专利名称：四环素衍生物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一类新的四环素衍生物、这些新衍生物的制备方法及这些衍生物的使用方法。
背景技术：
四环素化合物有如下通式结构 母核环系的编号如下 四环素以及其5-羟基(土霉素)和7-氯(金霉素)衍生物存在于自然界，是众所周知的抗生素。天然四环素可不失其抗生素性质而进行修饰，尽管必须保留结构中的某些元素。在Mitscher的“The Chemistry Of Tetracyclines，Chapter 6，Mrcel Dekker，Publishers，New York 1978)”一书中，已经阐述了在四环素的基本结构中哪些位置可以或不可以进行修饰。根据Mitscher的说法，四环素环系的5-9位的取代基进行修饰，可不失其抗生素性质。但在基本环系的1-4位及10-12位改变或被取代基代替，通常会导致合成的四环素实质上降低或失去抗微生物效果。一些化学修饰的无抗微生物效果的例子(以下称为CMT)有4-脱二甲氨基四环素，4-脱二甲氨基脱氧脱甲四环素(6-脱甲基-6-脱氧-4-脱二甲氨基四环素)，4-脱二甲氨基二甲氨四环素(7-二甲氨基-4-脱二甲氨基四环素)，及4-脱二甲氨基强力霉素(5-羟基-6-脱氧-4-脱二甲氨基四环素)。
一些4-脱二甲氨基四环素衍生物公开在美国专利Nos.3,029,284和5,122,519中，包括6-脱甲基-6-脱氧-4-脱二甲氨基四环素和5-羟基-6-脱氧-4-脱二甲氨基四环素，同时在D环的C-7位和C-9位有氢和其它取代基。这些取代基包括氨基，硝基，二(低级烷基)氨基和单(低级烷基)氨基或卤素。6-脱甲基-6-脱氧-4-脱二甲氨基四环素衍生物和5-羟基-6-脱氧-4-脱二甲氨基四环素衍生物据称可被用作抗菌剂。
其它在A环C4位带有一个肟基的4-脱二甲氨基四环素衍生物公开在美国专利Nos.3,622,627和3,824,285中。这些肟衍生物在C7位有氢和卤素作为取代基，包括7-卤-6-脱甲基-6-脱氧-4-脱二甲氨基-4-肟基四环素，以及7-卤-5-羟基-6-脱氧-4-脱二甲氨基-4-肟基四环素。
在4-脱二甲氨基四环素A环C4位取代了烷基氨基(NH-烷基)，以及烷基腙(N-NH-烷基)。这些化合物因为它们的抗菌活性而已知。参见美国专利Nos.3,345,370，3,609,188，3,622,627，3,502,660，3,509,184，3,502,696，3,515,731，3,265,732，5,122,519，3,849,493，3,772,363，以及3,829,453。
除了作为抗生素，四环素已被描述有许多其它用途，如已知四环素还有抑制胶原蛋白破坏酶的活性，如胞间质金属蛋白酶(MMP)，包括胶原蛋白酶(MMP-1)，白明胶酶(MMP-2)和溶基质素(MMP-3)。Golub等，J.Periodotit.Res.2012-23(1985)；Golub等，Crit.Revs.OralBiol.Med.2297-322(1991)；美国专利Nos.4,666,897；4,704,383；4,935,411；4,935,412。此外，已知四环素可以抑制哺乳动物骨骼肌消耗和蛋白降解，美国专利No.5,045,538，并能增强哺乳动物细胞白介素-10的产生。
而且，在美国专利No.Re.34,656中，四环素被报道可增强骨蛋白合成，在美国专利No.4,704,383中报道四环素在组织培养中有减少骨吸收的作用。
同样地，Golub等的美国专利No.5,532,227公开了四环素类可以改善蛋白质过多的糖基化作用。特别是，四环素类抑制由糖尿病人过量的胶原糖基化作用引起的过量胶原交联。
美国专利No.5,532,227公开了已知在发炎的情况下，如发生牛皮癣时，四环素类抑制过量磷脂酶A2活性。另外，已知四环素类还抑制环氧酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、氧化氮和IL-1(白细胞介素-1)。
这些性质使四环素用于治疗许多疾病。例如对四环素类包括非抗微生物药的四环素类在内的用途有许多建议，可以有效治疗关节炎。例如，greenwald等的文章中提到，“四环素类抑制反应性关节炎金属蛋白酶活性，且与氟比洛芬共同使用可改善骨损害”(JournalOfRheumatology 19927-938(1992))；Greenwald等认为，″与MMP抑制剂共用可治疗毁灭性的关节炎；在基质金属蛋白酶的抑制中，四环素类起着重要作用“(Therapeutic Potential，AnnalsOf the New York AcademyOf Sciences 732181-198(1994))；Kloppenburg等，Minocycline in Active RheumatoidArthritis，Arthritis Rheum 37629-636(1994)；Ryan等的“二甲氨四环素在活动性变形性关节炎治疗中的作用”，Arthritis Rheum 37629-636(1994)；Ryan等，″四环素改善骨关节炎破裂”，CurrentOpinion in Rheumatology8238-247(1996)；O′Dell等，“二甲氨四环素或安慰剂治疗早期变形性关节炎”，ArthritisRheum 40842-848(1997)。
也有人建议用四环素类治疗皮疾病。例如white等，Lancet，Apr.29，p966(1989)报道说二甲胺四环素可有效治疗大疱型表皮松解症，该病是一种危急生命的皮肤病，被认为与胶原蛋白酶有关。
此外，也有研究建议四环素类和金属蛋白酶抑制剂可用于抑制肿瘤发展，DeClerck等，Annals N.Y.Acad.Sci.，732222-232(1994)，骨吸收，Rifkin等，Annals N.Y.Acad.Sci.，732165-180(1994)，血管生成，Maragoudakis等，Br.J.Pharmacol，111894-902(1994)，并且可能具有抗炎的性质，Ramamurthy等，Annals N.Y.Acad.Sci，732，427-430(1994)。
综上所述，四环素类已经被认为能有效治疗许多疾病和病症。所以，需要有新的而且甚至更多有用的衍生物。
发明内容
在此公开的化合物是四环素的衍生物，均显示出抗菌和/或抗癌活性。
在一个优选方案中，本发明涉及一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，包括如下通式
其中R选自CH2N(RaRb)或 RaRb是C1～C6烷基；Rc和Rd是(CH2)nCHRe，n是0或1，且Re是H，C1～C6烷基，或NH2，以及X是NH，S，或CH2；R1是H或OH；R2是H，OH，＝0，或OCOR8，其中R8是C1～C6烷基，或可选择的，R2是N(R9)2，其中R9是氢或C1～C6低级烷基，或R9CO，条件是当R2是羰基或N(R9)2时，R3和R4是H或CH3，R3和R4不能同时是CH3或同时是H；5a氢是α或β；R3和R4是H，CH3或F，条件是当R3是CH3时，R4是H或F，当R4是CH3时，R3是H或F，R4和R5不能同时是F；R5和R7是卤素，H，NO2，N3，N2+，C2H5OC(S)S-，CN，NR10R11，其中R10和R11是H，C1～C10烷基，R12(CH2)nCO-，其中n是0～5，且R9是H，NH2，选自直链、支链或环状C1～C10烷基的单或二取代氨基，条件是R10和R11不能同时是R12(CH2)nCO-；可选择的，R7是叔丁基；R6是卤素、乙炔、R13-C6H5，其中R13是NO2，卤素，乙酰氨基，氨基，苯基，烷基或烷氧基。
在另一个优选方案中，本发明涉及一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，包括如下通式
其中R选自CH2N(RaRb)或 式中，RaRb是C1～C6烷基；Rc和Rd是(CH2)nCHRe，n是0或1且Re是H，C1～C6烷基，或NH2，X是NH，S，或CH2；R1是H或OH；R2是H或OH；R3是H或CH3；R4和R6是卤素，H，NO2，N3，N2+，C2H5OC(S)S-，CN，NR7R8，其中R7和R8是H，C1～C10烷基，R9(CH2)nCO-，其中n是0～5，且R9是H，NH2，选自直链、支链或环状C1-C10烷基的单或二取代氨基，条件是R7和R8不能同时是R9(CH2)nCO-；且R6是H或卤素，乙炔，R10-C6H5，其中R10是NO2，卤素，乙酰氨基，氨基，苯基，烷基，或烷氧基。
在另一个优选方案中，本发明涉及一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，包括如下通式 其中R选自CH2N(RaRb)或 式中，RaRb是C1～C6烷基；Rc和Rd是(CH2)nCHRe，n是0或1，且Re是H，C1～C6烷基，或NH2，X是NH，S，或CH2；R1，R2是H或N(R9)2，其中R9是H或C1～C6烷基，条件是R1和R2不能同时是N(R9)2，R1，R2还可以是N(R10)3I，其中R10是C1～C6烷基，条件是R1，R2不能同时是N(R10)3I；R3是H；R4和R5是H，CH3或F，条件是当R4是CH3时，R5是H或F，当R5是CH3时，R4是H或F，且R4和R5不能同时是F；R6和R8是卤素，H，NO2，N3，N2+，C2H5OC(S)S-，CN，N R11R12，其中R11和R12是H，C1～C10烷基，R13(CH2)nCO-，其中n是0～5，R13是H，NH2，选自直链、支链或环状C1～C10烷基的单或二取代氨基，条件是R10和R11不能同时是R12(CH2)nCO-；R8还可以是叔丁基，R7是H或卤素。
在又一个优选方案中，本发明涉及一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，包括如下通式 其中R选自CH2N(RaRb)或 Ra Rb是C1～C6；Rc和Rd是(CH2)nCHRe，n是0或1，Re是H，烷基(C1～C6)，NH2，X是NH，S，或CH2；R1，R2是H或N(R9)2式中，R9是氢或低级烷基(C1～C6)，条件是R1和R2均不可以是N(R9)2。R3是H，OH，＝O，OCO R10，其中R10是C1～C6，或可选择的，R3是N(R9)2式中，R9是氢或C1～C6，条件是当R23是＝O或N(R9)2时，R4和R5是H或CH3，且R4和R5不能同时是CH3或H；5a氢是α或β；R4和R5是H，CH3或F，条件是当R4是CH3时，R5是H或F，当R5是CH3时，R4是H或F，且R4和R5不能同时是F；
R6和R4是卤素，H，NO2，N3，N2+，C2H5OC(S)S-，CN，NR10R11，其中R10和R11是H，烷基(C1～C10)，R12(CH2)nCO-，其中n是0～5，R12是H，NH2，选自直链、支链或环状C1～C10烷基的单或二取代氨基，条件是R10和R11均为R12(CH2)nCO-，或者，可选择的，R8是叔丁基；R7是H或卤素，乙炔，R12-C6H5，其中R12是NO2，卤素，乙酰氨基，氨基，苯基，烷基，或烷氧基。
在另一个优选方案中，本发明涉及一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，包括如下通式 其中R1是H或N(CH3)2；R2是H，CH3或OCOCH3；R3是H或CH3；R4是H；R5是H，N(CH3)2，NH2，N(C4H9)2，N(C6H13)2，N(3，3-二甲基丁基)2，N3，N2+，NO2，NHCOCH3，NH(n-丙基)2，NH-异丁基，NH-异丁基甲基，NH(环丁基)，NH(环丁基甲基)；R6是H，NO2，NH2，(CH3)2CHNH，N3，NHCOCH3，N2+，N3或(CH3)3C。
在另一个优选方案中，本发明涉及一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，包括如下通式 其中R1是H或N(CH3)2；R2是H，OH或OCOCH3；R3是H或CH3；R4是H；R5是H，N(CH3)2；N(C4H9)2，N(C6H13)2，N(3，3-二甲基丁基)2；N3，N2+，NO2，NHCOCH3，NH(n-丙基)2，NH-异丁基，NH-异丁基甲基，N(CH3CO)(异丁基)，NH(环丁基)，NH(环丁基甲基)，或NH2；R6是H，NO2，NH2，(CH3)2CHNH，N3，NHCOCH3，N2+或(CH3)3C。
以下实施例描述了本发明各种物质的制备。
HPLC分析用Waters反相层析C18-对称柱，使用含0.1％TFA的水和乙腈作为洗脱剂。
分析LC/MS用配备系列1100MSD检测器的Hewlett Packard Series1100液相色谱仪进行，并带有ES电离模式及于270nm的紫外检测，用4.6×100mm柱，流速是0.4ml/min。制备HPLC用Gilson系列HPLC，并带有270nm紫外检测，用19×150mm柱，流速是15ml/min，1H NMR用Bruker 300MHz核磁仪在氘代甲醇中进行。
9-硝基-强力霉素硫酸盐搅拌下，在0℃向盐酸强力霉素(1g，2.08mmol)在30ml浓硫酸的溶液中，加硝酸钾(252mg，2.49mmol)。产生的混合物在0℃搅拌20分钟，然后在搅拌下注入1.2L冷乙醚。滤出沉淀的固体，用冷的醚洗涤，并在真空中干燥，得到1.22g米色的产物。如需要，将产物溶于甲醇进行纯化，过滤并将滤液倾入乙醚，滤出固体进行干燥。
9-氨基-强力霉素硫酸盐向9-硝基-强力霉素硫酸盐(1g，1.7mmol)在35ml乙二醇一甲基醚和5ml甲醇的溶液中，搅拌下加入700mg 10％Pd/C。反应混合物在常压下氢化6小时。用硅藻土滤去催化剂，用甲醇洗。浓缩滤液，然后搅拌下滴加至800ml冷乙醚中。滤去分离出的固体，用冷乙醚洗涤，并真空干燥，得到843mg米色的产物。
9-异丙基氨基-强力霉素硫酸盐向搅拌的9-氨基-强力霉素硫酸盐(100mg，0.18mmol)在10ml乙二醇一甲基醚的溶液中，加入0.05ml浓硫酸，0.5ml丙酮和100mg 10％Pd/C。产生的混合物在大气压下氢化1小时15分钟，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩滤液，然后搅拌下倾入150ml冷乙醚中。滤出沉淀的固体，用冷乙醚洗涤，并真空干燥，得到109mg米色的产物。将产物溶于甲醇进行纯化，过滤并将滤液倾入乙醚。滤出形成的固体并进行干燥。
9-乙酰氨基强力霉素硫酸盐搅拌下，向9-氨基-强力霉素硫酸盐(72mg，0.13mmol)在1.5ml 1，3-二甲基-2-咪唑并烷酮的溶液中加入70mg碳酸氢钠，再加入0.05ml乙酰氯化物。混合物在室温下搅拌1小时，然后过滤。浓缩滤液，并在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出沉淀的固体，用冷的乙醚洗涤，并真空干燥，得到92mg产物。
9-重氮-强力霉素硫酸盐盐酸盐搅拌下，向冷却在冰浴中的9-氨基-强力霉素硫酸盐(300mg，0.54mmol)在9ml 0.1N盐酸的甲醇溶液内，加入0.3ml正丁基亚硝酸酯。溶液在0℃搅拌30分钟，然后搅拌下倾入300ml冷乙醚中。滤出沉淀的固体，并真空干燥，得到256mg橙棕色产物。
9-叠氮基强力霉素硫酸盐搅拌下，向9-重氮-强力霉素硫酸盐盐酸盐(80mg，0.14mmol)在4.5ml 0.1N盐酸在甲醇中的溶液中，加入10mg叠氮化钠。溶液在室温下搅拌2小时，然后搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出沉淀的固体，并真空干燥，得到43mg产物。
9-(4-氟苯基)-强力霉素向9-重氮-强力霉素硫酸盐盐酸盐(358mg，0.59mmol)和4-氟苯基硼酸(107mg，0.76mmol)在4ml甲醇的溶液中，加入18mg醋酸钯(II)，产生的混合物在室温下搅拌16小时。滤去催化剂，浓缩残余物，用制备高效液相层析法纯化。从高效液相层析收集的部分进行浓缩，并倾入20ml冷乙醚中。滤出固体，真空干燥，得到32mg产物。
7-[1，2-双(苄氧羰基)肼基]-强力霉素搅拌下，向强力霉素盐酸盐(300mg，0.62mmol)在2.5ml四氢呋喃和3.2ml甲磺酸的溶液中，在0℃下加入230mg二苄偶氮二羧酸酯(dibenzyazodicarboxylate)。产生的混合物在0℃搅拌2小时，然后倾入400ml冷乙醚中。滤出固体，真空干燥，得到479mg灰白色产物。
7-氨基-强力霉素向7-[1，2-双(苄氧羰基)肼基]强力霉素(478mg)在30ml乙二醇一甲基醚的溶液中，加入200mg 10％ Pd/C，产生的混合物在室温下氢化3小时。用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤，将滤液浓缩，并倾入500ml冷乙醚中。滤出分离出的固体，并真空干燥，得到268mg产物。
7-二甲氨基-强力霉素硫酸盐向7-氨基-强力霉素(100mg)在8ml乙二醇一甲基乙醚的溶液中，加入1ml 37％含水甲醛溶液，0.05ml浓硫酸和100mg 10％ Pd/C。产生的混合物在大气压下氢化6小时，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩残余物，并在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。分离出的固体因为粘性很强，进行很困难的过滤。然后立即将该固体再溶解在甲醇中，并在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到89mg产物。
7-二丙基-强力霉素硫酸盐向7-氨基-强力霉素(90mg)在8ml乙二醇一甲基乙醚的溶液中，加入0.5ml丙醛，0.05ml浓硫酸和80mg 10％ Pd/C。产生的混合物在大气压下氢化5小时，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩残余物，并在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到415mg产物。
7-二丁基氨基-强力霉素硫酸盐向7-氨基-强力霉素(100mg，0.2mmol)在6ml乙二醇一甲基乙醚的溶液中，加入0.6ml丁醛，0.05ml浓硫酸和100mg 10％ Pd/C。产生的混合物在大气压下氢化4小时，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩残余物，并在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到103mg产物。
7-二(3，3-二甲基)丁基氨基-强力霉素硫酸盐向7-氨基-强力霉素(100mg，0.2mmol)在6ml乙二醇一甲基乙醚的溶液中，加入0.5ml 3，3-二甲基丁醛，0.05ml浓硫酸和100mg 10％ Pd/C。产生的混合物在大气压下氢化4小时，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩残余物，并在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到122mg产物。
7-二己基氨基-强力霉素硫酸盐向7-氨基-强力霉素(100mg，0.2mmol)在6ml乙二醇一甲基乙醚的溶液中，加入0.6ml己醛，0.05ml浓硫酸和100mg 10％ Pd/C。产生的混合物在大气压下氢化4小时，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩残余物，并在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到129mg产物。
7-异丙基氨基-强力霉素硫酸盐向7-氨基-强力霉素(90mg，0.2mmol)在8ml乙二醇一甲基乙醚的溶液中，加入0.5ml异丁醛，0.05ml浓硫酸和90mg 10％ Pd/C。产生的混合物在大气压下氢化6小时，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩残余物，并在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到142mg产物。
7-甲基-7-异丙基氨基-强力霉素硫酸盐向7-异丙基氨基-强力霉素(60mg)在4ml乙二醇一甲基乙醚的溶液中，加入0.4ml37％甲醛水溶液，0.05ml浓硫酸和50mg 10％ Pd/C。产生的混合物在大气压下氢化2小时，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩残余物，并在搅拌下倾入80ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到52mg产物。
7-环丁基氨基-强力霉素硫酸盐向7-氨基-强力霉素(80mg)在7ml乙二醇一甲基乙醚的溶液中，加入0.3ml环丁酮，0.04ml浓硫酸和60mg 10％Pd/C。产生的混合物在大气压下氢化24小时，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩残余物，并在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到85mg产物。
7-甲基-7-环丁基氨基-强力霉素硫酸盐向7-环丁基氨基-强力霉素(40mg)在3.5ml乙二醇一甲基乙醚的溶液中，加入0.3ml 37％甲醛水溶液，0.03ml浓硫酸和40mg 10％ Pd/C。产生的混合物在大气压下氢化6小时，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩残余物，并在搅拌下倾入80ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到35mg产物。
7-乙酰氨基强力霉素硫酸盐搅拌下，向7-氨基-强力霉素(200mg)在3ml 1，3-二甲基-2-咪唑烷酮的溶液中，加入200mg碳酸氢钠，然后加入0.09ml乙酰氯化物。混合物在室温下搅拌1小时，然后过滤。浓缩滤液，并在搅拌下倾入200ml冷乙醚中。滤出沉淀的产物并真空干燥，获得202mg产物。
7-乙酰氨基-7-异丙基-强力霉素硫酸盐搅拌下，向7-异丁基氨基-强力霉素(60mg)在1.5ml 1，3-二甲基-2-咪唑烷酮的溶液中，加入60mg碳酸氢钠，然后加入0.05ml乙酰氯化物。混合物在室温下搅拌1小时30分钟，然后过滤。浓缩滤液，并在搅拌下倾入80ml冷乙醚中。滤出沉淀的产物并真空干燥。
7-重氮-强力霉素盐酸盐或四氟硼酸盐搅拌下，向冷却在冰浴中的7-氨基-强力霉素(200mg，0.4mmol)在4ml 0.1N盐酸的甲醇溶液内，加入0.2ml正丁基亚硝酸酯。溶液在0℃下搅拌30分钟，然后搅拌下倾入200ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到173mg产物。重氮四氟硼酸盐用四氟硼酸(54％乙醚溶液)制备，以代替盐酸。
7-叠氮-强力霉素搅拌下，向冷却在冰浴中的7-重氮-强力霉素盐酸盐(80mg，0.14mmol)在4.5ml 0.1N盐酸的甲醇溶液内，加入12mg叠氮化钠。溶液在0℃下搅拌2小时，然后搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出沉淀的固体，并真空干燥，得到43mg产物。
7-氨基-9-硝基-强力霉素硫酸盐搅拌下，向7-氨基-强力霉素(220g，0.44mmol)在4ml浓硫酸的溶液中，在0℃加入硝酸钾(52mg，0.51mmol)。产生的混合物在0℃下搅拌15分钟，然后搅拌下倾入300ml冷乙醚中。滤出分离的固体，用冷乙醚洗涤并真空干燥。将产物再溶解于甲醇中，过滤，将滤液倾入乙醚中。滤出分离出的固体，并真空干燥，得到222g产物。
7-二甲氨基-9-硝基-强力霉素硫酸盐搅拌下，向7-二甲氨基-强力霉素(40g，0.07mmol)在1.5ml浓硫酸的溶液中，在0℃加入硝酸钾(12mg，0.12mmol)。产生的混合物在0℃下搅拌30分钟，然后搅拌下倾入60ml冷乙醚中。滤出分离的固体，用冷乙醚洗涤并真空干燥。LC/MS显示，主要是一种有二个硝基的产物(可能是期望产物的一种硝酸酯)。
7-二甲氨基-9-重氮-强力霉素硫酸盐盐酸盐搅拌下，向冷却在冰浴中的7-二甲氨基-9-氨基-强力霉素(50mg)在1.5ml 0.1N盐酸的甲醇溶液内，加入0.05ml正丁基亚硝酸酯。溶液在0℃下搅拌30分钟，然后搅拌下倾入80ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到38mg产物。
7-乙酰氨基-9-硝基-强力霉素硫酸盐搅拌下，向7-乙酰氨基强力霉素(60g，0.095mmol)在2ml浓硫酸的溶液中，在0℃加入硝酸钾(11mg，0.11mmol)。产生的混合物在0℃下搅拌5分钟，然后搅拌下倾入80ml冷乙醚中。滤出分离的固体，用冷乙醚洗涤并真空干燥。
7-乙酰氨基9-氨基-强力霉素硫酸盐搅拌下，向7-乙酰氨基9-硝基-强力霉素硫酸盐(77mg，0.12mmol)在7ml乙二醇一甲基乙醚的溶液中，加入60mg 10％ Pd/C。反应混合物在常压下氢化7小时。
用硅藻土滤去催化剂，用甲醇洗。浓缩滤液，然后搅拌下滴加至100ml冷乙醚中。滤出沉淀的固体，用冷的醚洗涤，并真空干燥，得到62mg产物。
7-乙酰氨基-9-重氮-强力霉素硫酸盐盐酸盐搅拌下，向冷却在冰浴中的7-乙酰氨基-9-氨基-强力霉素(100mg)在3ml 0.1N盐酸甲醇溶液内，加入0.1ml正丁基亚硝酸酯。溶液在0℃下搅拌30分钟，然后搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到92mg产物。
7-乙酰氨基-9-叠氮-强力霉素硫酸盐搅拌下，向冷却的冰浴中的7-乙酰氨基-9-重氮-强力霉素(112mg，0.19mmol)在6ml0.1N盐酸甲醇溶液内，加入14mg(0.21mmol)叠氮化钠。溶液在0℃下搅拌35分钟，然后搅拌下倾入150ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到94mg产物。强力霉素甲碘化物将强力霉素游离碱(315mg)溶于2ml甲醇和10ml四氢呋喃中，然后加入1ml甲基碘。将反应混合物保持5天；未出现产物结晶。搅拌下将反应混合物倾入300ml冷乙醚，过滤分离出的产物，并真空干燥，得到269mg产物；LC/MS显示为纯品。
5-乙酸基-强力霉素将强力霉素(100mg)在3ml 30％氢溴酸的乙酸溶液在室温下搅拌3.5天；然后搅拌下将反应混合物倾入100ml冷乙醚，滤出分离出的产物。LC/MS显示起始物转化不完全，因此将产物(86mg)在同样反应条件再进行9小时，然后以同样方式分离。
9-叔丁基-强力霉素将强力霉素(100mg)在2ml叔丁醇和3ml甲磺酸的溶液在室温下搅拌18小时，然后倾入100ml冷水，并用正丁醇提取。用1N氢氧化钠溶液碱化有机提取物，并用浓盐酸将pH迅速地调节至6.5-7。滤出固体沉淀物，然后溶于甲醇，浓缩并在搅拌下滴加至30ml乙醚/PET乙醚冷溶液中。滤出分离的固体，用冷乙醚洗涤并真空干燥。
9-叔丁基-7-硝基-强力霉素在室温下搅拌强力霉素盐酸盐(2g)在10ml叔丁醇和30ml甲磺酸中的溶液3小时，然后加入500mg硝酸钾，产生的混合物再搅拌1小时。将反应混合物倾入100ml含23g氢氧化钠的冷水溶液中；然后再滴加氢氧化钠稀释液，至反应混合物成为碱性。用浓盐酸将pH迅速调节至6.5-7。滤除分离出的深色的胶状固体。
用正丁醇提取含水滤液一次，回收更多产物。将粗产物溶于小量的甲醇，用高效液相层析法纯化。将从高效液相层析中得到的部分合并，浓缩至干，溶于甲醇，并滴加至50ml 3∶1的乙醚/PET乙醚的混合物中。滤出沉淀的固体，得到788mg浅黄色产物。
9-叔-丁基-7-氨基-强力霉素向9-叔-丁基-7-强力霉素(500mg)在25ml乙二醇一甲基醚的溶液中，加入350mg10％Pd/C，产生的混合物在常压下氢化17小时。用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗。浓缩残余物，溶于四氢呋喃并在搅拌下滴加至1∶1的乙醚/PET的乙醚溶液中。滤出沉淀的产物，并真空干燥，得到452mg产物。
9-叔丁基-7-重氮-强力霉素向冷却在冰浴中的9-叔丁基-7-氨基-强力霉素(93mg，0.18mmol在2.5ml 0.1N盐酸甲醇溶液内，加入0.1ml正丁基亚硝酸酯。溶液是在0℃搅拌30分钟，然后搅拌下将一半倾入30ml 3∶1的乙醚/PET的乙醚冷混合物中。产物如胶状粘附在烧杯的底部。将其再溶解在甲醇中，并进行浓缩，将残余物倾入20ml冷乙醚中，立即滤出分离的固体，进行真空干燥；获得42mg产物。另一半反应混合物直接用于下述9-叔丁基物质。
9-叔丁基-7-叠氮-强力霉素搅拌下，在0℃向9-叔丁基-7-重氮-强力霉素反应混合物(1.5ml)中加入8mg(0.12mmol)叠氮化钠。使溶液升温至室温期间，搅拌3小时。浓缩反应混合物以后，搅拌下将残余物倾入冷的3∶1的乙醚/PET的乙醚混合物中。没有固体分离，因此将溶液浓缩至干，获得35mg产物。
9-叔丁基-7-二甲氨基-强力霉素搅拌下，向含167mg 9-叔丁基-7-氨基-强力霉素在10ml乙二醇一甲基乙醚中9-叔丁基-7-氨基-强力霉素和115mg 10％ Pd/C的反应混合物中，加入1.2ml 37％甲醛水溶液。产生的混合物在大气压下氢化3.5小时，然后用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗涤。浓缩滤液，并在搅拌下将残余物倾入10ml冷乙醚中。滤出分离的产物，用冷乙醚洗涤并真空干燥。LC/MS显示为所预期的产物，但被碱性杂质所污染。
9-叔丁基-7-乙酰氨基-强力霉素硫酸盐搅拌下，向9-叔丁基-7-氨基-强力霉素(100mg)在2ml 1，3-二甲基-2-咪唑烷酮的溶液中，加入100mg碳酸氢钠，然后加入0.07ml乙酰氯化物。将混合物在室温下搅拌1.5小时，然后过滤。浓缩滤液，并在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤除分离出的产物。将粗产物再溶于甲醇，过滤并在搅拌下滴加至冷的3∶1的乙醚/PET的乙醚混合物中。过滤收集产物，并真空干燥，得到76mg产物。
4-脱二甲氨基-强力霉素搅拌下，向四环素甲基碘化物(860mg)在12ml乙酸和12ml水的溶液中，加入432mg锌粉。搅拌15分钟后，滤出锌粉。滤液用86ml含0.86ml浓盐酸的水稀释。滤出分离的产物，并真空干燥，得到419mg产物。
4-脱二甲氨基-9-硝基-强力霉素搅拌下，在0℃向4-脱二甲氨基-强力霉素(402mg，1mmol)在20ml浓硫酸的溶液中，加入111mg硝酸钾。搅拌20分钟以后，反应混合物倾入100ml冷水中。将正丁醇加入此含产物的水中，分出有机层。用正丁醇重复提取两次。浓缩合并的有机提取物，搅拌下加入到冷水中。滤除分离出的产物。通过用正丁醇再提取含水滤液回收更多产物，浓缩，然后倾入冷水中，再过滤。真空干燥后，获得353mg产物。
4-脱二甲氨基-9-氨基-强力霉素向4-脱二甲氨基-9-硝基-强力霉素(353mg)在17ml乙二醇一甲基醚的溶液中，加入0.1ml浓硫酸和200mg 10％ Pd/C，产生的混合物在常压下氢化10小时。用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗。浓缩滤液，并倾入100ml乙醚中。滤出分离出的固体，并真空干燥，得到292mg产物。
4-脱二甲氨基-9-重氮-强力霉素盐酸盐搅拌下，向冷却在冰浴中的4-脱二甲氨基-9-氨基-强力霉素(220mg)在5ml 0.1N盐酸甲醇溶液内，加入0.2ml正丁基亚硝酸酯。溶液在0℃搅拌30分钟，然后搅拌下倾入150ml2∶1的乙醚/PET乙醚冷混合物中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到191mg产物。
4-脱二甲氨基-9-叠氮-强力霉素向冷却在冰浴中的4-脱二甲氨基-9-重氮-强力霉素(150mg，0.32mmol)在6.5ml 0.1N盐酸的甲醇溶液内，加入23mg叠氮化钠，产生的混合物在0℃搅拌1小时，然后在搅拌下倾入120ml冷乙醚中。一些固体形成，滤出后发现不是所期望的产物。将滤液浓缩至干，加在甲醇中，并在搅拌下倾入50ml冷水中。滤出分离的固体，并真空干燥。通过用正丁醇提取滤液，获得更多产物，浓缩，倾入水中，滤出固体，获得84mg产物。
4-脱二甲氨基-7-硝基-9-叔丁基-强力霉素在室温下搅拌4-脱二甲氨基-强力霉素(500mg 1.25mmol)在3ml叔丁醇和15ml甲磺酸的溶液15小时，然后加入140mg硝酸钾，产生的混合物再搅拌1小时。将反应混合物在搅拌下倾入200ml冷水。滤除分离出的固体并在空气中干燥。将粗产物溶于小量的甲醇，用高效液相层析法纯化。合并从高效液相层析中得到的部分，浓缩至干，溶于甲醇，并滴加至50ml冷水中。滤出分离的固体，真空干燥，得到217mg产物。
4-脱二甲氨基-7-氨基-9-叔丁基-强力霉素搅拌下，向4-脱二甲氨基-7-硝基-9-叔丁基强力霉素(217mg 0.42mmol)在12ml乙二醇一甲基醚的溶液中，加入170mg 10％ Pd/C，产生的混合物在常压下氢化13小时。用硅藻土滤除催化剂，用甲醇洗。浓缩滤液，倾入20 3∶1的乙醚/PET乙醚混合物，得到40mg产物。浓缩橙色滤液至干，另获得138mg产物。
4-脱二甲氨基-7-重氮-9-叔丁基-强力霉素搅拌下，向冷却在冰浴中的4-脱二甲氨基-7-氨基-9-叔丁基-强力霉素(165mg)在5ml0.1N盐酸甲醇溶液内，加入0.15ml正丁基亚硝酸酯。溶液在0℃搅拌30分钟；在搅拌下将其中一半倾入50ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到50mg产物。
4-脱二甲氨基-7-氨基-强力霉素搅拌下，在0℃向4-脱二甲氨基-强力霉素(400mg)在4ml四氢呋喃和4.5ml甲磺酸的溶液中，加入418mg(1.4mmol)二苄基偶氮二羧酸酯，将产生的混合物在温热到室温的同时搅拌4小时。加入水和正丁醇，分离出两相。水层用乙醚/正丁醇的混合物提取。将合并的有机提取物浓缩至干，然后加入10ml乙二醇一甲基乙醚。然后，加入430mg 10％ Pd/C，将产生的混合物在常压下氢化12小时。用硅藻土滤去催化剂，用甲醇洗。将滤液浓缩，搅拌下倾入3∶1乙醚/PET乙醚的冷混合物中；滤出分离的产物，并真空干燥，得到114mg产物。
9-硝基-二甲氨四环素硫酸盐搅拌下，在0℃向二甲氨四环素盐酸盐(1g，2.02mmol)在30ml浓硫酸中的溶液中，加入硝酸钾(246mg)。在0℃，将产生的混合物搅拌45分钟，然后搅拌下倾入1.2L冷乙醚中。滤出沉淀的固体，用冷的醚洗涤，并真空干燥，得到1.33g产物。
9-氨基-二甲氨四环素硫酸盐搅拌下，向9-硝基-二甲氨四环素硫酸盐(500g，0.83mmol)在10ml乙二醇一甲基乙醚和7ml甲醇的溶液中，加入250mg 10％Pd/C。反应混合物在大气压力下氢化4小时。用硅藻土滤去催化剂，用甲醇洗。滤液浓缩，然后在搅拌下滴加至600ml冷乙醚中。滤出沉淀的固体，用冷的醚洗涤，并真空干燥，得到465mg产物。
9-重氮-二甲氨四环素硫酸盐盐酸盐搅拌下，向冷却在冰浴中的9-氨基-二甲氨四环素硫酸盐(100mg)在3ml 0.1N盐酸甲醇的溶液内，加入0.1ml叔丁基亚硝酸盐(或正丁基亚硝酸酯)。溶液在0℃搅拌30分钟，然后然后在搅拌下倾入100ml冷乙醚中。滤出沉淀的固体，并真空干燥，得到87mg橙棕色产物。
9-叠氮-二甲氨四环素硫酸盐搅拌下，向9-重氮-二甲氨四环素硫酸盐盐酸盐(485mg，0.83mmol)在18ml 0.1 N盐酸的甲醇溶液中，加入59mg叠氮化钠。溶液在室温下搅拌2小时，然后过滤并在搅拌下将滤液倾入500ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到480mg米黄色产物。
9-乙酰氨基-二甲氨四环素搅拌下，向9-氨基-二甲氨四环素硫酸盐(100mg，0.175mmol)在1.5ml 1，3-二甲基-2-咪唑烷酮的溶液中，加入100mg碳酸氢钠，然后加入0.05ml乙酰氯化物。产生的混合物在室温下搅拌45分钟，然后搅拌下倾入150ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到165mg产物。
4-脱二甲氨基-二甲氨四环素将二甲氨四环素游离碱(175mg，0.38mmol)溶于2ml四氢呋喃，然后加入0.43ml甲基碘化物。没有结晶产物出现。浓缩反应混合物，并在搅拌下倾入200ml冷乙醚/PET乙醚(比例为40∶60)中。滤出分离的产物，并真空干燥。将产物重新置于同样的反应条件中，再进行反应3天。如前所述，从乙醚中析出沉淀物，获得123mg二甲氨四环素甲碘化物。将粗产物溶于2ml乙酸，搅拌下加入2ml水和60mg锌粉。搅拌15分钟后，滤出锌粉。滤液用15ml含浓盐酸的水稀释。合并的有机提取物用硫酸镁干燥并浓缩。滤出分离的固体，并真空干燥，得到150mg黄色产物。
4-脱二甲氨基-9-硝基-二甲氨四环素室温下，将4-脱二甲氨基二甲氨四环素(415mg，1mmol)溶于30ml浓硫酸。将溶液冷却在冰浴上，搅拌下加入硝酸钾(110mg，1.09mmol)。产生的混合物搅拌15分钟，然后搅拌下倾入300ml冷乙醚中。滤出分离的固体，用冷乙醚洗涤并真空干燥。LC/MS显示初始物质不完全转化，因此将产物再溶解在15ml浓硫酸中，在0℃加入50mg硝酸钾，搅拌产生的混合物45分钟。如前所述分离产物，得到542mg产物。
7，9-二溴脱甲脱氧四环素在0℃，搅拌下向脱甲脱氧四环素(50mg，0.12mmol)在1.5ml浓硫酸的溶液中，加入42mg N-溴琥珀酰亚胺。30分钟以后，搅拌下将反应混合物倾入60ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到70mg黄色的产物。
7-硝基-脱甲脱氧四环素与9-硝基-脱甲脱氧四环素混合物在0℃，搅拌下向脱甲脱氧四环素(40mg，0.09mmol)在1.5ml浓硫酸中的溶液中，加入10mg硝酸钾。20分钟以后，搅拌下将反应混合物倾入50ml冷乙醚中。滤出分离的固体，并真空干燥，得到59mg产物。LC/MS显示，两种一硝酸盐产物的比例为1.6∶1。
在本发明进一步的测试中，用十种不同的细菌菌株评价了五种测试产物的最低抑菌浓度(MIC)。五个测试产物的MIC评价研究用Macrodilution Broth Method改良方法进行，该方法记载在NCCLS文献M7-A5，Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests forBacteria that Grow Aerobically第五版中。每个测试产物用十种细菌菌株的悬浮物的评价进行两次。每个产物测试前，用灭菌的Mueller-Hinton Broth(MHB)稀释(w/v)，达到一个基础初始浓度1000μg/mg，160μg/ml效价。
测试之前约48小时，从含细菌的冷冻小瓶中，将每种受试细菌分别接种在每个无菌的Tryptic Soy Broth试管中，见下表。肉汤培养基在35±2℃培养大约24小时。将如上所述制备的肉汤培养基接种到置于陪替氏平皿内的胰蛋白酶大豆琼脂的表面上，在35±2℃培养约24小时。如此生产在琼脂平板表面上的细菌“菌苔”(lawns)被用作配制评价的混悬物。
在开始测试之前，对每种细菌配制含大约1.0×109CFU/ml细菌的初始评价悬浮物，配制方法是通过接种取自于固体培养基的细菌及加入氯化钠冲洗剂(Sodium ChlorideIrrigation)，配制方法如上所述。评价所用的最终悬浮物每种细菌含量大约为1.0×106CFU/ml，配制方法是将0.2ml 1.0×109CFU/ml悬浮物置于含200ml Mueller Hinton Broth的250ml无菌聚丙烯瓶内中。在用于测试之前，将最终评价悬浮物进行充分混合。培养盘中的最终稀释度是10-3、10-4和10-5。将这些培养盘在35±2℃培养，直到可观察到细菌充分生长。(表I)。
下列培养，对培养皿上的菌落用手持计数器进行手工计数。CFU(菌落形成单位)在30-300范围的用于数据计算。
每个待评价悬浮物计算初始群体(CFU/ml)公式如下CFU/ml＝(Ci×10-D)Ci＝2个平皿计数的平均值D＝所用的平板计数的稀释因子对于每种待评价悬浮物，之后接种在每管产物/肉汤中的群体(CFU/ml)按下式计算每管群体数(CFU/ml)＝(Ci×10-D)/2其中Ci＝2个平皿计数的平均值D＝所用的平板计数的稀释因子2＝之后接种在每管产物/肉汤中的总体积(ml)测试步骤如下将30ml Mueller-Hinton Broth置于无菌瓶中30ml产物(初始浓度是160μg/ml)加入到11个系列瓶(每个含30ml Mueller-Hinton Broth)的第1瓶中，并且充分混合，以达到1∶2的产物稀释度(v/v)。从上述配制的瓶中移去30ml用剩余10瓶按1∶2(v/v)稀释度进行系列稀释，(10瓶的产物稀释度分别是1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024和1∶2048)，每瓶中均含30ml Mueller-HintonBroth。每瓶在移去30ml部分用作进行下次系列稀释之前，均进行充分混合。将每个产物稀释液1.0ml和初始产物(160，μg/ml产物浓度)1.0ml分别转至无菌试管中。配制12个系列管，每个含1.0ml适当的产物稀释液(1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024和1∶2048)用于评价每种产物对每种细菌的作用(表1)。这样，得到的产物浓度范围从160μg/ml到0.078μg/ml。
将1.0ml含大约1.0×106CFU/ml混悬物加入到系列产物稀释管的每个管中，由此产生最终产物稀释系列是1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048和1∶4096，每个稀释管含有大约5.0×105CFU/ml待评价细菌。这样，最终产物浓度范围从80μg/ml到0.039μg/ml。试验程序如上所述进行，每个测试产物对每种细菌的试验重复两次(表I)。阳性对照管(生长对照)含1.0ml Mueller-Hinton Broth和1.0ml待评价混悬物。还配制了仅含Mueller-Hinton Broth的阴性对照管(培养基)是无菌对照(未接种细菌)。
通过分别在每个无菌的试管中加入1.0ml每个产物稀释液，为每个产物准备了产物混浊度对照。在每个产物稀释管中加入1.0ml无菌的Mueller-Hinton Broth，并使用涡流混合器充分地混合，由此产生的最终产物稀释度与如上所述相同。在35±2℃培养待评价的混悬物/产物稀释管和对照管20小时，直到在阳性对照管中的生长清晰可见。
然后进行培养，检查管中细菌生长，根据可见的混浊度确定。
记录每个测试产物对每个待评价细菌的最低抑菌浓度(MIC)，为测试产物完全抑制细菌生长的最高稀释度，检测是用目视法。记录每个待测产物对每种细菌两次检测的结果，然后将平均值作为最终报告值。
表I
*＝初始群体培养皿先在室温下(20℃-27℃)随意地培养约48小时，然后在35±2℃培养大约72小时。
表II提供每一测试产物对10种测试细菌中每一种的最低抑菌浓度，以产物稀释度表示。表III提供每一测试产物对10种测试细菌中每一种的最低抑菌浓度，以产物浓度(μg/ml)表示。每个产物的初始溶液浓度，以1000μg/mg，160μg/ml为基础。
表II
表III
在另一些研究中，还研究了本发明的四环素衍生物作为基质降解金属蛋白酶(matrixdegrading metalloproteinases，简称MMPs)抑制剂的活性，MMPs与恶性肿瘤生长和转移有关。这些研究用哥本哈根大鼠的Dunning MAT LyLu肿瘤模型，该模型来自移植了肿瘤的哥本哈根大鼠，从一只老年哥本哈根大鼠脊部前列腺原发的前列腺肿瘤移植而来。当进行注射后，该MAT LyLu肿瘤自然地转移到80-100％的被注射动物的淋巴结和肺，并发生骨转移。试验中，试验用药是每日新配制的含每种药物10mg/ml及2％羧甲基纤维素的溶液。
本研究初步评价了药物的毒性，用两组各5只未移植肿瘤的动物，每只动物用四环素类药物(9-氨基-强力霉素和9-硝基-强力霉素)，剂量为40mg/kg/日，用药7日。
三组动物(10只/组)通过灌胃给药，分别喂空白对照(药物赋形剂)及两种药物中的一种，共用药三周，然后每周加大药量，为三倍用量，直到动物死亡或处死。在尾静脉注射植入MAT LyLu肿瘤细胞之前7天开始给药。约0.1ml肿瘤细胞悬液注入尾部旁静脉(lateraltail veins)。药物的选择根据两个因素(1)药物作用(2)与疾病有关的药物。下表(表IV)列出了对照组和治疗组动物的存活时间和每周体重。如表所示，9-氨基-强力霉素和9-硝基-强力霉素显示出可显著增加肿瘤移植之后的存活数，但与对照组相比，体重的改变无差异。此后一发现特别有意义，因为常规的抗癌治疗往往会导致体重减轻。
表IV
在另一研究中，评价了多种四环素衍生物抑制MMPs的活性以及对各种癌的百分抑制率。结果见表V，表明了本发明的治疗效果。研究的目的之一是评估系列四环素衍生物是否可作为纯的人基质金属蛋白酶(包括MMP1，2，3，7，9和14)的抑制剂。本发明的四环素衍生物在mM-μM范围内是有效的抑制剂。
具体实施例方式
1.测定MMP1(胶原酶-1)被四环素衍生物抑制的方法MMP1活性的测定，是通过从14C乙酰化的大鼠皮肤I型胶原质中可溶的14C标记的胶原质片断的释放来确定的。(测定方法见Enzymology80 711，1981)。
实验材料100μg14C标记的大鼠皮肤I型胶原质(5-6000dpm)50mM Tris HCl pH7.915mM CaC12，0.02％叠氮化物重组人MMPl 3-4nM±四环素(1mM以下)在总体积为300ul的溶液中在35℃培养5小时。以10,000g转速，在4℃10分钟离心，除去未断裂的胶原质纤维(在前10分钟内形成的)。取200μl上清液在Packard Opti Phase Supermix闪烁液中用闪烁计数器进行计数。仅有来自实验(10-70％胶原质溶解)中呈线性关系的数据可被使用。仅通过每个样品的浓度范围得出的MMP1的抑制百分率。可用线性回归分析计算出每种四环素的IC50值。
2.测定MMP2(白明胶酶A)被四环素衍生物抑制的方法MMP2活性的测定，是通过从14C乙酰化的大鼠皮肤I型白明胶中可溶的片断释放的三氯乙酸(TCA)来确定的。(测定方法见Enzymology 248，470，1995.Biochem.J.195，1981)。
实验材料100μg14C标记的白明胶(I型胶原质，60℃变性20分钟)50mM Tris HCl pH 7.915mM CaC12，0.02％叠氮化物重组人MMP1，0.1-0.5nM±四环素(1mM以下)在总体积为250ul的溶液中在37℃培养16小时。冷却培养物停止反应，并加入50μl冷的90％(w/v)三氯乙酸，小心地混合均匀。在4℃使三氯乙酸沉淀15分钟，然后以10,000g转速，在4℃离心10分钟，取200μl三氯乙酸上清液，在Packard Opti Phase Supermix闪烁液中进行闪烁计数，以确定放射含量。仅有来自实验(10-70％溶解)中呈线性关系的数据可被使用。通过每个四环素样品的浓度得出的MMP2的抑制百分率。用线性回归分析计算出每种四环素的IC50值。
3.测定MMP3(溶基质素1)被四环素衍生物抑制的方法MMP3活性的测定，是通过从14C乙酰化的β酪蛋白(Sigma)中可溶的片断释放三氯乙酸(TCA)来确定的。测定方法见Enzymology 248，451(1995)。
实验材料100μg14C标记的酪蛋白(7000dpm)50mM Tris HCl pH 7.915mM CaC12，0.02％叠氮化物重组人MMP3，0.25-1.0nM±四环素(1mM以下)在总体积为250ul的溶液中在37℃培养16小时。冷却培养物停止反应，并加入500μl冷的18％三氯乙酸，在冰上放置15分钟。在4℃，以10,000g转速离心10分钟，以除去三氯乙酸沉淀。取200μl三氯乙酸上清液用于进行闪烁计数。仅有来自实验(10-60％溶解)中呈线性关系的数据可被使用。通过每个待选四环素的浓度得出的MMP3的抑制百分率。用线性回归分析计算出每种四环素的IC50值。
4.测定MMP7(Matrilysin)被四环素衍生物抑制的方法MMP7活性的测定，是通过从14C乙酰化的β酪蛋白(Sigma)中可溶的片断释放三氯乙酸(TCA)来确定的。测定方法见Enzymology 248，451(1995)。
实验材料100μg14C标记的酪蛋白(7000dpm)50mM Tris HCl pH7.915mM CaC12，0.02％叠氮化物重组人MMP7，1.5nM±四环素(1mM以下)在总体积为250ul的溶液中在37℃培养16小时。冷却培养物停止反应，并加入500μl冷的18％三氯乙酸，在冰上放置15分钟。在4℃，以10,000g转速离心10分钟，以除去三氯乙酸沉淀。取200μl三氯乙酸上清液用于进行闪烁计数。仅有来自实验(10-60％溶解)中呈线性关系的数据可被使用。通过每个待选四环素的浓度得出的MMP7的抑制百分率。用线性回归分析计算出每种四环素的IC50值。
5.测定MMP9(白明胶酶)被四环素衍生物抑制方法MMP9活性的测定，是通过从14C乙酰化的大鼠皮肤I型可溶的片断释放三氯乙酸(TCA)来确定的。测定方法见Enzymology 248，470，1995.Biochem.J.195，1981。
实验材料100μg14C标记的白明胶(胶原质，60℃变性20分钟)50mM Tris HCl pH7.915mM CaC12，0.02％叠氮化物重组人MMP9，1.2-2nM±四环素(1mM以下)在总体积为250ul的溶液中在37℃培养16小时。冷却培养物停止反应，并加入50μl冷的90％(w/v)三氯乙酸，小心地混合均匀。在4℃使三氯乙酸沉淀15分钟，然后以10,000g转速，在4℃离心10分钟，取200μl三氯乙酸上清液，在Packard Opti Phase Supermix闪烁液中进行闪烁计数，以确定放射含量。仅有来自实验(10-70％溶解)中呈线性关系的数据可被使用。通过每个四环素样品的浓度得出的MMP9的抑制百分率。用线性回归分析计算出每种四环素的IC50值。
6.测定MMP14(MTI-MMP)被四环素衍生物抑制的方法MMP14活性的测定，是通过从14C乙酰化的大鼠皮肤I型可溶的片断释放三氯乙酸(TCA)来确定的。测定方法见Enzymology 80 711，1981)。
实验材料100μg14C标记的胶原质(5-6000dpm)50mM Tris HCl pH7.915mM CaC12，0.02％叠氮化物重组人MMP 14，50-100nM±四环素(1mM以下)在总体积为300ul的溶液中在35℃培养15小时。以10,000g转速，在4℃10分钟离心除去未断裂的胶原质纤维(在前10分钟内形成的)，取200μl上清液在Packard Opti Phase Supermix闪烁液中用闪烁计数器进行计数。仅有来自实验(10-70％胶原质溶解)呈线性关系的数据可被使用。仅通过每个样品的浓度范围得出的MMP1的抑制百分率，计算出每种四环素的IC50值。
另一目的是分析四环素衍生物在体外对下列肿瘤细胞的化学侵入的特异性作用C8161人黑色素瘤细胞MDA-MB-231人乳腺癌细胞PC3人前列腺癌细胞RPM18226人骨髓瘤细胞Ark人骨髓瘤细胞Arp-1人骨髓瘤细胞选择体外膜侵入培养系统(Membrane Invasion Culture System，MICS)化学侵入试验，以测定四环素衍生物药物侵入时对特异的人癌细胞的改变。每种化合物原液在含2％ DMSO，pH为10.0的水中成为水合物。溶解后立即在溶液中加入HCI，调节pH为7.5-8.0。将该溶液用薄片包裹，试验的24小时中，在4℃保存。每次试验新制备化合物。对肿瘤细胞入侵的化学侵入试验用前述体外膜侵入培养系统进行。
该MICS系统是一个经过热处理的塑料复合系统，包括两个配套的14孔板，直径为13mm。两板之间有孔径为10μm的一层滤膜，覆盖有一层已知成分的基质，由人层粘连蛋白/胶原质IV/白明胶组成，在MICS的孔顶部和底部形成一层厚度为35μm的屏障。在放置此屏障之前，下板的孔中加入无血清的RPMI培养基，培养基50％来自保存完好的人成纤维细胞的2日培养物，已通过离心或经过0.45μm无菌滤器过滤除去细胞或细胞碎片。该系统组装完毕后，此屏障置于下部板的孔上，将新鲜的无血清培养基置于上板的孔上。然后将5万个肿瘤细胞加在孔中，孔中或者有受试化合物存在，或者有DMSO载体(对照)。在12个试验孔中，3个随机选择的孔作为对照，3个孔中加入1μg/ml受试化合物，3个孔中加入10μg/ml，3个孔中加入25μg/ml。24小时之后，从下部的孔中取出细胞和培养基，以磷酸缓冲盐水和2mM EDTA代替。此溶液用于从下部的孔中去除所有细胞，对从同一孔中恢复的细胞和培养基增加此冲洗。用斑点印迹多功能系统收集这些样品于含多熔素的孔径为3μm的聚碳酸酯膜上。将收集的滤器固定在甲醇中，用Wrght′s stain(Leukostat染色试剂盒)在原位进行染色。将这些滤器放在显微镜载玻片上，同时还加入浸镜用油(减少从孔中产生的光折射)。进行5次显微镜视野计数，以计算24小时内透过膜入侵的细胞数。然后对该数据进行统计学分析，讨论如下。
表V
表V中，A是所用的浓度1μg/ml、10μg/ml、25μg/mlB是显著性差异，即P＜0.051IC50的单位是μm，除非特别指出2预测值+增加入侵NE未评价R待重复(数目次数重复)表V中化合物19-硝基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐29-氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐39-异丙基氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐47-二甲氨基-6-脱甲基-6-脱氧-9-硝基四环素硫酸盐5同269-叠氮-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐79-氨基-7-二甲氨基-6-脱甲基-6-脱氧四环素硫酸盐89-乙酰氨基-7-二甲氨基-6-脱甲基-6-脱氧四环素硫酸盐97-二甲氨基-6-脱甲基-6-脱氧四环素-9-重氮硫酸盐盐酸盐
109-叠氮-7-脱甲基氨基-6-脱甲基-6-脱氧四环素硫酸盐116-脱氧-5-羟基四环素-9-重氮硫酸盐127-氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐137，9-二溴-6-脱甲基-6-脱氧四环素硫酸盐147-氨基-6-脱氧-5-羟基-9-硝基四环素硫酸盐157-二甲氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐169-乙酰氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐177-二正丁氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐187-二正己氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐197-二-(3，3-二甲丁基)氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐207-叠氮-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐216-脱氧-5-羟基四环素-7-重氮硫酸盐227-乙酰氨基-9-硝基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐237-乙酰氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐247-二正丙氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐257-异丁氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐267-乙酰氨基-9-氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐277-异丁基甲氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐286-脱氧-5-乙酸基-四环素硫酸盐297-乙酰异丁基氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐307-乙酰氨基-6-脱氧-5-羟基四环素-9-重氮硫酸盐317-二甲氨基-6-脱氧-5-羟基四环素-9-重氮硫酸盐327-环丁基氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐337-环丁基甲基氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐344-脱二甲氨基-6-脱氧-5-羟基四环素354-脱二甲氨基-6-脱氧-5-羟基-9-硝基四环素369-氨基-4-脱二甲氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐374-脱二甲氨基-6-脱氧-5-羟基四环素-9-重氮硫酸盐387-硝基-9-叔丁基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐399-叔丁基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐
407-硝基-9-叔丁基-4-脱二甲氨基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐414-脱二甲氨基-7-二甲氨基-6-脱甲基-6-脱氧四环素硫酸盐427-乙酰氨基-9-叠氮-6-脱氧-5-羟基-四环素439-叔丁基-6-脱氧-5-羟基四环素-7-重氮硫酸盐447-氨基-9-叔丁基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐457-叠氮-9-叔丁基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐466-脱氧-5-羟基四环素-4-甲碘化物477-(1，2-苄基羧基肼)-6-脱氧-5-羟基-四环素盐酸盐484-脱二甲氨基-7-氨基-6-脱氧-5-羟基1四环素硫酸盐497-氨基-9-叔丁基-4-脱二甲基-6-脱氧-5-羟基四环素硫酸盐504-脱二甲氨基-9-叔丁基-6-脱氧-5-羟基四环素-7-重氮硫酸盐519-(4-氟苯基)-6-脱氧-5-羟基四环素524-表-7-氯四环素盐酸盐536-脱甲基-6-脱氧四环素盐酸盐虽然本发明记述了一些具体的例子，但显然对本领域的技术人员来说，其它一些形式以及对本发明的一些修改是很容易的。本发明所附的权利要求及说明书已经基本覆盖了所有这些显而易见的形式及改变，所有这些改变都不能脱离本发明真正的精神实质和范围。
权利要求
1.一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，所述四环素包括如下通式 其中R选自CH2N(RaRb)或 RaRb是C1～C6烷基；Rc和Rd是(CH2)nCHRe，n是0或1，且Re是H，C1～C6烷基，或NH2，以及X是NH，S，或CH2；R1是H或OH；R2是H，OH，＝O，或OCOR8，其中R8是C1～C6烷基，或可选择的，R2是N(R9)2，其中R9是氢或C1～C6低级烷基，或R9CO，条件是当R2是羰基或N(R9)2时，R3和R4是H或CH3，R3和R4不能同时是CH3或H；5a氢是α或β；R3和R4是H，CH3或F，条件是当R3是CH3时，R4是H或F，当R4是CH3时，R3是H或F，R4和R5不能同时是F；R5和R7是卤素，H，NO2，N3，N2+，C2H5OC(S)S-，CN，NR10R11，其中R10和R11是H，C1～C10烷基，R12(CH2)nCO-，其中n是0～5，且R9是H，NH2，选自直链、支链或环状C1～C10烷基的单或二取代氨基，条件是R10和R11不能同时是R12(CH2)nCO-；可选择的，R7是叔丁基；R6是卤素、乙炔、R13-C6H5，其中R13是NO2，卤素，乙酰氨基，氨基，苯基，烷基或烷氧基。
2.一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，所述四环素包括如下通式 其中R选自CH2N(RaRb)或 式中，RaRb是C1～C6烷基；Rc和Rd是(CH2)nCHRe，n是0或1且Re是H，C1～C6烷基，或NH2，X是NH，S，或CH2；R1是H或OH；R2是H或OH；R3是H或CH3；R4和R6是卤素，H，NO2，N3，N2+，C2H5OC(S)S-，CN，NR7R8，其中R7和R8是H，C1～C10烷基，R9(CH2)nCO-，其中n是0～5，且R9是H，NH2，选自直链、支链或环状C1-C10烷基的单或二取代氨基，条件是R7和R8不能同时是R9(CH2)nCO-；且R6是H或卤素，乙炔，R10-C6H5，其中R10是NO2，卤素，乙酰氨基，氨基，苯基，烷基，或烷氧基。
3.一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，所述四环素包括如下通式 其中R选自CH2N(RaRb)或 式中，RaRb是C1～C6烷基；Rc和Rd是(CH2)nCHRe，n是0或1，且Re是H，C1～C6烷基，或NH2，X是NH，S，或CH2；R1和R2是H或N(R9)2，其中R9是H或C1～C6烷基，条件是R1和R2不能同时是N(R9)2，R1和R2还可以是N(R10)3I，其中R10是C1～C6烷基，条件是R1和R2不能同时是N(R10)3I；R3是H；R4和R5是H，CH3或F，条件是当R4是CH3时，R5是H或F，当R5是CH3时，R4是H或F，且R4和R5不能同时是F；R6和R8是卤素，H，NO2，N3，N2+，C2H5OC(S)S-，CN，NR11R12，其中R11和R12是H，C1～C10烷基，R13(CH2)nCO-，其中n是0～5，R13是H，NH2，选自直链、支链或环状C1～C10烷基的单或二取代氨基，条件是R10和R11不能同时是R12(CH2)nCO-；R8还可以是叔丁基，R7是H或卤素。
4.一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，所述四环素包括如下通式 其中R选自CH2N(RaRb)或 Ra Rb是C1～C6；Rc和Rd是(CH2)nCHRe，n是0或1，Re是H，烷基(C1～C6)，NH2，X是NH，S，或CH2；R1和R2是H或N(R9)2式中，R9是氢或低级烷基(C1～C6)，条件是R1和R2不能同时是N(R9)2；R3是H，OH，＝O，OCOR10，其中R10是C1～C6，或可选择的，R3是N(R9)2式中，R9是氢或C1～C6，条件是当R23是＝O或N(R9)2时，R4和R5是H或CH3，且R4和R5不能同时是CH3或H；5a氢是α或β；R4和R5是H，CH3或F，条件是当R4是CH3时，R5是H或F，当R5是CH3时，R4是H或F，且R4和R5不能同时是F；R6和R8是卤素，H，NO2，N3，N2+，C2H5OC(S)S-，CN，N R10R11，其中R10和R11是H，烷基(C1～C10)，R12(CH2)nCO-，其中n是0～5，R12是H，NH2，选自直链、支链或环状C1～C10烷基单或二取代的氨基，条件是R10和R11均为R12(CH2)nCO-，或者，可选择的，R8是叔丁基；R7是H或卤素，乙炔，R12-C6H5，其中R12是NO2，卤素，乙酰氨基，氨基，苯基，烷基，或烷氧基。
5.一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，所述四环素包括如下通式 其中，R1是H或N(CH3)2；R2是H，CH3或OCOCH3；R3是H或CH3；R4是H；R5是H，N(CH3)2，NH2，N(C4H9)2，N(C6H13)2，N(3，3-二甲基丁基)2，N3，N2+，NO2，NHCOCH3，NH(正丙基)2，NH-异丁基，NH-异丁基甲基，NH(环丁基)，NH(环丁基甲基)；R6是H，NO2，NH2，(CH3)2CHNH，N3，NHCOCH3，N2+，N3或(CH3)3C。
6.一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的四环素组合物或其盐，所述四环素包括如下通式 其中R1是H或N(CH3)2；R2是H，OH或OCOCH3；R3是H或CH3；R4是H；R5是H，N(CH3)2；N(C4H9)2，N(C6H13)2，N(3，3-二甲基丁基)2；N3，N2+，NO2，NHCOCH3，NH(正丙基)2，NH-异丁基，NH-异丁基甲基，N(CH3CO)(异丁基)，NH(环丁基)，NH(环丁基甲基)，或NH2；R6是H，NO2，NH2，(CH3)2CHNH，N3，NHCOCH3，N2+或(CH3)3C。
全文摘要
公开了一种用于抑制细菌或肿瘤生长的方法，包括对所述需要处理的对象给予有效量的一种或多种四环素衍生物。
文档编号A61K31/65GK1564690SQ02819722
公开日2005年1月12日 申请日期2002年10月4日 优先权日2001年10月5日
发明者约瑟夫·拉弗卡, 理查德·J·阿布林 申请人:泰特拉吉尼克斯医药公司