通过"湿法化学"的表征。这些研究方面包括l)通过全细胞ELISA测定针对各个纯化的蛋白质产生的特异性小鼠多克隆血清与细菌表面反应的能力，2)通过LV-SEM确定这些相同的血清与对数期或静止期生长期间的细菌细胞表面反应的能力，3)酿脓链球菌的菌株(M血清型)以及包括C组和G组的其它种类的链球菌的基因的遗传保守性，4)如经斑点印迹所确定的由这些菌株进行特异性蛋白的表型表达，5)通过定量的PCR(qPCR)在转录水平上感兴趣的基因的表达，和6)在体外调理吞噬测定中人抗体对这些蛋白进行调理的能力。在;t^斧慮中克隆和表达了74个0RF，纯化62个表达蛋白。这些纯化的蛋白注入小鼠用于特异性抗体的生产，通过全细胞ELISA和LV-SEM完成对这些特异性抗体的分析。另外，评估了酿脓链球菌和其它链球菌种类的24个0RF的遗传保守性；通过qPCR体外和体内评估少量ORF在转录水平上的表达。最后，对酿脓链球菌蛋白具有特异性的人抗体被纯化并在调理吞噬测定中评估。全细胞酶联免疫吸附测定(ELISA)使用酿脓链球菌SF-370接种含有0.5%的酵母提取物(THY)的Todd-Hewitt培养液，并在37'C培养过夜。通过离心收获细胞并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次。细菌在PBS中被重悬浮至0D咖的值为0.2，并且96孔聚苯乙烯微量滴定板的各个孔中加入lOOnl的细菌悬浮液。然后该滴定板在室温下晾干，用聚酯薄膜平板密封器密封在4°C下倒转储存3个月。在测定准备中，平板用Tris缓冲盐溶液(TBS)/0.1%Brij-35洗涤三次，100^1/每孔的0RF-特异性抗血清加入各个孔中，并在37。C培养2小时。然后用TBS/0.1%Brij-35洗涤平板三次，100^1/每孔的第二抗体接合物加入各个孔中，室温下培养l小时。最后，用PBS洗涤三次后，100nl/每孔的底物加入各个孔中并使之在室温下发育60分钟。通过加入50^1/每孔的3NNaOH终止反应。使用ELISA平板读出器确定吸光率(0D4()5)。遗传保守性的聚合酶链反应(PCR)分析检验的细菌菌株包括来自酿脓链球菌的10种，SF370(M1)、90-226(Ml)、80-003(Ml)、CS210(M2)、CS194(M4)、83-112(M5)、CS204(0F+、Mll、Tll)、CS24(M12)、95-0061(M28)、CS101(M49)，和第四个Ml的血清型SpeB+，两种51zoo印icfe組'cws菌株，CS258和GB21，和三个G组链球菌菌株，CS241、CS140和CS242。5ml过夜培养物在THY中生长。两个和一个半毫升的各个培养物离心并在480nl的50mMEDTA、120^1的10mg/ml的溶菌酶和2^1的2500单位/ml的变溶菌素中重悬浮。样品在37。C培养1小时。接着使用Promega'sWizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega'sWizardGenomicDNAPurificationKit)进行剩余物的基因组纯化。测定中使用用于全长基因的引物组和其次设计用于qPCR的引物(见下文)。PCR循环条件如下:94。C保持l分钟，94"C15秒16轮和58。C10分钟，前面每个增加15秒，12轮的94tU5秒和58t:iO分钟，72'C保持10分钟，和最后保持在4r。通过在琼脂糖凝胶的迁移率证实PCR产物。任何含有适当大小的强度带的扩增被认为是阳性结果。定量PCR(qPCR)从上述细菌培养物中或从感染的匀化的小鼠组织中分离RNA。样品在2ml的RNAhfeHAmbion，Austin,TX，USA)中重悬浮并使用干冰/乙醇快速冷冻在-70'C贮存直到使用。样品解冻到室温，然后使用上述方法再次冷冻，共进行三次冷冻-解冻的循环。样品或者用100pllOmg/ml的溶菌酶和10nl2500单位/ml的变溶菌素处理，并在37'C培养1小时，或者样品与等体积的0.lram的玻璃珠混合并放入玻璃珠搅拌器在4800rpm搅拌l分钟以溶解细胞。从玻璃珠中回收上清液并向玻璃珠中加入另外40(^1的RNAht"并如上述进行混合。从玻璃珠或消化的溶液中回收的上清液与等体积的RNA水溶液(RNAqueous)溶解/结合溶液(Ambion)混合并有力地涡旋搅动。样品在微量离心机中高速旋转2分钟以沉淀任何剩余的组织。上清液与等体积的64%的乙醇混合并通过滤筒过滤，一次70(^1。滤筒如RNA水溶液(RNAqueous)手册中描述的方法洗涤。样品用2X25pl95°C的洗提溶液洗提。在37'C使用游离DNA进行两次1.5^1的DNA酶处理各1小时以除去任何基因组的污染。在如RETROscript(Ambion)的方案中所描述的具有热变性的40nl的最终体积的RT反应物中使用纯化的RNA以生产cDNA。样品在85'C变性，并通过在42'C接种1小时被逆转录，随后在92。C培养10分钟。使用用引物表达软件(PrimerExpresssoftware)(应用生物系统AppliedBiosystems，FosterCity，〔:A，USA)设计的、对各个0RF具有特异性的引物和探针进行定量PCR。使用2XTaqmanUniversalPCRMasterMix(应用生物系统AppliedBiosystems)、300nM的正向引物、300nM的反向引物、200nM的FAM/TAMRA探针和cDNA模板建立25pl的反应物。PCR反应如下50。C2分钟，95°C10分钟，40轮95。C15秒和60。C1分钟。核糖体16SRNA用作内部对照，所有的结果对于16SCt值被标准化。基于从标准曲线获得的结果，将加入这些孔的cDNA稀释100倍以产生与感兴趣的ORF相似的Ct值。人多形核白细胞(PMN)的纯化从四个共体获得的人全血集合中使用Percoll梯度纯化PMN。通过在Hank氏平衡盐溶液(Hank'sBalancedSaltSolution)(HBSS)中稀释Percoll制备3层梯度。Percoll:HBSS的值分别是:最密集的相为2.7:1，中间相是1.079:1和上层的相为1.07:1。体积为10ml的全血在梯度上分层并在20°C、2600RPM下离心20分钟。除去上层，在PBS中用葡萄糖洗涤以除去Percoll,离心并重悬浮于无菌的水中以裂解红血球。加入正常盐水的20倍浓縮的溶液以平衡、再离心和除去裂解的细胞，PMN被重悬浮并计数。使用前细胞稀释到含有钙和镁的PBS中并使其达到37'C。从人血清中获得的ORF特异性抗体的印迹分析2网的蛋白质包被在硝化纤维上并使之晾干15分钟。该印迹在BLOTTO中室温下培养30分钟，然后用5ral聚集的人血清原生质4X:下培养16小时。硝化纤维在PBS中用0.2%的Tween20冲洗并用与碱性磷酸酶接合的山羊抗人IgG在室温下培养2小时。再洗涤印迹并在NBT/BCIP基质中展开。人抗体的亲合性纯化使IOO吗各个酿脓链球菌的纯化的蛋白粘附到硝化纤维的带上，用5%的BLOTTO阻断15分钟，然后用PBS冲洗。血清在4。C下过夜吸附后，用PBS洗涤硝化纤维带并用lOOmM的甘氨酸在pH3.0时冲洗以洗提结合的抗体。洗提的抗体用1M、pH8.8的Tris中和并在PBS中渗析。用和人全血检验这些抗体对于SF-370菌株的0PA。调理吞噬测定(OPA)使用酿脓链球菌菌株SF-370接种THY培养液并静态生长过夜。过夜的培养物稀释到新鲜的培养基中并进一步培养至0D^的值为0.5-0.7。离心细胞，用PBS洗涤一次并在冰冷的PBS中重悬浮至0D65。的值为0.5。在PBS中稀释细胞到1:5，000并在4。C下与检验的抗体或抗血清混合30分钟。预热的PMN以每耙细胞100和200个效应细胞的比率加入细菌和抗体。反应物在振荡器上37。C培养1小时，最后用冰冷的PBS停止反应并在BHI琼脂上平行铺板两次。使用全人血进行OPA获得分别用肝素处理的人血并在37'C培养15-30分钟直到使用。如所描述的制备细菌，并用5(^1检验的抗体在4'C下培养15分钟，然后加入430pl的全血。反应物在振荡器上37。C培养1.5小时，并在BHI琼脂上平行铺板两次。各个试验显示的是各个人的全血样品，而不是集体的。全细胞ELISA通过ELISA检验ORF特异性抗体与全细胞表面反应的能力。如以前所描述的在小鼠中生产抗体。反应性证实在酿脓链球菌细胞的表面表达的蛋白质的数量和/或以允许抗体结合的模式暴露的蛋白质的区别。ELISA效价显示于表XV中并表明蛋白质表达的量或允许抗体反应的暴露的表位的数量的不同反射的反应性的范围。高于预免疫本底效价的值以黑体显示。表XV.酿脓链球菌ORF的全细胞ELISA效价Orf#ELISA效价Orf#ELISA效价68〗.，63513586,201731,70214874,0071452，10516593,240218〗，13916645,3552321，27716982，0323091，45617231,2733472，76617883，3244331，43117891，47555422，873181840,2716611，72718202,4986681,869■8956782，14419831，1796853，09420151,8007041，716201924，66972168020641,486729〗，38122584,96274711，733237919,2208504，86124174,2259674，82324504,22511571，82724522，25611911，24824592，1661202b1,19424775,4121218220，2892497666122421，17025938,60212841，37426012,00013166,407基因保守性进行一些链球菌菌株的PCR分析以测定各个ORF保守性的程度。从这一分析获得的结果可见于图11中。通过凝胶电泳分析所有的PCR产物并将带的大小与预测值比较。显示为阳性的所有的ORF表明PCT产物以预期的大小迁移。数据显示高度的基因组保守性，所有11个酿脓链球菌菌株的检验的24个ORF中21个ORF是保守的。另外，C组和G组中18个是保守的；在B组链球菌的菌株中观察到最低量的保守性。选择的酿脓链球菌0RF的定量的PCR进行定量的PCR以鉴定包含于酿脓链球菌的基因组中的一些0RF的转录。而且，使用该方法作为在刺激感染模型中鉴定体内基因表达的手段。包含两个已知的转录调节基因，roA和Mga，和一个其它的管家基因，gyrA作为另外的对照。所有被检验的基因进行表达，并根据条件，一些基因在转录水平上显示变异。该值以Ct数表示，它显示在哪一个PCR循环可检测到扩增超过本底。因此，较低的Ct值表明大量的mRNA存在于起始材料中。在检测的总量的mRNA中一个Ct差异与两倍的差异相联系。图12显示这--分析的结果。所有的ORF显示比无模板的对照明显低的Ct值。0RF2019显示在大腿中的表达比在肺或体外培养物中观察到的表达低155倍。另一方面，0RF2477，当从感染8小时后的肺中提取时，相对于大腿或体外培养物在mRNA水平上显示49倍的增加。这些数据显示所有检验的0RF的体外或体内转录为细菌暴露的条件所影响。人血清对酿脓链球菌蛋白的反应性从人血清中纯化抗体以检测0RF特异性抗体增强PMN吞噬和杀死酿脓链球菌能力的能力。通过点印迹显示人血清对几种酿脓链球菌蛋白的反应性的图表明该血清适合作为调理吞噬研究的抗体来源。表XVI总结了这些印迹的结果。这些印迹的结果显示24个PRF蛋白中的14个对人血清的反应性检测为阳性。在一个相似的试验中，针对蛋白质检验单一的人血清，其结果与表XVI中显示的一致。根据它们的反应性和可获得的材料的数量选择一些蛋白质用于亲合性纯化抗体的研究。表XVI.对反应蛋白质的0RF鉴定<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>注释:粗体=阳性具有纯化的PMN的亲合性纯化的人抗-0RF抗体的调理吞噬活性从四个人的血液样品的集合中纯化PMN，如上文所述培养酿脓链球菌SF-370。细菌、PBS稀释液和PMN用作阴性对照。杀死的百分比通过分离从包含具有CFU的检验抗体的反应中回收的CFU进行计算，该CFU从含有阴性对照的反应中回收。这些研究结果总结于表XVII中，表明当用纯化的PMN培养时亲合性纯化抗体对SF-370具有调理活性。特别是，ScpA和0RF1224的抗体导致大于50%的致死率，与在0PA中全部三次测定的阴性对照一样。表XVII.亲合性纯化人抗体对具有纯化的PMN作为效应细胞的酿脓链球菌蛋白的调理吞噬活性__<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>试验#1606463NDNDND试验#2655359NDNDND试验#3628545713161平均值62.367.355.7713161i调理吞噬活性与阴性对照相比。PMN与细菌的比是100:1。亲合性纯化抗体是反应混合物的10%(1:10稀释)。ND-无数据。使用全血的亲合性纯化人抗体的调理吞噬活性具有酿脓链球菌的传统的0PA利用全血作为效应细胞的来源。进行试验以确定存在于全血中的亲合性纯化抗体是否具有调理活性。结果概括于表XVIII中并显示取决于其血液被用作PMN的来源的个体的可变的结果。然而，0RF1224和145的抗体使用检验的所有7个个体血液样品始终给出较大的OPA效价。相反，使用所有7个血液样品ScpA的抗体始终产生较小的0PA效价。这是没有预料到的，因为当用PMN检验ScpA的抗体时，在3个检验中都超过50%的致死率。5个其它的蛋白质的抗体对于同源的菌株针对酿脓链球菌SF-370具有较不一致的0PA。应注意到ORF1284的抗体在试验4和7中产生大于50%的致死率。表XVIII.使用全血作为效应细胞来源的0PA。人5"145ORF抗体的调理吞噬致死(百分数)1122412841698181824591218c;x4116778660564582562365079866872642831647565339426633414485441256362335196956356342194267576854625465367564594233381916平均值1458645132504733标准差10121317201325121当与包含全血、细菌和PBS的反应比较时的调理吞噬活性(实施例4-链球菌致热性外毒素I的生物学活性进行表征SPEI的生物学活性的研究。数据表明SPEI具有超抗原活性并且非特异性地诱导显示T细胞受体VP区域(TCRV|3)6.7、9和21.3的T细胞的增殖。SPEI通过等电子聚焦和亲合层析的结合纯化SPEI。纯化的毒素通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳显示是同源的。超抗原性测定家兔脾细胞以2X105细胞/孔的浓度接种到96孔微量滴定板的孔中。10倍稀释的毒素加入孔中一式四份，从1.0ug/孔下降至10—Sug/孔。这些稀释液与作为阴性对照的仅PBS存在时培养的细胞和作为阳性对照的其它SPE相比较。脾细胞在37'C生长3天，用luCiSH-胸苷脉冲过夜。第二天收集细胞，如通过311-胸苷掺入DNA测定一样，在闪烁计数器(BeckmanInstruments,Fullerton，CA)中测定细胞增殖。T细胞所有组成成分的流式细胞仪分析从3个正常的人供体中获得的周围血液单核细胞(PBMC)通过经Ficoll-Hypaque(Histopaque，Sigma)的密度梯度沉淀从肝素化的静脉血分离。然后在Hank氏平衡的盐溶液(HBSS)(MediatechCellgro，Herndon，VA)中洗涤细胞三次并在用于细胞培养的培养基中重悬浮。PBMC(1X106细胞/ml)在RPMI1640(MediatechCellgro)中培养，该RPMI1640添加了10%的热灭活的胎牛血清(FCS)(GeminiBioproducts，Woodland,CA)、20mMHEPES缓冲液(MediatechCellgro)、lOOu/ml青霉素(MediatechCellgro)、100ug/ml链霉素(MediatechCellgro)、和2mML-谷氨酰胺(MediatechCellgro)。细胞在抗-CD3(20ng/ml)或SPEI(100ng/ml)存在的情况下培养3天，在如先前所描述的为了T细胞所有组成成分的免疫荧光分析进行洗涤和染色前，洗涤并使之在白介素2(50U/ml)存在的情况下再生长一天。对于流式细胞仪研究，PBMC在HBSS中洗涤并在染色溶液[具有5%的FCS的PBS(GeminiBioproducts),1%的免疫球蛋白(AlphaTherapeuticCorp.,LosAngeles,CA)，0.02y。的叠氮化钠(Sigma)]中以10X10e细胞/ml的浓度重悬浮。细胞在96孔、圆底的平板中染色，该平板具有一系列针对人TCRVp2、3、5.1、5.2、7、8、11、12、13.1、13.2、14、16、17、20、21.3、22(I腿unotech，Westbrook，ME)、TCRVp9、23(Pharmingen，SanDiego，CA)和TCRV卩6.7异硫氰酸荧光素(FITC)(Endogen，Woburn,MA)的生物素化的单克隆抗体，然后在37'C黑暗中培养30分钟。培养期后，用洗涤缓冲液[PBS，2%FCS(GeminiBioproducts)，0.02%的叠氮化钠(Sigma)]通过在4'C下以300g离心5分钟洗涤细胞两次。细胞颗粒在染色溶液中重悬浮并用抗-CD3别藻蓝蛋白(APC)、抗-CD4藻红蛋白(PE)(BectonDickinson,SanJose，CA)、抗-CD8(FITC)(BectonDickinson)和链霉抗生素多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)接合物(BectonDickinson)4'C下培养30分钟。通过在4'C下以300g离心5分钟，染色的细胞在洗涤缓冲液中再洗涤两次和在PBS中的0.02%的叠氮化钠(Sigraa)中洗涤一次。最后细胞固定在200ul的PBS中的l%(v/v)的甲醛中(Polysciences，Warrington,PA)。如先前所述使用四色流式细胞仪(FACSCalibur，BectonDickinson)进行分析。先前还描述了细胞仪的建立和数据获得的方法。使用Cellquest程序(BectonDickinson)分析列表形式的多参数档案(各个档案具有前向散射、侧向散射和4个荧光参数)。活化的种群的分析使用根据T-细胞胚细胞种群设定的光散射门控进行。使用阴性对照试剂证实试验抗体的染色特异性。微量渗透泵在3组中的6只美国荷兰束带的家兔的左侧胁腹植入含有500ug的SPEI或200ug的TSST-1的皮下微量渗透泵。在15天的阶段中评估毒素的致死率。结果如通过将3H胸苷掺入DNA进行测定(图14)，在4天的测定中评估SPEI诱导小鼠脾细胞增殖的能力。SPEI与也包含于图中的对照的SPE毒素一样是促有丝分裂的。SPEI的促有丝分裂活性的完全减少与其它毒素观察到的相似在10—6和10-7叫/孔之间。与用抗-CD3抗体刺激的细胞相比，SPEI显著地刺激具有TCRV卩6.7、9和21.3(图15)的人T细胞，这与SPEI是一个超抗原是一致的。某些T细胞种群，例如具有TCRV卩14或17的T细胞与用抗-CD3抗体刺激的细胞相比显著减少。当在皮下植入的微量渗透泵中以200和500ug之间的毒素浓度给予家兔时，大部分致热性毒素超抗原是致命的。SPEI在500ug的剂量时不显示这一特性(3/3存活)。相反，200ug的TSST-1完全致死(3/3死亡)。讨论致热性毒素超抗原通过它们诱导T淋巴细胞非特异性增殖的能力界定，但是取决于T细胞受体的P链的可变部分的组成成分(6)。因此例如，TSST-l将刺激任何具有TCRVp2的人T细胞的增殖，而与应答T细胞的抗原特异性无关。这种高水平的刺激导致细胞因子从T细胞和巨噬细胞大量释放。特别重要的是引起低血压和与TSS有关的休克的肿瘤坏死因子ct和(3是释放。数据显示SPEI作为超抗原刺激T细胞。因此，SPEI引起人周围血液中含有TCRVP6.7.9和21.3的单核细胞增殖。这些选择的T细胞种群的这种增加，以及同时发生的非-剌激T细胞的相对减少，是SPEI的检验标记信号并称做Vp偏移。另外，当如TSS模型(8)以皮下植入的微量渗透泵的方式给予家兔时许多致热性毒素超抗原是致命的。设计这些泵以在7天的期间里释放稳定量的毒素。然而，虽然家兔可在那个时间段内因给予毒素而死亡，试验仍持续15天。SPEI在这个TSS的模型中不是致命的。尽管许多致热性毒素超抗原在这一测定中是致命的，这里仍有明显的例外。例如，新鉴定的葡萄球菌肠毒素L和Q在这一模型中不是致命的，然而这两种毒素具有这一家族要求的所有其它活性(包括超抗原性)。对于这些后来的毒素，已表明它们或者在微量渗透泵的整个7天的毒素释放阶段中不稳定或者在泵中沉淀。相应地，SPEI具有致热性毒素超抗原定义的超抗原特性。尽管上文参考具体的实施例进行说明和描述，本发明仍不欲限制在显示的细节上。而且，在与权利要求书相当且不背离本发明的精神的范围内细节上可做各种修改。参考书目1.1997.公共卫生监督下的传染条件的情况限定.CDC.2.Alra，R.A.，L.S.Ling，D.T,Moir，B.L.King，E,D.Brown，P.C.Doig，D.R.Smith,B.Noonan，B.C.Guild，B.L,dej"onge，G.Carmel，P.J.Tu咖ino，A.Caruso，M.Uria-Nickelsen，D.M.Mills,C.Ives，R.Gilbson，D.Merberg，S.D.Mills,Q.Jlang，D.E.Taylor,G.F.Vovis，和T.J.Trust.1999.人胃病原体^Zj'co&cter的两种不相关的分离物的基因组序列比较[出版错误出现于Nature1999年2月25;397(6721):719].Nature.397:176-80.3.Altschul，S.F.，T丄Madden,A丄Schaffer，J.Zhang，Z.Zhang，W.Miller,和D.J.Lipman.1997.GappedBLAST和PSI-BLAST:—种新产生的蛋白质数据库搜索程序.NucleicAcidsRes.25:3389-402.4.Anderson,T.F.1951.在制备用于电子显微镜的标本时保持三维结构的技术.TransNYAcadSci.13:130-134.5.Benson,G.1999，衔接重复探测器分析DNA序列的程序.NucleicAcidsRes.27:573-肌6.Chen，C.C.，和P.P.Cleary，1989.在大肠杆菌中链球菌C5a肽酶基因的克隆和表达与12M型蛋白基因结合.Infect.Immun.57:1740-1745.7.Chmouryguina,I.，A.Suvorov，P.Ferrieri,和P.P.Cleary.1996.A组和B组链球菌中C5a肽酶基因的保守性.Infect.Immun.64:2387-2390.8.Cockerill，F.R.，3rd,R.L.Thompson,J.M.Musser，P.M.Schlievert，J.Talbot,K.E.Holley，W.S.Harmsen，D.M.Ilstr叩，P.C.Kohner，M.H.Kim，B.Frankfort,J.M.Manahan，J.M.Steckelberg，F.Roberson，和W.R.Wilson.1998.侵袭性链球菌疾病的16个连续病例的分子的、血清学的和临床特征.明尼苏达州东南部的链球菌工作组.ClinInfectDis.26:1448-58.9.Courtney,H.S.,Y.Li，J.B.Dale,和D.L.Hasty.1994.来自A组链球菌的纤连蛋白/纤维蛋白原-结合蛋白的克隆、测序和表达.InfectImmun.62:3937-46.10.Cserzo，M.E.Wallin，I.Simon，G.vonHeijine，和A.Eofsson.1997.在原核细胞膜蛋白中跨膜a螺旋的预测密集排列表面方法.ProteinEngineering.10:673—6.11.Cunningham,M.W.，和A.Quinn.1997.链球菌M蛋白和肌球蛋白的I类表位之间的免疫学交叉反应性.AdvExpMedBiol.418:887-92.12.Dale,J.B.，W.Baird，H..S.Courtney,D丄Hasty,和M.S.Bronze.1994.针对A组链球菌咽部感染通过脂磷壁质酸被动保护小鼠.JInfectDis.169:319-23.13.Dale,J.B.，M.Simmons,E.C.Chiang,和E.Y.Chiang.1996.重组,八价的A组链球菌M蛋白疫苗.Vaccine.14:944-8.14.Dale,J.B.，R.G.Washburn,M.B.Marques,和M.R.Wessels.1996.透明质酸盐被膜和表面M蛋白抵抗A组链球菌的调理作用.InfectImmun.64:1495-501.15.Eddy，S.R.1996.隐蔽的Markov模型.CurOpinStructBio.6:361-5.16.Ellen，R.P.,和R.J.Gibbons.1972.与M蛋白相关的酿脓链球菌与上皮表面的粘着毒性的先决条件.InfectImmun.5:826-830.17.Eng，J.K.，A.L.McCormack，和J.R.Yates，3rd.1994.在蛋白质数据库中将串联的肽的质谱数据与氨基酸序列联系起来的方法.AmSocMassSpectrometry.5:976-89.18.Fischetti，V.A.，V.Pancholi，和0.Schneewind.1990.来自革兰氏阳性球菌的表面蛋白的锚定区域中己肽序列的保守性.MolMicrobiol.4:1603-5.02810999.6说明书第57/61页19.Fogg,G.C.，和M.G.Caparon.1997.酿脓链球菌中结合的纤连蛋白的构成表达是rofA的厌氧活化的结果.JBacteriol.179:6172-SO-SO.Foster,T.J.，和M.Hook.1998.金黄色葡萄球菌的表面蛋白粘附素.TrendsMicrobiol.6:484-8.21.Fraser，C.M.，S.Casjens，W.M.H腿g，G.G.Sutton,R.Clayton,R.Lathigra，0.White,K.A.Ketchum，R.Dodson，E.K.Hickey，M.Gwinn，B.Dougherty,J.F.Tomb，R.D.Fleischma皿，D.Richardson,J.Peterson,A.R.Kerlavage，J.Quackenbush，S.Salzberg,M.Hanson,R.vanVugt，N.Palmer,M.D.Adaras，J.Gocayne，J.C.Venter等.1997.拉姆病螺旋菌，6o/7'eh'ak/2^/or/eW，的基因组序列[见注释].Nature,390:580-6.22.Hacker,J.，G.Blum-Oehler，I.Muhldorfer，和H.Tschane.1997.毒性细菌的致病性岛结构、功能和对微生物进化的影响.MolMicrobiol.23:1089-97.23.Hanski，E.，和M.Caparon.1992.蛋白质F，一种纤连蛋白结合蛋白，是一种酿脓链球菌A组链球菌的粘着物.ProcNatlAcadSci.,USA.89:6172-76.24.Hanski，E.，P.A.Horwit7"和M.G.Caparon.1992.在异源的链球菌和肠球菌菌株促进它们向呼吸上皮细胞粘附中，酿脓链球菌JRS4的纤连蛋白结合蛋白一蛋白质F的表达.InfectIramun.60:5119—5125.25.Hernandez-Sanchez，J.，J.G.Valadez，J.V.Herrera，C.0ntiveros，和G.Guarneros.1998.A棒状小基因-介导的蛋白质合成的抑制涉及肽基-tRNA的累积和tRNA的缺乏.EMB0Journal.17:3758-65.26.Huang,T,T.，H.Malke，和J.J.Ferretti.1989.A组链球菌链激酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达和序列分析.MolMicrobiol.3:197-205.27.Hynes，W.L.，A.R.Dixon,S.L.Walton,和L.J.Aridgides.2000.酿脓链球菌的细胞外透明质酸酶基因(力y").FEMSMicrobiolLett.184:109-12.28.Hynes，W.L.，L.Hancock,和J.J.Ferretti.1995.来自酿脓链球菌的次级噬菌体透明质酸酶基因的分析涉及细胞外酶活的第三个透明质酸酶的证据.InfectImmun.63:3015—20.29.Isberg，R.R.，和G.TranVanNhieu.1994.通过整合蛋白受体微生物的结合和内在化.TrendsMicrobio.2:10-4.30.Jones,K.F.，和V.A.Fischetti.1988.结合在M6蛋白上的抗体的位置对于A组M6链球菌的调理作用和吞噬作用的重要性.JExpMed.167:1114-23.31.Kihlberg，B.M.，M.Collin,A.01sen,和L.Bjorck.1999.蛋白质H,—种酿脓链球菌中抗吞噬作用的表面蛋白.InfectImun.67:1708-14.32.Koebnik，R.1995.提出一种在一些细菌细胞表面蛋白的C-末端区域中与肽聚糖缔合的or螺旋基序.[信函；注释].MolecularMicrobiology.16:1269-70.33.Loessner，M.J.，S.Gaeng，和S.Scherer.1999.在金黄色葡萄球菌噬菌体187的内溶菌素基因中完全包埋于读框外的holin-样蛋白质基因的证据.JBacteriol.181:4452—60.34.Lukashin，A.V.，和M.Borodovsky.1998.基因标记.hmra:基因搜索的新方法.NucleicAcidsRes.26:1107-15.35.Lukomski，S.，C.A.Montgomery,J.Rurangirwa，R.S.Geske，J".P.Varrish，G.J.Adams,和J.M.Musser.1999.由酿脓链球菌产生的细胞外半胱氨酸蛋白酶参与小鼠中侵袭性皮肤感染和传播的病理.InfectImraun.67:1779-88.36.Madore，D.V.1998.作为流感嗜血杆菌b型疫苗功效的指示剂的免疫应答的表征.PediatrInfectDisJ.17:S207-10.37.Matsuka，Y.V.，S.Pillai，S.Gubba，J.M.Musser，和S.B.Olmsted.1999.由酿脓链球菌细胞外半胱氨酸蛋白酶进行的血纤蛋白原的酶切和抑制酶的蛋白水解活性的抗体的产生.InfectInramn.67:4326-33.38.Ma薩nian，S.K.,G.Liu，H.Ton-That,和0.Schneewind.1999.金黄色葡萄球菌分类酶，一种锚定表面蛋白到细胞壁的酶.Science.285:760-3.39.McAtee，C.P.，K.E.Fry,和D.E.Berg.1998.通过"蛋白质代谢proteome"技术鉴定^eJico^"erp^ar/的潜在诊断和疫苗候选物.Helicobacter.3:163-9.40.McAtee，C,P.，M.Y.Lim，K.Fung，M.Velligan，LFry,T.Chow，和D.E.Berg,1998.通过二维凝胶电泳、序列分析、和血清表征鉴定《eij'co/ba"erA^anf的潜在诊断和疫苗候选物.ClinDiagnLabImmunol.5:537-42.41.McAtee，C.P.，M.Y.Lim，，K.Fung，M.Velligan，K.Fry，T.P.Chow，和d.e.Berg.1998.通过蛋白质代谢(proteome)技术表征/fe/j'co^"ara^otj'疫苗候选物.JChromatogrBBiomedSciAppl.714:325—33.42.Mejlhede，N.，J.F.Atkins,和J.Neuhard.1999.在枯草杆菌cdd解码过程中在序列CGAMG上发生核糖体-1移码.J.Bacteriol.181:2930-7.43.Molinari，G.，S.R.Talay，P.Valentin-Weigand,M.Rohde，和G.S.Chhatwal.1977.酿脓链球菌的纤连蛋白结合蛋白，Sfbl，包含于由上皮细胞内在化的A组链球菌中.InfectImmun.65:1357—63.44.Nakai，K.，和M.Kanehisa.1991.在革兰氏阴性菌中预测蛋白质固定位点的专家系统.Proteins.11:95-110.45.Navarre，W.W.，0.Schneewind.1999.革兰氏阳性菌的表面蛋白和它们指向细胞壁外膜的机制.MicrobiolMolBiolRev.63:174-229.46.Nielsen,H.，J.Engelbrecht，S.Brunak，和G.vonHeijne.1997.原核和真核细胞的信号肽的鉴定以及其酶切位点的预测.ProteinEngineering.10:1-6.47.Nizet，V.，B.Beall，D,J.Bast，V.Datta，L.Kilburn，D.E.Low,和J.C.DeAzavedo.2000.A组链球菌生产的链溶素S的基因座位.InfectI腿un.68:4245-54.48.Nordstrand，A.，W.M.McShan，J.J.Ferretti，S.E.Holm，和M.Norgren.2000.链激酶基因的等位基因的取代降低了A组链球菌菌株NZ131的致肾炎的活性.InfectI咖un.68:1019-25.49.Olmsted,S.B.，S.L.Erlandsen，G,M.D觀y，和C.L.Wells.1993.由场致放射扫描电子显微镜高分辨地观察经信息素诱导的接合质粒pCFlO编码的i)2ter。cocctAS/aecsh's表面蛋白.J.Bacteriol.175:6229-37.50.Park,J.,和S.A.Teichmann.1998.DIVCLUS:在单一和多功能域蛋白中发现同源功能域的GEANFAMMER包中的自动方法.Bioinformatics.14:144-50.51.Parkhill，J.，N.Achtman，K.D.J柳es，S.D.Bentley，C.Ch腦her，S.R.Klee，G.Morelli，D.Basham，D.Brown，T.Chillingworth,R.M.Davies,P.Davis，K.Devlin,T.Feltwell，N.Hamlin,S.Holroyd，K.Jagels，S.Leather,S.Moule，K.Mungall，M.A.Quail，M.A.Rajandream，K.M.Rutherford，M.Simraonds，J".Skelton，S.Whitehead,B.G.Spratt，和B.G.Barrell.2000.脑膜炎奈瑟球菌Z2491的血清组A菌株的完全DNA序列[见注释].Nature.404:502-6.52.Pierschbacher,M.D.,和E.Ruoslahti.1987.序列Arg-Gly-Asp-Xaa的立体化学对细胞粘附中结合特异性的影响.JBiolChem.262:17294-8.53.Pizza,M.,V.Scarlato，V.Masignani，M.M.Giuliani,B.Arico，M.Comanducci,G.T.Jennings，LBaldi，E.Bartolini，B.Capecchi，C丄Galeotti，E丄uzzi,R.Manetti，E.Maxchetti，M.Mora,S.Nuti,G.Ratti，LSantini，S.Savino，MLScarselli，E.Storni，P.Zuo，M.Broeker，E.Hundt，B.K卿p，E.Blair，T.Mason,H.Mason，H.Tettelin,D.W.Hood，A.C.Jeffries,N.J.Saunders,D.M.Granoff，J.C.Venter,E.R.Moxon，G.Grandi，和R.R印puoli.2000.通过全基因组测序鉴定针对血清组B脑膜炎球菌的候选疫苗[见注释].Science.287:1816-20.54.Podbielski，A.，A.Flosdorff,和J.Weber-Heynemann.1995.A组链球菌virR49基因控制四种结构的vir调节子基因的表达.InfectIramun.63:9-20.55.Proft，T.，S.LouiseMoffatt，C.J.Berkahn，和J.D.Fraser.1999.来自酿脓链球菌的新的超抗原的鉴定和表征.J.Exp.Med.189:89-102.56.Pugsley，A.P.1993.革兰氏阴性菌中的全部的常规分泌途径.MicrogiolRev.57:50-108.57.Quinn，A.，K.Ward，V.A.Fischetti，M.Hemric，和M.W.Cunningham.1998.链球菌M蛋白和肌球蛋白I类表位之间的免疫学关系.InfectImmun.66:4418-24.58.Reda，K.B.，V.Kapur，D.Goela，J.G.Lamphear，J.M.Musser，和R.R.Rich.1996,链球菌超抗原SSA等位基因变体的系统发育分布提供酿脓链球菌内ssa横向转移的证据.InfectImmun.64:1161-5.59.Salzberg，S.L.，A.L.Delcher，S.Kasif，和0.White.1998.使用插入的Markov模型进行微生物基因鉴定.NucleicAcidRes.26:544-8.60.Sonnenberg，M.G.，和J.T.Belisle.1997.通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳、N_末端氨基酸测序和电喷射质谱定义结核杆菌培养物滤液蛋白.InfectImmun.65:4515-24.61.Bateman，A.T.，R.Birney,S.P.Durbin，K丄Howe和E丄丄Sonnharamer.2000.Pfam蛋白家族数据库.Nuc.Acids.Res.28:263-6.62.Stevens,D.L.1995.链球菌中毒性休克综合症:疾病、发病机理以及治疗的新概念谱.EmergInfectDis.1:69-78.63.Stockbauer，K.E.，L.Magoun，M.Liu，E.H.Burns,Jr.，S.Gubba，S.Renish，X.Pan，S.C.Bodary，E.Baker，J.Coburn，J.M.Leong，和J.M.Musser.1999.具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序的A组链球菌半胱氨酸蛋白酶毒性因子自然变体优选地结合人整合蛋白avp3和allb卩3[在过程引证中ProcessCitation].ProcNatlAcadSci.，USA.96:242-7.64.Ton-That,H.，G.Liu，K.Mazmanian，K.F.Faull，禾口0.Schneewind.1999.分类酶、在LPXTG基序酶切金黄色葡萄球菌的表面蛋白的转录酶的纯化和表征.ProcNatlAcadSci.，USA.96:12424-12429.65.Weldingh，K.，I.Rosenkrands，S.J"acobsen，P.B.Ras咖ssen，M.JLElhay，和RAndersen.1998.用于结核杆菌培养物滤液的分析和六种新的蛋白质的纯化和表征的二维电泳.InfectImmun.66:3492-500.66.Yutsudo，T.，K.0k咖ura，M.Iwasaki，A.Hara，S.Kamitani，W.Minamide，H.Igarashi，和Y.Hinuma.1994.在酿脓链球菌菌株中编码新的有丝分裂因子的基因仅分布于A组链球菌中.InfectionandImmunity.62:4000-4004.67.出版的国际专利申请号WO99/27944.68.美国专利号4,666,829.权利要求1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽包含(i)与任何一个偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列；(ii)任何一个偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列；(iii)任何一个(i)或(ii)中的氨基酸序列的免疫原性片段；(iv)任何一个(i)或(ii)中的氨基酸序列的至少7个连续的氨基酸残基；或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)中任何一个的生物学等价物，所述生物学等价物有效预防或改善易感受检者中p-溶血性链球菌的集群或传染。2.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述生物学等价物与阴性对照相比，当通过0PA中集落生成单位(CFU)的减少进行测定时，显示至少约15%的细菌致死百分率的调理吞噬活性。3.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述生物学等价物与阴性对照相比，当通过0PA中集落生成单位(CFU)的减少进行测定时，显示至少约20%的细菌致死百分率的调理吞噬活性。4.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述生物学等价物与阴性对照相比，当通过0PA中集落生成单位(CFU)的减少进行测定时，显示至少约40%的细菌致死百分率的调理吞噬活性。5.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述生物学等价物与阴性对照相比，当通过0PA中集落生成单位(CFU)的减少进行测定时，显示至少约50%的细菌致死百分率的调理吞噬活性。6.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述生物学等价物与阴性对照相比，当通过0PA中集落生成单位(CFU)的减少进行测定时，显示至少约60%的细菌致死百分率的调理吞噬活性。7.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述生物学等价物提供了免遭p-溶血性链球菌侵袭所需的水平。8.如权利要求7所述的分离的多肽，其特征在于，所述多肽包含任何(i)与任何一个偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列；(ii)任何一个偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列；(iii)任何一个(i)或(ii)中的氨基酸序列的免疫原性片段，或(iv)任何一个(i)或(ii)中的氨基酸序列的至少7个连续的氨基酸残基。9.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述多肽包含与任何一个偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列具有至少85%的同一性的氨基酸序列。10.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述生物学等价物与至少两种品系的溶血性链球菌有交叉反应性。11.如权利要求l所述的分离的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列选自SEQIDN0:6、SEQIDN0:46、SEQIDN0:48、SEQIDN0:80、SEQIDN0:88以及它们的组合。12.如权利要求l所述的分离的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列选自SEQIDN0:16、SEQIDN0:64、SEQIDNO:128、SEQIDNO:140、SEQIDNO:182以及它们的组合。13.如权利要求l所述的分离的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列选自SEQIDN0:32、SEQIDN0:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:104、SEQIDNO:138以及它们的组合。14.如权利要求l所述的分离的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列选自SEQIDN0:66、SEQIDN0:82、SEQIDN0:78、SEQIDNO:142、SEQIDNO:146、SEQIDNO:162、SEQIDNO:186、SEQIDN0:342以及它们的组合。15.如权利要求l所述的分离的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列选自SEQIDN0:2、SEQIDN0:8、SEQIDN0:20、SEQIDN0:22、SEQIDN0:24、SEQIDNO:34、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:54、SEQIDN0:62、SEQIDN0:68、SEQIDN0:90、SEQIDN0:96、SEQIDN0:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:106、SEQIDNO:118、SEQIDNO:124、SEQIDNO:130、SEQIDNO:148、SEQIDNO:158、SEQIDN0:376以及它们的组合。16.权利要求2所述的分离的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列是SEQIDNO:6。17.如权利要求2所述的分离的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列是SEQIDNO:46。18.如权利要求2所述的分离的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列是SEQIDNO:48。19.如权利要求2所述的分离的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列是SEQIDN0:80。20.如权利要求2所述的分离的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列是SEQIDN0:88。21.如权利要求l所述的分离的多肽，其特征在于，所述分离的多肽是任何一个偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列的成熟的多肽。22.—种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含(i)编码如权利要求1所述的分离的多肽的核苷酸序列；(ii)编码如权利要求1所述的分离的多肽的核苷酸序列，其中所述分离的多肽是成熟多肽；(iii)任何一个奇数的SEQIDN0S:1-147中的核苷酸序列；(iv)任何一个奇数的SEQIDN0S:149-181中的核苷酸序列；(v)任何一个奇数的SEQIDN0S:183-187中的核苷酸序列；(vi)任何一个奇数的SEQIDN0S:189-667中的核苷酸序列；(vii)与编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列具有至少70%的同一性核苷酸序列；(viii)与任何一个奇数的SEQIDNOS:1-667中的核苷酸序列具有至少70%的同一性的核苷酸序列；(ix)在严格杂交条件下与编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(x)在严格杂交条件下与任何一个奇数的SEQIDNOS:1-667中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或(xi)与任何一个(i)-(x)中的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。23.如权利要求22所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列选自SEQIDN0:5、SEQIDN0:45、SEQIDN0:47、SEQIDN0:79、SEQIDN0:87以及它们的组合。24.如权利要求22所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:15、SEQIDNO:63、SEQIDNO:127、SEQIDNO:139、SEQIDNO:181以及它们的组合。25.如权利要求22所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列选自SEQIDN0:31、SEQIDN0:57、SEQIDN0:59、SEQIDN0:103、SEQIDN0:137以及它们的组合。26.如权利要求22所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列选自SEQIDN0:65、SEQIDN0:81、SEQIDN0:77、SEQIDN0:141、SEQIDN0:145、SEQIDNO:161、SEQIDNO:185、SEQIDN0:341以及它们的组合。27.如权利要求22所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:7、SEQIDNO:19、SEQIDN0:21、SEQIDN0:23、SEQIDN0:33、SEQIDN0:39、SEQIDN0:41、SEQIDN0:43、SEQIDN0:53、SEQIDN0:61、SEQIDN0:67、SEQIDN0:89、SEQIDN0:95、SEQIDN0:97、SEQIDNO:的、SEQIDNO:IOS、SEQIDNO:117、SEQIDNO:123、SEQIDNO:129、SEQIDNO:147、SEQIDNO:157、SEQIDNO:375以及它们的组合。28.如权利要求22所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列选自25、131、147、149、151、153、155、159、163、165、169、171、173、175、177、179、183、187、215、243、301、327、331、463、541、579、617、619、665、669以及它们的组合。29.—种重组宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有如权利要求22所述的多核苷酸。30.—种重组表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求22所述的多核苷酸。31.—种重组宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有如权利要求22所述的载体。32.—种生产多肽的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在适合于生产由多核苷酸编码的多肽的条件下，培养重组宿主细胞，所述细胞含有(i)如权利要求22所述的多核苷酸或(ii)如权利要求22所述的多核苷酸的重组表达载体；和(b)从培养物中回收多肽。33.—种抗体，其特征在于，所述抗体免疫特异性地结合权利要求l所述多肽。34.如权利要求33所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列选自SEQIDN0:6、SEQIDN0:46、SEQIDN0:48、SEQIDN0:80、SEQIDN0:88以及它们的组合。35.如权利要求33所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列选自SEQIDNO:16、SEQIDNO:64、SEQIDNO:128、SEQIDNO:140、SEQIDNO:182以及它们的组合。36.如权利要求33所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列选自SEQIDNO:32、SEQIDNO:58、SEQIDN0:60、SEQIDNO:104、SEQIDNO:138以及它们的组合。37.如权利要求33所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列选自SEQIDN0:66、SEQIDN0:82、SEQIDNO:78、SEQIDNO:142、SEQIDNO:146、SEQIDNO:162、SEQIDNO:186、SEQIDNO:342以及它们的组合。38.如权利要求33所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列选自SEQIDN0:2、SEQIDN0:8、SEQIDN0:20、SEQIDN0:22、SEQIDN0:24、SEQIDN0:34、SEQIDN0:40、SEQIDN0:42、SEQIDN0:44、SEQIDN0:54、SEQIDN0:62、SEQIDN0:68、SEQIDN0:90、SEQIDN():96、SEQIDN0:98、SEQIDNO:IOO、SEQIDN0:106、SEQIDNO:118、SEQIDNO:124、SEQIDNO:130、SEQIDNO:148、SEQIDNO:158、SEQIDNO:376以及它们的组合。39.如权利要求33所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列选自26、132、148、150、152、154、156、160、164、166、170、172、174、176、178、180、184、188、216、244、302、328、332、464、542、580、618、620、666、670以及它们的组合。40.如权利要求34所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列是SEQIDN0:6。41.如权利要求34所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列是SEQIDN0:46。42.如权利要求34所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列是SEQIDN0:48。43.如权利要求34所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列是SEQIDN0:80。44.如权利要求34所述的抗体，其特征在于，所述抗体与具有一个氨基酸序列的多肽免疫特异性地结合，所述氨基酸序列是SEQIDN0:88。45.—种包含免疫原性量的含有权利要求1所述多肽的成分的免疫原性组合物，其特征在于，所述成分以有效预防和改善易感哺乳动物中P-溶血性链球菌集群或传染的量存在。46.如权利要求45所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物含有至少一部分与肽、多肽或蛋白质接合或连接的所述多肽。47.如权利要求45所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物含有至少一部分与多糖接合或连接的所述多肽。48.如权利要求45所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步含.有生理学可接受的载体。49.如权利要求45所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含有效量的佐剂。50.如权利要求45所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述哺乳动物是人、狗、牛、猪或马。51.如权利要求50所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述哺乳动物是人。52.—种包含免疫原性量的含有如权利要求1所述多肽的成分的免疫原性组合物，其特征在于，所述多肽能够产生特异性识别所述多肽的抗体，并且其中所述成分的量有效预防和改善在易感哺乳动物中|3-溶血性链球菌的集群或传染。53.—种包含免疫原性量的含有如权利要求22所述多肽的成分的免疫原性组合物，其特征在于，所述成分是以有效预防或改善易感晡乳动物中P-溶血性链球菌集群或传染的量存在。54.如权利要求53所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包括含有如权利要求22所述的多核苷酸的重组表达载体。55.如权利要求53所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步含有生理学可接受的载体t56.如权利要求53所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含有效量的佐剂。57.如权利要求53所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述哺乳动物是人、狗、牛、猪或马。58.如权利要求57所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述哺乳动物是人。59.如权利要求53所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述P-溶血性链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或G组链球菌。60.如权利要求59所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述P-溶血性链球菌是酿脓链球菌。61.—种免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包含(i)一种分离的多肽，所述多肽在全部溶血性链球菌的菌株中基本上是保守的，并且它在易感受检者中有效预防或改善溶血性链球菌集群或传染，所述分离的多肽与任何一个偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列具有至少70%的同一性。(ii)(i)的免疫原性片段；或(iii)与(i)或(ii)免疫特异性结合的抗体。62.如权利要求61所述的免疫原性组合物，其特征在于，当针对人血清检验时，所述分离的多肽检验反应性为阳性。63.如权利要求61所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述p-溶血性链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或G组链球菌。64.如权利要求61所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述P-溶血性链球菌是酿脓链球菌。65.如权利要求61所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述分离的多肽在全部菌株中至少约80%是保守的。66.如权利要求61所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述分离的多肽在全部菌株中至少约85%是保守的。67.如权利要求61所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述分离的多肽在全部菌株中至少约90%是保守的。68.如权利要求61所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述分离的多肽在全部菌株中至少约95%是保守的。一种保护易感哺乳动物免遭p-溶血性链球菌集群或传染的方法，其特征在于，所述方法包括给予哺乳动物包含免疫原性量的成分的免疫原性组合物，所述成分含有权利要求1所述多肽，其量可有效预防或改善易感哺乳动物中p-溶血性链球菌的集群或传染。69.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物含有至少一部分任选地与肽、多肽或蛋白质接合或连接的所述多肽。70.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物含有至少一部分任选地与多糖接合或连接的所述多肽。71.一种保护易感哺乳动物免遭P-溶血性链球菌集群或传染的方法，其特征在于，所述方法包括给予哺乳动物有效量的含有权利要求1所述多肽的免疫原性组合物，其中所述多肽能够产生对所述多肽具有特异性的抗体，且所述的量可有效预防或改善易感哺乳动物中P-溶血性链球菌的集群或传染。72.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述多肽含有任何一个SEQIDN0S:2-670中的氨基酸序列的成熟多肽。73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物进一步含有生理学可接受的载体。74.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物通过皮下或肌肉内注射给予。75.76.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物通过口服给予。77.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物通过鼻内给予。78.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述所述p-溶血性链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或G组链球菌。79.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述P-溶血性链球菌是酿脓链球菌。80.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人、狗、牛、猪或马。81.如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。82.—种保护易感哺乳动物免遭P-溶血性链球菌集群或传染的方法，其特征在于，所述方法包括给予哺乳动物有效量的含有如权利要求22所述的多肽的免疫原性组合物，其量可有效预防或改善易感哺乳动物中P-溶血性链球菌的集群或传染。83.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物包括含有如权利要求22所述多肽的重组表达载体。84.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物进一步含有生理学可接受的载体。85.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物通过皮下或肌肉内注射给予。86.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物通过口服给予。87.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物通过鼻内给予。88.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述所述p-溶血性链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或G组链球菌。89.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述P-溶血性链球菌是酿脓链球菌。90.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人、狗、牛、猪或马。91.如权利要求90所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。92.—种在患有p-溶血性链球菌集群或感染的哺乳动物中减少P-溶血性链球菌的数量和生长至少一项的组合物，其特征在于，所述组合物含有与权利要求1所述多肽免疫特异性结合的抗体。93.—种在患有p-溶血性链球菌集群或感染的哺乳动物中减少P-溶血性链球菌的数量和生长至少一项的组合物，其特征在于，所述组合物含有能够阻遏编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列的表达的反义寡核苷酸。94.如权利要求93所述的组合物，其特征在于，所述多肽含有任何一个SEQIDNOS:2-668中的氨基酸序列的成熟多肽。95.—种减少P-溶血性链球菌的数量和生长至少一项的组合物，其特征在于，所述组合物含有能够阻遏编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列的表达的反义寡核苷酸。96.如权利要求95所述的组合物，其特征在于，所述多肽含有任何一个SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列的成熟多肽。97.—种在患有P-溶血性链球菌集群或感染的哺乳动物中减少P-溶血性链球菌的数量和生长至少一项的方法，其特征在于，所述方法包括给予哺乳动物有效量的组合物，所述组合物含有与权利要求1所述多肽免疫特异性地结合的抗体，其量可有效减少哺乳动物中溶血性链球菌的数量和生长的至少一项。98.—种在患有p-溶血性链球菌集群或感染的哺乳动物中减少p-溶血性链球菌的数量和生长至少一项的方法，其特征在于，所述方法包括给予哺乳动物有效量的组合物，所述组合物含有能够阻遏编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列的表达的反义寡核苷酸。99.一种在哺乳动物中减少由p-溶血性链球菌感染引起的副作用的方法，其特征在于，所述方法包括给予哺乳动物有效量的组合物，所述组合物含有与权利要求1所述多肽免疫特异性地结合的抗体，其量可有效减少哺乳动物中卩-溶血性链球菌的数量和生长的至少一项。100.—种在哺乳动物中减少由p-溶血性链球菌感染引起的副作用的方法，其特征在于，所述方法包括给予哺乳动物有效量的组合物，所述组合物含有能够阻遏编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列的表达的反义寡核苷酸，其量可有效减少哺乳动物中(3-溶血性链球菌的数量和生长的至少一项。101.—种在生物学样品中检测和/或鉴别p-溶血性链球菌的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在允许互补碱基对杂交的条件下，将生物学样品与如权利要求22所述的多肽接触；和(b)检测样品中杂交复合物的存在，其中杂交复合物的检出表明生物学样品中p-溶血性链球菌的存在。102.如权利要求101所述的方法，其特征在于，所述P-溶血性链球菌是酿脓链球菌。103.—种在生物学样品中检测和/或鉴定P-溶血性链球菌的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在适合于免疫复合物形成的条件下，将生物学样品与免疫特异性地结合权利要求l所述多肽的抗体相接触；和(b)检测样品中免疫复合物的存在，其中免疫复合物的检出表明生物学样品中p-溶血性链球菌的存在。104.如权利要求103所述的方法，其特征在于，所述p-溶血性链球菌是酿脓链球菌。105.—种在生物学样品中检测和/或鉴定P-溶血性链球菌的抗体的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在适合于免疫复合物形成的条件下，将生物学样品与权利要求1所述的多肽相接触；和(b)检测样品中免疫复合物的存在，其中免疫复合物的检出表明生物学样品中P-溶血性链球菌抗体的存在。106.如权利要求105所述的方法，其特征在于，所述多肽含有任何一个偶数的SEQIDN0S:2-670中的氨基酸序列的成熟多肽。107.如权利要求105所述的方法，其特征在于，所述P-溶血性链球菌是酿脓链球菌。108.—种含有权利要求1所述多肽的免疫原性组合物。109.如权利要求108所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述多肽是偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列的成熟多肽。110.—种含有权利要求22所述多肽的免疫原性组合物。111.如权利要求110所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物含有如权利要求30所述的表达载体。112.—种免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物含有与权利要求1所述分离的多肽免疫特异性地结合的抗体。113.如权利要求112所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述分离的多肽含有任何一个偶数的SEQIDN0S:2-668中的氨基酸序列的成熟多肽。114.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸含有与编码SEQIDN0S:2-668中的氨基酸的核苷酸序列具有至少70%的同一性的核苷酸序列，所述多核苷酸通过如下步骤鉴定(a)获得衍生自编码SEQIDN0S:2-668的成熟多肽的核苷酸的第一和第二PCR引物，其中在PCR条件下第一和第二引物能够以一种向外的方式起始核酸合成，并且其中第一引物能够在反义方向上延长，而第二引物能够在有义方向上延长；和(b)在适合于从第一和第二引物合成所述核苷酸序列的PCR条件下将所述第一和第二PCR引物与含有所述多核苷酸的cDNA文库结合。115.—种使用聚合酶链反应(PCR)延长如权利要求22所述多核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤(a)获得衍生自所述多核苷酸的第一和第二PCR引物，其中在PCR条件下第一和第二引物能够以一种向外的方式起始核酸合成，并且其中第一PCR引物能够在反义方向上延长，而第二PCR引物能够在有义方向上延长；和(b)在适合于从第一和第二PCR引物合成核苷酸序列的PCR条件下，将所述第一和第二PCR引物与包含于cDNA文库中的所述多核苷酸结合，从而延长所述的多核苷酸。全文摘要本文描述了β-溶血性链球菌的多核苷酸、多肽，具体是酿脓链球菌的多肽和多核苷酸，以及这些多肽的抗体。可配制本发明的多核苷酸、多肽和抗体用于免疫原性组合物。还公开了针对β-溶血性链球菌进行免疫和减少β-溶血性链球菌感染以及在生物学样品中检测β-溶血性链球菌的方法。文档编号A61K39/02GK101124237SQ02810999公开日2008年2月13日申请日期2002年4月12日优先权日2001年4月13日发明者E·B·尼克巴格,L·A·温特,R·J·扎古尔斯基,S·B·欧姆斯泰德申请人:惠氏