专利名称：人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物制剂的制作方法
相关申请本发明要求在2001年9月7日提交的美国临时申请序列号60/318,173的优先权，其内容在此引入作为参考。
背景纤溶酶原激活物是一种丝氨酸蛋白酶，其将纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶再将血管中阻断血液流向重要器官的血栓降解。Collen，D.(1980)Thromb.Haemost.4377-89。因此，纤溶酶原激活物可以用于预防或治疗其中需要通过纤溶酶原激活产生局部纤维蛋白溶解活性的疾病。该疾病包括中风，静脉血栓形成，肺栓塞，或深静脉和外周动脉阻塞。参见Bang，N.U.(1989)Circulation 791391-1392。
概述一方面，本发明涉及无水的不含精氨酸的制剂，其包括人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物；赖氨酸；磷酸；和非离子洗涤剂。在该制剂中，人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物，赖氨酸，磷酸，和非离子洗涤剂的量分别为10-60mg(例如15-50mg或30-40mg)，100-700mg(例如150-500mg或200-350mg)，20-100mg(例如30-80mg或40-60mg)，和0.2-5mg(例如0.3-3mg或0.4-0.8mg)；或者为相同相对比率的量。本发明的一种制剂包括人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物，赖氨酸，磷酸，和非离子洗涤剂，量分别为35mg，200mg，50mg，和0.5mg；或者为相同相对比率的量。非离子洗涤剂可以是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯或失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
在另一方面，本发明涉及无水的不含精氨酸的制剂，其包括5-20％(例如8-16％或10-14％)重量的人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物和55-85％(例如60-80％或65-75％)重量的赖氨酸。该制剂可另外包括15-20％重量的磷酸，和0.15-0.2％重量的非离子洗涤剂。
人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物是人组织纤溶酶原激活物和人尿激酶纤溶酶原激活物的杂合蛋白。它可以通过重组细胞培养系统生产。该杂合蛋白的氨基酸序列在美国专利4,997,766，4,916,071，5,045,315，和5,047,241中公开。术语“人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物”包括刚才所述的杂合蛋白的等价物，其具有至少80％(例如90％，95％或99％)的百分比同一性，并且具有基本上相同的纤维蛋白溶解活性(±10％)。使用如在Karlin和Altschul(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877)中改进的Karlin和Altschul的算法(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268)确定两个氨基酸序列的“百分比同一性”。该算法被结合到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(1990，J.Mol.Biol.215403-410)。用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12进行核苷酸搜索。用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质搜索。在两个序列间存在缺口处，如在Altschul等(1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)所述使用有间隙的BLAST(Gapped BLAST)。当使用BLAST和有间隙的BLAST程序时，使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov/。
本文使用的术语“赖氨酸”指D-或L-形式的赖氨酸。为了保持电中性，用来自磷酸的磷酸盐(即平衡离子)平衡本发明制剂中的赖氨酸。可以使用其它适当的平衡离子(例如乙酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，硫酸盐，或碳酸盐)。
本发明的其它特征，目的，和优势将从下列描述和权利要求中变得明显。
详细描述人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物是人组织纤溶酶原激活物和人尿激酶纤溶酶原激活物，在人中发现的两类纤溶酶原激活物的杂合蛋白。关于人组织纤溶酶原激活物和人尿激酶纤溶酶原激活物的DNA和氨基酸序列，参见Pennica等(1983)Nature 301214；Ny等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815355；和Verde等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814727。两种纤溶酶原激活物都与血纤蛋白结合并作用在血栓位点。与人组织纤溶酶原激活物或人尿激酶纤溶酶原相比，杂合蛋白还是纤维蛋白溶酶活性的并提供增加稳定性，增加的对血纤蛋白的亲和力，和改善的体内半衰期的优势。参见美国专利4,997,766，4,916,071，5,045,315，和5,047,241。不含精氨酸的本发明的制剂意外地保持人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的这些性能。
通过本领域已知的方法可以制备人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物。更具体地，使用如美国专利4,997,766，4,916,071，5,045,315，和5,047,241所述的重组DNA技术从培养的转化细胞系中可以获得它。然后通过柱层析或其它技术可以纯化人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物。通过任何适当的方法，例如柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳，高压液相色谱分析，或纤维蛋白溶解活性的分析可以容易地测量纯度。
通过在缓冲液交换方法(例如凝胶过滤或透析)中使用刚才所述的人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物和冻干包含人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的溶液可以制备本发明的制剂。在缓冲液交换方法中可以使用的缓冲液(即制剂缓冲液)包括0.1-0.7M的赖氨酸(例如0.15-0.5M，或0.2-0.35M)。缓冲液的pH值为6.5-7.5。另外，缓冲液包括一种或多种非离子洗涤剂，如失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯或失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，量为0.001％至1％。在缓冲液交换例如透析以后，可以将包含人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的溶液转移至细颈瓶中并冻干成贮存形式。使用对于本领域技术人员众所周知的方法和设备可以进行包含人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的溶液的冻干，或冷冻干燥。
用于实施本发明的人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的纤维蛋白溶解活性是30,000-38,000IU/mg，例如36,000IU/mg。通过例如在美国专利4,777,043中描述的方法可以测定人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的纤维蛋白溶解活性。本发明的无水制剂包括药物有效量的人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物。药物有效量指向治疗的患者提供治疗效果的人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的量，如10-60mg。如本领域的技术人员公认，取决于赋形剂的使用，给药途径，和与其它治疗疗法共使用的可能性有效量也将变化。
使用常规方法可以将本发明的无水制剂向患者给药。通过各种注射或输注技术可以经肠胃外途径给药。无论如何，将无水制剂溶解在适当的水性溶剂中，例如注射用水。需要适当体积的水性溶剂(例如5mL或10mL的注射用水)溶解无水制剂中的所有成分。作为制备适当剂型的实例，将10mL注射用水加至包含35mg人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物，200mg赖氨酸，50mg磷酸，和0.5mg失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯的小瓶中，从而重建包含人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的溶液。优选地，在用10mL注射用水重建后立即将无水制剂用于单次静脉内bolus给药。
没有另外的详述，认为上述描述已经足够实现本发明。因此下列具体的实施方案被认为仅仅是例证性的，无论如何不是以任何方式限制本公开的剩余。本文引用的所有出版物，包括专利，其全部内容由此通过参考被结合。
无水制剂的制备如在例如美国专利4,916,071所述获得转化的C127杂合人组织类型尿激酶纤溶酶原激活物-生产细胞系。在补充胎牛血清(10％)，谷氨酰胺(4mM)，和庆大霉素(50μg/mL)的DMEM∶F12(1∶1)生长培养基(GIBCO/BRL)中维持细胞。在湿润的37℃，5％CO2恒温箱中将细胞培养物温育1天。然后收集细胞并用10mL磷酸盐缓冲的盐水(PBS)缓冲液洗涤。加入4mL包含胰蛋白酶-EDTA的溶液以脱离细胞，并将细胞转移至5mL生长培养基。在转速为0.5rpm的滚桶上在37℃下温育获得的细胞培养物。2天后，用包含抑酶肽(10KIU/mL)的新鲜DMEM∶F12(1∶1)生长培养基替换培养液，保留包含人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的培养液。连续地，每2天重复替换。合并条件培养基(conditionmedium)并通过3.0和0.22μm滤器顺序过滤。
将滤液加样到螯合锌的-Sepharose柱(Pharmacia，5.0cm×7.5cm)。用150mL PBS/TW缓冲液(0.02M磷酸钠，0.15M NaCl，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.4)和600mL PB缓冲液(0.02M磷酸钠，0.3M NaCl，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.4)洗涤后，用洗脱缓冲液(0.02M磷酸钠，0.3M NaCl，0.05M咪唑，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.4)洗脱柱。收集并合并包含人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的级分。将合并的级分加样到L-赖氨酸Sepharose柱(1.5cm×20cm)。在用35mL PB缓冲液和250mL洗涤缓冲液(0.05M Tris-HCl，0.3M NaCl，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.5)洗涤后，用另外的洗脱缓冲液(0.05M Tris-HCl，0.5M L-精氨酸，0.3M NaCl，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.5)洗脱柱。获得在缓冲液中的纯化的人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物。所有上述步骤在5-8℃下进行。
将0.5mL缓冲液中纯化的人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物加样在透析膜(Spectrum)中，将膜放置在包含0.5L制剂缓冲液(0.2M赖氨酸，0.1M磷酸，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯，pH7.1)的透析液储存器中。在4℃下进行透析18小时，在用1L新鲜缓冲液替换制剂缓冲液后继续18小时，然后在供给另外1L新鲜缓冲液后另外进行16小时。从膜上去除，获得包含人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物的水溶液并冻干以生产无水制剂。
测定人组织尿激酶纤溶酶原激活物的活性使用人组织纤溶酶原激活物(购自NIBSC组织，标记为组织纤溶酶原激活物，人，重组体，第三国际标准98/714)作为标准物，通过平板纤维蛋白溶解作用测定方法进行人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物活性的测量。通过国际合作研究测定标准物的效价并且发现为10,000IU/安瓿。用5mL PBS缓冲液稀释15μL凝血酶溶液(0.5U/μL)，并与5mL包含纤溶酶原(10U)的PBS缓冲液混合。将4.5mL混合溶液和4.5mL血纤蛋白原溶液加到9mL 1％的48℃等分琼脂糖中。搅拌如此获得的混合物并倒在90×90mm2平板上。在冷却的平板上打3mm的孔以制备孔。使用用PBS缓冲液(0.1mg/mL牛血清清蛋白，0.01％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯)的标准人组织纤溶酶原激活物的连续稀释。将如上所述获得的在制剂缓冲液中人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物样品的10μL样品，和标准人组织纤溶酶原激活物稀释物加样到孔上，在室温下温育20-24小时。对于每个样品测量纤维蛋白的亮区直径。对于标准人组织纤溶酶原激活物稀释物，将区域直径对稀释物的活性单位作图，获得标准曲线。对于人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物，将区域直径用来测定人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物样品的活性。
其它实施方案本说明书中公开的所有特征可以以任何结合的形式结合。本说明书中公开的每个特征可以被备选的用于相同，等价，或类似目的的特征所替代。因此，除非特别另外声明，公开的每个特征只是一般系列的等价或类似特征中的实例。
从上述描述，本领域的技术人员可以容易地确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下可以进行本发明的各种变化和修改以使它适合于各种用途和情形。例如，可以将具有相同官能团和pKa的赖氨酸取代物用于制剂中来实施本发明。因此，其它实施方案也在权利要求的范围内。
权利要求
1.一种无水的不含精氨酸的制剂，其包含人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物；赖氨酸；磷酸；和非离子洗涤剂；其中所述人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物，赖氨酸，磷酸，和非离子洗涤剂的量分别为10-60mg，100-700mg，20-100mg，和0.2-5mg；或者为相同相对比率的量。
2.权利要求1的制剂，其中所述人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物，赖氨酸，磷酸，和非离子洗涤剂的量分别为15-50mg，150-500mg，30-80mg，和0.3-3mg；或者为相同相对比率的量。
3.权利要求2的制剂，其中所述非离子洗涤剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。
4.权利要求2的制剂，其中所述非离子洗涤剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
5.权利要求1的制剂，其中所述人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物，赖氨酸，磷酸，和非离子洗涤剂的量分别为30-40mg，200-350mg，40-60mg，和0.4-0.8mg；或者为相同相对比率的量。
6.权利要求5的制剂，其中所述非离子洗涤剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。
7.权利要求5的制剂，其中所述非离子洗涤剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
8.权利要求1的制剂，其中所述人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物，赖氨酸，磷酸，和非离子洗涤剂的量分别为35mg，200mg，50mg，和0.5mg；或者为相同相对比率的量。
9.权利要求8的制剂，其中所述非离子洗涤剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。
10.权利要求8的制剂，其中所述非离子洗涤剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
11.权利要求1的制剂，其中所述非离子洗涤剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。
12.权利要求1的制剂，其中所述非离子洗涤剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯。
13.一种无水的不含精氨酸的制剂，其包含5-20％重量的人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物和55-85％重量的赖氨酸。
14.权利要求13的制剂，其中所述制剂包含8-16％重量的人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物和60-80％重量的赖氨酸。
15.权利要求14的制剂，其另外包含15-20％重量的磷酸。
16.权利要求15的制剂，其另外包含0.15-0.2％重量的非离子洗涤剂。
17.权利要求14的制剂，其另外包含0.15-0.2％重量的非离子洗涤剂。
18.权利要求13的制剂，其中所述制剂包含10-14％重量人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物和65-75％重量赖氨酸。
19.权利要求18的制剂，其另外包含15-20％重量的磷酸。
20.权利要求19的制剂，其另外包含0.15-0.2％重量的非离子洗涤剂。
21.权利要求18的制剂，其另外包含0.15-0.2％重量的非离子洗涤剂。
22.权利要求13的制剂，其另外包含15-20％重量的磷酸。
23.权利要求22的制剂，其另外包含0.15-0.2％重量的非离子洗涤剂。
24.权利要求13的制剂，其另外包含0.15-0.2％重量的非离子洗涤剂。
全文摘要
本发明涉及一种无水的不含精氨酸的制剂，其包括人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物，赖氨酸，磷酸，和非离子洗涤剂，其中人组织尿激酶类型纤溶酶原激活物，赖氨酸，磷酸，和非离子洗涤剂的量分别为10－60mg，100－700mg，20－100mg，和0.2－5mg；或者为相同相对比率的量。
文档编号A61K47/04GK1553811SQ02817532
公开日2004年12月8日 申请日期2002年9月5日 优先权日2001年9月7日
发明者洪伯文, 张学贤, 吴灿辉, 黄国魁 申请人:环球基因生物科技股份有限公司