专利名称：用vegf－b刺激血管生成的制作方法
背景技术：
血管生成(即血管的重新生成(Vasculogenesis))及血管发生(即从原先存在的毛细血管中生成新的毛细血管(angiogenesis))对于胚胎发育和成人的正常生理功能都是关键的(Carmeliet，P.，血管发生和动脉发生的机制。自然医学，2000 6(4) 389-95)。这些过程的障碍可以导致胚胎的早期死亡，这是因为血管树与躯体生长的不良发育的结果。在成人中，不正常的血管发生可以导致伤口愈合不良，缺血组织中组织再生的受损、女性生殖系统的周期性生长受损以及发生肿瘤(Carmeliet，P.和R.K.Jain，肿瘤和其他疾病中的血管发生。自然，2000407(6801)249-57)。
生长因子的血管内皮生长因子(VEGF)家族是参与生理性和病理性血管发生的最为重要的因素。至今，已经发现了五种VEGF家族成员，包括VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D及PlGF(Li，X.和U.Eriksson，新的VEGF家族成员VEGF-B，VEGF-C和VEGF-D。Int J Biochem CellBiol，200133(4)421-6)。其中，VEGF-A是最有效的促血管发生因子，但是它要求对其表达和调控进行有规则的控制。单个VEGF等位基因的缺失可造成胚胎的死亡(Carmeliet P等，缺失单个VEGF等位基因胚胎的不正常的血管发育和致死性，自然，1996380(6573)435-39；以及FerraraN等，VEGF基因的靶向失活诱导杂合体胚胎的死亡，自然，1996380(6573)439-42)。VEGF-A与四种受体结合，VEGFR-1，VEGFR-2，neuropilin-1和neuropilin-2(Poltorak，Z.，T.Cohen，和G. Neufeld，VEGF剪切变异体特性，受体和用于治疗缺血性疾病的用途，Herz，200025(2)126-9)。通过这些受体，VEGF-A促进上皮细胞增生，诱导血管通透性以及趋化单核细胞。低氧能有效地上调VEGF-A的表达。VEGF-A有效的促血管发生的能力使得它对需要生理性血管发生的缺血性疾病有着潜在的治疗作用。但是，因为它的严重副作用，VEGF-A的临床应用已经被搁置(Carmeliet，P.，VEGF基因治疗刺激血管形成或血管瘤形成？自然医学，20006(10)1102-03)。
VEGF-B是VEGF家族中第三个被发现的成员(在VEGF-A和VEGF-C之后)(Oloffson B等，血管内皮生长因子B，内皮细胞的一种新的生长因子。美国国家科学院院报，1996，93(6)2576-81)，(GrimmondS等，一种与血管内皮生长因子相关的新基因的克隆和特征。基因组研究，1996，6(2)124-31)。VEGF-B有着与VEGF-A一样的促血管发生和其他性能，但是它所分布和表达的组织与VEGF-A有着不同。特别是，VEGF-B在心脏中有着强烈的表达，但仅仅弱表达于肺，而VEGF-A恰恰与之相反(Oloffson B等，美国国家科学院院报，1996，93(6)2576-81)。RT-PCR检测已经表明VEGF-B存在于黑色素瘤、正常皮肤和肌肉。这提示尽管VEGF-A和VEGF-B共表达于很多组织，但是它们有着功能上的不同。比较生长因子PDGF/VEGF家族发现VEGF-B的163个氨基酸异构体是唯一完全没有任何糖基化的家族成员。基因靶向研究已经表明VEGF-B的缺失造成了轻微的心脏表现和冠状血管受损(Bellomo等，循环研究，200086E29-35)。
利用酵母共杂交反应捕获筛选技术筛选可以和细胞I型维甲酸结合蛋白(CRABP-1)相互作用的细胞蛋白以分离人VEGF-B。在PCT/US96/02957，Ludwig肿瘤研究所及Helsinki大学的美国专利5,840,693和5,607,918，和Oloffson B等，美国国家科学院院报，1996，93(6)2576-81中都详细地描述了小鼠和人VEGF-B的分离和特征包括核酸序列。人VEGF-B的核酸序列也可以在基因库登记号No.U48801中找到。国际专利申请PCT/US97/14696(WO98/07832)，美国专利5,840,693和5,607,918的全文在此并入作为参考。
人和小鼠的VEGF-B基因几乎是一致的，两者的DNA全长都为约4kb。基因由七个外显子构成，它们的外显子-内显子组合类似于VEGF-A和PlGF的组合(Grimmond S等，基因组研究，1996，6(2)124-31；Olofsson等，生物化学杂志，1996；27119310-17；Townson等，生物化学和生物物理研究通讯，1996220922-928)。
VEGF-B特异性地与VEGFR-1(Oloffson B等，血管内皮生长因子B，内皮细胞的一种新的生长因子。美国国家科学院院报，1996，93(6)2576-81)和neuropilin结合(Oloffson B等，血管内皮生长因子B(Vegf-B)结合于Vegf受体-1并调节内皮细胞内纤溶酶原激活物的活性，美国国家科学院院报，1998，95(20)11709-14)，neuropilin以往被确定为脑衰蛋白(collaspin)/semaphorin的一种受体(Soker，S，在细胞迁移和回归之间的Neuropilin，国际生物化学和细胞生物学杂志，200133(4)433-37)。与其他的VEGF家族成员比较，VEGF-B有着独特的表达模式，在心肌细胞内有着最高水平的表达(Aase K等，VEGF-B在小鼠胚胎的定位提示生长因子在发育血管中的旁分泌作用，Developmental Dynamics，1999215(1)12-25)，其中在发育期间，邻近的内皮细胞表达VEGFR-1(AaseK等，VEGF-B在小鼠胚胎的定位提示生长因子在发育着的血管中的旁分泌作用，Developmental Dynamics，1999215(1)12-25)，且内皮细胞与心肌细胞都表达neuropilin-1(NP-1)(Makinen T等，血管内皮生长因子B的剪切和蛋白裂解异构体与neuropilin-1的不同结合，生物化学杂志，1999274(30)21217-22；和Kitsukawa T等，嵌合型小鼠膜蛋白neuropilin的过度表达造成心血管系统、神经系统和肢体异常，发育，1995121(12)4309-18)。因此VEGF-B和它的受体的时间-空间表达模式都提示VEGF-B在心脏的自分泌和旁分泌作用(Makinen T等，血管内皮生长因子B的剪切和蛋白裂解异构体与neuropilin-1的不同结合，生物化学杂志，1999274(30)21217-22)。当共表达时，VEGF-B和VEGF-A形成异二聚体(Oloffson B等，血管内皮生长因子B，内皮细胞的一种新的生长因子。美国国家科学院院报，1996，93(6)2576-81)。存在有两种不同剪切的VEGF-B异构体，VEGF-B186和VEGF-B167，其中第一种异构体占所有转录的VEGF-B的80％(Li等，生长因子20011949-59)。这两种多肽的羧基末端有所不同，并有着不同的结合neuropilin-1的能力(Makinen等，生物化学杂志，1999274(30)21217-22)。另外，VEGF-B186是游离分泌的，虽然VEGF-B167可以被分泌但大多是与细胞结合，这说明两者的功能特点可能是不同的。两种异构体都与细胞外基质细胞粘合素-X结合并通过VEGF-受体-1刺激内皮细胞增殖(Ikuta，T，H.Ariga，和K.Matsumoto，细胞外基质细胞粘合素-X联合血管内皮生长因子B增强内皮细胞的增殖，基因细胞，20005(11)913-927)。
缺失VEGF-B小鼠的毛细血管密度与正常小鼠相同。然而，基因靶向研究已经表明VEGF-B的缺失造成了心房传导的异常，特征性的为PQ间期延长和冠状血管受损(Aase K等，循环2001104385-64；WO98/36052，和Bellomo D等，缺失血管内皮生长因子-B基因(Vegfb)小鼠有着更小的心脏，功能异常的冠状血管和心肌缺血恢复不良，循环研究，200086(2)E29-E35)。因此，积累的数据表明VEGF-B对心血管系统的生理和病理状态都有着重要作用。
VEGF-B也可以参与肿瘤发展。可以在许多肿瘤和绝大多数肿瘤细胞株中测定到VEGF-B mRNA(Gunningham，S.P.等，人原发乳腺癌中VEGF-B的表达与淋巴结转移但不与血管发生相关，病理学杂志，2001193(3)325-32；Andre，T等，人直肠粘膜在肿瘤进展期间的Vegf，Vegf-B，Vegf-C和它们的受体KDR，FLT-1和FLT-4，国际肿瘤杂志，200086(2)174-81；Eggert，A等，促血管发生因子的高水平表达与人神经母细胞瘤的肿瘤进展期相关，临床肿瘤研究，20006(5)1900-08；Niki，T等，肺腺癌的血管生长因子A，B，C，和D的表达，以及它们与淋巴结状态的关系，临床肿瘤研究，20006(6)2431-9；和Salven P等，人肿瘤表达血管内皮生长因子Vegf-B和Vegf-C，美国病理学杂志，1998153(1)103-108)。卵巢上皮肿瘤(Sowter H等，血管内皮生长因子家族在卵巢上皮肿瘤中的表达和定位，Laboratory Invest.199777(6)607-14)及肾细胞癌(Gunningham，S.P.等，血管内皮生长因子B和血管内皮生长因子C在肾细胞癌的表达，受von Hippel-Lindauy基因和低氧的调控，肿瘤研究，200161(7)3206-11)。)的肿瘤相关巨噬细胞特异性上调了VEGF-B的表达。
冠状动脉血栓引起的急性和慢性心肌缺血是工业化社会致病率和致死率的主要原因(Varbella F等，急性心肌梗死早期的亚急性左心室游离壁破裂，两例临床报告和文献复习，G Ital Cardiol，199929(2)163-70)。在心脏梗死后即刻，氧的缺乏引起梗死区域的细胞死亡，之后存活的心肌细胞肥大以代偿正常收缩功能的需要(Heymans S等，抑制纤溶酶原激活物或基质金属蛋白酶预防了心脏破裂但削弱了治疗性的血管发生和引起心脏衰竭，自然医学，19995(10)1135-42)。利用供血给梗死左心室壁的梗死后即刻再灌注，通过预防肥大的存活细胞的凋亡和病理性的心室重构，可以显著地减少早期死亡率和继发的心脏衰竭(Dalrymple-Hay，M.J.等，梗死后室间隔破裂Wessex经验，Seminar ThoracCardiovasc Surg，199810(2)111-16)。
在将要建立或延伸血管的情况下，促进血管发生是必要的，例如在组织或器官移植后，或在组织梗死或动脉闭塞时刺激侧支循环的建立，比如冠状动脉心脏病和闭塞性血栓性血管炎。血管发生的过程是高度复杂的，它包括在细胞周期中对内皮细胞的保留，降解细胞外基质，对周围组织的迁移和侵袭，和最后管腔的形成。因为血管发生在如此多的生理过程中的关键作用，因此发展促进血管发生的因子是必要的。
给予诸如VEGF-A和FGF-2的生长因子已经被认为是治疗性处理缺血性心脏和肢体疾病的可能方案。然而，VEGF促血管发生的动物研究和早期临床实验都已经遇到了严重的问题(Carmeliet，自然医学，200061102-3；Yancopoulos等，自然，2000407242-8；Veikkola等，SeminCancer Biol，19999211-20；Dvorak等，Semin Perinatol 20002475-8；Lee等，循环，2000102898-901)。VEGF-A刺激出的微血管是无序的、窦样的和扩张的，很类似于肿瘤中发现的微血管(Lee等，循环，2000102898-901；和Springer等，分子细胞，19982549-559)。另外，这些血管通常是渗漏的、灌注差的、扭曲的且容易破裂和退化。因此，这些血管在改善心肌的缺血状态上的能力是有限的。另外，VEGF-A(也被称为血管通透性因子)诱导的血管渗漏可以造成心脏水肿，导致心脏衰竭。VEGF-A在心肌的未受调控的表达也可以导致血管瘤的发生或在远处器官的微转移灶，并取代功能性血管。
因此，尽管现有的技术已经获得了临床治疗和预防的一些进展，但是不充分的或不正常的梗死后血管重建仍是各种不同的心肌死亡的主要原因，并造成进行性的梗死扩大与纤维取代，以及最终造成心脏衰竭。因此，仍然需要有着最小毒性的促进正常的梗死后血管重建的治疗药物，继续需要新的促血管发生因子和促血管发生的新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的刺激和/或促进冠状动脉梗死后心肌血管重建的方法。
本发明的目的也是提供一种通过刺激或促进血管生成来治疗哺乳动物的缺血状态或循环不足的方法。
依照本发明的第一方面，通过提供一种促进生物体组织的血管重建的方法而实现这些和其他目的，包括给予上述需要这些治疗的生物体有效量的VEGF-B，或它的有着VEGF-B生物学活性的片段或类似物。
在本发明的另一方面，通过提供一种通过血管发生刺激缺血组织血管重建的方法而实现本发明的目的，包括给予有效的血管发生刺激量的VEGF-B，或它的有着VEGF-B生物学活性的片段或类似物的步骤。
依照本发明的另一方面，通过提供一种刺激动脉发生或已存在的肌化动脉即侧支血管的延伸而实现本发明的目的。
仍依照本发明的另一方面，通过提供一种在需要血管重建的哺乳动物中刺激血管重建的方法而实现本发明的目的，包括给予上述哺乳动物治疗有效量的VEGF-B，或它的有着VEGF-B的生物学活性的片段或类似物。
如这里所使用的，术语“血管形成”是上位概念，包括新的血管的生成或已存在的血管的延伸，不论是通过毛细血管的血管发生或动脉血管发生，或者是两者。
梗死后的缺血性疾病状态是血流减少后引起的灌注减少所造成的。通过血液对梗死区域的再灌注可以缓解这个问题。因为梗死区域的绝大多数血管和心肌细胞将坏死并被成纤维细胞所取代形成疤痕组织，只有通过增加血流才能达到再灌注，血流的增加依赖于梗死区域的新血管。因此，梗死心肌的有效的血管重建可以通过预防凋亡等显著地减少早期的死亡率以及继发的心脏衰竭。
因此，利用VEGF-B进行血管生成或血管发生治疗的候选病变包括，其中，(1)血管造影证实的冠状动脉疾病引起的慢性稳定型心绞痛患者(Carmeliet P和Collen D，血管发生和心血管疾病的转基因小鼠模型(综述)，病理学杂志，2000190(3)387-405)；(2)严重肢体缺血或慢性静脉腿部溃疡患者；(3)糖尿病神经病患者(Schratzberger，P等，VEGF基因转移逆转试验性糖尿病神经病，J Clin Invest，2001107(9)1083-92；以及Schratzberger，P等，VEGF基因转移对缺血性糖尿病神经病的有益作用，自然医学，20006(4)405-13)；(4)出生后动脉不良患者；(5)球囊成形术后再狭窄患者(Carmeliet P，Moons L，及Collen D，血管发生、动脉狭窄，粥样硬化和止血的小鼠模型(综述)，心血管研究，199839(1)8-33；以及Baumgartner，I和Isner，J.M.，血管系统的体内基因治疗，Annu Rev Physiol，200163427-50)；(6)缺血性心血管疾病患者(CarmelietP等，缺失血管内皮生长因子异构体VEGF(164)和VEGF(188)小鼠的心肌血管发生的减少和缺血性心肌病，自然医学，19995(5)495-502；和Simons M等，冠状血管发生的临床试验结果，问题，共识一专门小组的简报，循环，2000102(11)E73-86)以及(7)终末期冠状动脉疾病患者(Laham，R J，Simons，M和Sellke，F，冠状动脉疾病的血管发生的基因转移，Annu Rev Med，200152485-502)。
依照本发明，有很多种可以用于给予患者能有效地促进血管生成或刺激血管发生的剂量的VEGF-B的技术，这些患者为有着缺血或一些其他的可以通过血管生成或血管发生而缓解的病变的患者。给予的VEGF-B可以是重组蛋白，或者或以裸DNA或以载体基因转移给予(KoronowskiR，Fuchs S，Leon MB，Epstein SE，获得治疗性心肌血管发生的输送方案，循环，2000101(4)454-8；Simons HK等，冠状血管发生的临床试验结果，问题，共识一专门小组的简报，循环，2000102(11) E73-86；和Isner JM，Asahara T，血管发生和血管生成作为出生后新的血管形成的治疗方案，J Clin Invest，1999103(9)1231-36)。如果需要，可以使用可调控的载体，如在Ozawa等，Annu Rev Pharmacol & Toxicol，200040295-317所描述的。
例如，在手术期间，可以通过直接心肌注射编码VEGF-B的裸质粒DNA给予慢性心肌缺血患者VEGF-B，按照在Vale，PR等，左心室电机械绘图评价phVEGF(165)基因转移对慢性心肌缺血的治疗性血管发生的效果，循环，2000102965-74中所罗列的步骤。
也可以利用微开胸术直接心肌注射VEGF-B蛋白给予VEGF-B。优选的，以1μg/kg到15mg/kg的单次剂量给予，优选的为5μg/kg到5mg/kg之间，及最优选的为0.2到2mg/kg之间。也可以使用连续输注给药，例如，以Heyman等，自然医学，199951135-152描述的体内微量泵的方式给药。如果这样，以5到20μg/kg/分钟输注药物，优选的为7和15μg/kg/分钟之间。
同样，可以通过基于导管的心肌VEGF-B基因转移给予VEGF-B。在这个技术中，将一个连接有27号针头的可导向的、可弯曲的8F导管经皮插到左心室心肌中。将总剂量为200μg/kg的药物分6次注射到缺血心肌中(总量为6.0ml)。利用NOGA左心室电机械绘图进行注射引导。见Vale等，对慢性心肌缺血患者利用左心室电机械绘图进行基于导管的心肌基因转移的治疗性血管发生的随机、单盲，对照前瞻性研究，循环，2001103(17)2138-43。
另一种VEGF-B给药的可能性是在缺血肢体的肌肉内注射VEGF-B质粒，这根据Simovic等，对严重肢体缺血患者肌肉内phVEGF165基因转移后慢性缺血性神经病的改善，Arch Neurol，200158(5)761-68描述的方法。
还有另一个有效的VEGF-B给药的技术是利用腺病毒和复制缺陷的逆转录病毒进行VEGF-B基因的动脉内基因转移，如baumgartner I和IsnerJM，心血管系统的体内基因治疗，Annu Rev Physiol，200163427-50所描述的。
VEGF-B给药的另一种可能是冠状动脉内和静脉内给予重组VEGF-B蛋白，按照在Post，MJ等，利用蛋白制剂对心脏病的治疗性血管发生，心血管研究，200149522-31中所描述的方法。
还有另一种可能是使用体外扩增的已加工成表达VEGF-B的内皮前体细胞(EPC)进行心肌的新血管形成，如在Kawamoto A等，体外扩增的内皮前体细胞对心肌缺血的治疗作用，循环，2001103(5)634-37。
还有另一个可以被用于给予VEGF-B的技术是经皮将腺病毒介导的VEGF-B基因转移到受损的粥样硬化的支架化动脉的动脉壁。见，例如，Maillard，L等，经皮将腺病毒介导的Gax基因转移到双重损伤的粥样硬化的支架化的兔髂动脉的动脉壁的作用，基因治疗，20007(16)1353-61，和Laham RJ，Simons M及Sellke F，冠状动脉疾病的基因转移血管发生，Annu Rev Med，200152485-502。
本发明的一个有利的方面是通过将活性物质单次注射到缺血组织中来给予治疗有效剂量的VEGF-B，如心脏或周围肌肉组织。有效剂量的不同将依赖于体重和缺血对象的情况以及被治疗的缺血病变的性质。本领域人员能确定出针对给定对象和病变的合适的剂量。
根据本发明的另一个方面，VEGF-B的给予是如通过微泵的连续输注，直到患者本身能保持功能性的血管网络。
在本发明的范围内的另一个有利的方面，VEGF-B被有效地给予到缺血对象是通过将缺血组织和病毒载体接触，例如，腺病毒载体，它含有编码VEGF-B并改造性地连接有一启动子序列的多核苷酸序列。
也可以通过在缺血组织的直接附近种植充满活性物质的微粒来有效地给予VEGF-B。
如果需要，VEGF-B可以和至少一种另外的生长因子一起给药，这些生长因子选自VEGF-A，VEGF-C，VEGF-D，PlGF，PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C，PDGF-D和FGF。
活性的VEGF-B物质可以包括VEGF-B167，和/或VEGF-B186异构体或它们的有着刺激和/或促进血管重建、血管发生和/或动脉发生活性的片段或类似物(Oloffson B等，血管内皮生长因子B(Vegf-B)结合于Vegf受体-1并调节内皮细胞内纤溶酶原激活物的活性，美国国家科学院院报，1998，95(20)11709-14)。活性的类似物应当和天然的VEGF-B多肽有着至少85％的序列相同性，优选的至少90％序列相同性，特别优选的至少95％的序列相同性，和极特别优选的至少98％的序列相同性，利用BLAST分析确定序列相同性。
如这里所使用的，术语“VEGF-B蛋白”共同地代表为已知的VEGF-B167和VEGF-B186多肽异构体，以及它们的有着VEGF-B刺激血管生成活性的片段或类似物；代表为编码VEGF-B的多核苷酸，或它们的有着刺激血管生成活性的片段或类似物。多核苷酸可以是裸露的或含于载体或脂质体。活性物质通常包括氨基酸序列Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(其中Xaa可以是任意氨基酸)，这是VEGF-B的特征。
包含保守的取代，插入或缺失、但仍保持VEGF-B的生物学活性的多肽应当被清楚地理解为在本发明的范围内。本领域人员将很好地注意到能容易地应用生产这些多肽的方法，例如使用定点诱变，或特异性酶切和连接。本领域人员也应注意到一个或更多个氨基酸残基被非天然存在的氨基酸残基或氨基酸类似物所取代的多肽类似化合物或化合物可以保留有VEGF-B的生物学活性。这些化合物能容易地被已知的方法制备或测试，它们也在本发明的范围内。
另外，如同已知的发生在VEGF-A和VEGF-B的不同的剪切可以造成VEGF-B多肽的可能的各种形式，以及天然存在的编码VEGF-B的核酸序列的等位基因变异体都包含于本发明的范围内。等位基因变异体在本领域是熟知的并有着不同的形式或包括了取代、缺失或添加一个或多个核苷酸但不造成编码的多肽的任何功能的改变的核酸序列。
利用靶向修饰VEGF-B多肽的非必需区域可以制备VEGF-B的各种形式。预计这些非必需区域在生长因子VEGF/PDGF家族的强保守区域以外。特别的，生长因子VEGF家族包括VEGF-B是二聚体的，以及VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，PlGF，PDGF-A及PDGF-B在N末端区有着完全保守的八半胱氨酸序列(Oloffson B等，美国国家科学院院报，1996，932576-2581；Joukov等，EMBO J，199615290-298)。这些半胱氨酸被认为是参与形成分子内和分子间的二硫键。另外，在C末端区还有着高度、但不完全保守的半胱氨酸残基。通过每个亚基的分子内二硫键形成的环1，2，和3，参与与生长因子VEGF/PDGF家族受体的结合(Andersson等，生长因子，199512159-64)。
因此本领域人员很好地注意到在绝大多数情况中，这些半胱氨酸残基应当被保留在任何提议的变异体形式中，尽管可能有些例外，因为已知在与受体结合的VEGF-B类似物中有一个或多个半胱氨酸不是保守的。相同的，本领域人员将注意到存在于环1，2和3的活性位点也应当被保留。分子的其他区域可以被认为是对生物学功能有着更小的重要性，所以它们提供了改造的合适靶点。利用诸如内皮细胞增殖测定的常规活性测定方法可以容易地测试出改造多肽显示出了VEGF-B的生物学活性的能力。
本发明的另一个方面，在活性的VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-B，PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C，PDGF-D或PlGF单体与突变的CUB区连接之间插入了一个蛋白裂解位点，突变的CUB区连接于活性的VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-B，PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C，PDGF-D或PlGF单体形成二聚体并致使单体暂时失活。加入针对该蛋白降解位点的特异的蛋白酶将降解CUB区，因此释放出能结合于相应的受体活性二聚体。按照这个方法，制备控释的活性二聚体是可能的。
优选地，进行氨基酸取代时，取代是保守的，也就是，用一个相似大小和相似电荷特点的氨基酸取代另一个氨基酸。
如这里所使用的，术语“保守取代”指的是用一个生物学相似的氨基酸残基取代另一个氨基酸残基。保守取代的例子包括用疏水残基如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸，丙氨酸，半胱氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，色氨酸，酪氨酸，正亮氨酸或蛋氨酸中的一个取代另一个；或一个极性残基取代取代另一个，例如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺等等。中性疏水氨基酸可以彼此取代包括天冬氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸和苏氨酸。术语“保守取代”也包括使用发生取代的氨基酸替换未发生取代的母体氨基酸。
这样，在本发明的上下文中应当可以理解，本领域的保守取代被认为是一个有着相似性质的氨基酸取代另一个氨基酸。典型的保守取代列于下面来自WO97/09433的表A中。
表A保守取代I
或者，保守氨基酸可以按照Lehninger，(生物化学，第二版，Worth出版公司，NY:NY(1975)，第71-77页)所描述的被归类，如下面的表B中所示。
表B保守取代II侧链特征 氨基酸
典型的保守取代也列在下面的表C中。
表C保守取代III
如果需要，本发明的VEGF-B蛋白能被改造，例如，通过糖基化作用、酰胺化作用、羧基化作用或磷酸化作用，或者通过生成酸的盐、酰胺、酯，特别是C末端的酯，以及本发明多肽的N酰基衍生物。该蛋白也可以通过与其他成分形成共价或非共价的复合物的修饰以生成多肽衍生物。可以通过将化学的成分连接到构成多肽的氨基酸的侧链或N或C末端的功能基团来制备共价结合的复合物。
特别是，预计VEGF-B蛋白可以缀合一报告基团，包括但不限于放射性标记、荧光标记、酶(例如，催化比色或荧光检测反应的酶)，底物，固体基质或载体(例如生物素或亲和素)。
在WO 98/28621和Olofsson等，美国国家科学院院报，19989511709-11714中描述了VEGF-B类似物的实施例，在此并入作为参考。
本发明的临床应用包括诊断上的应用，促进组织或器官移植物的血管发生，或刺激伤口愈合，或结缔组织发育，或在坏死组织或动脉狭窄例如冠状动脉疾病中建立侧支循环。
在不同的启动子下过度表达VEGF-B的转基因小鼠没有表现出任何明显的异常，该事实提示应用VEGF-B没有严重的副作用。从中可以推论治疗性给予VEGF-B只能预计到最低限度的副作用。因为它无副作用，其可以在缺血状态的非常早的阶段适当地给予VEGF-B。
通过参照下面的实验可以进一步详细地描述本发明，这些实验说明了VEGF-B在促进缺血心肌的血管形成中的活性，附图显示了这些实验的结果，其中图1(a)和(b)是显微镜照片，显示通过凝血调节蛋白染色在野生型(WT)和VEGF-B缺陷型(KO)小鼠中相应地可见小鼠心中的梗死后血管重建。
图2是对图1(a)和(b)的野生型(WT)和VEGF-B缺陷型(KO)小鼠的梗死区域的血管重建的血管密度的图示。
图3(a)和(b)是显微镜照片，显示通过平滑肌α-肌动蛋白染色在野生型(WT)和VEGF-B缺陷型(KO)小鼠中相应地可见小鼠心中的梗死后血管重建。
图4是对图3(a)和(b)的野生型(WT)和VEGF-B缺陷型(KO)小鼠的梗死区域的血管重建的血管密度的图示。
具体实施例方式
实施例1VEGF-B在心肌梗死后血管重建中的作用步骤通过麻醉后结扎8周龄的正常和VEGF-B缺陷型小鼠的左前降支冠状动脉(LAD)以达到慢性心肌缺血。已发表的国际申请No.WO 98/36052描述了VEGF-B缺陷型小鼠。在处理前，野生型(正常)和敲除(VEGF-B缺陷型)小鼠的毛细血管密度是相同的。结扎LAD七天后，将梗死的心脏固定并收集。将梗死的心脏纵向切片(6m)。将凝血调节蛋白做为内皮细胞和α-肌动蛋白做为平滑肌细胞的标记物进行苏木精和伊红及免疫组化染色。凝血调节蛋白抗体来自比利时Leuven大学的Dr.Ed Conway。平滑肌细胞α-肌动蛋白抗体通过商品化获得(DAKO，X0910，丹麦)。利用Quantinet Q600图像分析系统计算梗死面积和血管密度。用学生T检验分析数据。
结果在LAD动脉结扎七天后，利用凝血调节蛋白(TM)和平滑肌细胞α-肌动蛋白(SMC)做为标记物计算梗死区域的血管密度。这些结果显示在图1(a)和(b)以及图3(a)和(b)，并在图2和4中列表说明。
图1(a)和(b)显示了野生型(WT)和VEGF-B缺陷型(KO)的梗死后心脏的凝血调节蛋白染色的结果。内皮细胞的标记物凝血调节蛋白染色排列在血管管腔的内皮细胞。与VEGF-B缺陷型(KO)相比较，在野生型心脏(WT)的梗死区域有着不同大小的血管的更多的阳性染色。
如从图2所能看到的，利用凝血调节蛋白作为标记物，VEGF-B缺陷型小鼠的总血管密度平均起来约是正常小鼠的63％(P＜0.01，n＝9)。将血管分类为三个不同的组，大、中等大小和小血管，结果显示在所有的组中有着相同的缺陷(VEGF-B缺陷型小鼠18.6±3.1大血管/mm2，34.8±8.5中等大小血管/mm2，75±20.3小血管/mm2；正常小鼠30.6±8.5大血管/mm2，54.9±13.4中等大小血管/mm2，117.7±20.8小血管/mm2，每组n＝9，在所有组中P＜0.05)。
图3(a)和(b)显示了野生型(WT)和VEGF-B缺陷型(KO)的梗死后心脏的平滑肌细胞α-肌动蛋白染色的结果。平滑肌细胞的标记物平滑肌细胞α-肌动蛋白染色围绕血管的平滑肌细胞。与VEGF-B缺陷型(KO)相比较，在野生型心脏(WT)的梗死区域有着不同大小的血管的更多的阳性染色。
如从图4的图表中所能看到的，当用平滑肌细胞α-肌动蛋白染色组织切片的血管平滑肌细胞，VEGF-B缺陷型小鼠表现出了在先前的实验中所观察到的心肌梗死后的相同的血管重建的缺乏。VEGF-B缺陷型小鼠只有整个正常血管密度的61％(P＜0.05，n＝9)。不同大小的血管显示出相同的结果(VEGF-B缺陷型小鼠5.5±1.3大血管/mm2，8.0±2.0中等大小血管/mm2，13.8±8.3小血管/mm2；正常小鼠7.7±1.9大血管/mm2，14.0±4.8中等大小血管/mm2，22.7±7.2小血管/mm2，每组n＝9，在所有组中P＜0.05)。
因此，这些实验数据清楚地表明VEGF-B的缺陷导致了心肌梗死后的血管重建的削弱。根据VEGF-B的存在对心肌梗死后的血管重建以及心肌缺血情况下的血管重建是必要的，因此给予治疗有效量的VEGF-B可以刺激或促进代偿性的血管发育。
实施例2VEGF-B的促血管发生活性按照Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9514389-14394，1998中所描述的方法，利用小鼠角膜模型和鸟尿囊绒膜实验测定VEGF-B的促血管发生活性。
实施例3利用VEGF-B诱导血管发生按照Witzenbichler等，Am.J.Pathol.153381-394，1998中所描述的方法测定VEGF-B诱导缺血组织中血管发生的能力。
实施例4产生含VEGF-B的重组腺病毒载体将编码VEGF-B167的cDNA克隆于细菌质粒pACCMVpLpA的巨细胞病毒(CMV)早期即刻基因的强增强子/启动子和SV40聚腺苷酸化信号之间(Gomez-Foix A等(1992)J.Biol.Chem.267，25129和Janssens S.P.等(1996)J.Clin.Invest.98(2)317)。该质粒也包含5型腺病毒的EIA-册除序列，包括复制起始位点，包装信号和一个多接头。通过与pJM17的同源重组生成重组的腺病毒，pJM17是一种包含全长腺病毒基因组的细菌质粒、随后共转染经EIA-转化的人胚胎视网膜(911)细胞。利用PCR分析确定VEGF-B cDNA存在于分离于被感染的911细胞的病毒DNA中。在融合的911细胞中扩增包含VEGF B的病毒(AdCMV.VEGF-B)分离物，在出现细胞病变效应后，利用非连续的CsCl梯度分离、沉淀和浓缩病毒。用重组腺病毒的一系列稀释物感染单层的911细胞以确定病毒滴度。对于体内研究，每个小鼠都静脉注射3×109噬斑形成单位(pfu)的VEGF-B或对照的RR5腺病毒。
实施例5通过腺病毒VEGF-B基因转移诱导血管发生按实施例1所述将野生型(WT)小鼠进行左前降支冠状动脉的结扎以诱导心肌缺血。之后用每小鼠3×109pfu的实施例4的AdCMV.hVEGF-B静脉内处理一组11只实验动物。用每小鼠3×109pfu的AdRR5处理另一组13只动物做为阴性对照。通过在结扎冠状动脉的7天内计算每mm2梗死区域的血管数目测定梗死区域的血管重建。结果显示于下面的表1表1
这些结果清楚地说明，与阴性对照比较，用病毒载体上的VEGF-BDNA进行基因治疗处理造成了梗死区域的血管重建的增加。
实施例6通过给予重组VEGF-B诱导血管发生按实施例1中所述将野生型(WT)小鼠进行左前降支冠状动脉结扎以诱导心肌缺血。之后用含有重组人VEGF-B167(r VEGF-B167)的溶液处理一组五只缺血的试验动物，重组人VEGF-B167由澳大利亚墨尔本Amrad有限公司提供。通过种植在每只小鼠背部的皮下渗透性微泵给予含有重组人VEGF-B的溶液。蛋白外漏到细胞外间隙并被血液所吸收。按每周每只小鼠10μg活性物质的速度给予重组人VEGF-B。做为阴性对照，用相同剂量的生理盐水处理第二组的五只动物。在结扎冠状动脉后的七天内通过计算梗死区域每平方毫米的血管数目来测定梗死区的血管重建。结果显示在下面的表2表2
这些结果清楚地表明与阴性对照比较，给予重组VEGF-B167造成梗死区域血管重建的增加。
前面的描述和实施例仅被用于说明本发明，并不用于限制本发明。既然本领域人员可以吸收本发明的精神和内容进行对阐述的具体实施方案的修改，因此总而言之本发明应当理解为包括所附权利要求和它们的等价物的范围内的所有的变更。
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权利要求
1.一种促进生物体组织的血管形成的方法，包括给予所述的需要这样治疗的生物体有效诱导血管形成的量的VEGF-B。
2.权利要求1的方法，其中通过直接注射重组VEGF-B蛋白给予VEGF-B。
3.权利要求2的方法，其中通过将VEGF-B蛋白单次注射到缺血的肌肉组织而给予所述VEGF-B。
4.权利要求3的方法，其中所述的缺血肌肉组织是心肌。
5.权利要求3的方法，其中所述的缺血肌肉组织是缺血肢体的肌肉。
6.权利要求2的方法，其中通过渗透性泵的连续输注给予所述VEGF-B。
7.权利要求2的方法，其中通过冠状动脉内给药给予所述VEGF-B。
8.权利要求2的方法，其中通过静脉内给药给予所述VEGF-B。
9.权利要求1的方法，其中通过编码VEGF-B蛋白的多核苷酸的基因转移给予所述VEGF-B。
10.权利要求9的方法，其中通过直接注射裸VEGF-B DNA而实现所述的基因转移。
11.权利要求9的方法，其中通过注射含有可操纵地连接于一启动子序列的、编码VEGF-B蛋白的多核苷酸序列的质粒载体实现所述的基因转移。
12.权利要求9的方法，其中通过引入经离体扩增的、经遗传工程化以表达VEGF-B蛋白的内皮前体细胞而实现所述的基因转移。
13.权利要求9的方法，其中通过经皮将腺病毒介导的VEGF-B输送到受损的动脉壁而实现所述的基因转移。
14.权利要求9的方法，其中通过利用腺病毒载体或复制缺陷的逆转录病毒载体的动脉内基因转移而实现所述的基因转移。
15.权利要求9的方法，其中通过心肌注射给予所述VEGF-B。
16.权利要求9的方法，其中通过直接注射于缺血肢体肌肉而给予所述的VEGF-B。
17.权利要求1的方法，其中所述的生物体患有选自冠状动脉疾病导致的慢性稳定型心绞痛、严重肢体缺血、慢性静脉性腿部溃疡、糖尿病神经病变、出生后动脉功能不全、再狭窄、缺血性心血管病和终末期冠状动脉病变的病症。
18.权利要求1的方法，其中通过在缺血组织的直接附近植入用活性物质浸渗的微粒给予所述VEGF-B。
19.权利要求1的方法，其中将所述VEGF-B和至少一种附加的生长因子一起给予，所述生长因子选自VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、P1GF、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D和FGF。
20.一种通过血管发生和/或动脉发生刺激缺血的心脏组织的血管形成的方法，包括将有效刺激血管发生和/或动脉发生的量的VEGF-B给予到所述组织的步骤。
21.权利要求20的方法，其中通过将VEGF-B蛋白单次注射到所述的缺血的心脏组织而给予VEGF-B。
22.权利要求20的方法，其中通过渗透性泵连续输注到所述缺血的心脏组织而给予所述VEGF-B。
23.权利要求20的方法，其中通过在缺血的心脏组织的直接附近植入用VEGF-B蛋白浸渗的微粒而给予VEGF-B。
24.权利要求20的方法，其中通过将缺血组织与含有可操纵地连接于一启动子序列的、编码VEGF-B蛋白的多核苷酸序列的病毒载体相接触而给予VEGF-B。
25.权利要求20的方法，其中通过将裸VEGF-B DNA直接注射到所述缺血的心脏组织而给予所述VEGF-B。
全文摘要
本发明显示VEGF－B对心肌梗死后的心肌的血管重建是需要的，并公开了促进或刺激，尤其是缺血的哺乳动物的血管发育如血管发生和/或动脉发生的方法。
文档编号A61K38/19GK1630538SQ02812568
公开日2005年6月22日 申请日期2002年6月20日 优先权日2001年6月20日
发明者乌尔夫·埃里克松, 李旭日, 彼得·卡尔梅利耶特, 德西雷·科伦 申请人:路德维格癌症研究所, 法兰德斯大学校际生物科技研究院