专利名称：对拉米夫定相关疾病复发和耐药性具有预防作用的药物组合物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及治疗肝病患者的方法，其包括向患者给药包含药物组合物和拉米夫定的药方。该药物组合物包含白花蛇舌草(Herba Hedyotidisdiffusae)的整株，拳参(Rhizoma Bistoriae)的根茎，虎杖(Rhizoma PolygoniCuspidali)的根茎，和五味子(Fructus Schisandrae)的熟果的水性提取物作为核心成分。本发明还涉及通过向患者给药本发明的药物组合物预防由拉米夫定治疗的停药导致的肝病复发和抑制拉米夫定耐药性发展的方法。
背景技术：
病毒性肝炎是由病毒感染导致的主要肠道传播肝病。该疾病的主要传播途径是通过摄食；病毒性肝炎也通过病毒污染的血液或血液制品如血浆的输血传播。
病毒性肝炎在全世界蔓延。例如，在中国约有3000万病毒性肝炎患者，包括每年900万估计量的新患者和约1亿乙型肝炎病毒(HBV)携带者。预计10％的中国怀孕妇女是HBV携带者。在中国每年大约10万人死于源于肝病的肝癌。
HBV感染是由乙型肝炎病毒所导致，该病毒是42-nm，双链和环状的脱氧核糖核酸(DNA)病毒，属于嗜肝DNA病毒科。HBV由表面和核心组成。在HBV DNA基因组中存在4个编码主要多肽的基因S(表面)，C(核心)，P(聚合酶)，和X(转录反式激活蛋白)。S基因由3个区域组成前S1区，前S2区，和编码表面蛋白的区域。该表面蛋白组成表面抗原(HbsAg)。C基因分成两(2)个区域，前核区和核心区；C基因编码两(2)种不同的蛋白质，核心抗原(HbcAg)和e抗原(HbeAg)。
在病毒表面上发现HbsAg并被过量生产。HbsAg在血液中作为22-nm的球形和管状颗粒循环。HBsAg可以在暴露于HBV 30-60天后的血清中鉴定和持续不同的时期。针对HbsAg的抗体(抗-HBs)在消退的感染后发展并负责长期免疫。
针对HBcAg(抗-HBc)的抗体在所有类型的HBV感染中发展并不确定地持续。IgM抗-HBc在感染早期中出现并持续六(6)个月或以上，因此它是急性或近来HBV感染的可靠标志。
第三种抗原，HBeAg可以在来自急性或慢性HBV感染患者的样品中检测。HBeAg的存在与病毒复制和高传染性有关。针对HBeAg(抗-HBe)的抗体在大多数HBV感染中发展并与复制病毒的减少和更低的传染性有关。
乙型病毒感染进展伴随在患者中变化的结果。最初，肝脏急性感染导致身体产生免疫应答以去除病毒。免疫系统设法通过破坏HBV感染的肝细胞来清除病毒。在某些人中，免疫系统取得成功以致病毒连同感染的肝细胞一起被完全破坏，患者获得完全恢复。这称为疾病的消退。然而在另一些患者中，对感染的免疫应答在多个月或多年内不足以完全或根本不去除病毒，随着病毒扩散免疫系统慢慢地破坏越来越多的受染肝细胞，形成长期感染。肝细胞这样缓慢但持久地被免疫系统破坏导致纤维化，硬变和甚至肝癌。免疫系统不能去除病毒的感染HBV的人被称为慢性HBV携带者。在慢性HBV患者中通常无显著的身体症状。特异的血液检查将显示病毒的存在，患者也通过血液，分娩，性，针等传染。慢性HBV携带者可将病毒传给其他人。
美国专利5,047,407公开一种具有抗病毒活性的化合物。该化合物是(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(也称为3TC)，并给予药典名拉米夫定(lamivudine)和由Glaxo SmithKline以商标Epivir在市场上出售。拉米夫定用于治疗和预防病毒性感染。
拉米夫定是核苷类似物，对HBV和人免疫缺陷病毒(HIV)的依赖于RNA的DNA聚合酶具有有效的抑制作用。已经体外和体内显示拉米夫定对HBV复制抑制的抗病毒作用。(Lai等，N.Engl.J.Med.(1998)，33961-68)。拉米夫定在大多数患者中实现病毒复制的抑制，如通过血清HBV-DNA的阴性所确定，但该化合物在短期治疗内HBeAg的清除方面效果差很多。对HBeAg清除的无效或降低的效果可能归因于肝细胞核中HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的持久性；在拉米夫定治疗停药后经常出现HBV复制的快速复发。已经提出延长拉米夫定治疗来解决该问题，HBeAg的血清转化率已经显著改善。
当长期使用拉米夫定时，它导致拉米夫定耐药HBV突变株的选择和在患者中发展耐药性，其对治疗方案提出新的挑战。(Hussain等，J.Viral.Hepat.(1999)，6183-194；Balzarini等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1996)，2363-369)。拉米夫定耐药的HBV突变株对长期拉米夫定治疗期间患者中的急性恶化和代偿失调发展负主要责任。(Liaw等，Hepatology(1999)，30567-572)。
一旦突变株存在和患者发展耐药性，内科医师面临停止还是继续治疗的难题。有时，持续治疗导致肝坏死炎症(hepatonecroinflammation)的反复恶化，其导致肝代偿失调或硬化；另一方面，停止治疗可导致野生型病毒的再活化，其也导致肝坏死炎症的恶化。针对耐药性HBV突变株以及野生型病毒的抗病毒治疗方案的开发对于这些患者是关键性的。
本发明提供一种对于治疗病毒性肝炎有效的草药组合物，特别是，该组合物在治疗病毒性肝炎中有效。该草药组合物同样在体内和体外治疗耐受拉米夫定的突变株HBV中有效。另外，该草药组合物增强拉米夫定的抗病毒疗效和改善由拉米夫定的长期使用导致的拉米夫定耐药HBV突变株的发展。
将该草药组合物命名为乙肝康(Yi-Gan-Kang)(在中文中，“乙”意为“第二或B”；“肝”意为“肝脏”；“康”意为“健康”；总起来说，“乙肝康”表示“无HBV感染的健康肝脏”)，缩写为YGK。
发明概述本发明提供通过向所述患者联合给药包含有效量的名为YGK和拉米夫定的药物组合物的药方来治疗肝病患者的方法。YGK包含作为核心成分下列草药白花蛇舌草(Herba Hedyotidis diffusae)的整株，拳参(RhizomaBistoriae)的根茎，虎杖(Rhizoma Polygoni Cuspidali)的根茎，和五味子(Fructus Schisandrae)的熟果的水性提取物。YGK另外包含下列草药的水性提取物北豆根(Rhizoma Menispermi)的根茎，黄苓(RadixScutellariae)根，牛黄粉，郁金(Radix Curcumae)的块茎，山楂(FructusCrataegi)的熟果，和三七(Radix Notoginseng)的根。最后，YGK另外包含下列草药的水性提取物枸杞子(Fructus Lycii)熟果的水性提取物，红参(Radix Ginseng Rubra)的根，玄参(Radix Scorphulariae)的根，当归(Radix Angelicae sinensis)的根，和黄芪(Radix Astragali)的根。用于从草药中提取药物成分的水性溶液的实例包括但不限于水，乙醇，或其混合物。优选水性溶液为水。
可以将YGK口服和/或静脉内给药于患者。对于口服给药，优选剂量约为每人每日0.5-5g YGK提取物，最优选1-3g YGK提取物。对于静脉注射，优选剂量约为每人每日1-10g YGK提取物，最优选3-5g YGK提取物。将术语“YGK提取物”用作确定YGK剂量的标准单位。YGK提取物是在浓缩两次后草本成分的水性提取物。YGK提取物定义的详细描述在以下“本发明详述”的实施例1中提供。使用“YGK提取物”作为标准剂量单位的原因是因为“YGK提取物”是在口服剂量形式和注射液中使用的YGK的通用形式。然而，对于YGK口服剂量形式的制备，加入其它赋形剂，如淀粉以将YGK提取物转换成最终的粉剂形式。但是对于注射液，通过将它稀释在适当的缓冲液中可以直接使用YGK提取物。因此，对于YGK的口服剂量和注射剂量之间的适当比较，“YGK提取物”而不是YGK的最终重量应当更准确。优选将YGK口服剂量和静脉注射液同时给予患者。
优选将拉米夫定口服给药于患者。拉米夫定的优选剂量约为每人每日50-500mg，最优选100-200mg。
YGK和拉米夫定的联合给药在治疗肝病如肝炎，硬化，和肝癌患者中特别有效。YGK和拉米夫定的联合给药在治疗由乙型肝炎病毒(HBV)感染导致的肝病中尤其有效。
本发明还提供包含第一剂量单位(即YGK)和第二剂量单位(即拉米夫定)的药物组合。YGK是口服剂量形式或静脉注射液。优选YGK口服剂量形式是胶囊形式。优选每次给药服用约0.1-2g YGK提取物和1天约2-4次。YGK提取物的静脉注射液的量是每次给药约1-10g YGK提取物，优选1天1次向患者给药。
优选将拉米夫定以每次给药约50-500mg，最优选100-200mg和约1天1次口服给药于患者。
本发明另外提供在他们的拉米夫定治疗已经停止后，通过向患者口服和/或静脉内给药YGK，预防在拉米夫定治疗已经停止后患者肝炎复发的方法。当肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所导致时该方法特别有效。
最后，本发明提供通过向正在服用拉米夫定的患者口服和/或静脉内给药YGK，抑制拉米夫定耐药性的发展的方法。当拉米夫定耐药性是由患者中拉米夫定耐药乙型肝炎病毒(HBV)毒株的发展所导致时，该方法特别有效。
附图简述
图1显示YGK对Hep3B细胞(图1A)和HepA2细胞(图1B)中HbsAg的生产率的影响。◆--◆表示用不同浓度的YGK处理的细胞。■--■表示用YGK和“条件培养基”处理的细胞。条件培养基是从已经温育24小时的单核细胞的培养基中收集的培养基。
发明详述拉米夫定耐药的病毒在依赖于RNA的DNA聚合酶的酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序上具有特有的氨基酸取代，如在拉米夫定耐药的免疫缺陷病毒中所示。(Balzarini等，(1996)，2363-369)。密码子552的甲硫氨酸被异亮氨酸(M552I)或缬氨酸(M552V)替换。(Ling等，Hepatology(1996)，3711-713；Tipples等，Hepatology，3714-717；和Naoumov等，Hepatology(1996)，24282；其在此引入作为参考)。
M552V突变经常伴随亮氨酸528至甲硫氨酸(L528M)的替代。(Fu等，Biochem.Pharmacol.(1998)，551567-1572；Niesters等，J.Infect.Dis.(1998)，1771382-1385)。这两种突变株，M552I和L528M/M552V通常被鉴定为拉米夫定耐药的突变株。(Liaw等，Hepatology(1999)，30567-572)。此外，开发另外两种抗性突变株，L528M/M552V和A529T。显著地，发现这些突变株中的一些的复制是部分依赖于拉米夫定。
本发明的药物组合物，YGK包含十五(15)种草药，其按照它们的基本作用分组如下首先，存在四(4)种形成YGK核心成分的草药。这4种草药有助于组合物的主要功效和治疗效果。这4种草药是(1)白花蛇舌草(药用名称Herba Hedyotidis Diffusae；植物名Hedyotis diffusa Wild。)；(2)拳参根茎(药用名称Rhizoma Bistortae；植物名Polygonum bistorta L.)(3)虎杖(药用名称Rhizoma Polygoni Cuspidati；植物名Polygonumcuspidatum Sieb.et Zucc.)；和(4)五味子(药用名称Fructus SchisandraeChinensis；植物名Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.，S.sphenanthera Rehd.et Wils.)。白花蛇舌草，拳参根茎，虎杖，和五味子的优选重量比约为3∶3∶1∶2。
核心草药的功能包括清热解毒，改善免疫系统及循环，治疗黄疸症状并滋补内脏。
存在另外六(6)种用于改善和平衡由核心成分产生的药物活性的草药。这六种草药还具有调节效果和改善肝脏血液循环以帮助肝病治疗。这六种成分是(1)北豆根(药用名称Rhizoma Menispermi；植物名Menisermumdauricum DC)；(2)黄芩(药用名称Radix Scutellariae Baicalensis；植物名Scutellaria baicalensis Georgi)；(3)牛黄(动物名Vesica Fellea Bovus)；(4)郁金(药用名称Radix Curcumae；植物名Curcuma wenyujin Y.H.Lee etCl Ling)；(5)山楂(药用名称Fructus Crataegi；植物名Crataeguspinnatifida Bge.)；和(6)三七(药用名称Radix Notoginseng；植物名Panaxnotoginseng(Burk.))。
最后五(5)种成分主要用于提供营养和能源给患者以加速恢复过程。这些成分包括(1)枸杞子(药用名称Fructus Lycii；植物名Lyciumbarbarum L.)；(2)红参(药用名称Radix Ginseng Rubra；植物名PanaxGinseng C.A.Mey)；(3)玄参(药用名称Radix Scrophulariae；植物名Scrophularia ningpoensis)；(4)当归(药用名称Radix Angelicae sinensis；植物名Angelica sinensis (Oliv.)Diels)；和(5)黄芪(药用名称Radix Astragali；植物名Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)。
在这五种成分中，红参还具有改善人体抵抗疾病的免疫功能。
本发明所用的草药的药用名称、植物名或动物名、科名、一般名称及其主要成分在表1中显示。
表一本发明药物组合物中各种草药
白花蛇舌草(Herba Hedyotidis Diffusae)属于茜草(Rubiaceae)科植物。将整株用作草本药用成分。此草药无毒。在中国大陆于夏、秋季节，在台湾则于晚春或早冬采收。Dan Bensky与Andrew Gamble编译的“MateriaMedia”(Chinese Herbal Medicine)中便指出，白花蛇舌草清热和利尿解毒。对舒缓热痛型尿道功能障碍以及湿热型黄疸特别有益。白花蛇舌草是有助于对肝病与HIV的医疗作用的本发明草药组合物的主要成份。
拳参(Rhizoma Bistortae)是植物Polygonum bistorta L.的干燥根茎。它属于蓼(Polygonaceae)科。拳参中度性寒(意指拳参是“阳性”草药)。它可以用来清热解毒，消肿与止血。
虎杖(Radix et Rhizoma Polygoni Cuspidati)为Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根茎与根。它属于Polygonaceae科。此植物遍布全中国，特别在江苏、浙江、安徽、广东、广西、四川及贵州等省份。在春季和秋季收获。虎杖通常用于祛风利湿、散瘀定痛以及止咳化痰。
五味子(Fructus Schisandrae)为Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.或Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果实。它属于木兰(Magnoliaceae)科。前者，它最好的的种类产于中国北方，惯称“北五味子”；后者通常称为“南五味子”因为它产于中国南方。两种均可用于本发明的药物制剂。果实于秋季采摘，去除果梗后在太阳下晒干。五味子通常用于收敛固涩、益气生津以及补肾宁心。五味子也可以降低肝炎患者的GPT(谷氨酸-丙酮酸转氨酶)水平。
北豆根(Rhizoma Menispermi)为Menispermum dauricum DC的干燥根茎。它属于防己(Menispermacea)科，性寒，多用于清热解毒、祛风止痛。
黄芩(Radix Scutellariae)为唇形(Labiatae)科植物Scutellariabaicalensis georgi的干燥根。该植物产于河北、山西、内蒙等，春、秋二季采挖。黄芩主要用于患者的清热燥湿、泻火解毒、止血与安胎。
牛黄是牛Vesica Fellea Bovus的胆结石。可清热，舒缓痉挛。
郁金(Radix Curcumae)为Curcuma wenyujin Y.H.Lee et C.Ling.或Curcuma Longa L.或Curcuma aromatica Salisb.或Curcuma zedoaria Rosc.或Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang的干燥块根。此药材主要产于中国四川、浙江、广东与广西等省份，冬天或春天采挖，除去须根后清洗，蒸透后晒干。郁金为姜(Zingiberaceae)科，性寒味苦，用于清热、解郁及祛痰。
山楂(Fructus Crataegi)为Crataegus pinnatifida Bge.var major N.E.Br.或Crataegus pinnatifida Bge.或Crataegus cuneata Sieb的干燥成熟果实。主要产地为中国河南、江苏、山东等省份，秋季成熟时采收、切片并晒干。山楂属蔷薇(Rosaceae)科，一般用于健胃整肠，行气散瘀。
三七(Radix Notoginseng)为五加(Araliaceae)科植物Panax notoginsent(Burk.)F.H.Chen的干燥根。植物三七又称为P.pseudoginseng Wall或P.sanchi Hoo，产于中国云南、广西、四川、贵州与江西等省份。通常在种植后第三或第七年秋冬，花开前(更好)或果实成熟后采挖。H.Gao等，Pharmaceutical Research，(1996)13(8)1196-1200公开来自三七(San-Chi)的多糖在体外具有改善免疫刺激活性。
枸杞子(Fructus Lycii)是Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，属茄(Solanaceae)科，产于中国宁夏、甘肃、青海等省份，于夏、秋二季采收，用于滋补肝肾，益精明目。
玄参(Radix Scrophulariae)为玄参(Scrophulariaceae)科Scrophularianingpoensis Hemsl的干燥根。主要产于中国浙江与四川两省，冬季茎叶枯萎时采挖。将根轮换堆放、晒干直到内部呈黑色，然后切片备用。玄参可用于凉血滋阴、泻火解毒。
红参(Radix Ginseng Rubra)为Panax ginseng C.A.Mey.经人工栽培(通称为称“园参”)、蒸制后变成红色，性味则成温热。此药材属五加(Arliaceae)科植物，药用部位为干燥根，通常作用于中枢神经系统。红参可加强中枢神经系统的刺激与抑制作用，从而促进神经反应的调节能力。它还可以降低血糖与胆固醇，并且对治疗与预防胃溃疡的效果。
当归(Radix Angelicae Sinensis)为伞形(Umbelliferae)科植物Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根。此药材主要产于中国甘肃与陕西省，秋末采挖，除须根、切段、酒炙后用慢火熏干。当归可以补血、活血、通经、止痛、润肠等。
黄芪(Radix Astragali)是Astragalus membrancaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus.(Bge.)Hsiao或Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，属豆科。主要产地为中国山西省、甘肃省、黑龙江省以及内蒙古。于春、秋两季采挖4年或以上的黄芪。黄芪可以消炎化脓、促进组织生长。
YGK在治疗肝病患者中特别有效。YGK适合于制药业典型规模以及较小量的制备。
在制备本发明的草药组合物的方法中，按照常规方法对单独的草药组分进行预处理。切割草药并放入含有水和/或低级醇(如乙醇)的容器煎煮两次。第一次先煎煮约两个小时，收集溶液，加入水和/或低级醇第二次煎煮约1.5半小时。来自煎煮步骤的溶液通过筛/滤器收集。然后将滤液从约1.4倍体积浓缩成1.0倍体积。随后将液体冷凝液喷雾干燥和造粒，制成颗粒。将颗粒进一步包装成胶囊和保护待用或通过活性成分的常规方法进一步分析以确保它们的质量。也可将液体冷凝液制备成静脉注射液。在一个安瓿中约有5ml静脉注射液。
本发明的组合物可以进一步加工和配制成适合口服给药或静脉注射的形式。
在YGK治疗慢性乙型肝炎效果的临床研究中，在以下各方面评估疗效
(1)血清HBV-DNA的连续消失，这是在血清和肝脏组织中HBV-DNA的清除的指征；(2)HBsAg的清除和抗-HBs的产生；(3)HBV复制的抑制；(4)HBeAg的清除和抗-HBe的产生；和(5)肝功能的显著改善(如通过组织损伤判断)，如由正常水平的血清转氨酶，死肝细胞的组织学检查，和缓和的炎症指示所显示。
当与拉米夫定联合给药时，YGK在治疗慢性乙型肝炎中特别有效，血清HBV-DNA迅速清除和HBeAg以及HBsAg阴性。为了治疗有效，将YGK以两种形式，胶囊或静脉注射液给药于患者。可以与拉米夫定分开或一起给药。本发明的草药组合物也已经证明使肝炎或肝硬化患者肝酶正常化和缓和临床症状的能力。
本发明的方法在治疗慢性乙型肝炎中特别有效，血清HBV-DNA迅速清除和HBeAg以及HBsAg阴性。本发明治疗乙型肝炎的方法包括与拉米夫定同时(concurrent)或联合给药YGK，有效增强拉米夫定的抗病毒性能和抑制由拉米夫定的长期使用导致的拉米夫定耐药的HBV突变株的发展。
本发明YGK和拉米夫定的联合治疗可以实现抑制病毒复制和改善患者免疫系统功能的双重目标。
拉米夫定，一种核苷类似物，在抑制HBV复制期间逆转录酶的酶活方面有效。六个月的拉米夫定治疗有效减少血清中的HBV-DNA，患者的转阴率可高达90.4％。与拉米夫定治疗有关的缺点是拉米夫定在病毒复制循环中的单个阶段切断，患者HBeAg转阴率极低，于是需要拉米夫定长期治疗。在拉米夫定治疗完成后，患者具有高HBeAg转阳率。
两种类型的YGK制剂，即YGK静脉注射液和YGK胶囊，具有稍微不同的抗-HBV作用。YGK静脉注射液具有直接的抗-HBV作用。它可以阻止病毒复制期间病毒的核苷酸摄取以致病毒将变得虚弱和死亡。在另一方面YGK胶囊对于保护肝细胞和调节免疫功能特别有效。静脉注射液和YGK胶囊的结合使用对于HBV的抑制和肝功能的恢复有效。
本发明证明拉米夫定和YGK的联合治疗对HBV复制的多个阶段具有多重功能拉米夫定抑制HBV复制期间逆转录酶的酶活，YGK静脉注射液阻止DNA复制期间病毒核苷酸的摄取；同时，YGK胶囊调节患者的免疫功能。该有效结合可以在8周内快速清除血清HBV-DNA以致100％患者显HBV-DNA阴性，更多的患者在治疗16周后HBeAg转阴。联合治疗中的拉米夫定治疗在16周治疗后终止，这样服用拉米夫定的时期大大减少，避免了长期拉米夫定治疗的副作用，包括拉米夫定耐药的HBV的诱导和疾病的复发。
下列实施例是例证性的，但不限制本发明的范围。可以不背离本发明的范围进行如普通技术人员所想到的那些合理变化。
实施例1药物制剂在制备本发明药物组合物的方法中所用草药成分的种类和量在表2中描述。该药物组合物称为“YGK”。它可以配制成注射液和胶囊。
表2.用于制备YGK注射液和YGK胶囊的成分
(1)原料的质量控制按照在草药领域中使用的常规方法，对于每种单独的原料进行质量控制试验，其包括但不限于物理外观，干燥失重，总灰分，酸不溶灰分，醇提物，水提物，TLC，HPLC，重金属，微生物计数和残留农药。
检验牛黄粉的外观，TLC和普通化学。
(2)制备方法按照常规方法预处理单独的草药组分。
按照表3称量草药。在表3中提供用于制备YGK胶囊和/或注射液的制备方法的流程图表3YGK制备方法制备方法 质量控制方法递送的原料草药原料草药的质量控制｜ ·物理外观↓制备(切割，干燥等)｜ 原料草药的质量控制｜ ·物理外观↓ ·干燥失重·总灰分获得总共20.003kg原料草药 ·酸不溶灰分并放于提取器中用于制备·醇提物｜ ·水性提取物｜ ·TLC↓ ·HPLC加350L±10％水以浸渍提取器中 ·重金属的草药60±10min ·微生物｜ ·残留农药｜ 注意只检验牛黄粉(也称为↓ Bovis Bezoar)的外观，TLC
和普通化学制备方法质量控制方法第1次提取质量控制参数设置(取10-15g作为试样)1.设定温度为95℃ ·固体含量浓度可接受范围为90℃-100℃。
·水分浓度2.设定蒸汽压力为2kg/cm2。
3.读取盖压为0.2-0.4kgf/cm2范围内。
4.提取45分钟。
｜｜液体提取物↓第1次浓缩参数设置1.设定真空为-60～-76cmHg。
2.设定温度为40℃±5℃。
3.处理40分钟。
｜｜原料草药加水350L±10％↓第2次提取参数设置1.设定温度为95℃。
可接受范围为90℃-100℃。
2.设定蒸汽压力为2kg/cm2。
3.读取盖压为0.2-0.4kgf/cm2范围内。
4.提取45分钟。
｜｜↓制备方法 质量控制方法合并浓缩的提取物并倒入不锈钢容器中｜↓产率6.1kg±10％喷雾舱参数设置1.设定温度为60℃。
2.预热15分钟。
｜↓流化床干燥器1.加入3.9kg淀粉(基于淀粉的含水量)。
2.设定内温为60℃；外温为50℃。
3.预热10分钟。
4.处理目标2小时±20分钟，直至LOD＜5％。
(下页继续)｜↓产率9.5kg-10.5kg过筛参数设置1.设定温度为23±4℃。
2.读取RH为50±10％。
3.以100网目筛过筛，再以80网目筛过筛。
｜｜产率9.0kg-10.5kg↓YGK粉剂制备方法质量控制方法药物的质量控制·物理外观·干燥失重·总灰分·酸不溶灰分·醇提物·水性提取物·TLC·HPLC·重金属·微生物·残留农药·稳定性将单独草药切成小片，然后充分混合。将混合的草药装入具有足够展开空间的袋中。将袋放入含有350L(±10％)水的提取器中，浸泡约60±10分钟。首先在95±5℃下在2kg/cm2的蒸汽压力和0.2-0.4kg/cm2的盖压下提取草药45分钟。将水性提取物收集到浓缩器中并在40±5℃下在-60～-76cmHg的真空下浓缩40分钟以形成第一次浓缩物。
将袋中的草药从提取器中回收，放入另外350L(±10％)水并再次在95±5℃下在2kg/cm2的蒸汽压力和0.2-0.4kg/cm2的盖压下提取45分钟。将来自第二次提取的提取物收集到浓缩器中并在40±5℃下在-60～-76cmHg的真空下浓缩40分钟以形成第二次浓缩物。
合并第一和第二次浓缩物并倒入不锈钢容器。合并的浓缩物的总重约为6.1kg±10％。合并的浓缩物称为“YGK提取物”。
对于YGK注射液，将约0.4g“YGK提取物”溶解在约1ml注射缓冲液中。将约5ml注射液倒入安瓿。
对于YGK粉剂(其被包装成YGK胶囊)，将约3.9kg淀粉(基于淀粉的含水量可调)加入YGK提取物并在设置为内温60℃和外温50℃的流化床中喷雾干燥约120±20min直至LOD(检出限)＜5％。
所得粉剂先以100网目筛过筛，再以80网目筛过筛。YGK粉剂的最终产率约为9.5～10.5kg。可将YGK粉剂进一步包装成YGK胶囊。存在两种剂量形式的YGK胶囊500mg的YGK胶囊，其包含约305mg“YGK提取物”和约195mg淀粉；和220mg的YGK胶囊，其包含约134mg“YGK提取物”和约86mg淀粉。
(3)加工过程中的质量控制在提取物浓缩后，收集10～15克样品，依美国药典、中国药典、和/或日本药典所述方法，测定固体物浓度和水分浓度。
(4)YGK粉剂的质量控制对YGK粉剂进行的质量控制试验包括但不限于通过常规方法和通过在美国药典、中国药典、和/或日本药典中所述方法的物理外观，干燥失重，总灰分，酸不溶灰分，醇提物，水提物，TLC，HPLC，重金属，微生物计数，残留农药和稳定性。
(5)YGK胶囊的质量控制对500mg YGK胶囊进行的质量控制试验包括但不限于通过常规方法和通过在美国药典、中国药典、和/或日本药典中所述方法的物理外观，干燥失重，总灰分，酸不溶灰分，醇提物，水提物，TLC，HPLC，重金属，微生物计数，残留农药和稳定性。
实施例2YGK草药组合物对乙型肝炎(HBV)患者的治疗功效该临床研究在中国人民解放军211医院进行。乙型肝炎的致病原因很多，包括免疫反应、宿主遗传因子以及HBV突变。慢性肝炎与急性肝炎不同。急性肝炎是肝脏活性和有症状的感染。急性肝炎患者有传染性。急性HBV感染的症状是非特异性的，但可能包括不适，厌食或黄疸。慢性肝炎患者无症状。HBV存在于肝脏和血液中，尽管通常没有明显身体症状。特异的血液检查将显示病毒的存在，患者也通过血液，分娩，性，针等传染。肝硬化是肝脏的病理性功能障碍状态，由慢性肝炎，慢性持续性肝炎(CPH)和慢性活性肝炎(CAH)导致的肝脏硬化。
共有948位急性HBV、慢性HBV以及肝硬化患者参与临床比较研究。将患者分为两(2)组。研究组有642位患者，比较组则有306位患者。参与本研究的患者资料在表4中列出。
表4临床研究中的患者资料
(*根據1990年上海肝炎會議修訂的病毒性肝炎診斷分型標準)患者以下列方式进行治疗(1)研究组的患者每天口服八(8)颗含有本发明草药组合物的YGK胶囊。
(2)比较组的患者则每天口服四(4)片护肝(“肝脏保护”)片。护肝(“肝脏保护”)片由五味子(Fructus Schisandrae chinensis)醇浸膏、保肝浸膏(含茵陈、紫胡、板蓝根(isatis root，Radix Isatidis seu Baphicacanthi))以及胆汁膏粉等组成。它治疗慢性肝炎的有效率为95.08％(70％有显著效果)，治疗肝硬化的有效率为82.5％(63％有显著效果)。
两组患者均给药九十(90)天。
表5显示该临床研究的结果。
表5.YGK胶囊疗效
(p＜0.01)*有療效的定義為在服藥90天後，病患的B型肝炎病毒e抗原(HBeAg)及去氧核糖核酸基因體(HBV-DNA)標記轉陰。
如表5所示，约71.3％服用YGK草药组合物90天的患者对草药组合物显示阳性应答。这与其中向患者给予在中国市场上可商购的常见“护肝”片的比较组相反。已经服用“护肝”片的患者仅具有显示他们肝病改善的约33.98％的有效率。
实施例3YGK草药组合物在动物中的毒性研究目的下列实验于中国黑龙江省劳动卫生职业病研究所的毒理学实验室进行，检验在静脉注射于动物期间YGK草药组合物的急性毒性。
方法试验动物为获自中国黑龙江省哈尔滨医科大学动物中心的日本大耳白种属家兔，此种属家兔的特点为耳部血管清楚，实验容易操作。
获得10只上述家兔，雄六只、雌四只，每只体重在1900克与3000克之间。
将兔子随机分为两组，每组五只，包括两只雌兔和三只雄兔。两组动物分别用10g/kg以及15g/kg剂量经家兔的耳静脉将YGK草药组合物静脉注射到家兔中。
包含草药组合物的注射液的浓度约为1g/ml，因此高剂量组15g/kg的浓度约为15ml/kg，换算成60公斤成人一次用900ml草药组合物治疗。
静脉注射后连续观察兔子行为两周。第一天每小时观察一次；之后每天观察四到六次。
观察期结束时，杀死动物并解剖，检查眼睛、肝脏、肺脏和胰脏是否有异常。
结论观察期间家兔行为正常，体重也与日俱增。杀死和解剖后观察，眼睛、肝脏、肺脏和胰脏均无异常。此结果相较于一般急性毒理分级标准，属正常无急毒。
实施例4YGK的体外抗病毒活性人肝癌Hep3B细胞的HBsAg的生产对各种试剂非常敏感。(Hsu等，J.Biol.Chem.(1993)，26823093-23097)。因此，可将Hep3B细胞发展成用于检查抗病毒活性相关的中草药的有效检验系统。
为了进一步研究HBV基因表达和病毒复制的调节，发展另一种肝癌细胞系，HepA2。通过将串联排列的HBV基因组转染到其基因组不含HBV序列的HepG2细胞之中，HepA2细胞衍生于HepG2细胞。HepA2细胞可以合成和分泌HBsAg和HBeAg到培养基中。
将这两种细胞系用作模式系统来检验YGK的抗病毒活性。因为YGK已经通过静脉内注射被直接用于治疗慢性活性肝炎患者，通过收集来自温育24小时的单核细胞(来自血液)的培养基，还检验了YGK可以与循环中单核细胞分泌的细胞因子配合来抑制肝细胞HBsAg生长的可能性。温育单核细胞的培养基称为“条件培养基”。
然后用单独YGK或YGK与条件培养基处理Hep3B细胞和HepA2细胞。结果在图1中显示。
单独YGK对Hep3B和HepA2细胞中HbsAg生产的抑制作用是剂量依赖性的。(图1A中◆--◆)。当YGK浓度约为2％(w/v)时在Hep3B细胞中约50％的HBsAg生产被抑制。当YGK浓度约为3％(w/v)时约50％的HBsAg生产被抑制。
在Hep3B细胞中，单独条件培养基对HBsAg没有影响。(图1A中未显示)。然而，当将条件培养基与2％的YGK一起加入Hep3B细胞培养基，Hep3B细胞中HBsAg的生产率从约50％(不含条件培养基)(◆--◆)降低到约15％(含条件培养基)(图1A■--■)。HBsAg生产的抑制作用似乎在约4％YGK时达到稳定水平，这时HBsAg生产率约为5％。
在HepA2细胞中，单独的条件培养基似乎对HBsAg生产有一些影响。(图1B中未显示)。当将条件培养基与2％YGK一起加入Hep3B细胞培养基，Hep3B细胞中HBsAg的生产率从约65％(不含条件培养基)降低到约20％(含条件培养基)(图1A■--■)。HBsAg生产的抑制作用似乎在约3-5％YGK时达到稳定水平，这时HBsAg生产率约为10％。
实施例5YKG对抑制拉米夫定耐药的HBV突变株病毒复制的作用的体外抗病毒研究方法(1)定点诱变产生包含HBV基因组的质粒的方法是按照Yeh等(Yeh等，Hepatology(2000)，311318-1326)。简短地，通过将1拷贝大于单位长度的HBV基因组(3.37kb；核苷酸1820-1990；adw亚型，衍生于pECE-C[Walsh等，Gut(2001)，49436-440])插入载体，pRc/CMV(Invitrogen，SanDiego，CA)产生质粒pCMVHBH。在该插入片段的3’和5’末端设计一个Hind III位点和Xba I位点。
为了产生表达拉米夫定耐药的突变株的质粒，使用基于PCR的策略进行定点诱变实验。合成侧邻突变位点的两个引物，Pol-L(上游)和Pol-R(下游)。还合成一组引物，其彼此互补和跨越突变位点。该组引物(有义和反义)包含用于定点诱变的设计的错配核苷酸。分别使用Pol-L/反义和Pol-P/有义引物作为PCR引物进行两组PCR(30个循环)。凝胶纯化产生的DNA片段。将1/10每个纯化的DNA片段混合在一起，在缺少引物下进行另一个PCR反应(10个循环)。最后，将Pol-L和Pol-R加入反应，再进行20个循环的PCR。在用Xba I消化和通过琼脂糖凝胶电泳纯化后，将产生的DNA片段用来替代pCMVHBV中相应的Xba I至Xba I片段(核苷酸250-1990)。用于定点诱变实验的所有引物的核苷酸序列都在以前公布。(Yeh等，Hepatology(2000)，311318-1326)。
通过一步诱变实验构建质粒pCMV-LLTQ和pCMV-YIDD。通过两步诱变实验构建另外两个质粒，pCMV-YVDD-LMAQ和pCMV-YIDD-LMAQ，其中突变位于两个分开位点。首先产生中间质粒，pCMV-LMAQ，实验第二步产生最终质粒。所有DNA质粒的核苷酸序列通过DNA序列分析证实。
(2)DNA质粒转染到HepG2细胞将HepG2细胞保持在包含10％胎牛血清的极限最低培养基(MEM)中。使用标准CaPO4沉淀法来转染细胞。在转染5小时后细胞甘油受激1分钟。次日换培养基并加入所需浓度的YKG。24小时后收获细胞。
(3)HBV DNA的分离和DNA印迹分析。
通过DNA印迹分析HBV-DNA。按照稍微修改的前述方案进行从HepG2细胞中提取HBV DNA。(Yeh等，J.Med.Virol.(1998)，5542-50)。简短地，将细胞从培养皿中胰蛋白酶化，用磷酸盐缓冲盐水漂洗2次并用0.5ml包含0.5％诺乃洗涤剂P-40(NP-40)的TBS(10mM Tris-HCl[pH7.2]，150mM NaCl)溶解。在微型离心机中在1500xg下简短离心后，将上清液转移至新管中并调整到10mmol/L MgCl2。在用100μg/ml DNA酶I在37℃下消化30分钟后，将乙二胺四乙酸(EDTA)加至30mmol/L的终浓度以终止反应。为了提取HBV DNA，加入等体积的包含蛋白酶K的缓冲液(50mM Tris-HCl[pH7.2]，1mM EDTA，1％SDS，0.45％NP-40，和200g/ml蛋白酶K)并在55℃下将混合物温育3小时。在用等体积的酚-氯仿提取两次和用氯仿提取一次后，用酸性乙醇沉淀DNA并溶解在TE缓冲液(10mM Tris[pH8.0]，1mM EDTA)中。
为了检测HBV DNA，在印到硝化纤维膜上之前将提取的样品上样到1％琼脂糖凝胶以电泳。通过与地高辛标记的探针杂交检测HBV DNA。标记探针的方法以及用该探针定量HBV DNA的灵敏度，特异性和有效范围在别处描述。
结果通过在HBV在HepG2细胞中温育24小时后，进行电泳，接着southern印迹分析来检测HBV-DNA复制中间体来评估YGK对HBV复制的作用。通过光密度分析法测量松弛环状加上线性形式的HBV-DNA的相对数量，将来源于无药物处理(0mg/ml药物)的细胞的HBV-DNA的量指定为1倍。
结果显示浓度为20mg/ml的YGK抑制野生型HBV(抑制到0.61倍)，M552I HBV突变株(抑制到0.76倍)，L528M/M552V HBV突变株(抑制到0.45倍)，和A529T HBV突变株(抑制到0.61倍)中的病毒复制。
总之，似乎YGK可以有效抑制大多数拉米夫定耐药的HBV突变株的复制。
实施例6YGK和拉米夫定治疗对慢性乙型肝炎(HBV)的功效本临床研究是在中国深圳Liuhua医院进行。
目标本临床研究研究了YGK和拉米夫定单独或联合的治疗对慢性乙型肝炎患者中血浆HBV-DNA的清除和HBeAg阴性的作用。
方法I.试验样品YGK注射液(5ml/安瓿，包含约2g YGK提取物)和YGK胶囊(约220mg/胶囊，包含约134mg YGK提取物和约86mg淀粉)由中国黑龙江省Gongming制药有限公司供应。
100mg拉米夫定片购自Glaxo Wellcome。
II.病例选择(1)包含标准(a)按照1990年国家乙型肝炎诊断标准的患者诊断(b)血清HBV-DNA在治疗前持续3周阳性(c)血清HBeAg和HBsAg持续阳性和波动或连续异常ALT。
(2)排除标准(a)小于18或大于60的男性或女性，孕妇或哺乳期妇女。
(b)心血管，肺，肾或贫血相关疾病或精神病患者。
(c)排除不满足上述标准，不遵守剂量给药方案，或遗失数据的患者。
III.分组和治疗(1)分组方法本研究包括总共135位满足标准的患者。患者随机打乱和分成A，B和C组。A组是有48位患者的治疗组，而有42位患者的B组和有45位患者的C组是阳性对照组。各组患者的性别，年龄，和病历被统计学分析为不显著(p＞0.05)和认为是可比较的。
(2)治疗方法每种治疗方法持续4周。治疗的持续时间是32周(8个疗程)。
(a)A组患者在开始2个疗程每天一次通过静脉注射接受10ml用500ml 5％葡萄糖稀释的YGK注射液(2安瓿)；贯穿8个疗程每天三次接受6个YGK口服胶囊(220mg)；和在开始4个疗程期间每天一次接受1片拉米夫定(100mg)。
(b)B组患者每天一次接受1片拉米夫定(100mg)，共8个疗程。
(c)C组在开始4个疗程期间每天一次通过静脉注射接受10ml用500ml 5％葡萄糖稀释的YGK注射液(2安瓿)；贯穿8个疗程每天三次接受6个YGK口服胶囊。
IV.观察和评估(1)观察项(a)乙型肝炎生物学标记在治疗前，治疗期间第4，8，16和32周和治疗终止后第24和48周分析血清HBV-DNA，HBeAg，抗-Hbe，HbsAg，抗-HBs。
使用9600 DNA扩增仪(PE公司，USA)和来自中国温州，浙江E-li-kangBiotech.Corp.的试剂，通过聚合酶链式反应(PCR)测量血清HBV-DNA。使用自动快速微型免疫分析仪和来自Abbott Laboratories，USA的试剂，通过Imx法测定血清HBeAg，抗Hbe，HBsAg，和抗-HBs。
(b)肝功能在治疗期间的第4，8，16和32周和治疗终止后第24和48周监视ALT。
(c)副作用贯穿整个治疗期间医务人员持续监视患者的副作用。
(2)统计学分析通过x2测验法(X2)和t-检验分析在治疗期间第4，8，16，和32周和治疗终止后第24和48周获得的数据。将获得的统计学结果用来评估疗效。
结果1.在治疗期间的观察-血清生物学标记(1)在1个疗程(4周治疗)后治疗4周后的结果在表6中显示。
表6.治疗4周后治疗效果的比较组患者数 ALT HBV-DNA HBeAg的 抗-Hbe的 HBsAg 的(正常)的清除 血清转化 血清转化 血清转化A组 48 4746 9 9 2B组 42 28**0**0**0**0C组 45 38*16**3 3 0*与A组比较P＜0.05**与A组比较P＜0.01从表5中，明显的是在4周治疗后患者的ALT水平显著改善。与B组的66.6％(28/42，X2＝15.75，p＜0.01)和C组的84.4％(38/45，X2＝5.39，p＜0.05)相比，97.9％的A组患者(47/48)具有正常的ALT。在A组中HBV DNA血清转阴(95.8％，46/48)显著高于B组(X2＝82.35，p＜0.01)和C组(X2＝38.04，p＜0.01)。A组中HBeAg的血清转阴(18.8％，9/48)显著高于B组(X2＝8.55，p＜0.01)，但不显著高于C组(X2＝3.07，p＞0.05)。A组中HBsAg的血清转阴为4.2％(2/48)，其与B组和C组(分别X2＝1.80和1.95，p＞0.05)相比较高但在统计学上不显著。拉米夫定阳性对照组(B组)中没有一位患者显示对HBV DNA血清转化的任何效应。
(2)在两个疗程(八周治疗)后治疗8周后的结果在表7中显示。
表7.治疗8周后治疗效果的比较组患者数HBV-DNAHBeAg的抗-HBe的HBsAg的 抗-HBs的的清除 血清转化 血清转化血清转化 血清转化A组 48 48 18 18 9 0B组 42 0**0**0**0**0C组 45 16**11 11 0**0**与A组比较P＜0.01如表7所示，所有A组患者具有HBV DNA的完全清除，而B和C组保持不变。A组患者中HBeAg血清转阴增加到37.5％(18/48)，其显著高于B组(X2＝19.62，p＜0.01)但不显著高于C组(X2＝1.86，p＜0.01)。A组患者中HBsAg的血清转阴增加到18.7％(9/48)，而B和C组未显示任何血清转化，分别地X2＝8.55和9.39，p＜0.01。拉米夫定阳性对照组(B组)中没有一位患者显示对HBV DNA血清转化的任何效应。
(3)在4个疗程(16周治疗)后在第8周后已经停止对A组患者的YGK注射液治疗。16周治疗后的发现在表8中显示。
表8.在16周治疗后疗效比较组患者数HBV-DNAHBeAg的抗-HBe的HBsAg的抗-HBs的的清除 血清转化 血清转化血清转化 血清转化A组 48 48 23 23 18 5B组 42 26**2**0**0**0C组 45 36**14 14 6**0**与A组比较P＜0.01如表8所示，明显的是，甚至在第8周后停止YGK注射液的条件下A组患者的HBV DNA保持阴性。对于B和C组，分别有61.9％(26/42)和80％(36/45)的患者显示阴性HBV DNA。然而，这些仍然显著(p＜0.01)低于A组(对于B和C组分别地X2＝22.32和10.60)。A组HBeAg的血清转化已经增加到47.9％(23/48)，其显著(X2＝20.79，p＜0.01)高于B组的4.8％(2/42)但不显著(X2＝2.79，p＞0.05)高于C组。A组HBsAg的血清转化已经增加到31.1％(18/48)，其显著高于B和C组(分别地X2＝19.62和7.07，p＜0.01)。当与A组比较时，B组患者的HBV DNA已经显示相对有限的血清转化。
(4)在8个疗程(32周治疗)后在16周后已经停止对A组患者的拉米夫定片的治疗和对C组患者YGK注射液的治疗。
表9.在32周治疗后疗效比较组患者数HBV-DNA的HBeAg的抗-HBe的HbsAg的抗-HBs的清除 血清转化 血清转化血清转化 血清转化A组 48 48 39 39 24 12B组 42 38*4**4**1**1C组 45 42 28*28*16 7*与A组比较P＜0.05**与A组比较P＜0.01如表9所示，明显的是，在32周结束时A组患者的HBV DNA继续为阴性，即使他们只从第16周末开始服用YGK胶囊。B组HBVDNA阴性转化已经增加到90.5％(38/42)，其仍然显著低于A组(X2＝4.77，p＜0.05)。C组HBV DNA转化已经增加到93.3％(42/45)，其可以比得上A组(X2＝3.35，p＞0.05)。A组HBeAg血清转化继续增加到81.3％(39/48)，其显著高于B组(9.5％，4/42，X2＝46.26，p＜0.01)和C组(62.2％，28/45，X2＝4.19，p＜0.05)。A组的HBsAg血清转化已经增加到50％(24/48)，其显著高于B组(X2＝25.38，p＜0.01)但不显著高于C组(X2＝1.95，p＞0.05)。结果显示A组和C组的HBVDNA阴性血清转化远比B组好。
2.副作用除了在静脉注射时的常见疼痛和口干，A组患者没有与治疗方案有关的显著副作用。
在16周的治疗后，B组42位患者中的8位显示副作用，如厌食，腹部不适和波动的ALT水平。然而，症状在再治疗2周后消失。
在8周治疗后，C组45位患者中的17位显示口干，腹部不适和波动的ALT水平。然而，症状在继续治疗后消失，肝功能恢复正常。
3.后续治疗表10.在治疗终止后第24和48周时血清生物学标记组 患者HBV-DNAHBeAg的血清抗-HBe的HBsAg的抗-HBs的数 的清除 转化 血清转化血清转化 血清转化24W 48W 24W48W 24W 48W 24W 48W 24W48WA组 48 4848 42 4242422929 29 29B组 42 38*26**4**0**4**0**1**0**1**0**C组 45 4242 32*32*32*32*1818 11*11*[请证实]*与A组比较P＜0.05**与A组比较P＜0.01如表10所示，明显的是，所有使用YGK注射液，YGK胶囊和拉米夫定的联合治疗的A组患者在治疗终止24和48周后保持HBV DNA的阴性。除了在治疗期间测试阴性的39位患者以外，另有3位患者已经测试HBeAg阴性，导致血清转化率增加6.2％至总共87.5％(42/48)。除了在32周治疗期间测试阴性的24位患者以外，另有5位患者已经测试HBsAg阴性，导致血清转化率增加10.4％至总共60.4％(29/48)。
对于C组，在终止治疗后未观察到另外的HBV DNA血清转化。4位更多的患者显示HBeAg转化，增加血清转化率8.9％至总共71.1％，然而，这仍然显著低于A组(X2＝3.91，p＜0.05)。另有2位患者显示HBsAg转化，增加血浆转化率4.4％至总共40％，其与A组(X2＝3.81，p＞0.05)无显著差异。
对于B组，在治疗期间为HBV DNA阴性的、38位患者中的12位在治疗终止后第48周已经复发和显示HBV DNA阳性。总血清转化率降低至61.9％(26/42)，其比32周治疗结束时低28.6％。那些在32周治疗结束时显示HBeAG和HBsAg血清转化的少数患者在治疗终止后第48周全都复发为阳性。
结论和讨论通过血清和肝组织中HBV-DNA的连续清除，HBsAg的清除和抗-HBs的生产，HBV复制的抑制，HBeAg的清除和抗-HBe的生产，如通过正常水平的血清转氨酶显示的肝组织损伤的显著改善，死肝细胞的组织学检查和减轻炎症的指征评估治疗方案对慢性乙型肝炎的疗效。
因为复杂的病毒结构和HBV的复制循环和患者免疫系统状况和体内病毒存在状态之间的紧密关系，难以实现HBV的清除和病毒复制的抑制。因此，慢性乙型肝炎的有效治疗方案必须攻击病毒复制的每一可能的阶段以阻止病毒复制和改善患者的免疫系统，包括破坏HBV的免疫耐受性和调整身体的免疫平衡。
本发明YGK和拉米夫定的联合治疗能够实现抑制病毒复制和改善患者免疫功能的双重目标。作为第二代核苷酸类似物代表的拉米夫定对于HBV复制期间逆转录酶活性的抑制非常有效。6个月的拉米夫定治疗有效降低血清中的HBV-DNA，患者转阴率可高达90.4％。然而，拉米夫定治疗存在缺点，即拉米夫定只在病毒复制循环的单一点切断以致在拉米夫定治疗后患者的HBeAg转阴率极低(9.5％)，需要长期拉米夫定治疗。实际上，本研究证实用拉米夫定治疗的患者在治疗完成后具有高HBeAg转阳率。
两种类型的YGK制剂，YGK静脉注射液和YGK胶囊在治疗HBV患者中有效。YGK静脉注射液具有直接的抗HBV作用。按照现在正在进行的研究，YGK静脉注射液可以阻止在病毒复制期间核苷酸的摄取以致病毒将变得虚弱和死亡。在另一方面，YGK胶囊有效用于肝细胞的保护和免疫功能调节。YGK静脉注射液和胶囊两种的结合使用可有效抑制HBV复制和刺激肝功能的恢复。
拉米夫定和YGK的联合治疗具有在HBV复制的多个阶段提供多种抗病毒功能的优势。首先，拉米夫定抑制HBV复制期间逆转录酶的酶活。第二，YGK静脉注射液阻止在DNA复制期间病毒对核苷酸的摄取。最后，YGK胶囊调节身体免疫功能以便刺激肝脏的恢复。
本研究的结果证明YGK和拉米夫定的联合治疗可以在8周内清除血清HBV-DNA。这是基于事实即在8周后100％的患者显示HBV-DNA阴性。两种YGK制剂形式的结合使用另外暗示开发对HBV的治疗方案。
尽管本发明已经通过实施例的方式和在优选实施例方面描述，应当理解本发明不受限于公开的实施方案。相反，它意欲包含诸如对于本领域技术人员显而易见的各种变体。因此，后附权利要求的范围应当给予最广泛的解释以便包含所有的这些变体。
权利要求
1.一种用于治疗肝病患者的方法，其包含向所述患者联合给药有效量的一种药物组合物和拉米夫定，其中所述药物组合物包含白花蛇舌草的整株，拳参的根茎，虎杖的根茎，和五味子的熟果的水性提取物。
2.按照权利要求1的方法，所述药物组合物另外包含北豆根根茎，黄苓根，牛黄粉，郁金块茎，山楂熟果和三七根的水性提取物。
3.按照权利要求2的方法，其另外包含枸杞子的熟果，红参根，玄参根，当归根和黄芪根的水性提取物。
4.按照权利要求3的方法，其中将所述药物组合物口服给药于所述患者。
5.按照权利要求4的方法，其中所述口服给药的药物组合物剂量为每人每日所述药物组合物的约0.5-5g所述水性提取物。
6.按照权利要求5的方法，其中所述口服给药的药物组合物的所述剂量为每人每日所述药物组合物的约1-3g所述水性提取物。
7.按照权利要求3的方法，其中所述药物组合物是通过静脉注射给药。
8.按照权利要求7的方法，其中所述药物组合物的剂量为每人每日所述药物组合物的约1-10g所述水性提取物。
9.按照权利要求8的方法，其中所述药物组合物的剂量为每人每日所述药物组合物的约3-5g所述水性提取物。
10.按照权利要求3的方法，其中将所述药物组合物同时口服和静脉内给药。
11.按照权利要1的方法，其中所述拉米夫定是口服给药。
12.按照权利要1的方法，其中所述拉米夫定是以每人每日50-500mg的剂量口服给药。
13.按照权利要12的方法，其中所述拉米夫定是以每人每日100-200mg的剂量口服给药。
14.按照权利要1的方法，其中所述肝病包含选自肝炎，肝硬化，和肝癌中的至少一种。
15.按照权利要1的方法，其中所述肝病是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所导致。
16.一种药物组合，其包含权利要求3的所述药物组合物的第一剂量单位和拉米夫定的第二剂量单位。
17.按照权利要求16的药物组合，其中所述药物组合物的所述第一剂量单位是选自所述药物组合物的口服剂量形式和所述药物组合物的静脉注射液中的至少一种。
18.按照权利要求17的药物组合，其中所述药物组合物的口服剂量形式的用量为每次给药约0.1-2g所述药物组合物和约1天2-4次。
19.按照权利要求17的药物组合，其中所述药物组合物的所述静脉注射液的用量为每次给药约1-10g所述药物组合物和约1天1次。
20.按照权利要求16的药物组合，其中所述拉米夫定是每次给药约50-500mg和约1天1次。
21.按照权利要求16的药物组合，其中将所述药物组合物用来治疗肝病患者。
22.按照权利要求16的药物组合，其中所述肝病是选自肝炎，肝硬化，和肝癌中的至少一种。
23.按照权利要求22的药物组合，其中所述肝病是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所导致。
24.一种防止在拉米夫定治疗停药后患者肝炎复发方法，其包含在拉米夫定治疗退出后向所述患者给药一种药物组合物；其中所述药物组合物包含白花蛇舌草的整株，拳参的根茎，虎杖的根茎，和五味子的熟果的水性提取物。
25.按照权利要求24的方法，所述药物组合物另外包含北豆根根茎，黄苓根，牛黄粉，郁金块茎，山楂熟果和三七根的水性提取物。
26.按照权利要求25的方法，所述药物组合物另外包含枸杞子的熟果，红参根，玄参根，当归根和黄芪根的水性提取物。
27.按照权利要求26的方法，其中所述药物组合物是口服或静脉内给药，或是口服和静脉内同时给药。
28.按照权利要求24的方法，其中所述肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所导致。
29.一种用于抑制患者中拉米夫定耐药性发展的方法，其包含向所述患者给药一种药物组合物；其中所述药物组合物包含白花蛇舌草的整株，拳参的根茎，虎杖的根茎，和五味子的熟果的水性提取物。
30.按照权利要求29的方法，所述药物组合物另外包含北豆根根茎，黄苓根，牛黄粉，郁金块茎，山楂熟果和三七根的水性提取物。
31.按照权利要求30的方法，所述药物组合物另外包含枸杞子的熟果，红参根，玄参根，当归根和黄芪根的水性提取物。
32.按照权利要求29的方法，其中所述药物组合物是口服或静脉内给药，或是口服和静脉内同时给药。
33.按照权利要求29的方法，其中所述拉米夫定耐药性是由患者中耐受拉米夫定乙型肝炎病毒(HBV)菌株的发展所导致。
全文摘要
本发明提供通过向患者联合给药一种药物组合物和拉米夫定治疗肝病患者的方法。药物组合物是草药组合物，其包含白花蛇舌草的整株，拳参的根茎，虎杖的根茎，和五味子的熟果的水性提取物作为核心成分。本发明还提供通过将本发明的药物组合物提供给拉米夫定治疗的患者，防止在拉米夫定治疗已经停止后患者肝炎复发和抑制患者中拉米夫定耐药性发展的方法。
文档编号A61K35/37GK1599617SQ02824119
公开日2005年3月23日 申请日期2002年10月4日 优先权日2001年10月5日
发明者邬之盛 申请人:邬之盛