Hepcidin作为铁稳态调节剂的用途的制作方法

专利名称：Hepcidin作为铁稳态调节剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及铁稳态(iron homeostasis)疾病的诊断和治疗。
铁是几乎每个有机体生长和生存所需的必需元素。在哺乳动物中，对铁平衡的调节主要是在十二指肠对膳食中的铁吸收的水平。吸收后，三价铁被结合于循环中的转铁蛋白并被转运到组织中，包括红系前体细胞，其中它被转铁蛋白受体介导的胞饮作用所摄取。网状内皮吞噬细胞在从衰老红细胞的血红蛋白的降解再利用铁中起着主要作用，而肝细胞含有有机体大多数的以铁蛋白聚合物形式的铁储存。在过去的五年里，从对造成严重铁障碍的人类和小鼠的遗传性缺陷的研究中获得了关于参与铁吸收和铁稳态调节的蛋白的重要信息(综述见ANDREWS，Nat.Rev.Genet.，1，208-217，2000)。对于铁缺乏，可以很好地理解已确认的基因缺陷的病理生理结果，因为它们通常造成了直接参与铁吸收途径的蛋白功能的缺失。这些蛋白包括铁转运蛋白DMT1(也称为Nramp2或DCT1)(FLEMING等，Nat.Genet.，16，383-386，1997；GUNSHIN等，Nature，388，482-488，1997)，ferroportin(也称为IREG1或MTP1)(DONOVAN等，Nature，403，776-781，2000)以及结合于ferroportin的铜氧化酶，即铜蓝蛋白(HARRIS，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，10812-10817，1999；YOSHIDA等，Nat.Genet.，9，267-272，1995)以及haephastin(VULPE等，Nat.Genet.，21，195-199，1999)。
相反，虽然一些与遗传性铁负荷过量相关的疾病已经鉴定出各种蛋白，但对于它们在控制铁稳态上的功能作用仍了解的很少。在人类，遗传性血色病(hereditary hemochromatosis，HH)是一种常见的常染色体隐性遗传病，它是因为对膳食中的铁的过量吸收而引起，造成了铁在血浆和多个器官的负荷过量，包括特别是胰腺、肝脏和皮肤，并因为铁的沉积造成了对这些器官和组织的损伤。
血色病的原因通常是HLA连锁的血色病基因(称为HFE)的突变，该基因定位于染色体6p，且大多数患者是HFE的C282Y突变的纯合子(FEDER等，Nat.Genet.，13，399-408，1996)。另外，不同的HH家系中也含有其他的突变位点在两个HH非HLA连锁的家系中已经报告了7p上转铁蛋白受体2基因(TFR3)的无义突变(CAMASCHELLA等，Nat.Genet.，25，14-15，2000)以及最近将幼年性血色病的位点定位于染色体臂1q(HFE2)。最后，尽管已经很长时间知道铁吸收的调节是反应于体内铁储备水平和红细胞生成所需要的铁量(ROY等，FEBS Lett.，484，271-274，2000)，但是仍然需要继续确定调控肠细胞调节铁吸收的信号的分子本质。
最近已经报告了小鼠编码转录因子USF2的基因断裂以及它对肝葡萄糖依赖的基因调控的影响(VALLET等，J.Biol.Chem.，272，21944-21949，1997)。
本发明人现在已经惊奇地观察到，Usf2 -/- mice出现了多内脏的铁负荷过量，在基因敲除动物中只有脾脏的铁含量显著地低于对照组。这些铁代谢异常类似于在遗传性血色病中所观察到的。然而，在这些病理变化中没有先前已鉴定的基因改变的参与，例如已经发现的HFE或TFR2。因此，本发明人将来自Usf2 -/-小鼠和野生型小鼠的肝脏进行抑制减数杂交以寻找新的候选基因，这些基因可以解释在Usf2 -/-小鼠中所发现的铁稳态异常。它允许进行编码hepcidin肽的cDNA的分离。
最近从人血的超滤液和从尿中纯化到Hepcidin(也被称为LEAP-1，即肝表达的抗微生物肽)，发现它是一种有着抗微生物活性的二硫键合的肽(disulfide-bonded peptide)(KRAUSE等，FEBS Lett.，480，147-150，2000；PARK等，J.Biol.Chem.，276，7806-7810，2001)。该蛋白在肝脏内以前肽(propeptide)形式被合成，该前肽包括83个氨基酸并被转化为有着20，22或25个氨基酸的成熟肽((PARK等，J.Biol.Chem.，276，7806-7810，2001；PIGEON等，J.Biol.Chem.，276，7811-7819，2001)。最近报道hepcidin在试验性或自发性铁负荷过量小鼠的肝脏内被高水平合成(PIGEON等，J.Biol.Chem.，276，7811-7819，2001)。尽管这种过度表达和铁负荷过量的关系仍有疑问，但是它提示这可能是慢性铁负荷过量相关炎症的结果。
相反，本发明人现在已经发现在Usf2 -/-小鼠中hepcidin表达的完全缺乏导致了进行性组织铁负荷过量。进一步的，他们已经获得了有着转基因的转基因小鼠，该转基因在组合的肝特异性启动子的调控下表达hepcidin，并发现上述的转基因动物是严重贫血的。
这些发现允许计划铁稳态调控的新方法，特别是通过调节肠道对膳食中的铁的摄取，或调节经胎盘屏障的母胎铁转运，以及调节网状内皮巨噬细胞的铁的再循环。
因此，本发明建议使用一种多肽，它包括20个氨基酸序列，并在2，5，6，8，9，14，17和18位点有半胱氨酸，以及和以下序列有着至少50％相同性或60％相同性，优选的至少60％相同性或至少70％相同性Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met CysCys Lys Thr(SEQ ID No.1)或使用一种编码上述多肽的核酸，以制备用于减少铁负荷过量的药物。
根据本发明，使用的优选的多肽或核酸是人类hepcidin的成熟形式，例如有着SEQ ID No.1的20个氨基酸多肽，或有着以下序列的22个氨基酸多肽Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys GlyMet Cys Cys Lys Thr(SEQ ID No.2)或者是有着以下序列的25个氨基酸多肽
Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg SerLys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr(SEQ ID No.3)或编码上述多肽的核酸。
也可以使用上述hepcidin成熟形式的前体，也就是prohepcidin和preprohepcidin及编码上述前体的核酸。根据本发明，其他适合使用的多肽或核酸的实例是脊椎动物的，优选的是哺乳动物的、人类hepcidin成熟形式的同源物或它们的前体物、或编码上述多肽的核酸。已知脊椎动物的人类hepcidin成熟形式的同源物，包括例如大鼠hepcidin、小鼠hepcidin，鳟hepcidin。
也可以使用包括hepcidin成熟形式的序列的嵌合多肽，以及最终，所有的所述pro-或所述prepro-序列的部分。
本发明也包括使用上述多肽的功能等价物。这里的功能等价物定义为肽异构体，或其他有着与hepcidin成熟形式相同的功能活性的化合物。这些功能等价物的实施例包括被塑造成模仿任何一种有着SEQ IDNo.1，SEQ ID No.2，或SEQ ID No.3的多肽的三维结构的化合物。特别注意到上述多肽的衍生物有着稳定性和生物半衰期的改善。这些衍生物的经典实例是例如“retro-inverso”肽，其中氨基酸序列是反向的，以及用D-氨基酸取代L-氨基酸。
所有的这些多肽和核酸都可以通过已知的经典方法获得。例如，可以从血浆或从尿液中获得20个氨基酸和25个氨基酸形式的hepcidin，如KRAUSE等或PARK等所描述的。同样的，可以通过培养表达hepcidin的细胞并从细胞培养物中收集上述多肽来获得。
根据特别的实施方案，上述细胞是用编码上述的任何一种多肽的核酸转化的宿主细胞。
也可以使用化学合成，特别是对肽衍生物。
例如可以利用能与编码hepcidin的核酸选择性杂交的合适引物从脊椎动物的基因组或cDNA库中获得上述的核酸。也可以通过多核苷酸合成的经典技术获得核酸。
本发明也提供了筛选能减少铁吸收的hepcidin的功能等价物的方法。
例如，利用动物很容易筛选出有着hepcidin调节铁稳态的生物学功能的功能等价物，特别是非人类的缺失hepcidin的哺乳动物，例如有着hepcidin表达缺失造成铁负荷过量的基因敲除小鼠。
具体而言，一种筛选能减少铁吸收的hepcidin的功能等价物的方法包括以下步骤-将化合物施用于缺失hepcidin表达的基因敲除动物以测定其减少铁吸收的能力；-确定上述化合物对上述动物的铁负荷过量的作用。
根据本发明获得的药物可以有效地预防和/或治疗-所有形式的血色病；-继发性铁负荷过量，继发于例如遗传性和/或先天性贫血如地中海贫血；以及与此相关的疾病。后者的疾病包括例如肝癌、心肌病或糖尿病。
根据另一方面，本发明也提供了hepcidin表达或hepcidin活性的抑制剂在制备用于通过增加肠道对膳食中的铁的摄取和/或增加巨噬细胞对铁的再利用来增加铁吸收的药物中的用途。上述药物能用于治疗贫血或贫血相关疾病。这些疾病特别包括与在例如感染或炎症状态下发生的急性或慢性疾病相关贫血，例如骨关节病如类风湿多关节炎或恶性肿瘤，特别是与炎性综合征相关时。
Hepcidin表达的抑制剂包括例如反义RNA或DNA分子、或核酶。
Hepcidin活性的抑制剂包括例如抗hepcidin抗体，特别是直接对抗hepcidin成熟形式的抗体。
本发明也提供了筛选其他的hepcidin活性抑制剂的方法，例如用转基因动物，特别是转基因非人类哺乳动物，例如有着表达hepcidin转基因的转基因小鼠，且上述表达在上述动物中诱导贫血。
例如，一种筛选能增加铁吸收的hepcidin活性抑制剂的方法包括以下步骤-将化合物施用于具有表达hepcidin的转基因的转基因动物以测定其通过抑制hepcidin活性增加铁吸收的能力；-确定上述化合物对上述动物的贫血的作用。
根据本发明获得的药物可以通过各种途径给药，这依赖于它们的特性。
例如，hepcidin多肽或它们的功能等价物，以及hepcidin抑制剂如抗hepcidin抗体可以单独或与合适的载体或赋形剂混合后给药。它们可以全身或局部使用。优选的给药途径是肠外途径，包括例如肌肉内、皮下、静脉内或腹腔内注射。
也可以使用口服途径，条件是该药物是以适合口服给药的形式存在，能避免胃肠的酶类以保护活性成分。
如上所述，也可以使用核酸分子例如编码上述任一hepcidin多肽的核酸，使得能在治疗对象的细胞内表达上述多肽，或使用能转录为反义RNA的核酸以抑制治疗对象细胞内hepcidin的表达。
在这种情况下，通过经典的基因转移技术将上述核酸分子引入目标细胞内。
典型地，上述核酸分子被放置在合适的启动子的转录控制之下。启动子的选择依赖于药物的使用目的和/或目标器官或组织。因此可以选择任何一种组成型或诱导型的和/或任何一种遍在的或组织特异性的启动子。
因此获得的能直接转移入细胞的表达框可以是裸DNA，或放置于一合适的载体中，例如病毒载体，如腺病毒载体。
转移方法和/或载体的选择依赖于目标器官或组织，和/或需要的是否是短时间的表达(暂时表达)或稳定表达。
可以体外对取自治疗对象的细胞进行基因转移，然后将上述细胞重新移植入上述对象中，或可以通过将核酸直接施用到上述对象内进行基因转移。
本发明也提供了经遗传学修饰的非人类的动物，其中遗传学修饰造成hepcidin表达的异常。本发明也包括生物学材料，例如来自上述遗传学修饰的动物的细胞、组织和器官。
这特别包括不表达hepcidin的基因敲除动物，优选的基因敲除哺乳动物，以及特别包括小鼠。Hepcidin的表达缺失在上述动物中诱导了铁负荷过量。但不包括VALLET等(J.Biol.Chem.，272，21944-21949，1997)阐述的已知的敲除小鼠，其中编码转录因子USF2的基因是失活的。
可以通过完全或部分灭活hepcidin基因以获得本发明的基因敲除动物，上述灭活造成hepcidin产物的缺失或其功能的缺失。
Hepcidin基因的灭活可以靶向-编码hepcidin的序列，造成上述蛋白产物的缺失，或其功能的缺失，和/或-至少一种控制hepcidin表达的调节序列，造成hepcidin产物的缺乏，或hepcidin产量的急剧减少。
本发明的有着hepcidin表达异常的其他遗传学修饰动物是有着表达hepcidin转基因的转基因动物，优选的转基因哺乳动物，以及特别是转基因小鼠。
合适的制备转基因或敲除动物的方法在本领域是熟知的，例如在HOGAN等编，小鼠胚胎处理，第二版，冷泉港实验出版社，1994；C.PINKERT编，转基因动物技术，科学出版社，1994；A.L.JOYNER编，基因打靶实践方法，牛津大学出版社，1995；G.M.MONASTERSKY和J.M.ROBL编，转基因动物科学的策略，ASM出版社，1995；Lee M.SILVER编，小鼠的遗传学概念和应用，牛津大学出版社，1995。
不表达功能性hepcidin的基因敲除动物，以及有着表达hepcidin的转基因的转基因动物可以被用作为研究铁稳态机制的模型。它们可以被同上所述的使用以筛选有着与hepcidin在铁吸收上同样作用的化合物，或筛选能抑制hepcidin对铁吸收作用的化合物。
本发明也提供了诊断性方法以确定是否铁吸收的异常和hepcidin的突变或不正常的hepcidin的产生相关。
例如本发明提供了-一种检测不正常的hepcidin的产生是否造成了铁吸收异常的方法，其中上述方法包括在取自有着上述异常的对象的生物学样品中确定hepcidin的量；-一种检测铁吸收异常是否与生产功能性hepcidin不正常的突变相关，其中上述方法包括在来自有着上述异常的对象的核酸样品中测定hepcidin基因的突变。
适合于测定hepcidin量的生物学样品包括例如血、尿、或羊水样品、或组织活检，特别是肝活检或胎盘活检。
适合于测定生产功能性hepcidin不正常的突变的核酸样品包括RNA、cDNA或基因组DNA。
生物学样品中的hepcidin的量容易被熟知的方法所测定，例如，HPLC色谱法、质量分光光度法、或利用抗hepcidin抗体的免疫测定。
可以通过对先前从测试样品的DNA样本中分离得到的上述基因或它的部分基因的测序，以及与从无铁稳态异常的一个或几个对象中获得的相应的野生型序列进行比较，很容易测定hepcidin基因的突变。
本发明将被以下的附加描述进一步地阐述，这些描述指的是实施例，它们阐述了基因敲除动物的hepcidin产生缺失或转基因动物的hepcidin过量生成的作用。应当认识到给定的这些实施例只是本发明的阐述的一种方式，并不构成对本发明的任何的限制。
实施例1hepcidin表达缺失的基因敲除动物的特点材料和方法Usf2 -/-小鼠的繁殖和基因分型以往已经描述了Usf2基因的裂解(VALLET等，J.Biol.Chem.，272，21944-21949，1997)。突变的等位基因包括小鼠USF2基因的7号外显子的无启动子IRESβgeo盒。所有研究的小鼠有着混合的遗传学背景，包括来自C57BL/6和129/Sv株。用每公斤体重含有280mg三价碳酸铁的标准的实验室小鼠食品(AO3，UAR，France)喂养小鼠。在2.5个月到19个月杀死小鼠。利用单次PCR反应进行小鼠尾部DNA的基因分型以确定野生型(WT)和USF2基因敲除等位基因。将基因组DNA(0.5-1μg)用于包含有3种引物的50μl反应物中野生型USF2等位基因用以下引物进行扩增-正向(退火于内含子6)GCGAAGCCCTGGGTTCAATC(SEQ ID No.4)和-反向(退火于内含子7)GGGGTCCACCACTTCAAGAGG(SEQ ID No.5)。
用以下引物扩增基因敲除的USF2基因-正向GCGAAGCCCTGGGTTCAATC(SEQ ID No.6)和-反向(退火于目标构建体的Neo选择标记物)GAATTCTCTAGAGCGGCCGGAC(SEQ ID No.7)
按照以下进行PCR37个循环(每个循环包括94℃30秒，56℃30秒，72℃40秒)以及最初的变性步骤94℃4分钟，和终末的延伸步骤72℃5分钟，反应体系为20mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，0.05％W-I，2mM MgCl2，5％甘油，0.04％溴酚蓝，0.2mM各种dNTP，0.2μM每种引物，2单位Taq多聚酶(Gibco)。在含有溴乙锭的1.5-2.0％琼脂糖凝胶上分析反应产物。发现该小鼠基因分型的PCR方法得到了与先前报道的Southern印迹法相同的结果(VALLET等，J.Biol.Chem.，272，21944-21949，1997)。
校正减数杂交(SSH)生成减数文库如前描述制备总RNA(CHOMCZYNSKI和SACCHI，Anal.Biochem.，162，156-159，1987)。用寡(dT)纤维素(BoehringerMannheim Biochemica)分离聚腺苷酸RNA。根据生产商对所有步骤的说明利用PCR-selectTMcDNA减数试剂盒(Clontech)，在3个5月龄的纯合子USF2缺失小鼠(“驱动物(driver)”)的混合的肝RNA和1个5月龄的野生型小鼠(“测试物(tester)”)的肝RNA之间进行SSH。简要的，将14ng连接的测试物和420ng非连接的驱动物cDNA，变性并重新退火。在减数杂交后，通过两轮PCR扩增1μl cDNA。利用AdvanTAgeTM PCR克隆试剂盒(Clontech)将减数cDNA文库克隆于pT-Adv载体。在用Advantage cDNA多聚酶混合物(Clontech)进行第二次PCR(15个循环)后，将减数的PCR cDNA混合物在72℃与1单位TaqDNA多聚酶(Gibco BRL)进一步孵育10分钟以使克隆效率最大化，以及用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。利用Cell-Porator(GibcoBRL)通过电穿孔将连接混合物引入到Electromax细菌株DH10B(GibcoBRL)中。将文库铺板于22×22cm的琼脂板，其中含有青霉素(100μg/ml)、40μl X-gal(40mg/ml)及40μl IPTG(0.1M)。将细菌在37℃中增长直到可见菌落，并保存在4℃直到能清楚地分别出蓝/白菌株。
反向Northern高密度印迹和筛选收集总共400个菌落，重悬于30μl水中，在100℃加热10分钟，然后在冰中放置5分钟并离心5分钟。用3μl清亮的上清液和以下的引物进行PCR-正向5’-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3’(SEQ ID No.8)，和-反向5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3’(SEQ ID No.9)。
在Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia)上印迹PCR产物。用32P-dCTP-标记的双链cDNA((RTS RadPrime DNA Labeling System，Gibco)将印迹在72℃杂交过夜，如上所述该双链cDNA用2μg来自野生型或Usf2 -/-小鼠肝的多腺苷RNA合成。在68℃用2 X SSC/0.1％SDS洗涤印迹4次20分钟，以及用0.2 X SSC/0.1％SDS洗涤印迹2次20分钟。
逆转录和RT-PCR总共20μl的2μg总RNA(或减数文库的polyA RNA)，以及0.25mM每种dNTP，200ng随机六核甘酸引物，20单位RNAsin(Promega)，10mM DTT和200单位M-MLV逆转录酶(Gibco)合成双链cDNA。在加热循环器中将RNA在70℃变性10分钟后，在42℃将反应进行1小时，后将逆转录酶在96℃灭活6分钟。在反应终末，加入80μl 10mM Tris-HCl(pH8.0)和0.1mM EDTA(pH8.0)。用5μl逆转录酶反应混合物以及50μl 20mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，2mMMgCl2，0.05％(v/v)W-1，0.2mM每种dNTP，1pmol正向和反向特异性引物(列下)，1pmol正向和反向对照的β-actin引物和2单位Taq多聚酶(Gibco)进行PCR扩增。PCR条件是25个循环，其中包括94℃变性20秒，50℃退火20秒，以及72℃引物延伸20秒。PCR后，用电泳将扩增产物(171bp的HEPC1或HEPC2及250bp的β-actin)在1.5％琼脂糖凝胶上进行分离。
引物序列如下
*HEPC1-正向5’-CCTATCTCCATCAACAGATG-3’(SEQ ID No.10)和-反向5’-AACAGATACCACACTGGGAA-3’(SEQ ID No.11)；*HEPC2-正向5’-CCTATCTCCAGCAACAGATG-3’(SEQ ID No.12)和-反向5’-AACAGATACCACAGGAGGGT-3’(SEQ ID No.13)；*β-actin-正向5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’(SEQ ID No.14)and-反向5’-TTTGATGTCACGCACGATTT-3’(SEQ ID No.15).
用于扩增DMT1的引物如下*无IRE的DMT1异构体-正向5’-TCCTGGACTGTGGACGCT-3’(SEQ ID No.16)和-反向5’-GGTGTTCAGAAGATAGAGTTCAGG-3’(SEQ ID No.17)；*有IRE的DMT1-正向5’-TGTTTGATTGCATTGGGTCTG-3’(SEQ ID No.18)和-反向5’-CGCTCAGCAGGACTTTCGAG-3’(SEQ ID No.19)；*14S标准化
-正向5’-CAGGACCAAGACCCCTGGA-3’(SEQ ID No.20)和-反向5’-ATCTTCATCCCAGAGCGA-3’(SEQ ID No.21)Northern印迹用于扩增用于检测特异性mRNAs的探针的引物是*小鼠血色病(HFE)cDNA的扩增(1080bp)-正向5’-ATGAGCCTATCAGCTGGGCT-3’(SEQ ID No.22)和-反向5’-TCACTCACAGTCTGTTAAGA-3’(SEQ ID No.23)；*小鼠转铁蛋白受体(TfR)cDNA的扩增(285bp)-正向5’-GAAATCCCTGTCTGTTATAC-3’(SEQ ID No.24)和-反向5’-GGCAAAGCTGAAAGCATTTC-3’(SEQ ID No.25)；*小鼠转铁蛋白2(TFR2)cDNA的扩增(333bp)-正向5’-TACAGCTCGGAGCGGAACG-3’(SEQ ID No.26)和-反向5’-TTACAATCTCAGGCACCTCC-3’(SEQ ID No.27)；*小鼠铜蓝蛋白cDNA的扩增(350bp)-正向5’-ACTTATTTCAGTTGACACGG-3’(SEQ ID No.28)和-反向5’-GCAGCACATACACATACTGT-3’(SEQ ID No.29)；*小鼠血色素加氧酶1(Hmoxl)cDNA的扩增(258bp)
-正向5’-ATGGAGCGTCCACAGCCCG-3’(SEQ ID No.30)和-反向5’-CCTTCGGTGCAGCTCCTCAG-3’(SEQ ID No.31)。
利用Taq聚合酶和肝总cDNA扩增每个片段，及用琼脂糖凝胶纯化(QIAquick PCR纯化试剂盒，Qiagen)，并将它克隆于TA载体(AdvanTAge克隆试剂盒，Clontech)。根据方案选择重组质粒并在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中扩增和纯化(QIAprep SpinMiniprep，Qiagen)。用EcoRI降解后，将每种cDNA从载体中纯化出来，并在琼脂糖凝胶上跑带。用于检测HEPC1 mRNA的探针是制备于抑制减数杂交分离的pT-Adv/HEPC1的EcoRI降解物。将每种来源的20微克RNA在含福尔马林的缓冲液中变性，并在1％琼脂糖，2.2M福尔马林凝胶中进行电泳。按以往描述的方法(VALLET等，J.Biol.Chem.，272，21944-21949，1997)进行Northern印迹。将每个条带剥离，并用核糖体18 S cDNA重新探试以核查获得RNAs的完整性和数量。
Southern印迹按以往描述的方法(VALLET等，J.Biol.Chem.，272，21944-21949，1997)进行Southern印迹。用以下的引物扩增1437碱基对的小鼠基因组DNA片段以制备HEPC1探针。
-正向5’-GAGCAGCACCACCTATCTCCA-3’(SEQ ID No.32)和-反向5’-AACAGATACCACAGGAGGGT-3’(SEQ ID No.33)。
用PvuII降解后，从琼脂糖凝胶中纯化出545碱基对片段并将其用作为Southern印迹的探针。该HEPC1显示出了与同源的HEPC2区域的95％相同性。
小鼠的血液学分析在杀死小鼠之前，通过眶后静脉切开取血，并收集在肝素化管(capijectTMT-MLH，Terumo医药公司)中。用MaxM coulter自动分析仪测定血细胞数目和红细胞参数。
铁的测定和组织学按以往Torrance和Bothwell(1968)描述的，利用IL实验TM(Instrumentation Laboratory)进行部分或整个组织的铁水平的定量化。对于组织学，利用标准方法将组织固定在4％福尔马林中，石腊包埋，放置于玻片上，普鲁士蓝染色以及核红复染。
结果Usf2 -/-小鼠肝脏和胰腺的大量铁负荷过量所有的Usf2 -/-小鼠在三个月后都表现出了肝脏致密的褐色色素沉着以及胰腺较多或较少的显著的青铜色色素沉着。这个表型性状是血色病的特点，是铁吸收异常的遗传性疾病。我们决定分析Usf2 -/-小鼠的铁状况。首先是评价铁累积的水平，对保持标准饮食的野生型和Usf2 -/-小鼠的肝脏和胰腺进行Perls’普鲁士蓝染色。
结果显示在

图1(A到D)图例肝脏切片来自(A)8个月大的野生型小鼠(x50)；(B)8个月大的Usf2-/-同窝出生的小鼠；(C)19个月大的Usf2 -/-小鼠(x10)。(D)中的胰腺切片来自8个月大的Usf2 -/-小鼠(x12，5)。C中的箭头指的是肝细胞核中的铁。D中的箭头指的是整个外分泌组织中散在的胰岛(islet of Langerhans)。
对照小鼠肝中显示出很少量的或没有阳性的铁染色(图1A)，而Usf2 -/-小鼠肝细胞中显示出铁的聚集(图1B-C)。这种铁的沉积主要于门脉周围的肝细胞以及被染色的肝细胞数目随着年龄增加而增加。到了19个月的年龄，如图1C所示，铁的累积是相当多的，而且整个肝实质被均匀染色。此外，在一些肝细胞(图1B)上检测到核中严重的铁累积。对于胰腺，得到了相似的结果，也就是，对照组织中没有染色，而在Usf2 -/-小鼠(图1D)的外分泌胰腺中有着严重的铁累积。
为了更准确地定量动物生命中的铁负荷过量，测定了从2.5到19个月年龄小鼠的肝脏和胰腺的铁的水平。
结果显示于图1(E和F)图例在对照组(野生型和杂合子小鼠，▲)和Usf2 -/-小鼠(□)中测定了年龄相关的肝的(E)和胰腺的(F)非血色素铁浓度(每克干组织的铁的微克数)。
如图1E所示，铁累积在出生后60和100天之间的小鼠肝中，并达到一平台，几乎是野生小鼠铁浓度的10倍。在胰腺(图1F)中，铁的累积更为严重，Usf2 -/-小鼠的铁水平比野生型小鼠最大高20倍。也测定了肾脏和心脏的铁的聚集，它们相应有着2倍和4倍的累积。最后，发现与对照小鼠比较，Usf2 -/-小鼠的血清有着1.7倍高的铁水平(对照组3.550±259μg铁/l[n＝15]对Usf2 -/-小鼠6.274±514μg铁/l[n＝13]P＜0.0001)，但是这种增加没有显示出年龄相关性。Usf2 -/-小鼠血清铁水平的增加与1.6倍增加的转铁蛋白饱和度(对照组1±9％饱和度[n＝6]对Usf2 -/-小鼠95±9％饱和度[n＝6]P＜0.0004)相关。最后，在直到目前为止分析最老的雌性小鼠中(19个月)，铁负荷过量是弥漫性的，测定的所有组织包括肌肉，子宫，肺和垂体(没有显示)都有着铁水平的增加。
Usf2 -/-小鼠脾脏可抵抗自然的铁沉积结果显示在图2图2的图例(A)在对照组(野生型和杂合子小鼠，▲)和Usf2 -/-小鼠(□)中测定了年龄相关的脾的非血色素铁浓度(每克干组织的铁的微克数)。脾的切片来自代表性的(B)8个月大的野生型小鼠(x20)和(C)8个月大的Usf2 -/-同窝出生的小鼠(x20)，用Perl’染色铁。RP，红髓；WP，白髓。
与所有其他测试的组织不同，在野生型小鼠的脾中观察到年龄相关的铁的累积，如示(图2A)。
观察到与Perls’普鲁士蓝染色呈阳性反应的颗粒，它们主要分布在红髓的细胞之间(图2B)。我们发现这种累积在小鼠之间有着很大的差异，提示它可能依赖于每个动物的杂种品系背景(129/Sv x C57BL/6)。在C57BL/6小鼠中以往已经报道了这种自然的铁储存，并发现主要发生在脾的巨噬细胞(VENINGA等，Lab.Anim.，23，16-20，1989)。奇怪的是，在Usf2 -/-小鼠的脾中，铁的水平仍是非常低的(图2A)，以及完全没有Perls’普鲁士蓝染色(图2C)。
Usf2 -/-小鼠的红细胞参数不受影响为了除外Usf2 -/-小鼠的铁累积的增加可能是因为红细胞生成障碍性贫血的可能，测定了不同年龄的对照和Usf2 -/-小鼠的红细胞参数。红细胞数目值(RBC，106/ml)，血红蛋白浓度(Hb，g/dl)和平均红细胞体积(MCB，fl)都是正常的RBC，Hb和MCB相应地分别为野生型10.3±0.3，16.73±0.49和48.27±0.67(n＝3)；Usf2 -/-小鼠10.0±0.3，15.67±0.06和48.63±1.36(n＝3)。
因此，有意思的是，在Usf2 -/-小鼠中观察到的铁的异常，包括脾脏对铁累积的抵抗和正常的血液学参数，明显地类似于HFE -/-小鼠的表型(LEVY等，Blood，94，9-11，1999；ZHOU等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，2492-2497，1998)，一种遗传性血色病的小鼠模型。
Usf2 -/-肝的HFE和TFR2基因的表达没有改变因此USF2是转录因子，因此检测了USF2是否参与了编码铁代谢相关蛋白的基因的调节。因为HFE -/-小鼠和Usf2 -/-模型的相似性，首先测定了HFE基因的表达。同时也关注了编码转铁蛋白受体-2的基因，最近报道在HH中存在它的突变(CAMASCHELLA等，Nat.Genet.，25，14-15，2000)。
结果显示在图3。
图3的图例将20微克来自野生型小鼠和Usf2 -/-小鼠(从3到11个月大)的总的肝RNAs进行电泳并印迹。用32P标记的HFE(A)和RTf2(B)的探针(PCR制成，如材料和方法中所述)杂交印迹。
如图3A的Northern印迹所述，Usf2 -/-小鼠肝的HFE mRNA丰度与野生型小鼠的丰度相当。与野生型小鼠比较，Northern印迹分析也表明Usf2 -/-小鼠肝的RTf2基因的表达也没有改变(图3B)。
也测定了Usf2 -/-小鼠的铜蓝蛋白、血色素加氧酶I和转铁蛋白受体mRNA水平，因为已经报道在破坏铁平衡的疾病中这些mRNA丰度有所改变(综述见ANDREWS等，Nutr.Rev.，57，114-123，1999)。再次发现Usf2 -/-小鼠的这些mRNA水平与对照小鼠是相似的。
最后，分析了DMT1基因(也称为Nramp2)的表达，一种主要的跨膜铁摄取蛋白，它主动地将还原的膳食中的铁转运到肠的肠细胞中。利用RT-PCR(7Usf2 -/-对6对照小鼠)，通过半定量分析了十二指肠的DMT1基因的表达。在两组小鼠之间没有发现显著的统计学差异(没有显示)。
减数cDNA文库分析确证hepcidin为血色病假定的候选基因为了确定出Usf2 -/-小鼠中表达水平被改变的基因，建立了Usf2 -/-(驱动者)和野生型(测试者)小鼠肝之间的减数cDNA文库(DIATCHENKO，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，6025-6030，1996)。在分析的400个克隆中，利用反向Northern印迹(没有显示)分析发现Usf2-/-小鼠肝的一些克隆被下调。这些克隆中的一个克隆含有编码最近认识的肽hepcidin的全长cDNA(KRAUSE等，FEBS Lett.，480，147-150，2000；PARK等，J.Biol.Chem.，276，7806-7810，2001；PIGEON等，J.Biol.Chem.，276，7811-7819，2001)。
小鼠Usf2和hepcidin基因在第7号染色体上的组合小鼠基因组含有两个紧密相关的hepcidin基因，它们共同定位于相同的小鼠基因组克隆(Genbank clone，accession number AC020841)。这两个基因被PIGEON等(J.Biol.Chem.，276，7811-7819，2001)称为HEPC1和HEPC2。有趣的是，基因组CT7-8N15克隆也发现HEPC1基因在小鼠第7号染色体上的位置与Usf2基因位置非常接近。PIGEON等报告HEPC1是直接定位于Usf2基因的下游(PIGEON等，J.Biol.Chem.，276，7811-7819，2001)。通过分析另一个基因组克隆，RP23-22G9(Genbank，accession number AC087143)发现Usf2基因的部分(包括外显子8，9和10)也是重复的，事实上，HEPC1位于缩短的Usf2基因的下游。
Usf2和hepcidin基因的基因组组合显示在图4中。
图4的图例基因位点区域的图示(没有标尺)包括Usf2和hepcidin基因。靶等位基因表示为插入外显子7的betageo盒(VALLET等，J.Biol.Chem.，272，21944-21949，1997)。数据来自基因组RP23-22G9克隆(基因库)。至今为止，没有得到关于两个hepcidin基因之间的定位和距离的数据。图右侧的Southern印迹来自用BglII降解和用HEPC1探针杂交的野生型、杂合子和纯合子小鼠的尾部DNA。无论基因表型如何，都发现了两条预期大小的条带，12.4千碱基对和5.1千碱基对。用USF2探针发现了相同的条带。
HEPC2基因定位了功能完全的Usf2基因的下游，而HEPC1位于部分Usf2基因的下游。目前，没有得到关于HEPC1和HEPC2的5’-3’的相对定位和两者之间距离的信息。
因为Usf2基因和hepcidin基因位置相近，因此验证目标Usf2等位基因的外显子7的重组事件是否可以剔除或缩短HEPC1和HEPC2基因。为了证实这个假说，利用HEPC1探针(图4)对来自野生型，Usf2+/-或Usf2 -/-小鼠的基因组尾部DNA进行Southern印迹。用BglII降解基因组DNA。依照对AC087143位点的分析，预计该降解能生成两个5.1和12.4千碱基对片段，它们相应地含有HEPC1和HEPC2基因。因为HEPC1和HEPC2杂交区域之间的紧密相似性(大于95％)，预计HEPC1探针都能发现这两条带。结果如图4中Southern印迹所示。从来自Usf2 -/-小鼠的DNA中观察到了同样的结果，这提示hepcidin基因存在于Usf2 -/-小鼠中并且它们没有进行大的重组。最后，该两条带也和从外显子8延伸到外显子10的USF2探针杂交，说明USF2的外显子8到10的确是重复的。
Hepcidin基因在Usf2 -/-小鼠肝中是完全沉默的用Northern印迹分析测定hepcidin基因的表达水平。事实上，在Usf2 -/-小鼠肝中完全不能测到hepcidin mRNA(图5A)。值得注意的是，与野生型小鼠比较，Usf2 +/-小鼠肝含有较少的hepcidin mRNA。为了进一步评价HEPC1和HEPC2信使的特异水平，设计了HEPC1和HEPC2转录的特异引物。通过RT-PCR证实，两个基因在野生型小鼠肝中都被活跃地转录(图5B-C)，而在Usf2 -/-小鼠肝中完全缺失HEPC1和HEPC2基因的转录物(图5B-C)。
图5的图例(A)20微克来自野生型，Usf2 +/-和Usf2 -/-动物(3个月和11个月大之间)的总肝RNAs被电泳和印迹化。用32P标记的HEPC探针(按“材料和方法”描述的制备)杂交印迹，该探针最主要识别HEPC1和HEPC2转录物。(B)按材料和方法所描述的RT-PCR测定特异的HEPC1和HEPC2水平。PCR后，将扩增产物(171碱基对对HEPC1或HEPC2，及250碱基对对β-actin)在1.5％琼脂糖凝胶上用电泳分离。HEPC1或HEPC2的特异引物都不能重新扩增HEPC2和HEPC1产物，相应的，说明每对引物的高特异性(没有显示)。
HFE敲除小鼠和Usf2 -/-hepcidin缺失小鼠之间的铁代谢改变的相似性提示hepcidin可能作用于和HFE相同的调节途径。已经发现HFE主要和十二指肠粘膜的隐窝细胞的转铁蛋白受体相互作用(WAHEED等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，1579-1584，1999)。不被该理论所约束，可以假设这种相互作用调节了这些细胞内铁的水平，这反过来调节了微绒毛顶部成熟细胞的顶端和基侧的转运蛋白(transporter)的表达。Hepcidin可能通过与HFE/beta2微球蛋白/转铁蛋白受体复合物的直接相互作用而影响HFE活性。相同地，hepcidin可能调节巨噬细胞内的铁储存。根据图6的模型所示，成熟HFE蛋白的存在和hepcidin表达的完全缺失可以造成肠道铁吸收的增加和巨噬细胞铁储存的减少。
在该模型中，hepcidin通过减少肠道细胞对铁的转运和通过促进巨噬细胞储存铁而预防铁的负荷过量。在Usf2 -/-小鼠，hepcidin的缺失可以造成肠道铁转运的增加和巨噬细胞铁储存的减少。
在这两种情况下，血浆铁克服了转铁蛋白饱和度，非转铁蛋白结合的铁聚集于不同的组织，包括心脏和胰腺。
依照hepcidin在铁稳态的预期作用，hepcidin的产生可能依赖于肝细胞的TFR2介导的转铁蛋白结合铁的摄取。这可以解释为什么TFR2缺失造成了一种人遗传性血色病，如果这种缺失导致了hepcidin分泌的减少，这反过来造成铁吸收的增加。通过测定TFR2缺失患者或TFR2敲除小鼠血浆的hepcidin可以验证这种假说。
实施例2过度表达hepcidin的转基因小鼠的特点方法转基因小鼠的生产用以下引物扩增小鼠的hepc1 cDNA的全长cDNA
5′-GGGGGATATCAGGCCTCTGCACAGCAGAACAGAAGG-3′(SEQ ID No.34)和5′-GGGGGATATCAGGCCTCTATGTTTTGCAACAGATACC-3′(SEQID No.35)。
两个引物都包含StuI位点(下划线部分)。
将hepc1 PCR片段引入到小鼠甲状腺转运蛋白(TTR)启动子(包括第一外显子，第一内含子和第二外显子的绝大多数)和SV40小-Tpoly(A)信号框之间。该构建体携带有3千碱基对的5’连接于帽位点的小鼠TTR DNA序列(YAN等，EMBO J.，9，869-879，1990)。通过降解将4.7千碱基对TTR-hepc1转基因从质粒序列中分离出来并用于生殖核的微注射。
PCR及Southern印迹的基因分型根据标准方法进行Southern印迹(SAMBROOK等，分子克隆，实验手册，第二版，冷泉港实验出版社1989)。从尾部制备基因组DNA如下从每只小鼠上切下一段5毫米长的尾巴，并放置于500μl降解混合物中(50mM Tris，pH8/100mM EDTA/100mM NaCl/1％SDS)。加入蛋白酶K(200μg)并在55℃降解过夜。加入500μl苯酚/氯仿/异表乙醇(1/24/25)直接萃取样品。涡旋和离心后，用等体积的异丙醇沉淀清亮的水相。对于southern印迹，用BamHI降解DNA，该BamHI切割转基因两次。电泳后，将DNA转移到尼龙膜上(Hybond-N+，Amersham)。探针针对于来自以往描述的TTR质粒的1.7千碱基对BglII-HindIII片段(YAN等，EMBO J.，9，869-878，1990)。利用商业可获得的试剂盒(DNA标记系统，Gibco)和dCTP32P的随机引物标记探针。5.3千碱基对标记的片段对应于内源的TTR基因，而4.7千碱基对标记的片段对应于转基因。
对于PCR反应，将基因组DNA(0.5-1μg)用于25μl反应物，该反应物包括两种引物利用引物扩增TTR-hepc1转基因
-5′-CTTTTTGCACCATGCACCTTTC-3′(SEQ ID No.36；退火于TTR的第一内含子)和-5′-AACAGATACCACACTGGGAA-3′(SEQ ID No.37；退火于hepc1cDNA)。
如下进行PCR反应25个循环(每个循环包括94℃40秒，50℃40秒及72℃40秒)和94℃初始变性步骤4分钟及72℃终末延伸步骤5分钟，反应含有20mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，0.05％W-I，2mMMgCl2，0.2mM每种dNTP，0.2μM每种引物，2单位Taq聚合酶(Gibco)。用相同大小的非特异片段扩增612碱基对特异性产物。用10单位StuI降解PCR产物2个小时产生268碱基对和344碱基对片段后提示转基因的存在。在含有溴化乙锭的1.5-2％琼脂糖凝胶上分析反应物。非特异片段的扩增确认转基因的缺失不能归结于基因组DNA的缺失或降解。发现用于小鼠基因分型的该PCR方法给出了和Southern印迹法一样的结果。
结果TTR-hepc1转基因小鼠的特点总共9只独立的转基因首建小鼠(transgenic founder mice)都用经典的线性构建体的微注射方法生成。
图7A图示了该构建体。
图7B显示了不同首建小鼠的Southern印迹。
三只转基因首建小鼠(TH27，TH37和TH52)与它们的野生型同窝生小鼠无区别。三只转基因首建小鼠在出生时皮肤苍白并在出生后几个小时内死亡(bb2，3和5)。最后，剩余的三只转基因首建小鼠的表型是显而易见的(TH5，35，和44)它们全身无毛以及皮肤是皱褶的)。在这些动物上进行血涂片，在有着皱褶皮肤的三只小鼠上发现了严重的异形红细胞(poikylocytosis)和低血红蛋白的证据。
上述实施例突出表明了hepcidin做为铁稳态的关键调节物的作用。预计hepcidin是一种新的候选基因，当它突变时，能参与铁代谢的异常调节和HH的发生。最后，上述的新的铁负荷过量疾病的小鼠模型表明是一种测试预防和纠正HH的铁储存的新的治疗方法以及了解铁稳态的合适的动物模型。
序列表<110>国家健康与医学研究院<120>HEPCIDIN作为铁稳态调节剂的用途<130>MJPcb598-54<140>
<141>
<150>01401377.5<151>2001-05-25<160>37<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>PRT<213>智人<400>1Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met1 5 10 15Cys Cys Lys Thr20<210>2<211>22<212>PRT<213>智人<400>2Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys1 5 10 15Gly Met Cys Cys Lys Thr20<210>3<211>25<212>PRT<213>智人<400>3Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg1 5 10 15Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr20 25<210>4
<211>20<212>DNA<213>Mus sp.
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<400>5ggggtccacc acttcaagag g 21<210>6<211>20<212>DNA<213>Mus sp.
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<213>Mus sp.
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<400>35gggggatatc aggcctctat gttttgcaac agatacc 37<210>36<211>22<212>DNA<213>Mus sp.
<400>36ctttttgcac catgcacctt tc 22
<210>37<211>20<212>DNA<213>Mus sp.
<400>37aacagatacc acactgggaa20
权利要求
1.一种包含在第2，5，6，8，9，14，17和18位具有半胱氨酸残基的具有20个氨基酸、并与SEQ ID No.1具有至少50％的相同性或60％的相似性、优选地至少60％的相同性或至少70％的相似性的序列的多肽在制备用于减少铁负荷过量的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述多肽是来自脊椎动物的hepcidin的成熟形式。
3.权利要求2的用途，其中所述脊椎动物是哺乳动物。
4.权利要求1至3中任一项的用途，其中所述的药物用于预防和/或治疗血色病或由其导致的疾病。
5.权利要求4的用途，其中所述的疾病选自肝癌、心肌病或糖尿病。
6.hepcidin表达或hepcidin活性的抑制剂在制备用于增加铁吸收的药物中的用途。
7.权利要求6的用途，其中所述的药物用于治疗贫血或由其导致的疾病。
8.一种基因敲除的非人类动物，其中hepcidin基因已经被失活，不包括其中编码转录因子USF2的基因也被失活的基因敲除小鼠。
9.一种包含表达hepcidin的转基因的转基因非人类动物。
10.hepcidin基因已经被失活的基因敲除的非人类动物在筛选用于减少铁吸收的化合物中的用途。
11.权利要求9的转基因非人类动物在筛选能抑制hepcidin对铁吸收的作用的化合物中的用途。
12.一种检测铁吸收异常是否与hepcidin不正常产生相关的诊断方法，其中所述方法包含确定来自患有上述异常的研究对象的生物学样品中的hepcidin的量。
13.一种检测铁吸收异常是否与引起功能性hepcidin生成减少的突变相关的诊断方法，其中所述方法包含检测来自患有上述异常的研究对象的核酸样品中的hepcidin基因的突变。
全文摘要
本发明涉及将hepcidin用于诊断和治疗铁稳态疾病的用途，hepcidin能被用于治疗铁负荷过量引起的疾病，而hepcidin的抑制剂可用于治疗贫血。
文档编号A61K38/17GK1612746SQ02814815
公开日2005年5月4日 申请日期2002年5月24日 优先权日2001年5月25日
发明者格尔·尼古拉, 索菲·沃隆特, 阿克塞尔·卡恩 申请人:国家健康与医学研究院