用于诊断及治疗胰岛素抗性及相关病症之方法和试剂的制作方法

专利名称：用于诊断及治疗胰岛素抗性及相关病症之方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及胰岛素抗性及相关病症的诊断及治疗，适用于医学与生物学领域。
背景技术：
人体内葡萄糖稳态的维持是一个动态平衡过程，包括肠道对葡萄糖的吸收，脑、肌肉和脂肪组织对葡萄糖的利用、胰腺对葡萄糖的感知和胰岛素释放以及肝脏对葡萄糖的合成和存储(参见综述Shepherd和Kahn，1999，New England J Med.341248-57)。血液葡萄糖水平的调节是通过循环激素(主要是胰岛素和胰高血糖素)、参与胰岛素信号传导和葡萄糖转运的细胞蛋白以及尚有待确定的众多遗传因子所参与的复杂相互作用来完成的。危害全球1.5亿多人健康的二型糖尿病的首要病因被认为是胰岛素效应组织(肌肉与脂肪组织)对胰岛素促进葡萄糖摄取的作用发生的抵抗。胰岛素抗性(insulin resistance，IR)是一种常见的生化代谢紊乱现象，在普通人群中发生率近25％，而且与一组称为X综合征(胰岛素抗性综合征)的代谢疾病相关，这些疾病包括循环高密度脂蛋白水平降低、高血压、腹部肥胖和冠状动脉病等(参见Reaven，Diabetes 371595-1607(1988)；De Fronzo等，Diabetes Care 14173-194(1991)；Reaven，Metabolism4116-19(1992))。以上疾病是发达国家中致病和致死的主要原因(Reaven，1994，J Internal.Medicine 23613-22)。遗传学方面的证据清楚地表明胰岛素抗性是由功能相关途径中的一系列基因的遗传缺陷引起的，尽管目前这些途径中的许多关键基因我们仍然未明(Pedersen，1999，Exp Clin Endocrinal Diabetes 107113-118)。在过去的20多年里，经过深入研究已发现了胰岛素、胰岛素受体、胰岛素受体底物、磷脂酰肌醇-3(PI3)-激酶、葡萄糖转运蛋白、糖原合成酶和葡萄糖激酶的基因。然而，上述基因中的突变却很罕见，而且仅能解释IR相关综合征的一小部分原因(不足1％)。因此，有必要进一步鉴定和研究与胰岛素抗性及IR相关病症相关的其它基因和蛋白。
发明概述本发明涉及胰岛素抗性标记(insulin resistance markers，IRMs)。IRM基因在胰岛素抗性个体中的表达水平与其在健康个体或胰岛素敏感个体中的表达水平是有差异的。本发明的胰岛素抗性标记列于表1。IRM基因编码RNA(IRM基因产物)，后者可以与具有表1中由GenBank登录号标识的序列或与之确切互补的序列的多核苷酸杂交(例如，在严紧条件下)。一方面，本发明提供了一个通过检测来自胰岛素抗性个体的生物样品与来自非胰岛素抗性个体的生物样品之间IRM基因序列的差异或IRM基因产物的表达差异而确定个体是否有发生胰岛素抗性的危险的方法。在多种实施方案中，非胰岛素抗性个体具有eIS表型，和/或胰岛素抗性个体具有eIR表型。在一个实施方案中，该方法涉及检测至少两个，任选地至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20，或者至少25个IRM基因的序列差异或者检测至少两个，任选地至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20，或者至少25个IRM基因产物的表达差异。在一个实施方案中，本发明提供诊断个体是否具有胰岛素抗性、IR相关病症或者IR或IR相关病症易感性的方法，该方法通过检测该个体的生物样本中至少一个表1所列胰岛素抗性标记(IRM)的表达与非胰岛素抗性参考个体群的相似生物样本中该IRM的特征性表达水平的差异来实施。在一个实施方案中，本发明提供诊断个体是否具有胰岛素抗性(IR)、IR相关病症或IR或IR相关病症易感性的方法，该方法通过如下方式实施测定个体生物样本中至少一个表1所列胰岛素抗性标记基因(IRM)的表达水平，并与非胰岛素抗性参考个体群(例如，具有eIS表型的个体)的相似生物样本中此IRM的特征性表达水平相比检测表达差异(例如，增高或降低)。在一个相关方面，本发明给出了通过提供被测个体的生物样本并对该样本中的IRM基因产物表达水平与健康个体或群体同类样本中的特征性表达水平进行比较，从而确定被测个体是否具有胰岛素抗性或是否具有发生胰岛素抗性的危险性的方法，其中如果差异存在则说明该个体为胰岛素抗性或具有发生胰岛素抗性的危险性。在另一相关方面，本发明提供确定个体是否为胰岛素抗性的方法，该方法通过如下方式实施鉴定具有发生胰岛素抗性危险的患者，提供该个体的生物样本，并对该样本中的IRM基因产物表达水平与健康个体或群体同类样本中的特征性表达水平进行比较，其中表达差异的存在说明该个体具有胰岛素抗性。在多种实施方案中，IRM基因产物的鉴定可通过扩增(例如，应用具有与登录序列相同或完全互补的至少10个连续碱基、任选地至少15个连续碱基的引物来进行扩增)、杂交(例如，应用具有与登录序列相同或完全互补的至少10个连续碱基、任选地至少15个连续碱基的探针来进行杂交)或检测IRM多肽来进行。所述生物样本可以是组织样本，优选使用来自血液的样本，诸如血细胞(如白细胞，B细胞等)等血液级分。在一些实施方案中，分析一组IRM基因的表达变化，或者它们的基因多态性。在一个实施方案中，针对每个被测个体，至少分析2个不同的IRM。在其它实施方案中，分析至少4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20或25个IRM基因或基因产物。在一个实施方案中，本发明提供确定某个体是否为胰岛素抗性或是否具有发生胰岛素抗性的危险性的方法，实施方式是从被测个体获取生物样本；将该样本的一组IRM基因表达水平与参考值作比较，其中所述的一组IRM基因为至少3个，任选地至少4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20或25个IRM基因，所述参考值代表具有已知胰岛素抗性状态的个体(如，个体群)中的表达；若参考值代表胰岛素抗性或具有发生胰岛素抗性的危险性的个体中的表达，如果这些IRM基因中至少25％，50％或75％的基因在被测个体中的表达水平在统计学水平上与参考值相似，则判定该被测个体为胰岛素抗性或具有发生胰岛素抗性的危险性；或者，若参考值代表健康个体中的表达，如果这些IRM基因中至少25％，50％或75％的基因在被测个体中的表达水平与参考值相比具有差异，则判定该个体为胰岛素抗性或具有发生胰岛素抗性的危险性。在一个方面，本发明提供了通过比较胰岛素抗性个体和非胰岛素抗性个体的生物样本中的IRM基因序列，鉴定与胰岛素抗性表型或发生胰岛素抗性的危险性相关的基因多态性的方法。在多种实施方案中，非胰岛素抗性个体具有eIS表型和/或胰岛素抗性个体具有eIR表型。在一个实施方案中，鉴定在IRM基因的内含子、外显子或者启动子区域中的突变。在一个实施方案中，鉴定的是IRM基因的单碱基突变。一方面，本发明提供筛选药剂以确定其在胰岛素抗性治疗中的有用性的方法，该方法通过如下方式实现提供表达IRM基因产物的细胞，将此细胞与测试药剂相接触，并确定IRM基因产物表达水平在测试药剂存在下是否发生变化，如果发生变化则提示该测试药剂对于胰岛素抗性的治疗有用。在多种实施方案中，上述接触细胞的步骤涉及给动物(譬如，糖尿病、胰岛素抗性、胰岛素敏感性或胰岛素抗性相关病症的实验模型)施用测试药剂。在多种实施方案中，所述筛选方法涉及确定是否该药剂能够影响一个以上IRM基因的表达水平。一方面，本发明提供筛选药剂或收集测试药剂以确定其在胰岛素抗性治疗中的有用性的方法，该方法通过如下方式实现提供包含IRM蛋白质的组合物，将此组合物与测试药剂相接触，并确定IRM蛋白质活性在测试药剂存在下是否发生变化，如果发生变化则提示该测试药剂对于胰岛素抗性的治疗有用。另一方面，本发明提供了一个在哺乳动物中治疗胰岛素抗性的方法，该方法是通过给予能够调节IRM基因产物之表达(例如，当IRM基因产物为RNA，而该RNA能够与具有登录序列之序列或与之完全互补的序列的多核苷酸在严紧条件下杂交时)的药剂的有效剂量来实现的。在一个实施方案中，本发明提供治疗哺乳动物的胰岛素抗性的方法，包括施用能够调节IRM基因产物之表达的药剂的有效量。在多种实施方案中，所述药剂导致IRM基因产物的表达或者活性的上调或下调。在一个实施方案中，此哺乳动物为患有胰岛素抗性症状或并发症或者胰岛素抗性相关病症的人类患者。在一个相关方面，本发明提供能够调节IRM基因产物表达的药剂在配制用于治疗IR的药物组合物中的用途。在另一方面，本发明提供适用于胰岛素抗性(和IR相关病症)的诊断或胰岛素抗性(和IR相关病症)治疗药剂的筛选的试剂盒。在一个实施方案中，本试剂盒包含多个不同IRM基因产物的特异探针(如多核苷酸或抗体探针)。在一个相关方面，本试剂盒包括其上固定有多个IRM探针或基因产物的基质。在另一方面，本发明提供了通过比较表1中所列IRM基因的序列在胰岛素抗性个体的生物样本中与在非胰岛素抗性个体的生物样本中的差异，鉴定与胰岛素抗性(IR)表型或发生胰岛素抗性的危险性相关的基因多态性的方法。在一个实施方案中，非胰岛素抗性个体具有eIS表型，在一个实施方案中，胰岛素抗性个体具有eIR表型。在相关方面，本发明提供判定个体是否有发生胰岛素抗性的危险或是否患有胰岛素抗性的方法，该方法包括步骤(a)获取所述个体的核酸样本；和(b)确定一个或多个IRM基因上存在的核苷酸是否指示发生胰岛素抗性的危险性。此外，本发明还给出一个检测基因型和胰岛素抗性表型的相关性的方法，包括(a)在具有第一胰岛素抗性表型的第一群体中分析至少一个IRM基因的基因型，(b)在具有第二胰岛素抗性表型(有别于第一胰岛素抗性表型)的第二群体中分析该IRM基因的基因型，和(c)分析上述基因型和表型之间是否具有统计学显著相关性。在一个实施方案中，这第一群体是eIS群体而第二群体是eIR群体。在相关方面，本发明提供估计群体中一组多核苷酸多态标记的单元型频率的方法，包括(a)针对群体中的个体鉴定表1所列IRM基因上的至少第一核苷酸多态；(b)针对群体中的个体鉴定IRM基因上的第二核苷酸多态，其中第二IRM基因可以和第一IRM基因相同也可以不同；和(c)通过单元型确定方法分析步骤(a)和(b)中确定的核苷酸多态身份，从而估计所述频率。在一个不同方面，本发明提供了鉴定可用于诊断疾病状态的基因表达模式(patter)的方法，包括鉴定第一群人类个体，其中所述个体为疾病患者或该疾病的高患病危险个体；鉴定第二群人类个体，其中所述个体为该疾病的低患病危险个体；和鉴定至少3个在该两个群体间表达存在差异的RNA序列。在一个实施方案中，本发明包括获取从这两个群体所有个体的B淋巴细胞衍生的细胞系，继而鉴定在一个细胞系中与在另一个细胞系中差异表达的基因。在一个实施方案中，所述细胞系来自血液细胞。譬如，所述细胞系可以来源于Epstein Barr病毒转化的B细胞。一般说来，第一和第二群体各包含至少3个个体，常常至少5个或者更多个个体。在一个实施方案中，鉴定差异表达的RNA序列的步骤包括1)从第一和第二群体的每一个个体中，获取由组织衍生的细胞系；2)从上述细胞系中提取RNA；3)制备同一组中不同的个体细胞系之RNA的探针池(pool)；4)将探针池与包含来自所述组织的多个表达序列标签(cDNAs)的核酸阵列进行杂交。在一个实施方案中，核酸阵列具有至少100个不同的表达序列标签(EST)。
发明详述I.一般参考文献及定义参考文献下列文献提供实施本发明时的有用信息(1)Sambrook等(1989)分子克隆实验室指南(MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL)(第二版)冷泉港实验室出版社及Sambrook和Russel(2001)分子克隆实验室指南(第三版)冷泉港实验室出版社(后文中，合称或单独称作”Sambrook”)；(2)Ausubel等(1987)现代分子生物学实验指南(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(2001增补版)John Wiley和Sons，纽约(后文以“Ausubel代替)；(3)Coligan等，免疫学实验方法指南(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)(2001增补版)，John Wiley和Sons，纽约(后文以“Coligan”代替)；(4)Harlow和Lane(1988)抗体实验室手册(ANTIBODIES，A LABORATORYMANUAL)，冷泉港实验室出版社，纽约，及Harlow和Lane(1999)抗体应用实验室指南(USING ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL)，冷泉港实验室出版社，纽约(后文中合称或单独称作“Harlow和Lane”)；(5)现代免疫学方法(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)(J.E.Coligan等，编辑，1999，包括2001年增补版)；(6)PCR聚合酶链式反应(PCRTHE POLYMERASE CHAIN REATION)(Mullis等编辑，1994)；(7)生物缀合技术(BIOCONJUGATE TECHNIQUES)(Greg T.Hermanson编辑，科学出版社，1996)；(8)Beaucage等编辑，现代核酸化学实验方法(CURRENT PROTOCOLS IN NUCLEIC ACID CHEMISTRY)(John Wiley & Sons，纽约，2000)。
定义下列定义有助于读者实施本发明“等位基因”或“等位序列”，这里指的是编码特定多肽的基因(即，IRM基因序列)的自然发生的可替代形式。“抗体”，这里指包含VL和/或VH序列的有专一结合性的分子，包括，例如，(1)多克隆抗体制备物、(2)单克隆抗体、(3)人源化抗体分子(参见例如Riechmann等.(1988)Nature 332323-327；Verhoeyan等.(1988)Science 2391534-1536)；(4)杂合(嵌和)抗体分子(参见例如Winter等(1991)Nature 349293-299；及美国专利号4,816,567)；(5)抗体片段，例如F(ab’)2和F(ab)片段；(6)Fv分子(非共价异二聚体，参见例如Ehrlich等(1980)Biochem 194091-4096)；(7)单链Fv分子(sFv)(参见例如Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)；(8)二聚和三聚的抗体片段构建体；(9)小抗体或微抗体(mini-antibody或minibody)(即，C端包含寡聚化结构域(oligomerization domain)的sFv多肽链，该结构域通过铰链区与sFv分开；参见Pack等(1992)Biochem 311579-1584)；(10)从这些分子获得的保持了母体抗体分子的特异结合特性的任何功能性片段。“反义序列”，定义为其序列与RNA序列互补的多核苷酸。该术语特别包括结合mRNA或其部分以阻断mRNA被核糖体转录的核酸序列。反义技术在本领域已众所周知(参见PCT公开WO 94/12633，及Nielsen等，1991，Science 2541497；寡核苷酸及类似物实践方法(OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES，A PRACTICALAPPROACH)，F.Eckstein编，IRL Press牛津大学出版社(1991)；反义研究及应用(ANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS)(1993，CRC出版))“保守替代”，当描述多肽的时候指的是多肽中氨基酸组成的改变不引起该多肽活性的实质上变化，也就是说替代的氨基酸和被替代的氨基酸具有相似的特性(例如，酸碱性，带正电或负电，极性或非极性，等等)，这样，即便是关键氨基酸发生这样的替换也不实质上改变多肽的活性。具有相似功能的氨基酸保守替换的列表早已研明。下列所分六组每组中的氨基酸彼此间替换都属于保守替换1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)(参见Creighton，1984，Proteins，W.H.Freeman and Company).“可检测标记的”，指试剂(如，探针)与可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、电磁学等相关分析技术进行检测的标记物相偶联。可以利用的可检测标记物包括，但不限制于，放射性同位素、荧光团、发色团、质量标记(mass lable)、电子致密颗粒、磁颗粒、自旋标记物、化学发光分子、电化学活性分子、酶、辅因子、酶底物。术语“标记的”，当涉及探针或抗体时，旨在包括通过可检测物质与探针或抗体的偶联(即，物理连接)直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂反应间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括通过荧光标记的二抗检测一抗，和利用生物素标记DNA探针末端以便通过荧光标记的链霉亲和素进行检测。“表位”，即抗体识别抗原的位点，通常为属于一整条多肽链上的一小部分的氨基酸片段。表位可以是构象化的(即，不连续的)。也就是说，它们可以由一级结构上的不连续部分编码的氨基酸通过蛋白折叠相毗邻而形成。“基因产物”，指基因转录出的RNA分子或者该基因编码的多肽，也就是由RNA翻译所得的多肽。“试剂盒”，指被一起包装或市售以便使用的成分。比如，一个试剂盒可以含有多个分别放置在不同容器中的多核苷酸或抗体探针。或者，一个试剂盒可以将两个成分放在一个容器中，而将第三成分和任何其它成分放在一个或者多个独立的容器中。任选地，试剂盒还可以包括用于联合这些成分的说明书。“天然的”，应用于某化合物或组合物(如mRNA)时，表示该化合物或组合物能够在自然界中发现。“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”，这里指任意长度的核苷酸聚合体，包括但不限于，核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。这三个术语之间并不着意于长度的区分。进一步讲，这些术语仅指分子的一级结构。因此，在某些实施方案中，这三者可以包括三链、双链和单链DNA，以及三链、双链和单链RNA。它们也包括经过诸如甲基化和/或加帽等修饰的多核苷酸，以及多核苷酸的未修饰形式。更具体地，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”，包括多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸以及包含非核苷酸骨架的其它多聚体，如聚酰胺(如，肽核酸(PNA))和聚吗啉代(商品可购买于Anti-Virals，Inc.，Corvallis，Oregon，商品名Neugene)多聚体，以及其它合成的序列特异核酸多聚体，条件是这些多聚体中包含的核苷碱基的构型应允许进行碱基配对，就象在DNA和RNA中的碱基配对一样。除非有特殊说明，提及多核苷酸序列也旨在指与之完全互补的序列，所述互补遵守标准的碱基配对原则，即A→(T/U)和G→C。因此，除非特别指出，否则，如果说某参考多核苷酸序列与第二多核苷酸序列杂交，就表示包括参考多核苷酸序列的任何一条链与第二多核苷酸序列的任何一条链之间的特异杂交。“可操作地连接”，是指核酸表达调控序列(如启动子、信号序列或转录因子结合位点序列)与第二多核苷酸之间发生的功能性连接，其中所述表达调控序列能够影响所述第二多核苷酸的转录和/或翻译。一般说来，发生可操作地连接的序列是毗邻的，如果是信号肽发生可操作地连接，那么既指毗邻的又指在阅读框中。但是，与增强子发生可操作地连接而被增强了转录的编码序列则不必邻近该增强子。“可药用”，是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其他成分相兼容，而且不能损害用药者的健康。“多肽”，在本申请中与“蛋白质”可互换使用，指由通过酰胺键连接的多个氨基酸残基形成的多聚体，包括其人工合成、天然与非天然类似物(氨基酸和键)。肽也代表多肽。“引物”，是指在适当缓冲液中和适宜温度下，于适当条件(即，存在四种不同的三磷酸核苷以及诸如DNA或RNA聚合酶或反转录酶等具有聚合作用的试剂)下能够作为模板指导的DNA合成的起始点的多核苷酸单链。引物不须完全与模板序列一致，但是必须具有足够的互补性从而可以与模板杂交。术语“引物对”是指包括可与待扩增的DNA序列的5’末端的互补链杂交的5’“上游引物”和可与此待扩增序列的3’末端杂交的3’“下游引物”的一对引物。“完全互补”的引物上所有碱基都是与模板互补的，即没有错配碱基。“错配”指的是当引物与靶核酸比对(align)时引物上的某碱基与靶核酸上相应位置的碱基不互补的现象。“基本上互补”，当涉及引物时，指的是引物与其靶核酸并不完全互补，而是该引物仅具有充分互补性，这种互补性使其能选择性地与相应链在期望的引物结合位点杂交。引物通常具有大约7个或者更多个核苷酸，乃至大约100个核苷酸，一般长度为大约10到50个核苷酸，更多为大约12到50个核苷酸，而大约15到25个核苷酸的长度最为常用。本文中，“探针”，当用于多核苷酸和抗体时，指的是该分子可以特异地结合另一分子。探针的一个例子是“核酸”探针，可以是DNA，RNA或其它多核苷酸。当给出一个核酸探针的具体序列时，也就给出并包括了其互补链的序列。如果目标分子是能够特异地与实质上互补的核酸结合(例如，退火或杂交)的双链核酸时，该探针的互补链同样也能很好地工作。探针的另一个实例是“抗体探针”，其能够特异地结合至相应的抗原或表位上。通过反转录RNA(例如，单种类或异质群体)可以制备“cDNA探针”。“重组体”，指体外合成的或经其他方式操作的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”)，也指利用重组多核苷酸在细胞或其他生物体系中产生基因产物的方法，还可以指重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。因此，“重组”多核苷酸既可以由其生产方法也可以由其结构定义。关于其生产方法，这一过程为重组核酸技术的利用，例如，涉及人为地干预，典型地筛选或制备核苷酸序列。或者，重组体可以是通过制备包含两个天然不相毗邻的片段的融合物的序列而产生的多核苷酸，该概念中排除了天然产物。因此，例如，此概念包括通过任何非天然载体转化细胞得到的产物，也包括含有通过任何合成寡核苷酸方法产生的序列的多核苷酸。同样，“重组”多肽是指重组多核苷酸表达的产物。“重组”当涉及细胞时是指，该细胞复制异源核酸或表达异源核酸所编码的肽或蛋白质。重组细胞可以含有细胞天然(非重组)状态不含有的基因，也可以含有细胞天然状态中含有的基因但是该基因是在经过人工修饰以后重新导入细胞的。该术语也包括含有经修饰的细胞内源核酸的细胞，其中所述修饰是在未将该核酸移出细胞的情况下进行的；该修饰包括通过基因置换、定点突变以及其它相关技术实现的修饰。“选择性杂交”指的是在细胞总DNA或RNA制备物中存在特定靶DNA或RNA序列时，与此靶DNA或RNA序列杂交、形成双链或结合的多核苷酸探针。“特异结合”(用于蛋白质时)、“特异免疫交叉反应”或简称“特异免疫反应”(用于抗体时)，均指可以在异质蛋白质群体和其他生物产品存在时确定出目的蛋白存在的结合反应。因此，在指定条件下，特异配体优先结合特定蛋白，而不会以显著的量结合样品中存在的其他蛋白。特异结合蛋白的分子或配体(例如抗体)具有的结合常数为至少103M-1或104M-1，有时是105M-1或106M-1，或者106M-1或107M-1，优选108M-1～109M-1，更优选大约1010M-1～1011M-1或者更高的值。很多免疫分析方法可用于选择与特定蛋白发生特异免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫分析常规用于筛选与蛋白质发生特异免疫反应的单克隆抗体。参见例如Harlow和Lane关于测定特异免疫活性的免疫分析方法和条件的叙述。本文中，“实质上序列一致”指的是两个或者更多个序列或者亚序列为获得最大对应而进行比较和比对时，通过下面的序列比较算法之一或直接观察法测量到具有至少60％(优选80％，最优选90％，95％，98％或99％)的核苷酸或氨基酸残基同一性。两个序列(核苷酸序列或者氨基酸序列)可以在全长(例如，如果两者具有实质上不同长度，则指较短序列的长度)水平进行比较，也可以比较至少大约50、大约100、大约200、大约500或者大约1000个连续核苷酸或者至少大约10、大约20、大约30、大约50或大约100个连续氨基酸残基的亚序列。进行序列比较的时候，一般以其中一条序列作为参考序列来比较测试序列。运用序列比较算法时，将测试序列和参考序列均输入计算机，如果需要则指定亚序列的坐标，并设定好序列算法程序参数。序列比较算法即可基于设定的程序参数计算出测试序列与参考序列的序列同一性百分数。为进行比较，可以按如下方式实现序列的最佳比对(align)例如，Smith和Waterman的局部同源分析(Local Homology)，Adv.Appl.Math.2482(1981)，Needleman和Wunsch的同源比对分析，J.Mol.Biol.48443(1970)，Pearson和Lipman的相似性检索方法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444(1988)，这些算法的计算机执行程序(Wisconsin遗传软件中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI))，或者直接观察法(一般参见Ausubel等)。以上各种参考文献及算法在此完整并入为参考文献。当使用上述任何算法时，对于视窗长度、空位罚值(Gap Penalty)等使用缺省参数。例如适用于确定序列一致性和相似性百分比的一个算法是BLAST，参见Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。执行BLAST分析的软件可以在美国国家生物技术信息中心公众网站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上获得。该算法涉及首先通过确定提交序列中长度为W的短字(word)，鉴定当与数据库序列中相同长度的字比对时能够满足或者符合某个正的阈值分数T的高分值序列对(high scoringsequence pairs，HSPs)。阈值T被称作相邻字得分阈值(Altschul等，上述引文)。然后将这些初选的相邻字命中点(hit)作为种子来启动检索以寻找包含这些命中点在内的更长的HSP。将这些字命中点沿每一序列向两个方向延伸，只要累计的比对分值可以得以增加即可。如果累积比对分值从其最大获得值下降数量X；或者由于一个或者多个负值得分残基比对造成累积比对分值趋向零或者更低；或者已经延伸到一条序列的端部，那么停止这种字命中点(hit)向两个方向的延伸。BLAST算法参数W、T、X决定比对过程的灵敏度和速度。BLAST程序一般设定的缺省值为字长(W)11、BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))、比对数(alignments)(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，而且正负两条链都进行比较。两个核酸序列实质上一致的另一标志是两者在严紧条件下彼此杂交。如果严紧条件下一个区段能够和另一区段的正链或者负链杂交，那么就说明此二者具有这种实质一致性，所述杂交典型地利用具有来源于这些探针核苷酸序列的至少大约50个连续核苷酸的序列进行。“结合”指的是探针核酸和靶核酸之间的互补杂交，而且可以通过减少杂交介质的严紧度允许小量错配的存在从而达到检测靶多核苷酸序列的目的。“严紧杂交条件”指低于靶序列熔解温度(Tm)大约5℃到大约20℃或25℃的条件和完全或者几乎完全互补于靶序列的探针。在此，熔解温度是双链核酸分子中半数解链为单链状态的温度。计算多核苷酸Tm值的方法众所周知(参见例如Berger和Kimmel，1987，酶学方法(METHODSIN ENZYMOLOGY)152卷分子克隆指南(GUIDE TO MOLECULARCLONING TECHNIQUES)，圣地亚哥，Academic Press，Inc.Sambrook)。正如标准参考文献中指出的，当核酸在1M NaCl的水溶液中时，Tm值可通过等式Tm＝81.5+0.41(％G+C)进行简单估算(参见例如，Anderson和Young，《核酸杂交》(Nucleic acid Hybridization)中的“定量滤膜杂交”(1985))。其他参考文献中，计算Tm值时将序列特性与分子结构考虑进去从而导致更为复杂的计算。杂交体的熔解温度(以及由此杂交严紧条件)受各种因素的影响，例如探针的长度和属性(DNA、RNA、碱基组成)以及靶的属性(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定化等等)以及盐浓度和其他组分(如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在与否)。这些影响因素的效果众所周知，并在本领域的参考标准文献中有讨论，见Sambrook，同上引文和Ausubel，同上引文。典型地严紧交杂条件是低于大约1.0M钠离子的盐浓度，通常大约0.01～1.0M钠离子，pH值7.0～8.3，并且对于短探针(例如10～50个核苷酸)和长探针(例如超过50个核苷酸)分别至少为大约30℃和大约60℃的杂交温度。正如所指出的，严紧杂交条件也可以通过添加甲酰胺等去稳定剂而达到，此时可以采用较低的温度。“实质性纯的”或者“分离的”用来形容蛋白质和多肽的时候，表示蛋白质与和它天然相关的其它蛋白或者杂质相分离。蛋白质或多肽占组合物的总蛋白含量的大约50％以上(通常大约60％以上)的时候，可以称之为实质性纯蛋白。更典型地，实质性纯的或分离的蛋白质或多肽将占总蛋白的至少75％，更优选至少90％。该蛋白优选在组合物中占总蛋白的大约90％以上，更优选大约95％以上。当涉及多核苷酸时，此术语“实质性纯的”或“分离的”一般指与其通常相关的杂质，例如脂、蛋白和其他多核苷酸相分离的多核苷酸。本发明中“实质性纯的”或“分离的”多核苷酸将有大于大约50％的纯度，通常大于大约60％的纯度，更为常见的是从大约75％到大约90％的纯度，优选纯度为大约95％至大约98％。“治疗有效量”是指研究人员、兽医、医师或其他临床医生所探寻的可以引起组织、系统、动物或人的生物或医学反应的对象化合物的量，例如，能够改善疾病状态或症状、或减缓、阻止、抑制或逆转疾病或任何其它不良症状发展的化合物量。个体中胰岛素抗性的改善可以通过观察OGTT及SSPG曲线的改善来衡量。“预防(prophylactic)量”是指能够充分地预防、阻止或延迟疾病的发生或发展的量。
II.引言本发明部分地基于这样的发现在人类胰岛素抗性和血细胞中某些基因(在此称作“胰岛素抗性标记基因”或“IRM基因”)的表达模式之间具有令人信服的相关性。IRM基因表达与胰岛素抗性之间的这种相关性是通过对极端胰岛素抗性群体和极端胰岛素敏感群体的大规模基因表达谱分析得到证实的。双亲中至少有一人为二型糖尿病的600例早先鉴定的个体通过口服葡萄糖耐受测试和稳态血浆葡萄糖检测筛选极端胰岛素抗性(“eIR”)或极端胰岛素敏感(“eIS”)。口服葡萄糖耐受测试(OGTT)是一种体内胰岛素敏感度评估方法，参见Bergman等，内分泌学综述(EndocrinologyReview)645-86(1985)。一般75-g 2-hr OGTT＞140mg/dl的个体被确定为胰岛素抗性，而75-g 2-hr OGTT＜120mg/dl的个体则为正常。稳态血浆葡萄糖检测(SSPG)是由胰岛素抑制检测法改良而来，在此检测中被测个体连续静脉输注生长激素抑制素(Somatostatin)、胰岛素和葡萄糖，参见Reaven等.，Diabetologia 1617-24(1979)。通常SSPG均值＞180mg/dl的个体被认为具有胰岛素抗性，而SSPG均值＜150mg/dl则为正常。如果某个体年龄在18周岁以上而且符合下列标准则归为eIR组(即，具有eIR表型)120分钟时OGTT葡萄糖(口服75g葡萄糖后120分钟时的OGTT葡萄糖水平)＞140mg/dl；SSPG均值＞250mg/dl；60分钟时OGTT胰岛素＞100μIU/ml Et；120分钟时OGTT胰岛素＞100μIU/ml。如果某个体年龄在18周岁以上而且符合下列标准则归为eIS组(即，具有eIS表型)120分钟时OGTT葡萄糖＜100mg/dl；SSPG均值＜120mg/dl；60分钟时OGTT胰岛素＜60μIU/ml或120分钟时OGTT胰岛素＜40μIU/ml。“SSPG均值”指的是稳态血浆葡萄糖水平(SSPG测试中150、160、170和180分钟时获得的四个值的均值)。在此，“Xm时OGTT胰岛素”指的是口服75g葡萄糖后X分钟时的OGTT胰岛素水平。从年龄性别匹配的6例eIR和6例eIS获得建成的Epstein Barr病毒(“EBV”)转化的B淋巴细胞系(即，12株细胞系)。使用50个已知的胰岛素效应基因进行的分析证明EBV转化的B淋巴细胞系在接触胰岛素时的基因表达模式与胰腺这一经典的“胰岛素效应器官”中的表达相似。在相同培养条件下，在存在15μIU/ml或100μIU/ml(IU＝国际单位，international unit)胰岛素的环境中培养上述12个细胞系并进行相同次数的细胞传代，之后分别提取各细胞系的总RNA。从6例eIR细胞系得到的总RNA等量混合成为eIR-RNA池，从6例eIS细胞系得到的总RNA等量混合成为eIS-RNA池。通过oligo-dT引物反转录特异扩增eIR和eIS池的mRNA制备不同标记的探针。上述探针应用于微阵列杂交，此微阵列包含大约10,000个人白细胞表达基因的表达序列标签或者大约40,000个来自不同人类组织中的表达基因的表达序列标签(EST)。在一些情况下，还进行了许多附加的验证实验。鉴定到的几个差异表达基因在表1中显示并在下文中详细讨论。部分地基于这些IRM基因的鉴定，本发明给出如下方法及试剂，这些方法及试剂可用于设计和实施胰岛素抗性及IR相关病症的诊断和预后试验、评价发生胰岛素抗性及IR相关病症等疾病的危险度、设计胰岛素抗性及IR相关病症等疾病的预防和治疗方案以及筛选胰岛素抗性及IR相关病症等疾病的有效治疗药剂。“胰岛素抗性”在本文中具有通常为本领域接受的含义，指外周组织抵抗胰岛素对葡萄糖吸收的促进作用。如果胰腺能够针对这种缺陷分泌更多的胰岛素，那么就能够维持正常的葡萄糖耐受。某些异常，包括高血压和异常血脂症，特征为升高的血浆甘油三脂(TG)、降低的高密度脂蛋白(HDL)、更小更密的LDL颗粒、升高的餐后脂血、高尿酸血症、升高的血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)水平，它们倾向于簇集出现在具有胰岛素抗性的胰岛素分泌过多患者身上，被称为IR相关病症。胰岛素抗性相关病症包括糖尿病(例如，二型和妊娠糖尿病)和糖尿病症状和并发症如X综合征(例如，包括循环高密度脂蛋白水平降低、高血压、腹部肥胖和冠状动脉疾病)等等。
III.胰岛素抗性标记如前所述，本发明人已鉴定出在胰岛素抗性个体与健康个体的细胞(如血液细胞)中差异表达的一系列基因。这些基因称为胰岛素抗性标记或者IRM，它们编码的RNA(即，IRM基因产物)可以在严紧条件下与具有(即，相同或者完全互补)表1中登录号标识的多核苷酸(见下文，如具有所示登录号的表达序列标签(EST)、IMAGE克隆插入片断或cDNA序列)的序列的多核苷酸杂交。在某些实施方案中，登录序列为基因组序列。例如，IRM基因的转录物可以和，例如，(1)具有表1的登录序列或其互补序列(除poly(A)尾)的多核苷酸，以及(2)具有表1中所列IMAGE克隆插入片断的序列的多核苷酸杂交。表1提供了各种信息。表1第一列是每个IRM基因的数字名称。第二列是EST序列的GenBank登录号，这些EST与来自eIR和eIS群体的RNA有差异杂交，参见上文§II描述以及下文的实施例。同时第二列还给出与某些表达序列标签相对应的比较长的基因组或cDNA序列的GenBank登录号，以及与每个EST对应的IMAGE克隆的ID号。IMAGE克隆通常包含大约1kb到全长的插入片段。这些克隆可获自ResearchGenetics，Inc.(http//www.resgen.com/resources/apps/cdna/index.php3)，IMAGE克隆的核苷酸序列可以通过常规方法确定。表1第三列提供特定IRM基因在eIR群体的细胞系中的表达相对于在eIS群体中的表达而言是上调还是下调，测定方法详见下文实施例。“-”表示在eIR群体中该IRM基因相对于eIS群体而言下调(即，在eIR群体中具有较低表达)，“+”则表示在eIR群体中该IRM基因相对于eIS群体而言上调。表1第四列表示的是与EST序列相应(例如，通常＞95％的序列同一性)的全长基因的有关信息和/或该基因编码的多肽的有关描述。IRM基因编码的多肽序列在第四列中或在附随着所指出的登录号的GenBank注释中给出，或者可以通过概念性翻译给出的IRM核酸序列确定或从给出的核酸序列信息确定。为方便起见，IRM基因编码的多肽或其亚序列有时称作“IRM多肽”。相应于这里描述的IRM的其它克隆和序列信息(如编码序列、全长序列、侧翼序列和基因组序列)可通过分子生物学家熟知的技术获得。比如，可以获得表1中的IMAGE克隆并测定克隆插入片断的序列。可以被测序的其他克隆可以通过含有本文提供的IRM序列的标记探针扫描哺乳动物(如人类)cDNA文库(如血液细胞文库，如淋巴细胞cDNA文库)或基因组文库得到。或者，可以用登录序列、其亚序列或其中编码的多肽序列基于实质性序列同一性检索计算机序列数据库。由IRM基因编码的RNA(IRM RNA)能够(例如，在严紧条件下)与具有和表1中GenBank登录号标识的序列相同或完全互补的序列的多核苷酸杂交。IRM基因产物也包括RNA编码的多肽，所述RNA能够在严紧条件下与具有和登录序列相同或完全互补的序列的多核苷酸杂交。本发明人鉴定的IRM基因产物包括表1所示核酸序列或其片段的序列、该序列编码的序列、或该序列的互补序列。能够特异杂交此处公开的IRM序列(包括互补序列)的多核苷酸探针和引物可用于监控、检测及测量编码该IRM的基因的表达。例如，一般来说探针含有至少10个与表1所列多核苷酸相同或完全互补的碱基，常常至少大约15个、至少大约20个、至少大约25个、50个、至少大约100个或至少大约500个碱基。然而，在确定序列同一性、互补性或杂交的时候，任何3’末端poly(A)序列(例如，在cDNA衍生的序列中给出的)均不算在内。在一个不同的实施方案中，能够结合IRM基因编码的多肽的试剂(如抗体)可用以监控、检测和测量IRM编码基因的表达。已证实的在表1所列IRM基因的表达与胰岛素抗性之间的相关性表明IRM基因的表达可用作胰岛素抗性或IR相关病症的发生或发展可能性的诊断标志。因此，对于能与具有表1所列登录序列的多核苷酸或它的互补分子(包括具有表1所列IMAGE克隆的插入序列的多核苷酸)进行杂交或与其实质上序列一致的IRM RNA，检测它的表达变化在本发明的诊断、预后和筛选方法中将是有用的。同样，IRM基因编码的多肽的表达或活性的变化也可用于本发明的诊断、预后和筛选方法中，详见后述。类似地，已证实的在包含表1所给序列的IRM基因的表达与胰岛素抗性之间的相关性也指出IRM基因可能是引起胰岛素抗性表现的原因。因此，本发明给出治疗胰岛素抗性的方法，该方法包括施用能够调节IRM蛋白(即，由例如在严紧条件下与本文公开的任一多核苷酸杂交的RNA编码的蛋白)表达的药剂(agent)或疗法。本发明众多其他方面和实施方案在此将会进行详述或者基于本公开的综述将是明显的。
表1 IRM多核苷酸和多肽(例如，用作探针、免疫原等等)可以通过本领域熟知方法制备，包括从头(de novo)化学合成和重组表达。从头(denovo)合成寡核苷酸和多核苷酸的方法是已知的(参见Beaucage等编，当代核酸化学操作技术(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry)John Wiley & Sons，Inc.，New York，2000)；以及Agrawal，编，寡核苷酸及类似物操作指南，合成与特性(Protocols for Oligonucleotides andAnalogs，Synthesis and Properties)Humana Press Inc.，New Jersey，1993)。关于蛋白的固相合成方法的实例在Grant(1992)《合成肽用户指导》(Synthetic PeptidesA User Guide)，W.H.Freeman和Co.，N.Y；以及《肽合成原理》(Principles of Peptide Synthesis)(Bodansky和Trost，编，Springer-Verlag，Inc.N.Y.，(1993))中有具体阐述。重组表达多核苷酸和多肽的方法已众所周知。例如，IRM多核苷酸可以插入用于制备IRM多肽或多核苷酸的表达载体中。表达载体一般包含转录和/或翻译控制信号(如转录调控元件、启动子、核糖体结合位点及ATG起始密码子)。而且，包含适合所用细胞体系的增强子能够增加表达效率。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞内的基因表达效率。因此，在一个实施方案中，编码IRM多肽的DNA可以插入能够导入体外宿主细胞并在其中表达的DNA构建体中，这些体外宿主细胞包括细菌(大肠杆菌(E.coli.)，枯草杆菌(Bacillus subtilus)等)、酵母(如酵母属(Saccharomyces))、昆虫(如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda))或哺乳动物细胞培养系统等。可以用于表达和制备本发明多肽的哺乳动物细胞培养系统包括人胚肾细胞系(293；Graham et al.，1977，J.Gen.Virol.3659)、CHO(ATCC CCL 61和CRL 9618)、人子宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)以及其它熟知的细胞系。有用的人源及非人源细胞系均很容易得到，比如可购买于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box1549，Manassas，VA 20108(参见http//www.atcc.org)。关于哺乳动物细胞培养物在蛋白表达中的应用一般可以参见上文中提到的Sambrook和Ausubel等人著作。在一些实施方案中，来源于哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子被用于，例如，哺乳动物细胞系中的基因表达。适合的启动子可以是组成型、细胞类型特异型、阶段特异型和/或可调控型(如通过糖皮质激素等激素作用来调控)。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导的MMTV启动子、SV40启动子以及本领域熟知的启动子增强子联合等等。IRM多肽和片段同样可以通过能够整合入宿主细胞染色体的适当表达载体在转基因动物(鼠、羊、牛等)和转基因植物(烟草、拟南芥等)中表达。
IV.诊断和预后方法一方面，本发明给出一个确定被测个体是否患有胰岛素抗性或IR相关病症或有危险发生胰岛素抗性或IR相关病症的方法，即通过一个或多个IRM基因表达谱的变化来检测。在本发明的一个方面，通过监测IRM基因产物的表达来诊断个体是否为胰岛素抗性或IR相关病症的患者或易感者。在一相关方面，通过监测IRM表达进行预后评价以检出有发生胰岛素抗性和IR相关病症危险的个体。预后方法也可用于疾病严重度和适当治疗方法的评估。IRM基因产物可以进行定性或定量(绝对或相对)分析，并可以根据分析方法的形式、分析样本的属性以及所寻求的信息以多种方式解释分析结果。所以，一方面，本发明提供诊断被测个体是否具有胰岛素抗性、IR相关病症或者对胰岛素抗性或IR相关病症的易感性的方法，方式是检测表1中至少1个胰岛素抗性标记(IRM)在来自被测个体的生物样本中的表达与此IRM在非胰岛素抗性参考个体群(例如具有eIS表型的群体)的类似生物样本中的特征性表达水平之间是否存在差异。参考群体可以与被测个体在性别、年龄和/或种族上匹配。在一个实施方案中，IRM表达水平通过检测IRM RNA来获悉，例如可以通过从被测个体之RNA衍生的探针与固定化多核苷酸靶杂交然后检测杂交复合物的形成来确定IRM表达水平。可用的多核苷酸靶包括可与表1所列IRM基因杂交的多核苷酸。适宜的探针包括使用被测个体之RNA制备的任选标记的cDNA探针、从被测个体分离出的任选标记的RNA，任选标记的扩增产物或者RNA或cDNA，或者其他的检测探针(例如，所谓的侵入者指导的切割(invader-directed cleavage)，例如US Pat.No.6,001,567)。在一个实施方案中，与探针杂交的是固定化的多核苷酸阵列，这些固定化的多核苷酸中包含可以与表1所列的至少两个不同的IRM基因杂交的多核苷酸。基于胰岛素抗性的诊断，医生可给出适当的治疗方案和建议以改善疾病的症状或结果、或者使患者恢复非胰岛素抗性状态。尽管以往胰岛素抗性易感性的诊断取决于糖尿病家族史、高血压、肥胖、OGTT和SSPG检测结果以及其他本领域已知的危险因素(低HDL、高甘油三脂等)，然而本发明提供了另一种方法来鉴定患者为胰岛素抗性高易感性(即，具有高于普通群体的平均水平的易感性，亦即高危险度或高于平均水平的危险度)。诊断为易感性的患者可以实施预防治疗从而避免该病症的发生或恶化。本发明给出了胰岛素抗性患者或胰岛素抗性易感性患者的诊断方法，即，测定患者样本中IRM基因表达水平并且与具有已知的胰岛素抗性状态的群体(如非胰岛素抗性群体)所特征的表达水平进行比较。非胰岛素抗性群体和/或被认为无高度危险发生胰岛素抗性的群体(“健康”群体，如eIS群体)中的IRM基因表达水平(例如，平均水平)被称作“正常”水平。IRM基因表达水平的差异可以作为胰岛素抗性或胰岛素抗性易感性的诊断指标，这种差异可以是相对于正常水平的降低，也可以是升高。在一些实施方案中，本发明的诊断和预后方法涉及从被测个体获取生物样本，通常是组织样本，优选血液样本。用于检测IRM基因表达和本发明其它诊断方法的样本可以通过多种途径获得。由于本发明方法主要设计用于人胰岛素抗性和IR相关病症(例如二型糖尿病)的诊断和危险因素评估，所以样本通常都来源于人类被测个体。然而，本方法也可以使用来源于其它哺乳动物(例如非人灵长类动物，如猿和黑猩猩等，大鼠及小鼠)的样本，或者是来源于体外细胞培养物的样本，比如用于筛选药物和/或进行临床前毒性及药效试验。可以将这些样本称为“生物样本”。在本发明中应用的生物样本包括血液样本、血清、细胞(包括完整细胞、细胞级分、细胞提取物和培养的细胞或细胞系)、组织(包括活检组织)、来自体液的细胞(如尿液、痰、羊水、滑液、精液、唾液、眼泪和脊髓液)或培养的细胞或细胞系。来源于患者的生物样本在本文中有时被称为“患者样本”。当然，在对样本中的IRM基因产物的量进行分析之前，生物样本可以接受多种广为人知的收集后制备和贮存技术(贮存或冰冻等)的操作。在一个实施方案中，生物样本是来自患者的血液或血液组分。例如，可以在禁食8小时后抽血，并收集到含有例如乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(浓度为1.5mg/ml血液)的抽真空后的管(例如，“vacutainer”采血管)中。如果需要，在采血2小时内将血样在4℃离心1500×g 30分钟，收集白细胞。在上层血浆和下层红细胞之间的界面含有白细胞(白细胞层)，收集并用于后续分析(例如，用常规方法提取RNA)。患者组织样本中的IRM基因表达水平可以与具有已知的胰岛素抗性状态的群体(比如，健康个体)中的正常表达水平以多种方式进行比较。例如，组织样本中IRM基因表达水平可以与参考或基线值进行比较。尽管参考值可以是具有已知的胰岛素抗性状态的某个个体的IRM表达水平，但是通常参考值都是具有已知的胰岛素状态(如eIS表型、eIR表型)的个体群中此IRM的特征性表达水平。通常，参考值是由具有至少3例，通常至少5例或更多例个体的群体确立的统计值(例如，均值)，详见后文。后文中提到的个体的特征值应理解为也指个体群的特征值。如下文所述，通常参考值或基线值是健康个体的特征性IRM表达水平。健康个体的实例包括未患有IR的个体或，在某些实施方案中，非胰岛素抗性高危发生个体(包括，在某些实施方案中，具有eIS表型的个体或群体)。被测个体中的实验值或测量值(即，“检测值”)与参考值之间的差异说明被测个体患有胰岛素抗性或IR相关病症，或者具有发生胰岛素抗性或IR相关病症的危险性。为了诊断的目的，参考值可以是健康个体中的IRM基因表达水平。或者，参考值可以是在较早或较晚时间从被测个体获得的组织样本中的IRM表达水平。通常，参考值是基于对照细胞或个体的群体确立的统计值(例如，均值)。该对照群体的大小可变，可以少至1个成员，但是可能的是包括几十例、几百例或几千例个体。通常确定参考值所基于的每个群体的群体大小为至少3例，任选地至少5例个体。当对照是一个大群体时，参考值可以是群体各成员测定值的统计值，也可以是将对照群体作为一个集合体得到的测定值(例如，在一个孔内测定细胞群体得到的值)。因此，参考值可以是例如反映普通群体(更通常地为未患有IR且不具有发生IR的增加危险性的健康个体，有时也可为具有eIS表型的个体群)的IRM水平的统计水平或范围。为了确定参考值或基线值，健康个体(即，没有IR的个体)可以通过如下标准确定禁食葡萄糖＜95mg/dl，75-g 2-hr OGTT葡萄糖＜120mg/dl且最好＜100mg/dl，SSPG均值＜150mg/dl且最好＜120mg/dl，75-g 1hr或2-hr胰岛素＜60μIU/ml。具有eIS表型的个体(也即健康个体)也可用于确定基线值或参考值。确定某个体是否具有eIS表型的标准在上文中已给出。胰岛素抗性也可以通过正常血糖胰岛素钳夹技术(Andres等，1966，分析化学的自动操作技术(Automation in AnalyticalChemistry)；Skeggs LT编P.486-91)和极小模型(Bergman等，1987，JClin Invest 79790-800)来确定。正常IRM表达水平可以在任何特定的生物群体、亚群体或组中依照本领域熟知的标准技术测定。应用标准统计学方法可以确定表达的基线水平并识别出与参考值之间的显著偏差。因此，例如，可以确定群体(如，至少3、至少5或至少10例个体)中IRM表达水平，并利用常规方法定义与该群体的统计学显著差异。如果随机发生所观察到的差异的可能性(p值)小于某一预定水平，这种差异典型地被认为具有“统计学上的显著性”。本文中“统计学显著差异”指p值＜0.05，优选＜0.01且最优选＜0.001。具有胰岛素抗性或增加的胰岛素抗性易感性的被测个体与由健康个体组成的群体相比，IRM基因表达差异的大小将随基因的不同和疾病严重程度的不同而有差别。在一些实施方案中，测试个体中的IRM基因表达与参考值相比如果存在如下情况则被认为存在差异(上调)，所述情况指的是检测值高于参考值至少大约25％，常常至少大约50％，有时增加50～100％，有时检测值大约2～5倍或之间的任何整数倍数(即，3或4倍)，有时大约5～10倍或之间的任何整数倍数，有时大约10～20倍或之间的任何整数倍数，有时大约20～50倍或之间的任何整数倍数，有时大约50～100倍或之间的任何整数倍数，再有时100倍或更高。在一些实施方案中，测试个体中的IRM基因表达与参考值相比如果存在如下情况则被认为存在差异(下调)，所述情况指的是检测值低于参考值至少大约25％，常常至少大约50％，有时大约2～5倍或之间的任何整数倍数，有时大约5～10倍或之间的任何整数倍数，有时大约10～20倍或之间的任何整数倍数，有时大约20～50倍或之间的任何整数倍数，有时大约50～100倍或之间的任何整数倍数，再有时100倍或更多。在一些实施方案中，IRM蛋白或IRM mRNA水平是通过定量来自于被测个体(例如，人类个体)的生物样本中的IRM蛋白和/或mRNA来决定的。但是，应当明了，分析方法无需测定IRM表达的绝对值，除非如此期望，因为对于本发明方法的多种应用来说相对值即足够。需要定量的时候，本发明可以提供试剂以便实际上任何已知的基因产物定量方法均可以使用。由于IRM表达水平在不同组织中可能有差异，因此优选检测值和参考值或基线值来源于同一组织(如血或特定血液级分——B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞或其他白细胞等)。对于某些样本和目的，可能期望定量单位细胞或单位体积的IRM基因产物。而且，应当认识到，通常可能期望测试值和参考值是在相似条件下得到的。例如，如果使用血液样本，一般在禁食条件下收集血液(即，至少8小时内无卡路里摄取，如过夜禁食)。在一个实施方案中，例如，为评估胰岛素抗性，采集数据用以获得疾病严重程度或进程与不同IRM表达模式的统计学显著相关性，并针对来自具有已知临床结果的个体的相同细胞或组织样本确立IRM水平的预定范围。为了产生用于比较的统计学显著值(或值域)进行足够数量的测量。然后可以利用针对给定的细胞或组织样本的预定IRM水平或活性范围确定与有利(或不利)预后状况相关的IRM基因产物水平或其范围。之后可以对生物样本(如患者样本)的IRM基因产物水平进行确定并与范围的上限和下限进行比较，以便进行临床结果的预测。如上说述，实施本发明的诊断和预后方法时，有时提及“诊断值”和“预后值”是有用的。在此，“诊断值”描述的是针对样本中检测的IRM基因产物的测量值，通过该值与IRM基因产物的正常(或基线)范围相比可以指示疾病(如胰岛素抗性或II型糖尿病)的存在。“预后值”描述的是在给定细胞类型(如血细胞)中检测到的IRM基因产物量，该值相应于特定的疾病诊断和预后结果。将样本中检测到的IRM基因产物量(包括零)与针对该细胞的预后值进行比较，以便通过这些值的相对比较指示疾病的存在或可能的疾病发展结果。在本发明的一些实施方案中，在实施分析试验之前或以后，确定被测个体是否为有危险或有增加的危险发生胰岛素抗性的患者。例如，可以基于被测个体或被测个体家族的病史确定被测个体的发病危险性。胰岛素抗性和IR相关病症的诊断还可基于来自被测个体的生物样本的IRM基因多态的检测，详见下文。因此，作为本发明的一个方面，分析IRM基因的序列(即，多态)或表达以确定该个体与群体的平均情况相比是否更可能发生胰岛素抗性。在一个实施方案中，本发明提供确定个体是否为胰岛素抗性的方法，方式是鉴定胰岛素抗性危险患者(或怀疑为具有发生胰岛素抗性危险的患者)、获取个体的组织样本并对该组织样本中的IRM表达水平与参考值进行比较。读者需要认识到的是，此处描述的方法也可以(在进行明显的改动下)用于具有极端胰岛素敏感表型的个体的诊断或筛查。
IRM组的表达分析在一些实施方案中，本发明提供了诊断、预后和药物筛选分析方法(例如，下文所述)，其中监测1个以上IRM基因(“系列IRM基因”)的表达水平。这些方法也用于监控IR相关病症的发展和疗效。多个基因的表达监控为更有力的分析方法提供了准备。因此，在多种实施方案中，针对被测个体(例如，用于诊断和预后分析)或细胞系(如用于药物筛选分析)确定包含IRM基因组合(如，至少2，3，4，5，6 7，8，9，10，11，12，15，20或25个或更多的表1所列基因，或其亚系列)的基因表达谱。可以通过任何(包括但不局限于下文所提的方法)检测RNA或蛋白水平的方法(例如，膜杂交或微阵列杂交、RT PCR等)确定IRM表达水平。执行这些分析试验时，可以利用包含针对特异IRM基因产物的探针阵列的装置，例如，本文中所述的装置。有用的IRM基因亚组的选择可以基于结构、功能或其他标准进行。IRM组的实例包括，但不仅限于包含例如下列的组(a)IRM 1，21，33，124，180，190，200，230，288，和290；(b)IRM 11，44，84，122，136，140，150，202，210，236，244，296，309，310，320，和336；(c)IRM 50，56，67，119，170，270，和280；(d)IRM 6，10，11，28，56，57，67，73，80，118，120，148，152，160，170，178，207，210，228，248，250，255，270，280，330，331，332，和340；(e)IRM110，278，和326；(f)IRM 6，74，78，266，和297；(g)IRM 4，12，16，18，19，20，25，27，29，40，49，51，52，60，62，66，68，75，77，85，90，92，94，100，146，182，188，217，240，250，259，260，314，328，和344；(h)IRM 69，220，228，244，277，和300；(i)IRM 10，20，40，50，60，120，130，180，190，200，210，220，和260；(j)IRM 90，150，160，170，250，和300；(k)IRM 30，70，81，130，和303；(l)IRM 10，20，40，50，60，120，130，220，和260；(m)IRM10，20，40，50，60，120，和130；(n)IRM 10，20，40，50，60，和130；(o)IRM90，160，170，250，和300；(p)IRM 120；(q)IRM 350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，和363；(r)IRM 350，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，和363；(s)IRM 350，351，353，354，355，356，357，358，359，360，361，和362；(t)选自于一个组的至少2，3，4，5，6，7，8，9，或至少10个IRM。正如所指出的，在多种实施方案中，诊断、预后、药物筛选或其他分析方法可能会监测任何IRM基因组合的表达(即，基因表达谱)，所述组合为例如包含至少2，3，4，5，6，7，8，9，或至少10个表1所列IRM基因的组合或表1所列IRM的亚组。本发明考虑到使用2个或2个以上IRM基因的所有联合的分析方法。在一个实施方案中，本发明给出了鉴定个体是否具有胰岛素抗性、胰岛素抗性发生危险性或胰岛素敏感性的方法，方式是从被测个体获取生物样本，分析样本中IRM基因表达水平与参考值相比是否有差异，其中参考值代表具有已知的胰岛素抗性状态的个体的表达(例如，从个体群确定的值)。因此，在一个实施方案中，参考值可以是胰岛素抗性或胰岛素抗性危险个体中的特征性表达。相同的方法和参考水平可用于分析一组几个IRM基因并可以用于单基因表达的测定和比较。当使用一组IRM基因时，诊断可以由在被测个体中具有与给定的参考水平(即，具有已知的胰岛素抗性状态如eIR表型的群体的特征值)相似的表达的IRM基因的数量和身份来决定。在一个实施方案中，例如，如果至少50％(任选地至少25％或至少75％)的IRM基因的表达水平都与代表胰岛素抗性或高易感性群体中的特征性表达的参考值相似，那么可以推断该个体为胰岛素抗性个体或有发生胰岛素抗性的危险的个体。在另一实施方案中，参考值为健康个体的特征性表达值，因此当至少50％(任选地至少25％或至少75％)的IRM基因的表达水平都与参考值不同时，可以推断该个体为胰岛素抗性个体或有发生胰岛素抗性的危险的个体。因此，在一个实施方案中，本发明提供了诊断个体是否为胰岛素抗性或具有发生胰岛素抗性的增加危险性的方法，方式为获取被测个体的生物样本，然后对样本中表1所列至少3个IRM基因的表达水平与参考值进行比较，其中参考值代表具有已知胰岛素抗性状态的个体群中的表达，如果参考值为胰岛素抗性群体的特征性表达值且所述至少3个IRM基因中至少50％IRM的表达水平与参考值相比没有统计学显著性差异，或者如果参考值为非胰岛素抗性群体的特征性表达值且所述至少3个IRM基因中至少50％IRM的表达水平与参考值相比具有统计学显著性差异，那么该个体即诊断为胰岛素抗性患者或有发生胰岛素抗性的危险患者。在一个实施方案中，胰岛素抗性个体具有eIR表型，和/或非胰岛素抗性个体具有eIS表型。
IRM基因产物表达的监控一个方面，本发明的诊断和预后方法涉及IRM基因产物(RNA或多肽)表达的检测。此分析方法可以用于诊断、预后、药物筛选和其他应用。在一些实施方案中，如此处所述，对被测个体或细胞的IRM基因表达水平与参考值进行比较分析。基于本公开的教导，本领域技术人员将明了，对于IRM表达的定性、定量或半定量分析有很多不同的常规方法可用。例如，IRM基因表达可以通过检测特异多核苷酸(如IRM RNA)或特异多肽(如IRM蛋白)来监控。适用的特异多核苷酸检测方法包括，但不限于，点杂交、Northern杂交、原位杂交、高密度多核苷酸或寡核苷酸阵列杂交、核酸扩增方法(如定量反转录PCR)、RNA酶保护分析等等。适用的特异多肽检测方法包括但不限于利用特异结合IRM多肽或其表位的抗体或其他试剂的免疫分析(如ELISA、Western杂交等等)或者可指示IRM多肽存在的酶活性分析等。关于IRM RNA和多肽的适宜检测方法下文将列举其中几例详述，这些例子仅用于举例阐释而非限制。
IRM多核苷酸的分析方法本发明的一部分诊断和预后方法涉及对生物样本中IRM RNA转录本的检测。为检测RNA水平，获取来自或衍生自生物样本的核酸。从生物样本衍生的核酸是指最终以样本中的mRNA转录物(或其亚序列)为模板合成的核酸。例如，mRNA逆转录得到的cDNA、由cDNA转录的cRNA、cDNA扩增得到的DNA、从扩增的DNA转录的RNA都是由mRNA转录本“衍生”而来的，检测上述衍生产物可以表明样本中最初转录本的存在和/或丰度。因此，适宜的样本包括，但不限于，IRM的mRNA转录本、从此mRNA逆转录得到的cDNA、由此cDNA转录的cRNA、由IRM核酸扩增得到的DNA和从扩增的DNA转录的RNA等等。在一些实施方案中，这些方法始于细胞裂解及随后核酸从其他细胞物质中的纯化。然而，通常不必要将核酸与其它物质完全分离。从个体生物样本中提取RNA的本领域熟知方法有多种(参见Sambrook和Ausubel，前述引文)。例如，当以禁食个体的血样开始收集RNA时，可以裂解红细胞并收集白细胞，之后按每10ml全血加入1.3ml TRIZOL(Life TechnologyIncorporation，GIBCOBRL，Cat#15596-018)来裂解白细胞。加入300微升氯仿以引起混合物分相，用力震荡后静置一段时间。用12,000rpm离心15分钟，使得混合物完全分成含有RNA的水相和含有基因组DNA和蛋白的有机相。收集水相，乙醇沉淀法获取RNA。提取的RNA的质量和完整性通过与1μg和0.5μg的RNA标准(Stratagene catalogue#735026成年，胎盘总RNA)一起并行凝胶电泳(1％琼脂糖凝胶，在含有0.1％DEPC处理后的1X TBE的电泳槽中，270伏之下电泳10分钟)来鉴定。通过Alpha Imager 2200光密度计对比样本条带与标准RNA条带的强度即可获悉RNA样本的量。用提取的RNA制备的探针可以通过标准方法进行标记(如在标记核苷酸存在的条件下反转录和PCR)。很多熟知的方法，如扩增和基于杂交的方法，都可用于检测IRM基因表达水平(参见Sambrook和Ausubel，前述引文)，其它适合生物样本的方法也可以使用。例如，可以使用基于杂交的分析(其中使多核苷酸探针与目标多核苷酸杂交)。实例性多核苷酸探针和引物的有关描述详见下文，用于多核苷酸杂交的多核苷酸探针序列的选择方法是熟知的(参见，例如Sambrook和Ausubel，上述引文)。有的杂交方式需要至少一个目的序列或探针为固定化的。固定化的多核苷酸可以是DNA，RNA或其它形式的寡聚或多聚-核苷酸，并可以包含天然的或非天然的核苷酸、核苷酸类似物或骨架。这样的分析试验可以通过多种形式来进行，包括高密度多核苷酸或寡核苷酸阵列(Lipshutz，等.Nat Genet 1999，2120-4；U.S.Pat.Nos.5,445,934；5,578,832；5,556,752；及5,510,270)、高密度cDNA阵列(参见Schena et al.，1995，Science270467-70)、Southern印迹、Northern印迹杂交、点印迹及狭线印迹、dipsticks、针、芯片或小珠。以上方法均为本领域熟知的，而且是许多商业化的诊断试剂盒的基础。杂交技术在Hames等人编辑的《NUCLEICACIDHYBRIDIZATION，APRACTICALAPPROACH》(IRL Press，1985)书中以及Gall和Pardue(1969，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，63378-383)、John等人(1969，Nature，223582-587)两篇文献中有一般性描述。点杂交可用于定量分析获自测试个体的核酸样本中IRM转录本的量。在这些分析方法中，来自于测试个体的样本被点在支持物(如滤膜)上，然后用标记后的核酸探针进行探测，该探针可以与IRM核酸特异杂交。允许探针在滤膜上与固定化的核酸杂交以后，洗脱未结合的核酸，可以检测杂交复合体并且通过与滤膜结合的标记探针的数量进行定量。Northern杂交用于样本中IRM转录本的检测和定量。此方法通常涉及最先分离细胞总RNA或poly(A)RNA，然后将RNA在琼脂糖凝胶上电泳分离，用硝酸纤维素或活化的纤维素滤膜、或者玻璃或尼龙膜覆盖在凝胶上，使胶上的分离RNA通过转移缓冲液穿过凝胶转移到膜上。然后可以利用标记后的与IRM互补的特异探针进行探测以形成可以被检测和任选地定量的标记的杂交复合体，从而确定膜上IRM转录本的存在和量(参见，例如Sambrook和Ausubel，前述引文)。相关的杂交方法通过核酸探针阵列来检测和定量IRM转录本。阵列中的探针的类型可以变化，包括例如合成的相对短探针(例如，20-mer或25-mer)、cDNA(全长基因或短于全长的片段)、扩增的DNA、DNA片断(如限制性内切酶消化而成)以及反转录DNA(参见Southern等，1999，Nature Genetics Supplement 215-9)等等。定制阵列和普通阵列都可用于IRM表达水平的检测。定制阵列可以使用与IRM mRNA基因序列的特定预先选定亚序列或其扩增产物杂交的探针制备。普通阵列不是专门制备用来结合IRM序列的，而是设计用来分析任何序列的mRNA的。然而，仍然可以使用此阵列，因为是IRM核酸仅能在包括其互补探针的位置杂交。因此，基于承载互补序列探针的位置的结合程度，仍可以确定IRM水平。在探针阵列方法中，一旦从测试样本获得核酸，通常要将它们反转录为标记的cDNA，虽然也可使用标记的mRNA。然后使包含标记核酸的测试样本与探针阵列相接触。经过充分的时间使得样本中所有标记的IRM核酸都能与探针杂交，然后典型地在高度严格洗涤条件下洗涤此阵列一次或多次以去除未结合的核酸，同时尽量减少与阵列核酸探针的非特异结合。通过多种商品化扫描设备和附随的分析软件便可检测标记IRM的结合情况。例如，如果来源于样本的核酸进行荧光标记，则杂交的强度可以通过例如光子计数模式的扫描共聚焦显微镜来确定。有关适宜扫描装置的描述参见Trulson等的U.S.5,578,832、Stem等的U.S.5,631,734，并且可以从Affymetrix公司获得商品名GeneChipTM的此装置。一些类型的标记物提供了可以通过酶法扩增的信号(参见Broude等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.913072-76)。还可应用其它多种标记物，包括，如放射性同位素、发色团、磁颗粒和密电子颗粒等等。与标记核酸杂交的探针阵列的位置可以通过解读器来识别，例如U.S.专利No.5,143,854，WO 90/15070，和U.S.5,578,832的描述。定制阵列中，然后可以分析杂交模式以确定所分析样本中已知mRNA种类的存在和/或相对量或绝对量，见WO 97/10365。关于探针阵列使用的其他足以指导本领域技术人员的教导可以参见WO 97/10365，PCVUS/96/143839和WO 97/27317。有关微阵列在表达分析中的用途的其他讨论可参考Duggan等，1999，Nature Genetics Supplement 2110-14；Bowtell，1999，NatureGenetics Supplement 2125-32；Brown和Botstein，1999，Nature GeneticsSupplement 2133-37；Cole等，1999，Nature Genetics Supplement 2138-41；Debouck和Goodfellow，1999，Nature Genetics Supplement 2148-50；Bassett，Jr.，et al.，1999，Nature Genetics Supplement 2151-55；以及Chakravarti，1999，Nature Genetics Supplement 2156-60。核糖核酸酶保护分析法(RPA)可用于IRM表达的检测。RPA方法涉及制备针对IRM的标记反义RNA探针，随后使探针在液相中与包含在生物样本中的IRM转录本杂交形成RNARNA杂交体。未杂交的RNA用RNAase消化去除，而RNARNA杂交体却在此消化过程中受到保护而不被降解。然后通过凝胶电泳分离标记的RNARNA杂交体，检测和定量分析IRM相应的条带。通常被标记的RNA探针是由放射性同位素来标记的，通过放射性自显影进行IRM条带的检测和定量。(有关RPA的进一步讨论参见Lynn et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.802656；Zinn等，1983，Cell 34865；以及Sambrook和Ausubel，同前引文。)
在一个实施方案中，原位杂交用于检测样本中IRM序列。原位杂交分析为人熟知，一般地描述在Angerer等，酶学方法(METHODSENZYMOL.)，152649-660(1987)和Ausubel，同前引文。此方法通常涉及首先将测试细胞固定于支持物(如微量滴定板孔壁)上，然后用适宜的透化溶液使细胞透化，再用含有针对IRM的标记探针的溶液与细胞接触，允许探针与IRM核酸杂交，消化过量探针、洗涤，之后对杂交的探针定量。此方法详见Harris，1996，Anal.Biochem.243249-256；Singer et al.，1986，Biotechniques 4230-250；Haase et al.，1984，METHODS IN VIROLOGY，vol.VII，pp.189-226；核酸杂交操作指南(NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATIONA PRACTICAL APPOACH)(Hames，et al.，eds.，1987)。基于扩增的方法，如PCR和LCR，也可以用于检测IRM表达。扩增核酸有很多方法，例如(1)聚合酶链式反应(PCR)(参见《PCR技术DNA扩增的原理及应用》(PCR TECHNOLOGYPRINCIPLESAND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION)(H.A.Erlich，Ed.)Freeman Press，NY，NY(1992)；《PCR操作方法和应用指南》(PCRPROTOCOLSA GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS)(Innis，et al.，Eds.)Academic Press，San Diego，CA(1990)；以及U.S.专利号4,683,202和4,683,195)；(2)连接酶链式反应(LCR)(参见Wu和Wallace，Genomics 4560(1989)以及Landegren等，Science 2411077(1988))；(3)转录扩增(参见Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173(1989))；(4)自动维持序列扩增(参见Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871874(1990))；(5)基于核酸的序列扩增反应(NABSA)(参见Sooknanan，R.和Malek，L.，BioTechnology 13563-65(1995))；(6)链置换扩增反应(SDA)(参见Walker et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89392-396)；(7)基于核酸序列的扩增反应(NASBA)(参见Cangene，Mississauga，Ontario；Compton，1991，Nature 35091)，等等。PCR方法衍生的一个实用的方法是PCR ELISA(见BoehringerMannheim Cat.No.1 636 111)，该方法中用地高辛标记的dUTP掺入PCR反应产物中。PCR反应混合物变性后与生物素标记的寡核苷酸链杂交，该寡核苷酸链经设计能够在退火时结合到PCR产物的内部序列上。杂交产物固定于链霉亲和素包被的平板上并通过抗地高辛的抗体进行检测。多种所谓“实时扩增”方法或“实时定量PCR”方法都可用于样本中IRM mRNA的定量检测分析。该方法涉及测量在扩增的过程中形成的扩增产物的量。荧光核酸酶分析是可以用于检测和定量IRM转录本的实时定量方法的一个具体实例。通常，此方法通过双重标记的荧光寡核苷酸探针连续测定PCR产物积累，此方法有时在文献中简称为“TaqMan”方法。该方法中的探针通常为短(大约20-25个碱基)多核苷酸，并且由两种不同的荧光染料进行标记。通常探针5’端连接报道染料，3’端连接淬灭染料，但这些染料也可以连接于探针的其它位置上。为测量IRM转录本，探针被设计为与IRM转录本上的探针结合位点具有至少实质上的序列互补性。结合IRM两侧区域的上游和下游PCR引物也可以加入到反应混合体系中，用以扩增IRM多核苷酸。当探针完整的时候，两个荧光团之间发生能量转移，报道染料的发光被淬灭染料所淬灭。在PCR的延伸期中，探针被Taq聚合酶等核酸聚合酶的5’核酸酶活性切割，从而使报道染料脱离探针-淬灭染料复合体，导致报道染料的发光强度增加，该荧光可被适当的监测系统测量。基于扩增的检测中使用的引物可以根据靶序列(待检测的序列)的信息容易地设计。某些分析中特别适宜的引物具有近60℃的TM值，长度在100～600bp之间，并且与待扩增区段具有特异性(这可以由GenBank的BLAST分析和预期引物，例如，使用软件如Oligo 6(Molecular BiologyInsights，Inc.；http//www.oligo.net)来确定)。优选引物跨越内含子/外显子拼接处，从而可以容易地将污染的基因组DNA的扩增与所需的RNA/cDNA的扩增分开。众所周知，引物不应自身内形成双螺旋，或是与用于扩增的引物对(如果存在的话)的另一引物之间形成双螺旋。Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)制造的ABI 7700分析仪是专门适用于检测荧光发射(诸如在荧光分析中产生的荧光)的一种装置。该装置的配套计算机软件能够在扩增过程中记录报道剂和淬灭剂的荧光强度。这些记录值然后可以用于计算标化的报道剂发光强度的连续增加以及最终对所扩增的mRNA进行定量。实时PCR方法的另一实例中，PCR通过Cy5标记的引物和单荧光标记的探针来进行。当探针在退火过程中与Cy5标记引物的延伸产物结合时，这些荧光团被拉的足够靠近以致可以引发能量共振转移，从而增加Cy5的荧光强度。参见Stoitchkov et al.，Clin Chim Acta.2001，306133-8。另一个可以与多种设备系统一起使用的检测方法是分子信标(Molecular beacon)的应用。分子信标是有内部淬灭的荧光团的DNA分子，当它们结合到互补的靶序列上时，荧光团的荧光便得以恢复。分子信标是一个茎环结构，环部是与靶DNA序列互补的探针序列，茎部是探针序列的两末端互补序列退火形成的。荧光分子结合到DNA序列的一端，淬灭分子结合到另一端。茎部的杂交使得两分子彼此靠近，从而荧光团的荧光通过共振能量转移被淬灭。当探针遇到靶分子时便与其互补序列杂交。该杂交迫使茎部打开，从而使荧光团和淬灭剂彼此分离，导致可被检测的荧光恢复。参见，Steuerwald等，1999，Mol.Hum.Reprod.51034-39。有关实时检测扩增产物量的荧光方法的原理和操作的其他细节可参见Gelfand的U.S.Pat Nos.5,210,015，Livak等的5,538,848、Haaland的5,863,736、以及Heid等1996，Genome Research 6986-994、Gibson等，1996，Genome Research 6995-1001、Holland et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-7280、以及Livak等，1995，《PCR方法及应用》(PCRMETHODS AND APPLICATIONS)357-362。如前作述，有时需要建立用于和被测个体中的IRM基因产物表达进行比较的标准参考cDNA。适用的标准参考cDNA可以由熟练技术人员用已知的各种方法来制备。例如，由来源于具有相似OGTT和SSPG值的IS个体群(即极端IS表型群体)的RNA预先制备的cDNA可作为此标准。从每例禁食后eIS对照个体中采集血样，用标准方法(如Gibco-BRL的Trizol法)在采血后1小时内提取总RNA。等量混合来自每例IS标准个体的RNA，用Cy3-脱氧鸟苷三磷酸(dUTP)标记进行初始检测或用Cy5-dUTP标记进行确证检测。为评估患者的基因表达谱，在同一条件下禁食采血并提取RNA，用此RNA制备Cy5-dUTP标记的cDNA。该cDNA与等量的Cy3标记的标准cDNA混合，然后与含有针对1个或多个IRM基因的探针的微阵列(玻璃或膜)杂交。通过上述方法检测相对于标准对照的基因表达水平，并可以基于相对于标准对照上调或下调的基因的组合数目，对患者发生胰岛素抗性或相关病症的危险度进行评分。如需要，结果可以通过“flip-dye”技术(参见Wang et al.，2000，Nat Biotech.18457-59)进一步确证，见实施例中的描述。明显地，在备选实施方案中，预先制备的cDNA标准样本可以来源于健康(“正常”)个体、胰岛素抗性个体、胰岛素敏感个体等等。一般，患者和标准的IRM基因(相对)表达水平相似，说明该患者与标准具有相同的表型(例如，正常、胰岛素抗性等)。
核酸引物和探针前述方法中的引物和杂交探针为具有足够长度的多核苷酸，所述长度使得该多核苷酸可以与样本中的IRM mRNA转录本特异杂交(例如，在严紧条件下)。如前所述，本领域技术人员能够选择和制备用于检测IRMmRNA的适宜探针或引物。例如，在一个实施方案中，引物或探针可以与例如(1)具有表1登录序列的多核苷酸和其互补序列(除去任何ploy-A尾巴)以及(2)具有表1所列IMAGE克隆的插入序列的多核苷酸杂交。在多种实施方案中，探针与上述(1)或(2)的多核苷酸或其互补序列具有实质上的序列同一性。在多种实施方案中，探针能够在严紧条件下与上述(1)或(2)的多核苷酸序列的互补分子进行杂交。在多种实施方案中，探针包含至少10个与上述(1)或(2)的多核苷酸一致或完全互补的碱基，常常至少大约15个碱基、至少大约20个碱基、至少大约25个碱基、至少大约50个碱基、至少大约100个碱基或至少大约500个碱基。引物常常含有大约12到大约100个与IRM序列一致或完全互补的连续核苷酸，更常见为大约12个到大约50个连续核苷酸，甚至更常见为大约15个到大约25个连续核苷酸。探针的设计可以基于包含表1所列多核苷酸或其片断的天然mRNA的序列来进行。杂交探针通常至少15个核苷酸，有时20～30个核苷酸，有时30～50个核苷酸，有时甚至达到全长IRM核酸。在一些实施方案中，引物和杂交探针小于大约下列任一长度(按碱基或碱基对计算)10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；10。在一些实施方案中，引物或杂交探针大于大约下列任一长度(按碱基或碱基对计算)10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500；10000；20000；50000。或者，引物或杂交探针可以是在以10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；或10为上限并以10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；或7500为独立选择的下限(其中，下限低于上限)的范围内的任何长度。在多种实施方案中，探针序列或者以上描述的部分具有与IRM序列相同或完全互补的序列。在一些实施方案中，探针和引物可以经过修饰，如引入限制性酶切位点等。在其他实施方案中，本发明的引物或探针包含额外序列，如接头。在再一些实施方案中，本发明引物或探针用可检测的标记物进行修饰。例如，可以对引物和探针进行化学修饰，例如衍生化、掺入修饰的核苷酸碱基或包含能与抗-配体(如生物素)结合的配体。在一些实施方案中，探针用可检测标记物进行标记，例如利于检测的放射性同位素、荧光团、发色团或酶等。在一些实施方案中，探针也可是衍生的。本发明的引物和探针可以通过化学合成(参见Narang等，1979，《酶学方法》6890；Brown等，1979，《酶学方法》68109)或重组等常规方法制备。引物和探针可以是RNA，DNA，PNA或嵌合体(chimeric)，也可以包含非天然碱基，如脱氧次黄嘌呤核苷(参见Batzer等，1991，Nucleic Acid Res.195081；Ohtsuka等1985，J Biol.Chem.2602605-2608；Rossolini等，1994，Mol.Cell.Probes 891-98)或修饰的骨架残基或键。在本文提供的教导下，本领域技术人员能够选择特异扩增样本中的IRM基因、mRNA或cDNA之全长或片断的引物对。
IRM多肽分析也可以检测IRM多肽的表达水平。在这里，IRM多肽这个术语指的是此处所述IRM基因编码的多肽(如天然多肽)。术语IRM多肽也包括等位基因变体以及修饰后的蛋白。在一些实施方案中，术语IRM也包括部分序列(如表达序列标签，EST)编码的截短多肽或变体多肽。通过参考附随表1所列GenBank登录号序列的注释，示例性多肽序列将是明显的，并且这些序列可以通过此处公开的多核苷酸序列的概念性翻译进行推导。IRM蛋白可以用本领域技术人员熟知的蛋白质分离方法(参考前面提到的Harlow和Lane引文的相关描述)从组织(如血液)中分离。检测特定多肽的方法为人熟知，包括但不限于酶免疫分析(ELA)、放射性免疫分析(RIA)、Western杂交分析、免疫组化法和酶联免疫吸附分析(ELISA)等等。应知道有时无需分离IRM蛋白；例如，常常可以在细胞裂解液中分析蛋白或者甚至分析在组织的细胞表面表达的蛋白质。凭借此处公开的IRM表达与胰岛素抗性和IR相关病症的相关性的教导，本领域普通技术人员可以设计出分析试验来检测(定量或定性)IRM多肽表达。在一个实施方案中，使用免疫学方法，例如使用结合IRM多肽的抗体或其它特异结合剂。抗IRM抗体(单抗或多抗)可以通过本领域技术人员熟知的多种方法制备。参见Harlow和Lane，同前引文，以及Coligan等，同前引文。这些技术包括通过从噬菌体或类似载体中的重组抗体文库内筛选抗体的抗体制备技术。参见Huse等，1989，Science 2461275-81；及Ward等，1989，Nature 341544-46。对于制备抗IRM抗体，IRM多肽(或更常用的是其免疫原性蛋白片断)用来作为免疫原或筛选IRM结合片断。IRM多肽或片断可以通过本文其它地方所述的重组表达或化学合成的方法制备。对于多抗的制备，选择适当的靶免疫系统，常用的为小鼠或家兔，也可以用山羊、绵羊、奶牛、小鸡、豚鼠、猴子和大鼠。可以通过亲和纯化等常规方法沉淀、分离和纯化宿主产生的免疫球蛋白。多克隆血清层析纯化后可得到基本上单特异性的抗体群。很多成熟的免疫结合分析方法都适宜用来对本发明的IRM蛋白进行检测和定量。参见U.S.专利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168，及《细胞生物学方法》(METHODS IN CELL BIOLOGY)37卷《细胞生物学中的抗体》(ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY)Asai等.Academic Press，Inc.New York(1993)；《基础及临床免疫学》(BASIC ANDCLINICAL IMMUNOLOGY)第7版Stites & Terr等著(1991)；Harlow和Lane，同前引文，Coligan和Ausubel，同前引文。检测IRM多肽的免疫分析方法有竞争性和非竞争性两种。通常所需分析的IRM基因产物通过可检测标记物直接或间接地检测。分析中所用的具体标记物或可检测基团通常不是本发明的关键方面，只要它们不显著地干扰分析中所用一种或多种抗体的特异结合就可以了。标记物可以共价结合到捕获物(如抗IRM抗体)上，也可以结合到第三者上，如能够在与捕获物识别位点不同的表位特异结合IRM多肽的其它抗体。非竞争性免疫分析直接检测被捕获的分析物(这里指IRM多肽)的量。利用单抗的双位点免疫分析就属于这样的分析，这里使用的单抗与被捕获的分析物上的两个相互之间没有干扰的表位发生反应。相关背景知识参见Maddox等，1983，J Exp.Med.，1581211。此分析直接定量样本中的IRM蛋白。例如，使用所谓的“夹心”分析，可以将捕获物(这里指抗IRM抗体)直接结合于固相基质上以固定化。然后这些固定化的抗体将捕获测试样本中的多肽。然后，由此固定的IRM可以与标记试剂，如带有标记物的第二抗IRM抗体结合。或者，第二抗IRM抗体可以缺少标记物，但是它又可以与标记的三抗结合，所述三抗为特异地针对二抗来源物种之抗体的抗体。二抗可以用生物素等可检测部分修饰，所述可检测部分将能够被第三标记分子(酶标记的链霉亲和素)特异结合。某些夹心分析属于酶联免疫吸附分析(ELISA)，该分析的检测抗体是酶标记的。通过加入该酶底物产生可被检测的信号，可以达到对检测抗体的检测目的。在竞争性分析中，样本中IRM多肽含量是通过测量被样本中的分析物(如IRM多肽)从捕获物(如抗IRM抗体)上替换(或竞争)下来的添加的(外源)IRM蛋白的量来间接得到的。在一个竞争性分析中，样本中先加入已知量的IRM蛋白，然后样本与能够特异结合IRM蛋白的捕获物(如，抗IRM抗体)接触。与抗体结合的IRM蛋白的量与样本中原来存在的IRM蛋白的浓度成反比。抗体优选固定在固相基质之上。结合抗体的IRM蛋白量可以通过测量IRM蛋白/抗体复合物中的IRM蛋白量来得到，也可以通过测量剩余的未形成复合物的IRM蛋白的量来得到。IRM蛋白量可以通过提供标记后的IRM分子来检测。例如，半抗原抑制分析法中，分析物(这里指IRM蛋白)固定在固相基质之上。样本中加入已知量的抗IRM抗体，然后样本与固定化的IRM蛋白相接触。此时，结合固定化IRM蛋白的抗IRM抗体的量与样本中存在的IRM蛋白量成反比。再者，固定的抗体的量可以通过检测固定化抗体的分数或剩余在溶液中的抗体分数来检测。该检测可以直接的，即利用标记的抗体进行；或可以是间接的，即通过随后添加特异结合上述抗体的标记部分来完成。关于各种抗体分析的方法学和步骤的其它指导可参见下列文献Greene的美国专利号4,376,110；《抗体实验室手册》(ANTIBODIESALABORATORY MANUAL)一书中“使用单抗的免疫分析方法”，冷泉港实验室，14章(1988)；Bolton和Hunter的《免疫学实验手册》(HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY)(D.M.Weir，ed.)，第一卷26章，“放射性免疫分析及相关方法”，Blackwell科学出版社，1986；Nakamura等《免疫学实验手册》(D.M.Weir，ed.)，第一卷27章，“酶学免疫分析异源和同源体系”，Blackwell科学出版社，1986；Coligan，同前引文。上述分析中使用的抗体可以包括多克隆抗体、单克隆抗体及其片断，见下文。单克隆抗体可通过已成熟的方法制备(参见Kohler和Milstein(1975)Nature 256495；及Harlow和Lane，同前引文)。除了IRM多肽的竞争性和非竞争性免疫分析方法，本发明还提供了检测和定量分析IRM多肽的其它方法。例如，Western杂交(免疫印迹immunoblot)分析可用于样本中IRM的检测和定量。此技术一般包括利用凝胶电泳基于分子量分离样本多肽，然后将分离的多肽转移到适宜固相支持物(如硝酸纤维素滤膜、尼龙膜或衍生化的尼龙膜)上，继而用可特异结合IRM的抗体与样本孵育。该抗IRM抗体将能够特异结合至固相支持物上的IRM。此抗体可以进行直接标记或可以使用特异结合此抗IRM抗体的标记抗体(如标记的山羊抗小鼠抗体)进行随后检测。除此以外，本发明还包括脂质体免疫分析(LIA)等方法。LIA利用的脂质体经设计能够结合特定分子(如抗体)并释放出包囊在其中的试剂或标记物。释放的化学物质即可通过标准技术进行检测(参见Monroe等，1986，Amer.Clin.Prod.Rev.534-41)。还可以测量各种IRM活性以检测IRM多肽表达的升高变化。例如，当IRM蛋白具有可分析的酶学活性的时候，酶活性的升高意味着IRM表达的升高。在一种分析试验中，检测由IRM蛋白直接(即催化)或间接产生的代谢物。
时程分析某些评价患者发生胰岛素抗性及其相关病症的危险度的预后方法涉及监测胰岛素抗性或IR相关病症易感患者的IRM表达水平，以跟踪患者的IRM表达随时间是否表现出变化。IRM表达随时间的变化意味着该个体发生胰岛素抗性或IR相关病症的危险性在升高。与其它的IRM测量一样，危险患者的IRM表达水平可以与参考值(或基线值)进行比较。分析中的基线值可以是针对相同个体的先前测定值或针对对照组(如无明显危险度的群体，eIS表型群体等)确定的统计值(例如，平均值)。患者的IRM表达水平表现出随时间出现统计学显著升高可以促使医师采取预防措施以减少个体发生胰岛素抗性的可能性。
治疗评估本发明的分析还可用于在动物实验、临床试验或患者的监控治疗过程中评价特定治疗方案的疗效。在这些情况下，可能期望确立患者在开始治疗前的基线水平，并且在整个治疗过程中——通常规则地——重复此分析一次或多次，从而评价作为治疗结果的IRM表达水平是否朝着期望的终点变化。因此，本发明给出了一个评估缓解或治疗患者胰岛素抗性之疗效的方法，即通过比较来自患者的第一和第二样本中IRM基因产物的表达来实现，其中第一样本得自患者接受至少一部分治疗之前，而第二样本从接受该部分治疗后的该患者得到，其中所述IRM基因(或者优选地，至少2、至少3或至少4个IRM基因)表达的统计学显著变化表明该疗法对于治疗胰岛素抗性有效。本发明的分析方法也可用于胰岛素抗性及其相关代谢疾病的候选药剂的临床试验研究。该试验的对象是接受治疗的群体或对照群体，群体中的个体在规定的一组基因上具有相似或相同的表达谱。使用遗传匹配的群体可以消除或减少遗传因素引起的治疗结果的差异，从而更准确地评估潜在药物的疗效。此外，本发明的分析还可用于临床试验完成之后阐释对既定治疗方案产生的应答差异。例如，可以凭借一个或多个IRM基因和/或其相关基因多态性将所选患者分为疾病亚型或亚类。还可以使用这些基因鉴定具有相似表达谱的患者亚组，即对治疗有不寻常(高或低)反应的亚组或对治疗完全无反应的亚组。这样，影响治疗效果的根本遗传因素的相关信息可用于治疗方法研发的很多方面(从新靶的鉴定到新临床试验的设计直至产物标记和患者的靶向治疗)。另外，IRM基因可用于鉴定与治疗不良应答(不良事件)相关的遗传因素。例如，发生药物不良反应的患者也许具有相似的表达谱，而且这种相似性高于预期由随机造成的相似性。这就使得可以早期地鉴定出这些个体并将他们排除到治疗之外。而且，这还提供了可用于理解造成不良反应的生物学原因并修改治疗方案以避免这些结果的信息。
胰岛素抗性易感性的相关基因多态的检测基于本发明的教导，可以在表1所列一个或多个IRM基因中鉴定出与群体中的胰岛素抗性或其相关表型有关的多态性。基因多态是指群体中对于特定的基因存在两个或更多个的遗传决定的可变序列(称为等位基因)。预期一些IRM基因多态与几种胰岛素抗性相关生物学和医学病症(包括糖尿病和X综合征)有关系。这样的多态可用于很多预后和诊断方法。在一个实施方案中，通过比较来源于胰岛素抗性表型不同的个体群的IRM基因序列(如cDNA序列、包含启动子和内含子的基因组序列或它们的部分)，确定可用于筛选中的多态性。这里所说的“表型”指的是任何可被检测或可被测量的生物体(如患者)性状，例如胰岛素抗性或IR相关病症(如X综合征或糖尿病)等疾病的症状或易感性。胰岛素抗性表型不同的个体群的实例包括，但不限于(1)eIS表型个体和eIR表型个体，(2)有或无胰岛素抗性的个体，(3)被认为有或无增加的危险性发生胰岛素抗性的个体，(4)患有和未患有胰岛素抗性相关病症(如糖尿病)的个体，(5)有和无增加的危险性发生胰岛素抗性的个体，或(6)以上不同组中群体的组合。为了清楚但非限制的目的，下文将提及示例性eIS表型群体和eIR表型群体。然而，所有这些提及都应理解为同样提及到其他IRM相关表型。多态标记包括限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、串联重复的可变数目(VNTR)、高变区、微卫星和简单序列重复(双、三或四核苷酸重复)。单核苷酸多态性(SNP)发生在由单核苷酸占据的多态位点，该位点是等位基因序列之间的差异位点。该位点两侧通常为基因的高度保守序列。有时将最高频率出现在所选群体中的等位基因形式称作野生型。对于等位基因形式而言，双倍体生物(如人)可以为纯合子或杂合子。表1所列的一个或多个基因的多态形式被预期与胰岛素抗性相关，可用于鉴定这些紊乱的危险个体。优选的多态标记有至少两个等位基因，每个等位基因在所选人群中的发生频率大于1％，更优选地大于10％。个体或群体中IRM基因序列或多态性的确定在此有时称为“基因型分析”。基因型分析包括通过本领域已知的任何方法确定IRM基因的多态性身份。多态可通过直接测序鉴定。对于基因组DNA的分析而言，事实上所有含DNA的生物样本都是适宜的。对于分析cDNA，则从表达该IRM基因的器官中获取组织样本(如白细胞)。纯化的基因组DNA或cDNA可通过PCR扩增，该PCR反应使用特异设计以扩增该基因组DNA或cDNA的一套重叠的引物，在横跨全基因(包括启动子序列)或cDNA的一系列500～1000bp的重叠片断中进行。eIS和eIR个体间这些PCR扩增片断中可能存在的多态可以通过多种标准方法进行检测，如(1)使用双脱氧链终止法或Maxam-Gilbert法直接测序(参见Sambrook，Ausubel，同前引文)，(2)SSCP(Orita等PNAS 862766-2770(1989)，(3)变性梯度凝胶电泳(《DNA扩增原理及应用》(Principles and Application for DNAamplification)第7章“PCR技术”，Henry Erlich编，W.H.Freeman andCo.New York，1992，)以及其它本领域熟知方法(如单链多态分析、连接酶链式反应、酶切分析和Southern杂交)。备选地或组合DNA测序，使用其它方法鉴定IRM基因中的改变。这些方法包括单链多态分析(SSPA)和杂合双链分析法(Orita等，1989，Proc Natl Acad Sci USA，862766)；连接酶链式反应(LCR)；错配检测技术；基因蛋白产物的存在或其存在形式分析(如等电聚焦及/或免疫分析)。这些IRM基因多态性可以是引发氨基酸替换或翻译终止的单碱基替换，也可以是缺失、插入或基因重排。多态位点可以位于基因的内含子、外显子或启动子或其它影响基因表达的调节区域内。表2中所列的是通过测序IRM10(假定蛋白FLJ22297)检测到的多态例子(+686位点SNP的其它相关数据也可以在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中查询)。
表2 在另一实施方案中，通过检查公众数据库中描述的存在于本文公开的IRM基因中的多态性可鉴定用于筛选的基因多态。此外，对通过数据库检索IRM基因(如SNP合作数据库的检索；www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)或通过其它方法鉴定到的推定多态性，可以通过DNA测序验证以确定这些多态的确切性质。从公众数据库鉴定到的选定IRM基因编码区中的多态性的实例列于表3。
表3 确定这些个体组在一个或多个IRM基因的一个或多个多态位点上存在的多态性之后，可分析该信息以检测一个或多个IRM基因的特定等位基因与胰岛素抗性表型之间的相关性。在一个实施方案中，该分析通过如下步骤实现确定一个或多个IRM基因中的每个多态等位基因的频率，并在eIS和eIR个体之间进行比较，然后选出在两组之间有不同等位基因频率的多态进一步在大个体组(n＝250～500)中测试。标准卡方检验可用于鉴定这些等位基因中的一个或多个与胰岛素抗性之间在统计学水平上的显著相关性(p＜0.05)(例如，通过标准分析确定)。例如，在最初的筛选中可能发现eIR组个体中IRM基因X的多态位点A上等位基因A1的频率比eIS组的高。这种A1等位基因频率差异被发现具有统计学显著性，而且在250～500个体的大群体中与胰岛素抗性之间存在相关性。而且，可能发现，由更显著的P值(如，在单多态性检验中P为0.05而在双多态性检验中P为0.005)判断，X基因多态位点A的A1等位基因与Y基因多态位点B的B1等位基因的组合存在与胰岛素抗性表型在该组个体中具有更显著的相关性。相关性研究方法，即单元型确定方法已为人所熟知，详见例如WO01/64957(胰岛素信号和葡萄糖转运通路的相关多态性)及美国专利号6,346,381，两份文献并入此处作为参考。因此，在一个实施方案中，本发明提供通过检测个体IRM基因中与胰岛素抗性相关IRM多态有关的至少一个多态性，评估被测个体发生胰岛素抗性的危险度的方法。对表1所列一个或多个基因的若干个这样的多态形式的组合检测将提高诊断的可信度(confidence)。例如，已知与胰岛素抗性相关的单IRM多态形式的存在可能提示个体有20％的(推测的)可能发生胰岛素抗性或易于发生胰岛素抗性，然而多个多态形式(如5个，且每个都与20％的易感可能性相关)的检测通常将指示该个体有更高的(例如，80％)的可能性发生或易于发生胰岛素抗性或IR相关病症。个体或样本中存在的多个等位基因的组合被称作“单元型”。本发明上下文中，单元型指的是在给定个体中存在的与表型(例如，大于平均的胰岛素抗性易感性)相关的一个以上IRM基因相关多态(等位基因)的联合。IRM多态的分析可以与其它多态或胰岛素抗性的其它危险因素(如II型糖尿病的个人和/或家族史等等)的分析相结合。在一些实施方案中，本发明的分析包括检测2个或2个以上IRM基因(例如，一组至少4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20，或25个IRM)的多态性标记的存在(或不存在)。因此，一方面本发明提供了确定个体是否有危险发生胰岛素抗性或所述个体是否患有胰岛素抗性的方法，即提取个体的核酸样本，继而确定一个或多个IRM基因上存在的核苷酸是否表明发生胰岛素抗性的危险性。一方面，本发明提供了估计eIR或eIS个体群中等位基因频率的方法，即从所述群体中多个个体之每一个获得核酸样本，并确定在来自所述群体的核酸样本池中IRM基因多态性碱基的比例。一方面，本发明给出基因型和胰岛素抗性表型之间相关性的检测方法，即分析具有已知胰岛素抗性状态的第一群体中至少一个IRM基因的基因型；分析具有已知胰岛素抗性状态的第二群体中所述IRM基因的基因型；然后确定该基因型与表型之间是否具有统计学显著相关性。一方面，本发明给出了估计群体中一套IRM多态的单元型频率的方法，即分析该群体中至少第一IRM基因的基因型；分析该群体中第二不同IRM基因的基因型；确定每个IRM基因的多态身份；并将单元型确定方法应用于所确定的核苷酸身份上以估计所述频率。这里的“单元型确定方法”用于指本领域已知的所有确定单元型的方法，包括期望最大化算法(参见美国专利号6,346,381，Lange K.，《遗传分析的数学及统计学分析方法》(Mathematical and Statistical Methods for Genetic Analysis)，Springer，New York，1997；Weir，B.S.，《遗传数据分析II离散群体遗传数据分析方法》(Genetic data Analysis IIMethods for Discrete population geneticData)，Sinauer Assoc.，Inc.，Sunderland，Mass.，USA，1996；)。优选地，利用期望最大化(EM)算法计算出最大似然单元型频率(参见Dempster等，J.R.Stat.Soc.，39B1-38，1977；Excoffier L.和Slatkin M.，Mol.Biol.Evol.，12(5)921-927，1995)，该算法可以用计算机执行方法进行，如EM-HAPLO程序(Hawley M.E.等，Am.J.Phys.Anthropol.，18104，1994)或Arlequin程序(Schneider等，《Arlequin群体遗传数据分析软件》(Arlequina software tor population genetics data analysis)，Universityof Geneva，1997)在相关方面，本发明给出检测单元型与表型之间相关性的方法，即评估具有上述第一表型(例如，eIS)的群体中至少一个单元型的频率，评估具有上述第二表型(例如，eIR)的群体中所述单元型的频率，并确定所述单元型是否与所述表型之间存在统计学显著相关性。在一个实施方案中，单元型与eIR表型或eIS表型的相关性表现出0.001的p值。
V.IRM表达与活性的调节物的筛选本发明给出了鉴定可用于治疗胰岛素抗性和IR相关病症的药剂的筛选方法。此筛选方法通常涉及进行多种分析试验来鉴定可以调节IRM基因产物的表达或活性的药剂。可以利用多种不同的筛选方法鉴定在细胞内可以调节IRM表达水平的药剂，所述细胞尤其可以是哺乳动物细胞，特别是人细胞。总的来说，筛选方法涉及筛选多种药剂以鉴定出能通过例如结合IRM多肽、阻止抑制物结合IRM多肽或激活或抑制IRM表达从而改变IRM活性的药剂。这里，IRM活性或表达的“调节物”可以抑制或刺激IRM基因产物的表达。因此，在一个实施方案中，施用调节物可以降低细胞或动物中IRM基因产物的表达或活性(如，起到拮抗剂或抑制剂作用)。在一个不同的实施方案中，施用调节物可以增加细胞或动物中IRM基因产物的表达或活性(如，起到激动剂或刺激剂的作用)。在筛选分析中鉴定出的调节物和/或其活性类似物可配制成可以有效治疗胰岛素抗性和IR相关病症的药物组合物。
IRM多肽的结合及相互作用分析可以通过选择能够结合IRM的化合物进行初步筛选，因为如此鉴定到的化合物中至少一部分可能是IRM调节物。在这些筛选中鉴定到的先导(Lead)化合物可作为合成活性更高的类似物的基础。因此，一方面，本发明给出了筛选药剂以确定其在胰岛素抗性或IR相关病症治疗中的有用性的方法，该方法包括(a)用测试化合物与IRM基因编码的多肽或表达该多肽的细胞相接触，和(b)确定该多肽是否能够结合测试化合物。一旦结合，则提示该测试药剂可用于治疗胰岛素抗性或IR相关病症。结合分析通常涉及IRM多肽与一个或多个测试化合物相接触并给予足够的时间使该蛋白质能够与测试化合物形成结合复合物。确定测试化合物直接结合IRM基因产物的能力可以通过例如如下方式实施在化合物上偶联放射性同位素或酶标记，以便可以通过检测复合物中被标记的IRM基因产物-化合物来确定化合物与IRM基因产物的结合。任何形成的结合复合物都可以通过多种成熟的分析技术之任一种进行检测。蛋白结合分析包括，但不限于，测量共沉淀、非变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的共迁移及Western印迹上的共迁移的方法(参见《A PRACTICALAPPROACH/THEPRACTICALAPPROACHSERIES》(D.Rickwood和BD Hames编的系列)中“受体配体相互作用”有关章节，E.C.Hulme，1992，牛津大学IRL出版社)等等。上述分析中使用的IRM多肽可以是纯化的或重组的。本发明也考虑到对可以调节IRM基因产物或其生物活性部分的活性的测试化合物的分析。IRM基因产物可以在体内与一个或多个细胞和细胞外分子(如，但不限于，肽、蛋白、激素、辅因子和核酸)相互作用，这里将这些细胞和细胞外分子称为“结合伙伴”。用于鉴定IRM的天然体内结合伙伴的方法是已知的，如双杂交和三杂交分析(参见美国专利号5,283,317；Zervos等，1993，Cell 72223-232；Madura等，1993，J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等，1993，Biotechniques 14920-924；Iwabuchi等，1993 Oncogene 81693-1696；BrentWO94/10300)。这些IRM基因产物结合伙伴可能通过IRM基因产物或IRM基因产物介导的信号通路下游元件参与信号传播，或者，它们可能是IRM基因产物的抑制物。通过本发明的应用可以设计分析试验以鉴定可以调节(例如，正面或负面影响)IRM基因产物及其结合伙伴的相互作用的化合物。典型地，用于分析干扰IRM基因产物及其结合伙伴的相互作用的化合物的试验涉及在足以允许IRM基因产物及其结合伙伴相互作用并结合的条件和时间下制备含有IRM基因产物及其结合伙伴的反应混合物，由此形成复合物。为检测药剂的抑制活性，在有或无测试化合物存在下制备反应混合物。测试化合物可以一开始就包括在反应混合物中，也可以在IRM基因产物及其结合伙伴加入以后再行加入。干扰IRM基因产物与其结合伙伴的相互作用的化合物的分析，可以在溶液中进行或通过将IRM基因产物或其结合伙伴锚定到固相表面或基质上来进行。本发明还包括在无进一步的样本处理的情况下在均质或非均质试验体系中直接检测IRM基因产物与其天然结合伙伴和/或测试化合物的相互作用的方法。例如，可以使用荧光能量转移技术(参见Lakowicz等，美国专利号5,631,169及Stavrianopoulos等，美国专利号4,868,103)。
表达及活性分析一些筛选方法包括筛选调节(例如，上调或下调)细胞中IRM表达及其活性的化合物。这些方法通常包括使用基于细胞的分析(cell-basedassays)，其中测试化合物与一个或多个表达IRM的细胞接触，然后检测IRM表达(例如，IRM RNA的水平)的变化。在一个实施方案中，鉴定调节物的方法包括将一个或多个细胞(即“测试细胞”)与测试化合物接触，确定测试化合物是否影响细胞内IRM基因产物的表达或活性。在一个实施方案中，本发明提供了筛选药剂以确定其在治疗胰岛素抗性或相关病症中的有用性的方法，即提供表达至少一种表1所列胰岛素抗性标记(IRM)的细胞；将该细胞与测试药剂接触；并确定IRM基因表达水平是否在该测试药剂存在时发生变化，其中有变化表示该测试药剂对治疗胰岛素抗性有用。通常该确定包括将测试细胞中的所述活性或表达与没有与测试化合物接触的一种或多种类似细胞(即对照细胞)进行比较。备选地，可以用细胞提取物替代完整细胞。在一个相关实施方案中，该测试化合物被施用于多细胞生物(例如，植物或动物)。IRM组分对该细胞或多细胞生物可以是完全内源的，也可以是含有一种或多种重组表达的IRM基因产物的重组细胞或转基因生物。通常测定测试药剂(test agent)对IRM RNA表达水平的影响。然而，在其他实施方案中，本发明提供了确定药剂是否可用于治疗胰岛素抗性的筛选方法，该方法包括(a)提供含有IRM蛋白或者表达该蛋白的细胞的组合物及测试化合物，(b)将该组合物与测试药剂相互接触和(c)确定测试物存在时IRM蛋白活性是否发生变化。有变化表明该测试药剂对治疗胰岛素抗性有用。在一方面，本发明提供了确定测试药剂是否可用于治疗胰岛素抗性的筛选方法，该方法包括(a)将IRM基因编码的蛋白或表达该蛋白的细胞与测试化合物相接触，其中所述蛋白具有可检测的生物活性；(b)确定存在该测试药剂时该蛋白的生物活性水平是否变化，有变化表明该测试药剂对胰岛素抗性的治疗有用。在各种实施方案中，本分析可用任意一种类型的表达IRM基因的细胞，包括培养细胞(例如，原代培养细胞或确立的细胞系)和体内细胞。优选地，该细胞表达一种以上IRM基因，例如，至少约3种，至少约5种，或至少约10种IRM基因。细胞的实例包括EBV-转化的B-淋巴细胞、熟知的胰岛素效应细胞系，如3T3-L1脂肪细胞、CHO和L6大鼠骨骼肌管。也可以使用其它的细胞系，如小鼠巨噬RAW细胞系、Jurkat细胞(急性白血病T细胞)、PC12细胞(大鼠神经元细胞)、Hela细胞和HepG2细胞，如果在这些细胞中所需的IRM基因的表达水平在可检测范围内的话。类似地，可使用来自患Burkitt淋巴瘤、B-细胞型幼淋巴细胞白血病(B-PLL)、B-细胞型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)和B-细胞型急性淋巴细胞白血病(B-ALL)的病人的细胞系或原代培养细胞(例如，Burkitt淋巴瘤细胞系(Raji，Daudi)、B-PLL细胞系(p11A-1-1)和B-ALL细胞系(MOLT-3，MOLT-4))。本领域技术人员将知道许多其它合适的细胞或细胞系。在一个实施方案中，细胞类型是细胞培养物里的细胞，如稳定转化的细胞系。如所指出的，可以使用EBV转化的B淋巴细胞。可以用熟知的技术制备转化的B淋巴细胞。例如，根据一种方法，在柠檬酸盐(黄顶)或肝素(绿顶)Vacutainer管中收集全血样本(12-15ml)，用一步离心技术(Boyum，1964，Nature 204793)分离淋巴细胞，用于分离淋巴细胞的离心溶液(IsoPrep，Red-Out)购自Robbins Scientific Corp(Cat#1070-03-0，和Cat#1069-01-0)。分离后的血淋巴细胞在补加了10％胎牛血清和必需氨基酸的RPMI 1640组织培养基上培养。参考Henderson等人的方法(1977，Virology 76152-63)用EBV上清液感染培养物。通常3～4天以后细胞开始表现出形态学上的变化，此时在倒置显微镜下可见分化细胞的结构呈现哑铃形。生长活跃的细胞培养物表现出的典型形态学变化包括肉眼可见的细胞簇。通常需要6～8周时间才能获得呈现典型的大细胞团的完全转化培养物。在一个实施方案中，用来自于具有已知胰岛素抗性状态(如eIR或eIS表型)的个体的细胞制备细胞系。来自eIR表型个体的细胞系称为“eIR细胞系”。来自B细胞的这样的细胞系称为“eIR B细胞系”。来自eIS表型个体的细胞系称为“eIS细胞系”。来自B细胞的这样的细胞系称为“eIS B细胞系”。应认识到，尽管通常使用的是人的细胞，也可以使用动物细胞(例如，可以监控人IRM基因的非人同系物的表达，或可以监控IRM基因的转基因动物如小鼠中人IRM基因的表达)。当使用非人细胞时，常常期望使用能够识别人IRM基因的非人同系物的核酸或抗体探针(例如，通常可以用基于人IRM序列的探针检测)。本领域普通技术人员可根据表1提供的信息鉴定上述同系物并且得到适用的探针。在一个实施方案中，将测试药剂施用于动物并检测该动物组织(例如，血液或血液级分)中该药剂对IRM同系物表达的影响。细胞中的IRM表达可以通过多种方法进行检测，包括上文诊断方法章节中讲述的方法。如前所述，为检测细胞中IRM的表达水平，可先从细胞中分离RNA，然后用可以与IRM转录本(或来源于其的互补核酸)特异杂交的探针检测细胞中表达的mRNA。或者，可以通过免疫学方法用能够与IRM多肽特异结合的抗体探测细胞裂解液以检测IRM蛋白。或者，可以测定IRM多肽的活性水平。药剂对细胞或体外系统中IRM基因表达的影响可同基线值进行比较，该基线值一般是没有该测试药剂存在时细胞或体外系统中的基因表达水平。还可以检测不表达IRM的细胞的表达水平作为阴性对照。这样的细胞除了不表达IRM外通常与检测细胞在遗传上是基本相同的。在其它实施方案中，基线值可以是来自于对照样本的值或代表对照群体(如非胰岛素抗性高危的健康个体群)的IRM表达水平的统计值。如前所述，本发明提供药物筛选方法，其中监控一个以上IRM基因的表达水平。通过多基因表达的监控可以提供更强有力的分析。由此，在多种实施方案中，测定药剂对IRM基因组合(例如，至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，15，20，或25或更多个表1所列IRM或选自本文公开的这些IRM基因的亚组的IRM基因组合)的表达的影响。通常，能够改变一组多个IRM基因表达的药剂是尤其有意义的，可以作为候选药物或先导药物。包含针对特定IRM基因产物的探针阵列的装置，如本文所述装置，可用于执行此分析。如下所述，在本文描述的筛选分析中鉴定到的药剂可以进一步作用于施用给实验动物(如灵长类、狗、兔、鼠等啮齿类)从而确定动物对该药剂的反应(例如，是否该药剂能够影响该动物对胰岛素的应答)。还可以使用被载体或表达盒稳定转染或瞬时转染的细胞，其中所述载体或表达盒含有编码IRM蛋白的核酸序列。在适宜该蛋白质表达的条件下维持细胞，并使细胞与推定的药剂相接触。其它的基于细胞的分析是使用不表达IRM的细胞的报导分析试验。这些分试验析中的某些利用异源核酸构建体完成，所述构建体包括与报道基因可操作地连接的IRM启动子，该报道基因编码能够被检测的产物。IRM基因启动子通常在转录起始位点上游(或5’)大约300～1000bp的区域内。一些IRM基因启动子的相关描述可通过http//www.ncbi.nlm.nih.gov/链接在GenBank中查询，也可见于科学文献。许多不同的报道基因都可使用，示例性报道基因包括绿色荧光蛋白、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等等。在这些分析试验中，包含报导构建体的细胞与测试化合物相接触。测试化合物如果能够结合并激活该启动子或者能够引发级联反应产生可激活该启动子的分子，那么将引起可检测报道分子的表达。此报导分析试验可以使用多种细胞类型(如酵母、COS、CHO、HepG2和HeLa细胞系等真核细胞)。
转基因动物表达一种或多种编码IRM的多核苷酸的转基因动物也可用于药物筛选和本发明的其它方法。适宜的含有外源IRM基因序列(可以是编码序列或调控序列)的转基因生物包括非人多细胞生物(例如，植物和非人动物)或单细胞生物(例如，酵母)，非人动物如小鼠、大鼠、兔、猴、猿和猪。在一个实施方案中，该生物体能够表达具有人IRM蛋白序列的外源IRM多肽。本发明还提供了单细胞和多细胞生物(或来自它们的细胞)，在所述生物中编码人IRM的同系物的基因被突变或缺失(即，在编码区或调控区)导致与野生型细胞或生物相比，天然IRM蛋白不表达、低水平表达或具有不同活性。这样的细胞或生物常称为“基因敲除”细胞或生物。本发明还提供下列细胞和生物，其中内源IRM基因或者存在或者可选地突变或缺失，且外源IRM基因或变体(例如，人IRM)被导入并表达。这种类型的细胞或生物可用于，例如，作为模式系统鉴定IRM活性或表达的调节物，或检测IRM基因突变对胰岛素抗性的影响。改变或破坏特定基因的方法对技术人员是熟知的，参见，例如，Baudin等，1993，Nucl.Acids Res.213329；Wach等，1994，Yeast 101793；Rothstein，1991，Methods Enzymol.194281；Anderson，1995，Methods CellBiol.4831；Pettitt等，1996，Development 1224149-4157；Ramirez-Solis等，1993，Methods Enzymol.225855；和Thomas等，1987，Cell 51503。典型地，上述方法包括改变或者替换控制待调节的特定基因表达的调控序列的所有或部分序列。可改变调控序列，例如，天然启动子。基因定向突变的一种传统技术包括，将含有目的基因的基因组DNA片段置入载体中，然后将与靶向基因连结的两条基因组臂克隆到含有胸苷激酶的载体中位于选择性新霉素抗性盒的两侧。然后将此“敲除”构建体转染到合适的宿主细胞，即小鼠胚胎干(ES)细胞中，随后对其进行正筛选(例如，用G418筛选新霉素抗性)和负筛选(例如，用FIAU排除缺少胸苷激酶的细胞)，从而允许筛选出经历了和敲除载体的同源重组的细胞。该方法导致目的基因的失活，参见，例如，美国专利5,464,764；5,631,153；5,487,992；和5,627,059。内源基因表达的“敲除”也可以通过同源重组方法在目的基因的调控序列(例如，启动子)中导入异源核酸序列来实现。为了防止功能性酶或产物的表达，可以用改变开放阅读框或破坏启动子的简单突变。为了上调表达，可以用能够引发更高水平转录的异源启动子替代原有的天然启动子。“基因诱捕插入”(gene trap insertion)也可用来破坏宿主基因，小鼠ES细胞可用于制备敲除转基因动物，参见，例如Holzschu(1997)Transgenic Res 697-106。其他方法是本领域已知的。通过同源重组改变内源基因表达也可使用包含目的结构基因的核酸序列来实现。上游序列用于使异源重组构建体定向。利用结构基因序列信息(可参考表1和发表资料(例如，GenBank中)确定)，仅仅使用常规实验方法本领域技术人员即可构建同源重组构建体。改变内源基因表达的同源重组方法参见美国专利5,272,071，及WO 91/09955，WO 93/09222，WO 96/29411，WO 95/31560，WO 91/12650，和Moynahan，1996，Hum.Mol.Genet.5875。
测试化合物本筛选方法可用基本上任何类型的潜在地能够调节IRM表达的化合物进行。因此，测试化合物可以是多种一般类型的，包括但不限于，小的有机分子、已知的药物、多肽；寡糖和多糖等碳水化合物；多核苷酸；脂或磷脂；脂肪酸；类固醇或氨基酸类似物。测试药剂可从例如，天然产物文库或组合文库等文库中得到。组合化学方法学可用于制备大量的寡核苷酸(或其他化合物)，从中可以快速筛选出对任何靶标(如此处描述的IRM蛋白及其基因)具有合适的结合亲和力和特异性的特定寡核苷酸(或化合物)(有关一般背景信息参见Gold(1995)J.Biol.Chem.27013581-13584)。用组合化学中熟知的技术可以制备大规模的合成分子文库并进行同步筛选，例如，见vanBreemen(1997)Anal Chem 692159-2164；Lam(1997)Anticancer DrugDes 12145-167(1997)。对多种可以逐步合成的化合物，可以制备它们的组合文库，这些化合物包括多肽、β转角类似物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、芳香族化合物、杂环化合物、苯并二氮杂唑(benzodiazepines)、寡聚N-取代的甘氨酸和oligocarbanate。多种不同类型的组合文库及其制备方法参见如PCT公开WO 93/06121，WO 95/12608，WO 95/35503，WO 94/08051以及WO 95/30642，将它们都并入此处作为参考。近年来发展了几种自动分析方法，从而使得可以短期内筛选数万的化合物。参见Fodor等.，1991，Science 251767-73以及化学多样性文库的其他说明书，这些说明书描述了通过一组化合物来测试结合亲和力的方法。也可以用噬菌体展示方法产生肽文库。
IRM表达或活性的调节物本发明还提供了(i)通过上述筛选分析鉴定的新药剂，(ii)含有通过上述筛选分析鉴定到的药剂的药物组合物和(iii)通过施用用上述筛选分析鉴定到的药剂来治疗患者的方法，该患者对胰岛素有抗性或具有胰岛素抗性相关症状(例如，糖尿病)，或者易于产生胰岛素抗性或者胰岛素抗性相关症状。用任一种前述筛选方法初步鉴定的化合物可进一步检验以验验其表现的活性。优选地用适宜的动物模型进行这些研究，这些方法的基本模式包括将初筛选确定的先导化合物施用于作为人的模型的动物，而后确定施用该药剂是否影响动物对胰岛素的反应(如施用胰岛素后对血液葡萄糖水平的影响)。适宜的动物的例子包括，但不限于哺乳动物、灵长类，如小鼠和大鼠。胰岛素抗性和II型糖尿病的典型动物模型包括Zucker糖尿病肥胖型(ZDF)大鼠，GK大鼠，Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty(OLETF)大鼠，db/db小鼠和BSB小鼠。一方面，本发明提供了用于治疗胰岛素抗性或IR相关病症的药物的制备方法，该方法包括通过在此描述的方法确定药剂对于治疗胰岛素抗性的有效性，并将该药剂配制成可施用于灵长类动物(例如，人)的药物。例如，适宜的药制剂可是无菌和/或基本上等渗的和/或完全符合美国食品和药物管理局药品生产质量管理规范(GMP)的所有规定和/或为单位剂量形式。
VI.用于诊断应用的装置及试剂盒本发明提供了用于诊断、预后、药物筛选及其它方法的装置及试剂。一方面，提供了包含对一个或多个IRM基因产物(多核苷酸或蛋白)特异的固定化探针的装置。这些探针可以结合多核苷酸(例如，基于对IRMRNA或cDNA的杂交)或多肽(例如，基于对IRM多肽的特异结合)。在一个实施方案中，使用了阵列形式，其中固定了很多(至少2个，通常至少3个或更多)不同的探针。术语“阵列”采用的是其通常含义，指通常固定到基质上的多个探针的每一个在例如基质上都有明确的位置(地址)。阵列上探针的数目可以依赖于装置的性质和用途而变化。例如，用于检测IRM表达的dipstick式阵列可以少至2个不同的探针，虽然通常将存在2个以上，并且常常更多。正如指出的，在一些实施方案中，也考虑到可以使用含有单个固定探针的装置，虽然这样的装置本身通常不被称为“阵列”。已知存在多种结合和杂交形式，包括寡核苷酸阵列、cDNA阵列、dip sticks、针、芯片或珠、southern杂交、northern杂交、点杂交和狭线杂交。因此，可以考虑包含固定于固相基质上的针对IRM基因产物的探针的装置。可以使用许多固相支持物的任何一种，这些支持物可以由玻璃(例如，载玻片)、塑料(例如，聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝化纤维素或其他材料制成。将核酸附着到表面上的一种方法是印刷于玻璃板上，如Schena等，1995，Science 270467-470；Shalon等，1996，Genome Res.6639-645的一般描述。制作微阵列的另一种方法是制作高密度寡核苷酸阵列。参见Fodor等，1991，Science 251767-73；Lockhart等，1996，NatureBiotech 141675；以及美国专利号5,578,832；5,556,752和5,510,270)。在一些实施方案中，考虑其上固定探针的基质(例如芯片或载片)包括多个IRM特异探针(例如不同于含有针对生物体、细胞或组织中表达的所有基因的探针的芯片或载片)。例如，可以根据此处教导专门设计一种阵列，其包括针对至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个或至少10个此处所公开的胰岛素抗性标记的探针。这样，在一个实施方案中，装置或阵列上至少约10％，有时至少约25％或甚至至少约50％的固定探针将特异结合(例如，杂交到)IRM基因产物。在一个实施方案中，基质含有少于约4000个不同的探针，常少于约1000个，少于约100个不同探针，少于约50个不同探针，少于约10个不同探针，少于约5个不同探针，或少于约3个不同探针。如本上下文所用的，如果两个探针不特异结合同一种多肽或多核苷酸(例如，针对不同基因的cDNA探针)，那么这两个探针是“不同”的。在一个实施方案中，探针选自特异结合IRM蛋白的单克隆抗体或其他特异结合蛋白(例如，抗体衍生物或片段)。用于多肽的探针也可固定为阵列形式，例如多孔板中的ELISA形式。本发明还考虑到含有评估一种或多种IRM基因表达的试剂，如检测或扩增IRM基因产物的探针和/或引物的试剂盒。在一个实施方案中，这些探针是能与从IRM基因转录的多核苷酸特异结合的核酸探针。在一个实施方案中，试剂盒含有特异针对多种(至少2种，优选3种，常常4种，有时5种或更多)不同IRM基因产物的探针(如本文中别处描述的针对一组IRM中选出的1、2、3、4、5或更多种IRM的结合或杂交靶标)。在一个实施方案中，探针选自特异杂交此处公开的IRM多核苷酸的多核苷酸。能与核酸(如mRNA，已剪接的mRNA、cDNA等)结合的适宜的试剂包括互补核酸。例如，核酸试剂可以包括固定于基质上的寡核苷酸(标记或未标记)、不与基质结合的标记寡核苷酸、PCR引物对等等。这些试剂可以用于例如，促进患者样本中多个IRM的同步检测。本发明的试剂盒也可以备选地含有对实施本发明的方法有用的额外成分。作为例子，该试剂盒可以含有适用于退火互补核酸或使抗体与其特异结合的蛋白结合的液体(如SSC缓冲液)、一个或多个样品区室、实施本发明检测方法的说明书，还可以包括校准曲线、用于校准或比较所测定的个体表达水平的参考样品(或蛋白或核酸)、打印版或电子版的正常和非正常群体的IRM表达的参考值。
VII.胰岛素抗性和IR相关病症的治疗方法在另一方面，本发明提供了胰岛素抗性或相关症状(如II型糖尿病)的治疗方法，即对此病患者或有危险患该病或症状的患者施用治疗有效量的IRM功能调节剂，如IRM功能或基因表达的激动剂(刺激剂)或拮抗剂(抑制剂)。对于IRM功能的抑制，调节剂的例子包括小分子拮抗剂(即分子量小于5000道尔顿、通常小于3000道尔顿、常小于500道尔顿，例如，核酸、肽、碳水化合物、脂、有机或无机分子)、抗IRM结合剂(例如，抗IRM单克隆抗体)、多肽抑制剂(例如，IRM的显性负突变体)、多核苷酸抑制剂(例如，反义多核苷酸、核酶和三链体多核苷酸)、基因治疗(例如基因敲除)等等。对于IRM功能的刺激，调节剂的实例包括IRM功能和IRM多肽的小分子激动剂(可以以例如多肽或核酸表达载体形式施用)等。根据个体状况，药剂可以以治疗或预防的量施用。在一个实施方案中，为了阐明而不是限定，施用提高IRM活性或表达的药剂以治疗胰岛素抗性或IR相关症状，其中与eIS群体相比，在eIR群体中该IRM被下调(即，以较低水平表达)。在一个不同的实施方案中，为了阐明而不是限定，施用降低IRM活性或表达的药剂以治疗胰岛素抗性或IR相关症状，其中与eIS群体相比，在eIR群体中该IRM被上调(即，以较高水平表达)。一方面，本发明的治疗方法利用已知或被认为能够调节此处公开的IRM的表达或活性、但是过去却没有认识到其对胰岛素抗性的影响的药剂或药物。在相关方面，以前未认识到所述药剂对一种或多种IR相关症状有影响。本发明的方法和试剂可用于治疗动物，如哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠)用于人类疾病的动物和或体外(例如，细胞培养物)模型中。
抑制IRM表达的方法本领域中有多种已知方法可用于减少IRM的表达或活性。在一个实施方案中施用了一种抑制性多核苷酸。抑制性多核苷酸的例子包括能够靶向或杂交IRM多核苷酸的反义试剂、三链体试剂和核酶试剂。本发明的一些治疗方法包括施用寡核苷酸，该寡核苷酸在体内生理条件下起抑制IRM活性的功能，并且能在这些条件下在足够达到疗效的一段时间内保持相对稳定。可对多核苷酸进行修饰以得到这种稳定性并且利于寡核苷酸向期望组织、器官或细胞的靶向输送。
反义多核苷酸根据本发明，反义寡核苷酸和多核苷酸用于抑制IRM基因的表达。本发明有用的反义多核苷酸包含能够与转录自IRM基因的mRNA中的序列特异杂交的至少约10个碱基，典型地至少12或14个，至多约1000或更多个连续核苷酸的反义序列。更常见的，本发明的反义多核苷酸长度为约12～约50个核苷酸或约15～25约个核苷酸。一般来说，反义多核苷酸应当足够的长从而能够形成稳定的双螺旋，但是又应当足够短(取决于输送的方式)以便体内施用(如果需要)。特异杂交到靶序列所需的多核苷酸最小长度取决于几种因素，如G/C含量、错配碱基(如果有)的位置、与靶多核苷酸群相比此序列的独特程度、和多核苷酸的化学性质(例如，甲基膦酸酯骨架、肽核酸、硫代磷酸酯)等。通常为保证杂交的特异性，反义序列应当与靶IRM mRNA序列基本上互补。在某些实施方案中，反义序列和靶序列完全互补。然而，反义多核苷酸也可以包括核苷酸的置换、添加、缺失、转换、易位、修饰或其他核酸序列或非核酸部分，只要该反义多核苷酸与对应于IRM RNA或者其基因的相关靶序列的特异结合可以作为该多核苷酸的功能特性保留下来即可。在一个实施方案中，反义多核苷酸序列与IRM mRNA的相对易接近序列(例如，相对缺乏二级结构)互补。这可通过用例如MFOLD程序(遗传计算组，Madison WI)分析预测的RNA的二级结构，并且利用本领域已知方法进行体外或体内检验来确定。另一个鉴定有效反义组合物的方法使用寡核苷酸组合阵列(见例如，Milner等，1997，NatureBiotechnology 15537)。反义核酸(DNA、RNA及其修饰物、类似物等)可以通过任何一种合适的核酸制备方法，如化学合成和此处公开的重组方法制备。在一个实施方案中，例如，本发明的反义RNA分子可以用从头化学合成制备。备选地，可以通过将IRM DNA序列插入(连接)在载体(例如，质粒)中并使其与启动子可操作的反向连结以制备与IRM mRNA杂交的反义RNA。如果启动子，以及优选地终止和聚腺苷酸化信号正确地安置，相应于非编码链的插入序列的链将被转录并成为本发明的反义寡核苷酸。本发明的反义寡核苷酸可用于抑制无细胞提取物、细胞和动物(包括哺乳动物和人)中IRM的活性。在一个实施方案中，与未处理情况相比，反义多核苷酸可以抑制测试细胞系中IRM的表达至少约25％，优选至少约50％。测试细胞系通常是已建立的人细胞系(即，可从ATCC得到，或者如此处描述的通过EBV转化白细胞制备)。关于反义多核苷酸的一般方法参见D.A.Melton编，1988，《反义RNA和反义DNA》(Antisense RNA and DNA)冷泉港实验室，冷泉港，NY.以及Dagle等，1991，核酸研究(Nacleic Acid Research)，191805。
三链体寡核苷酸和多核苷酸本发明提供能与双链或双链体IRM核酸(例如，IRM RNA的折叠区域或IRM基因内)结合而形成三螺旋或“三链体”核酸的寡核苷酸和多核苷酸(DNA、RNA、PNA等)。三螺旋形成将导致IRM表达的抑制，例如，通过阻碍IRM基因的转录从而减少或消除细胞内IRM的活性。不想被任何特定机理所束缚，但认为三螺旋配对危害了双螺旋充分打开以结合聚合酶、转录因子或调节分子的能力。用三螺旋形成的碱基配对原则(参见例如，Cheng等，1988，J Biol.Chem.26315110；Ferrin和Camerini-Otero，1991，Science 3541494；Ramdas等，1989，J.Biol.Chem.26417395；Strobel等，1991，Science2541639；和Rigas等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.839591)和IRMmRNA和/或基因序列可以构建本发明的三链体寡核苷酸和多核苷酸。典型地，本发明的形成三链体的寡核苷酸包含由约10个到至少约25个或更多个核苷酸组成的特定序列，该序列“互补”于IRM RNA或其基因中的特定序列(即，该寡核苷酸应足够大以形成稳定的三螺旋，但是又应足够小，以便如果需要可根据递送方式而实现体的施用)。在该上下文中，“互补”指能够形成稳定的三螺旋。
核酶本发明还提供可用于抑制IRM活性的核酶。本发明的核酶能够结合并且特异切割IRM mRNA从而使IRM mRNA失活。有用的核酶可以包含与IRM mRNA互补的5’-和3’-端序列，并且可以基于此处公开的IRM mRNA序列由本领域技术人员进行构建(参见PCT出版物WO93/23572，见前)。本发明的核酶包括那些具有I型内含子核酶的特征(Cech，1995，Biotechnology 13323)和锤头型核酶的特征(Edgington，1992，Biotechnology 10256)的核酶。本发明的核酶包括具有如GUA、GUU和GUC等切割位点的核酶。根据本发明，用于核酶介导的IRM活性抑制的其它最适切割位点包括在PCT公开WO 94/02595和WO 93/23569中所描述的切割位点。可以评估含有切割位点的、相应于靶IRM基因区的长度为15到20个核糖核苷酸的短RNA寡核苷酸的二级结构特征，这些二级结构特征可能使得该寡核苷酸更合意。也可以以如下方式评估切割位点是否合适利用核糖核酸酶保护测定来检验与互补寡核苷酸杂交的易接近性，或根据本领域已知的标准方法对体外核酶活性进行检验。在一个实施方案中，本发明中的核酶是体外产生后导入细胞或患者体内的。在另一个实施方案中，基因治疗方法用于离体或在体内在靶细胞中表达核酶。
寡核苷酸的施用典型地，本发明的治疗方法包括寡核苷酸的施用，该寡核苷酸能够在体内生理条件下抑制或刺激IRM活性，并且能在这些条件下在足够产生疗效的一段时间内保持相对的稳定。如前所述，可通过修饰核酸来赋予这种稳定性以及实现向目的组织、器官或细胞的靶向递送。寡核苷酸和多核苷酸可以作为药物以适宜的药物制剂形式直接输送，也可以通过脂质体、免疫脂质体、弹道(ballistics)、直接摄入细胞等将核酸导入细胞的方法间接输送，参见此处所述。对于疾病的治疗，将对患者施用治疗有效量的本发明寡核苷酸。治疗有效量是足够缓解疾病症状或调节靶细胞中IRM活性的量。用于治疗的寡核苷酸的输送方法描述于美国专利5,272,065。在另一个实施方案中，可通过基因治疗和重组DNA表达质粒输送寡核苷酸和多核苷酸。
抗体在本发明的一个方面，在IR或IR相关病症的治疗中，使用能够特异结合IRM多肽的抗体，例如，单克隆抗体来抑制IRM活性。如上面所讨论的，抗IRM抗体也可以用于本发明的诊断和预后方法中。本发明的抗体将特异识别并结合具有与此处所述的IRM的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的多肽或其免疫原性片段。本发明的抗体通常显示出的特异结合亲和力为至少约107、108、109或1010M-1。可以用各种本领域技术人员熟知的方法制备抗IRM抗体。多克隆和单克隆抗体的制备方法在本领域公知。参见例如，前面的Kohler和Milstein，1975，Nature 256495-97以及Harlow和Lane的方法。这些技术包括从噬菌体或类似载体的重组抗体文库中筛选抗体的抗体制备方法。参见Huse等，1989，Science 2461275-81；和Ward等，1989，Nature341544-46。对于多抗的制备，可以选择合适的靶免疫系统，常用的为小鼠和兔，也可以用山羊、绵羊、奶牛、小鸡、豚鼠、猴和大鼠。可以通过常规方法沉淀、分离并纯化(包括亲和纯化)宿主产生的免疫球蛋白。通过多克隆血清的层析纯化可以得到基本上具有单一特异性的抗体群。在本发明的某些实施方案中，为了减少潜在的抗原性而不降低与目的蛋白的亲和性，抗IRM单克隆抗体是人源化的，人的或嵌合的。人源化抗体的描述可参见Queen等，1989，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 8610029；美国专利号5,563,762；5,693,761；5,585,089及5,530,101。用于人源化的人抗体序列可以是天然发生的人抗体序列，也可以是几种人抗体的共有序列。参见Kettleborough等，Protein Engineering 4773(1991)；Kolbinger等，Protein Engineering 6971(1993)。抗IRM的人源化单克隆抗体也可以用具有人免疫系统成分的转基因动物来制备(参见美国专利号5,569,825；5,545,806；5,693,762；5,693,761；及5,7124,350)。也可以用噬菌体展示技术制备有用的抗IRM结合组合物(参见Dower等，WO 91/17271及McCafferty等，WO 92/01047)。在这些方法中，噬菌体文库中的成员在其外表面展示不同的抗体。抗体通常展示为Fv或Fab片段。可以通过相对于IRM多肽进行亲和富集筛选出具有所需的特异性的噬菌体展示抗体。当制备物中至少约80％，更通常至少约90％，更通常至少约95％，最通常至少约99％或以上的多肽分子能特异结合相同抗原(例如，IRM多肽)时，抗体(例如，抗IRM抗体)为基本上纯的。药用抗IRM免疫球蛋白优选具有至少约90～95％的同质性，最优选98～99％或以上的同质性。本发明的抗体可以修饰以后或未经修饰而使用。时常，通过共价地或非共价地连接上可提供可检测信号的物质来标记抗体。这些标记物包括本领域熟知的标记物，如放射性、荧光、生物活性(例如，酶)标记物等等。以标记的结合实体形式存在的本发明抗体可能在诊断中尤其有用。
提高IRM基因产物水平的方法基因治疗的方法可用于提高IRM表达。这种方法通常包括给个体施用编码IRM多肽或其活性片段的核酸分子。此施用的核酸可以提高一种或多种组织中IRM的表达水平。核酸的施用应使得合成的IRM的量能够对接受该治疗的个体产生有效的治疗或预防效果。这里所用的“基因治疗”指的是使用单次治疗可以获得持久的效果的疗法和多次施用基因治疗剂以便获得或维持所需的IRM表达的增加的方法。编码IRM的核酸分子可以离体(ex vivo)或体内(in vivo)施用。离体基因治疗方法包括将核酸体外施用于细胞然后将含有导入的核酸的细胞移植回被治疗的个体体内。适于将IRM核酸体外转入哺乳动物细胞的技术包括，但不限于，使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖和磷酸钙沉淀方法。细胞一经转染，随后便可导入患者体内。体内基因治疗方法包括直接将核酸或核酸/蛋白复合体施用于被治疗的个体。体内施用可根据许多以建立的方法完成，包括，但不限于，注射裸露的核酸、病毒感染、脂质体运输或内吞作用运输。其中，病毒载体转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染是常用的方法(参见Dzau等，1993，Trends in Biotechnology 11205-210)。适宜的病毒载体包括，例如，腺病毒、腺病毒相关病毒以及逆转录病毒载体。在相关方面，通过施用IRM多肽提高细胞中或患者体内IRM多肽的水平。该多肽可通过常规重组技术制备，备选地，该多肽可以通过本领域已知的纯化方法制备。
药物组合物、剂量和施用本发明还提供含有IRM的激动剂、拮抗剂或配体的药物组合物。药物组合物可在无菌条件下直接施用于要治疗的宿主。然而，虽然活性成分可单独施用，但是通常优选将其以药物制剂形式施用。制剂典型地包含至少一种活性成分及其一种或多种可接受的载体。每种载体都必须在药理上和生理上与其他成分可配伍，并且不会危害患者。例如，可以在施用前将生物活性剂与载体蛋白如卵白蛋白或血清白蛋白复合以提高稳定性或药理性质如半衰期。可用制药领域中任何熟知的方法制备此药物制剂，见，如Gilman等编，1990《GOODMAN ANDGILMAN’SThe Pharmacological Basis ofTherapeutics》第8版Pergamon Press和Remington’s PharmaceuticalSciences，(1990)第17版Mack Publishing Co.，Easton、PA.；Avis等编(1993)《Pharmaceutical Dosage FormsParenteral medications》Dekker，N.Y.。可以施用药物组合物以进行预防性和/或治疗性治疗。活性成分的毒性和疗效可在细胞培养物和/或实验动物中据标准的药学方法确定，这些方法包括，例如，测定LD50(50％群体致死剂量)和ED50(50％群体的治疗有效剂量)。毒性和疗效的剂量比是治疗指数，可用LD50/ED50比值来表示。优选表现出大治疗指数的化合物。从细胞培养物和/或动物研究得到的数据可用于制定用于人的剂量范围。活性成份的剂量通常位于包括ED50并且毒性很小或无毒的循环浓度范围内。剂量可在该范围内变化，取决于所用的剂量形式和给药途径。这里所描述的药物组合物可以通过多种不同方式施用。这些方式的实施例包括通过口、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、真皮下、透皮、鞘内和颅内的方法施用含有可药用载体的组合物。用于配制药物组合物的成分优选具有高纯度且基本上没有潜在的有害污染物(例如，至少国家食品(National Food)(NF)级，通常至少为分析级，更典型地，至少为制药级)。而且，预期体内使用的组合物通常是无菌的。就使用前必需合成的给定化合物而言，所得产物典型地基本上没有任何潜在毒性成分，尤其是可能在合成或纯化过程中存在的任何内毒素。肠胃外施用的组合物也是无菌的，基本上等渗的，并在GMP条件下制备。
VIII.疾病或症状相关基因序列的鉴定方法在一个不同的方面，本发明提供了表达水平与疾病状态或医学症状(以后称作“疾病”)相关的一个基因或一组基因的鉴定方法。这样鉴定的基因，包括相应的基因产物，是进行干扰以预防或治疗该疾病的靶标，可用于该疾病的诊断或预后(例如，通过检测可用于诊断疾病状态的基因表达模式)，可用作药物筛选靶标以寻找可用于治疗该疾病的药剂，以及用于许多其他用途。在本发明的一个实施方案中，该方法包括鉴定第一群人类个体，这些个体已经患有或者有高度危险患有该疾病；并鉴定第二群人类个体，其中这些个体患该疾病的危险性低。此方法可用于任何疾病，只要该病的患病或高易感性群体能够与非患病或相对低易感性群体区分即可。这些疾病的例子包括胰岛素抗性及IR相关疾病(例如，II型糖尿病)、心血管疾病，包括异常脂血症(dyslipidemia)(例如，禁食LDL和/或甘油三脂水平偏高，或者禁食HDL水平偏低)，动脉粥样硬化相关疾病，包括如心肌梗死，再狭窄、脑血管疾病和外周血管疾病。其它例子包括自身免疫疾病，如类风湿性关节炎和过敏。在一个实施方案中，第一和第二群体都包括至少3例，常至少5例，有时至少10例个体。在一些实施方案中，根据年龄、性别、种族和/或其它临床相关标准匹配这些个体。年龄和性别匹配指的是在最初选取研究对象的时候匹配第一组研究群体(如eIR组，通常称为病例组)和第二组研究群体(如eIS组，通常称为对照组)的过程。年龄匹配的组指病例组的平均年龄与对照组的平均年龄相似(即无显著差异)，该相似性经p值＞0.05的标准卡方检验确定。性别匹配的组指病例组与对照组的男性和/或女性数量或男/女比例相同或相似。相似性(或非显著差异)可经p值＞0.05的标准卡方检验确定。除了年龄和性别匹配，种族匹配在所有遗传学研究中也是一个重要的过程。对于相对同源的人群，如中国台湾人，通过选择来自同一城市或省份的病例和对照个体即可实现种族匹配。对于异源人群，如美国人群，通常有5个主要种族欧洲美国人、非洲美国人、墨西哥美国人、本土美国人和亚洲美国人。这种情况下的种族匹配通常指研究中选择5个种族之一同时用于病例和对照组。获得每组群体的细胞，鉴定在第一组群体和第二组群体的细胞中差异表达的基因。在一个实施方案中，来自每例个体的组织的细胞都用以建立细胞系，例如，无限增殖化细胞系，例如，无限增殖化B细胞系，并鉴定在一个群体的细胞系中比在另一群体的细胞系中以较高水平表达的基因。在一个实施方案中，通过使个体血细胞无限增殖化得到细胞系，在一个实施方案中，细胞系为无限增殖化B淋巴细胞。从血液淋巴细胞中建立细胞系的方法已熟知，包括，例如，EBV介导的转化。参见，例如，Henderson等，1977，Virology 76152-63。如所指出的，可以从分离的血液淋巴细胞制备EBV转化的B淋巴细胞，该方法用EBV上清液进行感染并培养细胞6到8周后得到完全转化的培养物。有多种方法可用于鉴定在两组群体间差异表达的基因。通常，从细胞系中分离RNA，并用其制备探针。在一个实施方案中，将来自每组个体的细胞系的RNA(或相应的cDNA或其它探针)合并。例如，可在合并来自每个细胞系的RNA(等量混合来自每个个体细胞系的RNA)之后进行标记，备选地，相应于几个细胞系的探针在标记后混合。通常对应于各组群体的探针用不同方式标记以便区分。这些任选地合并的探针(例如，cDNA、RNA等)可通过常规方法用于鉴定在组织中差异表达的基因。参见，例如，Lockhart等，1996，Nature Biotech 141675，美国专利号5,578,832；5,556,752；5,510,270，Schena等.，1995，Science 270467-70。在一个实施方案中，该组织是血液，例如，血液淋巴细胞。用以鉴定的一种方法是用探针与寡核苷酸或cDNA序列(如表达序列标签)阵列杂交，如下文的实施例所述(例如，将合并的探针与包含了来自于组织的＞100个表达序列标签的核酸阵列杂交)。这样，在一个实施方案中，通过鉴定患有疾病或有增加的患病危险性的第一组人群，鉴定具有低患病危险性的第二组人群，并鉴定与第二组人群相比，在第一组人群中差异表达的RNA序列来鉴定该疾病相关的基因序列。在一个实施方案中，鉴定步骤包括从第一组和第二组人群的每例个体的组织中分别制备各自的细胞系、从所述细胞系中得到RNA、制备相应于每个细胞系的RNA的探针(所述探针任选地进行合并，例如，反转录之前合并RNA或反转录之后合并cDNA)、并将合并的探针杂交到含有在人组织(如血)中表达的序列的核酸阵列上。典型地，通过该方法可确定至少3个在第一组群体和第二组群体之间有表达差异的基因(RNA序列)。在一个举例说明性实施方案中，第一组群体为极端胰岛素抗性群体(例如，120分钟时OGTT Glu＞140mg/dl；SSPG均值＞250mg/dl；60分钟时OGTT Ins＞100μIU/ml Et；120分钟时OGTT Ins＞100μIU/ml)，第二组群体为极端胰岛素敏感群体(例如，120分钟时OGTT Glu＜100mg/dL；SSPG均值＜120mg/dl；60分钟时OGTT Ins＜60μIU/ml或；120分钟OGTT Ins＜40μIU/ml)。在另一个举例说明性实施方案中，第一组为极端高HDL群体(例如，禁食HDL＞60mg/dl、年龄＞18岁、葡萄糖耐量试验正常、非糖尿病、无心血管疾病)，第二组为极端低HDL群体(例如，禁食HDL＜30mg/dl；年龄＞18岁)。在再一个举例说明性实施方案中，第一组为极端肥胖/高体重群体(体重指数＞30；年龄＞18岁；可获得细胞系)，第二组为极端瘦型/低体重群体(体重指数(Kg/M2)＜20；年龄＞18岁；葡萄糖耐量试验正常；非糖尿病、无心血管疾病)。
通常，第一组和第二组的年龄、性别和种族相互匹配。
IX.实施例下面的实施例仅为更详细地举例说明本发明的某些方面，并不意味着限制本发明的范围。
实施例1台湾胰岛素抗性家系(TWIR)研究采样和表型分析TWIR家系按三个判断方案收集(1)双亲为NIDDM患者；(2)双亲之一为NIDDM患者；(3)双亲临床表型正常。由于胰岛素抗性在双亲之一或两者为患者的家系中以高频率分离，本方法使找到连锁关系的可能性最大化。此外，也包括一些双亲临床表型正常的家系，因为胰岛素抗性也可以发生在无NIDDM的个体中。1993-1996年间在台湾三军总医院的糖尿病门诊部(DiabetesClinics of Tri-service General Hospital in Taiwan)收集了总共112个中国人核心家系。其中，81个家系符合遗传连锁研究(linkage study)的入选标准每个家系如果双亲入选，至少入选一对同胞；每家系至少入选双亲之一；每家系如仅入选双亲之一，则至少入选3个同胞。这81个家系中，18个家系的双亲皆证明为NIDDM患者，46个家系的双亲之一为NIDDM患者，17个家系的双亲临床表型正常。在该研究中，从此81个家系共选择了432例个体，包括152例亲本和280例非糖尿病子女，他们是否患糖尿病用口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和稳态血浆葡萄糖试验(SSPG)来定义。基本临床数据，如年龄、性别、体重、身高、腰臀比、NIDDM初次发病年龄以及病史，在每个患者初次就诊时获取。BMI用作一般肥胖指数，等于体重(kg)除以身高(m)的平方。腹部肥胖通过腹围与臀围的比例来估计(WHR表示腰臀比)。腰围的测量在脐的水平上进行，臀围根据臀部最宽的部分确定。收缩压和舒张压的测量采用坐姿三次测量，每次测量间隔20分钟，由熟练护士通过传统血压测量法和基于示波技术的自动便携装置两种方法进行测量。这些三数据点的平均值分别用于确定收缩压和舒张压的水平。通过OGTT确定口服葡萄糖后葡萄糖和胰岛素的反应。每例研究对象通过饮用口服75g葡萄糖(Glucola)，分别在葡萄糖摄取之前10分钟，葡萄糖摄取时(0分钟)、及口服葡萄糖后30、60、90、120及180分钟采血。这些样本中的血浆葡萄糖和胰岛素水平通过酶学比色法以及自动免疫分析测定。隔夜禁食后，在研究对象两臂分别插入静脉导管，一臂采血用于测量血浆葡萄糖和胰岛素浓度，另一臂用于施用测试物质。通过Harvard输注泵将溶于含有2.5％(w/v)人血清白蛋白的溶液中的Sandostatin以25ug/h施用以抑制内源胰岛素的分泌。同时，胰岛素和葡萄糖分别以25mU/m2/min注入。于如下时间点采血(每次7ml)输注开始前-10min，0min，进入研究每半小时直到150分钟，然后每10分钟直到180分钟。到60分钟胰岛素浓度通常达到平台，而葡萄糖浓度在120分钟后才达到平台。将150、160、170以及180min四点所得数据平均，并认为这些均值代表在输注过程中达到的稳态血浆葡萄糖(SSPG)和稳态血浆胰岛素(SSPI)浓度。由于SSPI浓度在所有个体中具有定量和定性的可比性，而葡萄糖输入速率一致，所以所得SSPG浓度的大小可用于定量估计胰岛素处理葡萄糖负荷的效率，即个体的SSPG越高，胰岛素抗性越显著。分别于不同的两天进行隔夜禁食后采血(每次15ml)，一天为OGTT的那一天，另一天为SSPG试验的那一天。采用标准酶学方法检测脂和脂蛋白。用标准EB病毒转化分别从245个研究对象的B淋巴细胞建立细胞系。
实施例2IRM序列鉴定基于上述表型分析，6例个体被鉴定为具有极端胰岛素抗性(“eIR”)表型，另有6例个体被鉴定为具有极端胰岛素敏感(“eIS”)表型。符合下面的标准的对象被归为eIR组120分钟时OGTT Glu＞140mg/dl；SSPG均值＞250mg/dl；60分钟时OGTT Ins＞100μIU/ml Et；120分钟时OGTT Ins＞100IU/ml。符合下面标准的对象被归为eIS组120分钟时OGTT Glu＜100mg/dl；SSPG均值＜120mg/dl；60分钟时OGTTIns＜60μIU/ml或者120分钟时OGTT Ins＜40μIU/ml。来自每例个体的EBV转化的B淋巴细胞系在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中在37℃，5％CO2培养箱中培养约两周，然后将这些细胞系转移到含3％FBS的RPMI-1640中培养72小时，之后转移到含3％FBS以及15μIU/ml胰岛素或者100μIU/ml胰岛素的RPMI-1640培养基中再孵育72小时。在提取RNA的时候，来自IR和IS人群的细胞系在完全相同的培养条件下培养并传了相同代数。用标准Trizol方法(Gibco-BRL)提取每个细胞系的总RNA。来自6例eIR细胞系的总RNA等量混合成为IR-RNA池，来自6例eIS细胞系的总RNA等量混合成为IS-RNA池。以oligo-dT为引物反转录从总RNA池特异扩增mRNA以制备不同标记的探针。通过反转录将IR池用Cy5-dUTP(脱氧尿苷三磷酸)标记，IS池用Cy3-dUTP标记。将来自各池的标记cDNA混合并同时与微阵列杂交，这些微阵列含有约10,000个来自血细胞中表达基因的表达序列标签(参见PCT公开WO 00/40749)，或者含有约40,000个来自各种人组织表达的基因的表达序列标签(http//genome-www4.stanford.edu/cgi-bin/sfgf/home.pl/)。cDNA标记、微阵列杂交和洗涤都遵循厂商Corning提供的用于CMT-GAPS载片的标准使用说明书进行(http//www.corning.com/CMT/TechInfo/PDFs/cmt_amino_silane_im.pdf)。通过GenePix 4000A扫描仪用GenePix Pro 3.0微阵列分析软件(Axon Instruments，Inc，Foster City，Calif.)扫描微陈列鉴定出差异表达的基因。可从扫描图像识别基因，即在IR池中具有更高mRNA丰度的基因(标记为红点(Cy5))，以及在IS池中具有更高mRNA丰度的基因(标记为绿点(Cy3))。黄点表示对这些特定cDNA点，在IR池和IS池之间基因表达没有显著差异。
实施例3IRM表达的补充分析本发明的IRM基因还可以用许多测定方法进行进一步分析，这些方法包括(a)Northern分析实验，其测定来源于eIS和eIR群体的EBV转化的B淋巴细胞系中IRM基因表达。Northern分析可使用来自多个细胞系的RNA池，也可使用单个细胞系的RNA。
(b)Northern分析实验，其测定具有已知胰岛素抗性状态(例如，具有eIS或eIR表型)的个体的IRM基因表达。此Northern分析可使用来自若干个体的RNA池，也可使用单个体的RNA。
(c)定量实时PCR(qRT-PCR)，其测定来源于eIS和eIR群体的EBV转化的B淋巴细胞系中IRM基因的表达。此qRT-PCR可使用来自多个细胞系的RNA池，也可使用来自单细胞系的RNA。
(d)定量实时PCR(qRT-PCR)，其测定具有已知胰岛素抗性状态(例如，具有eIS或eIR表型)的个体的IRM基因表达。此qRT-PCR可使用来自若干个体的RNA池，也可使用来自单个体的RNA。按照本说明书的指导，本领域普通技术人员就能够很好的完成所有这些分析，并且至少有一些补充分析已针对此处公开的许多IRM基因进行了。下面概括地对每个分析进行描述“Flip-Dye”阵列杂交通过来自eIR和eIS细胞系的探针与阵列cDNA序列进行补充轮的杂交，可以验证或检测多套IRM基因的差异表达，其中包括利用“flip-dye”技术的杂交循环，在这些杂交循环中用于制备每种探针的标记物被互换。参见Wang等，2000，Nat Biotech.18457-59。例如，在第一实验中用Cy5(红色)标记的eIR cDNA池可在第二实验中用Cy3(绿色)标记，而原来用Cy3标记的eIS cDNA池可在第二次实验中用Cy5标记。通过此方法，如果基因X(与固定探针“X”杂交)在eIR细胞系中过表达，“X”的位置应该在第一实验中在陈列上呈现红点而在第二实验中在阵列上呈现绿点。Northern分析可以用能与IRM基因杂交的探针进行Northern分析以监测群体中基因表达的差异。进行Northern分析的方法已熟知(参见Sambrook，同前)。在一个分析中，从来源于eIS或eIR表型个体的EBV转化的B淋巴细胞系提取总RNA。备选地，从具eIS或eIR表型的个体的血样中提取总RNA。在每种情况下，样本或来自样本的RNA可独立分析(条件是可以得到足够用量的RNA)或混合后分析。取20ug各样本的总RNA加到1％变性琼脂糖凝胶(2.2M甲酰胺，20mM MOPS(3-[N-吗啉代]丙磺酸)，2mM乙酸钠，1mM EDTA，和5ng/ml溴化乙啶)的加样孔中。于100伏电泳4小时。凝胶在电泳完后置于紫外光下拍照检查上样量的RNA样本的完整性和浓度。过夜将胶上的RNA转移到尼龙滤膜(Hybond-N，Amersham)上。之后将尼龙膜在80℃烘2小时固定RNA。转移的RNA先经预杂交再与标记后的探针杂交。用随机引发试剂盒(High Prime，Roche Inc.)和IRM基因片段制备32P标记的IRM探针。例如，从IMAGE克隆1909455的PCR扩增物得到的纯化的500bp DNA片段可以作为探针检测免疫球蛋白κ链前体V-III基因的RNA水平。在65℃于rotisserie杂交炉中用Church缓冲液(0.5M磷酸钠缓冲液，7％SDS，10mM EDTA)对杂交膜进行预杂交4小时，然后与32P-dCTP标记的探针在相同条件下杂交16小时。用2×SSC(300mM氯化钠，30mM柠檬酸三钠pH 7.0)以及0.1％SDS在室温洗膜2次，每次15分钟，之后用0.1×SSC，0.1％SDS在50℃洗膜一次30分钟，滤膜干燥后用BioMaxMR胶片(Kodak)在-70℃自显影3天。根据厂商说明书，用凝胶记录和分析系统，Alpha Imager 2200(Alpha Innotech Corp)扫描并分析Northern印迹的每张胶片。测定每个条带的信号强度，其用相对于背景的强度单位(RIU)来表示，来源于eIS样本的强度均值作为参考值。为每个IR样本确定倍数差异，其用eIR强度除以eIS强度均值得到。鉴于eIS样本间的标准差，通常认为2～3倍的差异即是显著的。定量实时PCR多种“实时定量PCR”方法也可以用于确定样本中IRM mRNA的量。参见，例如，Higuchi等，1992，Biotechnology10413-17；Weis等，1992，Trends in Genetics 8263-64；Ausubel等，同前，Current Protocols in Molecular Biology；Sambrook，等，同前；用于ABIPRISM 7700序列检测系统(ABI)的Bulletin#2。在一个实施方案中，将从6个不相关的eIR或eIS个体中分离的总RNA等量混合用于分析。5微克混合的总RNA用于cDNA合成。先通过SuperScript反转录酶(Invitrogen)和随机六聚体制备cDNA第一条链。然后热变性使反转录酶失活，用RnaseH消化样本以除去RNA。用Qiaquick DNA纯化试剂盒(Qiagen)纯化cDNA以除去引物、未反应的dNTP和酶。反转录反应的终产量在OD260测定，并将cDNA稀释到1ng/μl。SYBR-green实时定量PCR分析可以用于测定目的基因的表达水平。该PCR反应为300nM引物对，10ng cDNA，2x SYBR green PCRready mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)，终体积50μl。PCR和实时检测在ABI’s Prism Sequencing Detection System 7700(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上进行。PCR循环条件为50℃ 2分钟，95℃10分钟，之后40个循环的95℃ 15秒、58℃ 60秒。在实时运行过程中及终点收集信号。用ABI的序列检测软件1.6分析序列。目的基因的表达水平被翻译成Ct(循环阈值)。高表达水平有较早的Ct(较小的数)，低表达水平有较迟的Ct(较大的数)。在两个不同试验样本(例如，eIR细胞系和eIS细胞系，eIR个体和eIS个体的血样)中表达的同一基因有两个Ct值。这两个Ct的差值(ΔCt)用于计算两个不同样本中基因的差异表达。在检测范围内(15-35Ct)，1个ΔCt代表两倍差异。
实施例4定量和诊断性IRM分新本实施例描述了胰岛素抗性标记补充分析的示例性结果。补充杂交分析依照例2中所描述的并使用flip dye方法进行。IRM 120基因的差异表达在8轮杂交的6轮中被检测到。qRT-PCR用于检测血中IRM的表达。收集禁食后9例无关eIR或eIS个体的血样，分离总RNA，并将分离的总RNA等量混合。从各组得到的5微克总RNA池用于cDNA合成。先通过SuperScript反转录酶(Invitrogen)和随机六聚体合成cDNA第一条链。加热变性使反转录酶失活后，用RnaseH消化样本以除去RNA。用Qiaquick DNA纯化试剂盒(Qiagen)纯化cDNA以除去引物、未反应的dNTP和酶。 YBR-green实时定量PCR分析用于测定IRM 120的表达水平。此PCR反应体系为300nM引物对，10ng cDNA，2x SYBR green PCRready mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)，终体积50μl。PCR反应和实时检测在ABI的Prism Sequencing Detection System 7700(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上进行。PCR循环条件如下50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，然后40个循环的95℃ 15秒、58℃ 60秒。在实时运行过程中和终点收集信号，用ABI的序列检测软件1.6分析此序列。目的基因的表达水平被翻译成Ct(循环阈值)。高表达水平有较早的Ct(较小的数)，低表达水平有较迟的Ct(较大的数)。在两个不同试验样本(例如，eIR和eIS)中表达的同一基因有两个Ct值。这两个Ct的差值(ΔCt)用于计算两个不同样本中基因的差异表达。在检测范围内(15-35Ct)，1个ΔCt代表两倍差异(ABI使用手册2)。
表4 用定量RT-PCR进行补充杂交分析，所用血样来自eIR和eIS表型个体。根据TRIZOL RNA分离实验指南(GIBCOBRL，Cat#15596-018)从禁食后eIR和eIS个体的10ml血样中提取RNA，用100μl DEPC处理的Tris缓冲液(10mM，pH 7.0)重悬纯化后的总RNA。各来自于6例无关eIR个体的大约0.5微克血样RNA分别用于cDNA的合成，作为比较，用等量的来源于9例eIS个体的总RNA池(eIS池)合成cDNA。通过SuperScript反转录酶(Invitrogen)和随机六聚体制备cDNA第一条链。加热变性使反转录酶失活后，用RnaseH消化样本以除去RNA。用QiaquickDNA纯化试剂盒(Qiagen)纯化cDNA以除去引物、未反应的dNTP和酶。为测定IRM 120基因的表达水平，SYBR-green实时定量PCR分析使用IRM 120基因的特异引物(正向引物5’-CAG AAG GAA ATT AAGCAA ACA-3’；反向引物5’-CCG TAT ATG GCA ATT CAA TAA-3’；扩增子长度为98bp)进行。此PCR反应体系为300nM引物对，10ng cDNA，2x SYBR green PCR ready mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)，终体积50μl。PCR和实时检测在ABI的Prism Sequencing Detection System7700(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行。PCR条件设定如下50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，之后40个循环的95℃ 15秒和58℃ 60秒。对每个样本做三份相同的定量RT-PCR，在实时运行过程中和终点收集信号，最后用ABI的序列检测软件1.6分析此序列。另外，在每次运行结束后，通过和1μg DNA分子量标准(Cat#E-3048-1，ISC BioExpress)并行凝胶电泳(电泳槽中含有3％琼脂糖凝胶，1X TBE，100伏45分钟电泳)鉴定扩增子大小和质量，确保无非特异扩增和/或引物二聚体带。
Ct(循环阈值)表示目的基因的表达水平，Ct为用户定义的阈值，在此阈值时由于双链DNA结合SYBR green，荧光强度为背景值(PCR反应早期测定)的10倍。高水平表达的基因会有较早的Ct(较小的数)，低水平表达的基因有较迟的Ct(较大的数)。分析物的Ct先相对于对照基因(这里采用GAPDH)进行标化。分析物和对照Ct的差值定义为ΔCt。将ΔCt与预定的标准(这里采用eIS池)作比较得到ΔΔCt。在检测范围内(15～35 Ct)，1个Ct表示2倍的差异。基于以上前提，可用2-ΔΔCt得到分析物的相对表达水平(ABI使用手册#2)。
表5 以上数据表明IRM120基因在eIR患者血液中的表达水平均低于在eIS患者血液中的表达水平。由此证明IRM120基因可用作诊断标记并且可用于药物筛选。值得注意的是，IRM50和IRM120都在182,943bp BAC(GenBank Acc#AC016251.9)的大约8000bp基因组区段(大致相当于BAC的第3000-11000位碱基)中。已知4个IRM120的外显子，分别定位于BAC序列的nt9969-10386(外显子1)、nt 9603-9911(外显子2)、nt7547-8076(外显子3)和nt4375-4804(外显子4)。IRM5 EST序列定位于nt3682-4016，位于IRM120外显子4下游大约350bp。IRM120和50除了在物理上连锁外，在对比来自eIR个体和来自eIS个体的细胞系时，IRM120和50都以相似程度下调。数据表明IRM50同IRM120基因一样，在eIR患者血液中的表达水平均低于在eIS患者血液中的表达水平。此外，这些数据表明IRM50可能是IRM120的一种剪接变体。另外，cDNA克隆AK025842(1590bp；此后称为IRM 393)定位于IRM120的3号外显子和4号外显子之间。而且，一些IMAGE克隆(例如，Acc#4849984，4862951，731736，4900978，5199490，5200043)也定位于包含IRM50和IRM120的BAC AC016251.9的8000bp基因组片段内。因此，此BAC序列、克隆AK025842或者这些IMAGE克隆也是胰岛素抗性的标记。在各种实施方案中，与此BAC序列、克隆AK025842或者这些IMAGE克隆杂交的探针以及由相应于这些序列的基因编码的多核苷酸和蛋白可用于此处公开的诊断、预后、筛选及其它方法中。
***应理解，此处描述的实施例和实施方案仅为通过举例达到阐释清楚的目的，而且鉴于这些描述本领域技术人员将明了各种修饰或改动，并且这些修饰和改动都包括在本申请的精神和范围及所附权利要求书的范围内。本文所引用的所有出版物、专利、专利申请和登录号(包括自提交日和/或在先申请提交日起的多核苷酸和多肽序列以及相应注释)为所有目的整体并入作为参考，并且等同于专门单独地指出并入各出版物、专利和专利申请作为参考。
权利要求
1.诊断个体的胰岛素抗性(IR)、IR相关病症或者IR或IR相关病症易感性的方法，所述方法包括检测来自被测个体的生物样本中至少一个表1所列胰岛素抗性标记(IRM)的表达水平与非胰岛素抗性参考个体群的相似生物样本中的此IRM的特征性表达水平的差异。
2.权利要求1的方法，其中非胰岛素抗性的个体群具有极端胰岛素敏感(eIS)表型。
3.权利要求1或2的方法，其中IRM表达的增加可用于诊断被测个体是否具有胰岛素抗性、IR相关病症或者IR或IR相关病症易感性。
4.权利要求1-3的方法，其中IRM表达的减少可用于诊断被测个体是否具有胰岛素抗性、IR相关病症或者IR或IR相关病症易感性。
5.权利要求1-4的方法，其中生物样本为血液或血液级分。
6.权利要求1-5的方法，其中生物样本包含B淋巴细胞。
7.权利要求1-6的方法，其中IRM表达水平通过检测IRM RNA来确定。
8.权利要求7的方法，其中RNA的检测包括使衍生自被测个体的RNA的探针与固定化的多核苷酸杂交，并检测杂交复合物的形成，其中所述固定化的多核苷酸可与表1所列的IRM基因杂交。
9.权利要求8的方法，其中RNA的检测包括使被测个体的RNA或从被测个体的RNA衍生的探针与固定化多核苷酸阵列杂交，其中所述固定化多核苷酸包含可以与至少2个不同的表1所列IRM基因杂交的多核苷酸。
10.权利要求7的方法，其中RNA的检测包括使cDNA探针与多个固定化多核苷酸杂交。
11.权利要求7-10的方法，其中IRM编码的RNA从被测个体的血液样本中分离。
12.权利要求1-6的方法，其中所述至少一个IRM的表达水平是通过检测表1所列IRM基因编码的多肽来确定的。
13.权利要求1-6的方法，其中检测表达水平与非胰岛素抗性参考个体群的相似生物样本中的IRM特征性表达水平的差异之步骤包括确定所述表达水平是否与胰岛素抗性参考个体群的相似生物样本中的此IRM的特征性表达水平相似。
14.权利要求13的方法，其中胰岛素抗性个体群具有极端胰岛素抗性(eIR)表型。
15.权利要求1-14的方法，其还包括预先地基于被测个体或其家族的病史确定被测个体是否为胰岛素抗性危险患者。
16.权利要求1-15的方法，其中检测IRM 120或IRM 50的表达差异。
17.诊断个体具有胰岛素抗性或有增加的危险发生胰岛素抗性的方法，包括(a)从被测个体获取生物样本，和(b)将样本中一组至少3个表1所列胰岛素抗性标记的表达水平与参考值相比，所述参考值代表具有已知胰岛素抗性状态的个体群中的表达，其中当符合下面条件时可以将个体诊断为胰岛素抗性或有发生胰岛素抗性的危险(i)若参考值代表胰岛素抗性个体群中的表达，则所述至少3个胰岛素抗性标记的至少50％的表达水平与参考值相比无统计学差异，或者(ii)若参考值代表非胰岛素抗性个体群中的表达，则所述至少3个胰岛素抗性标记的至少50％的表达水平与参考值相比具有统计学差异。
18.权利要求17的方法，其中胰岛素抗性个体群具有eIR表型。
19.权利要求17或18的方法，其中非胰岛素抗性个体群具有eIS表型。
20.分析胰岛素抗性相关基因的表达的装置，其包含固定化的能与表1所列IRM杂交的至少一个多核苷酸探针，其中基质包含少于4000个的不同多核苷酸探针。
21.权利要求20的装置，其中所述基质包含少于100个的不同多核苷酸探针。
22.权利要求20或21的装置，其中基质包含少于10个的不同多核苷酸探针。
23.权利要求20-22的装置，其包含能与至少4种不同IRM基因杂交的探针。
24.权利要求20-23的装置，其中至少10％的固定化探针为能与IRM基因产物杂交的多核苷酸。
25.权利要求20-24的装置，其中多核苷酸被固定在载玻片上。
26.权利要求20-25的装置，其包含至少一个能与IRM 120或IRM 50杂交的多核苷酸探针。
27.权利要求8的方法，其中固定化多核苷酸被固定于权利要求21的装置上。
28.筛选药剂以确定其在胰岛素抗性治疗中的有用性的方法，包括a)提供表达至少1个表1所列胰岛素抗性标记(IRM)的细胞；b)将该细胞与测试药剂相接触；和c)检测在测试药剂存在下IRM基因表达水平是否变化，如果发生变化则提示该测试药剂可用于胰岛素抗性的治疗。
29.权利要求28的方法，其中细胞为培养细胞。
30.权利要求29的方法，其中细胞为原代培养物或确立的细胞系。
31.权利要求30的方法，其中细胞选自3T3-L1脂肪细胞、CHO细胞、L6大鼠骨骼肌管细胞、小鼠巨噬细胞RAW、Jurkat细胞、PC12(大鼠神经元)细胞、Hela细胞、HEP G2细胞、Burkitt氏淋巴瘤细胞系Raji、Burkitt氏淋巴瘤细胞系Daudi、B-PLL细胞系(p11A-1-1)、B-ALL细胞系MOLT-3和B-ALL细胞系MOLT-4。
32.权利要求30的方法，其中细胞选自来自于Burkitt氏淋巴瘤、B-细胞型幼淋巴细胞白血病、B-细胞型慢性淋巴细胞白血病或B-细胞型急性淋巴细胞白血病患者的细胞系或原代培养细胞。
33.权利要求29的方法，其中细胞为EBV转化的B淋巴细胞。
34.权利要求28-33的方法，其中检测RNA表达水平的变化。
35.权利要求28-33的方法，其中检测IRM基因编码的蛋白的表达水平变化。
36.权利要求28-35的方法，其包括检测测试药剂存在下至少2个胰岛素抗性标记的表达水平是否发生变化，如果至少1个IRM的表达水平发生变化则提示该测试药剂可用于胰岛素抗性的治疗。
37.权利要求36的方法，其包括确定至少5个胰岛素抗性标记的表达水平。
38.权利要求34的方法，其中表达水平通过扩增分析来确定。
39.权利要求34或35的方法，其中表达水平通过杂交分析来确定。
40.权利要求28-39的方法，其还包括给动物施用所述药剂以确定该药剂是否影响动物对胰岛素的反应。
41.权利要求40的方法，其中动物为啮齿类动物。
42.权利要求28-41的方法，其中细胞至少表达IRM 120和IRM 50两者之一。
43.筛选药剂以确定其在胰岛素抗性治疗中的有用性的方法，包括a)提供包含IRM蛋白质的组合物，b)使该组合物与测试药剂接触，和c)确定在测试药剂存在时IRM蛋白质的活性是否发生改变，如果发生改变，则提示该测试药剂可用于治疗胰岛素抗性。
44.筛选药剂以确定其在胰岛素抗性治疗中的有用性的方法，包括(a)将IRM基因编码的多肽或表达该多肽的细胞与测试化合物相接触，其中该多肽具有可检测的生物活性；和(b)检测在该测试药剂存在下蛋白的生物活性水平是否发生变化，如果变化则提示测试药剂可用于胰岛素抗性的治疗。
45.筛选药剂以确定其在胰岛素抗性治疗中的有用性的方法，包括(a)将IRM基因编码的多肽或表达该多肽的细胞与测试化合物相接触；和(b)检测多肽是否与测试化合物结合，如果结合则提示测试药剂可用于胰岛素抗性的治疗。
46.用于胰岛素抗性或IR相关病症治疗的药物的制备方法，包括(a)使用权利要求28-45之任一项的方法确定药剂是否可用于治疗胰岛素抗性；和(b)配制药剂以用于给灵长类动物施用。
47.筛选可用于胰岛素抗性治疗的药剂的方法，包括(a)使用权利要求28-45之任一项的方法确定药剂是否可用于治疗胰岛素抗性；和(b)将药剂施用给非人类的动物以确定药剂的效果。
48.在哺乳动物中治疗胰岛素抗性的方法，包括施用有效量的能够调节表1所列胰岛素抗性标记表达的药剂。
49.权利要求48的方法，其中药剂能够调节IRM 120或IRM 50的表达。
50.与胰岛素抗性(IR)表型或发生胰岛素抗性的危险性相关的多态的鉴定方法，包括对比来自胰岛素抗性个体的生物样本中和来自非胰岛素抗性个体的生物样本中的表1所列IRM基因的序列差异。
51.权利要求50的方法，其中非胰岛素抗性个体具有eIS表型。
52.权利要求50的方法，其中胰岛素抗性个体具有eIR表型。
53.确定个体是否有发生胰岛素抗性的危险或所述个体是否患有胰岛素抗性的方法，包括步骤(a)从所述个体获得核酸样本；和(b)确定存在于一个或多个IRM基因上的核苷酸是否指示发生胰岛素抗性的危险性。
54.检测基因型和胰岛素抗性表型之间的相关性的方法，包括步骤(a)鉴定第一组具有第一胰岛素抗性表型的群体中至少1个IRM基因的基因型；(b)鉴定第二组具有不同于第一胰岛素抗性表型的第二胰岛素抗性表型的群体中上述IRM基因的基因型；和(c)检测所述基因型和所述表型之间是否存在统计学显著相关性。
55.权利要求54的方法，其中第一组群体具有eIS表型，第二组群体具有eIR表型。
56.群体中一套核苷酸多态性标记的单元型频率的估计方法，包括(a)鉴定群体中个体的表1所列IRM基因的至少第一核苷酸多态，(b)鉴定群体中个体的IRM基因的第二核苷酸多态，其中所述第二IRM基因与第一IRM基因相同或不同；和(c)对步骤(a)和(b)中确定的核苷酸多态的身份应用单元型确定方法进行分析以估计所述频率。
57.检测单元型与表型之间的相关性的方法，包括步骤(a)依照权利要求56的方法估计在具有第一胰岛素抗性表型的第一群体中至少一个单元型的频率，(b)依照权利要求56的方法估计上述单元型在不同于第一胰岛素抗性表型的第二胰岛素抗性表型中的频率，和(c)确定所述单元型与第一胰岛素抗性表型之间是否存在统计学显著相关性。
58.权利要求57的方法，其中第一胰岛素抗性表型为eIR。
59.权利要求57的方法，其中胰岛素抗性表型为eIS。
60.疾病状态相关基因的鉴定方法，包括(a)鉴定第一群人类个体，其中所述个体患有该疾病或为该疾病的高危患病个体；(b)鉴定第二群人类个体，其中所述个体无该疾病或为该疾病的低危患病个体，(c)从第一和第二群体的每个个体的B淋巴细胞制备细胞系，(d) 比较第一群的细胞系和第二群的细胞系中RNA的表达，由此鉴定在第一和第二群之间存在表达差异的RNA，其中所述在第一和第二群之间存在表达差异的RNA是由疾病状态相关基因编码的。
61.权利要求60的方法，其中细胞系通过用Epstein Barr病毒转化而建立。
62.权利要求60的方法，其中第一和第二群体分别至少包括3名个体。
63.权利要求60的方法，其中第一群为极端胰岛素抗性群体，第二群为极端胰岛素敏感群体，或者第一群为极端高HDL群体，第二群为极端低HDL群体，或者第一群为极端肥胖/高体重群体，第二群为极端消瘦/低体重群体。
全文摘要
本发明提供用于胰岛素抗性和胰岛素抗性相关病症的诊断、预后和治疗的方法、试剂和装置，以及用于鉴定胰岛素抗性和胰岛素抗性相关病症治疗药剂的方法及由此鉴定的药剂。
文档编号A61P5/00GK1533435SQ02814499
公开日2004年9月29日 申请日期2002年6月3日 优先权日2001年6月1日
发明者马元红, 栗志坚, 陈帆, 杰弗·法尔曼, Y－D·I·陈, 陈, 法尔曼 申请人:克林杰尼克斯公司