包含多官能磷酸二酯酶抑制剂和腺苷吸收抑制剂的药物组合物的制作方法

专利名称：包含多官能磷酸二酯酶抑制剂和腺苷吸收抑制剂的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含至少一种多官能磷酸二酯酶抑制剂(MPDEI)和至少一种腺苷吸收抑制剂的药物组合物。MPDEI为至少抑制磷酸二酯酶III型(PDE3)和腺苷吸收(例如西洛他唑)的药剂。本发明也涉及使用该组合物的方法，该组合物可用于治疗多种症状和疾病，其中包括与外周动脉阻塞性疾病(PAOD)有关的肢体局部缺血和间歇性跛行(IC)，该组合物还可用于预防和治疗中风以及预防冠状动脉血栓形成和再狭窄。本发明提供了使用组合物的方法，以获得增强的治疗效能和功效，该方法的副作用小于单独使用MPDEI、传统PDE3抑制剂或腺苷吸收抑制剂时产生的副作用。该组合物具有增强抗血小板和血管舒张效果的能力，以及阻遏MPDEI或PDE3抑制剂的潜在的强心副作用的能力，这些能力提供了扩展MPDEI(例如西洛他唑)的已批准适应症和用法的可能性，使MPDEI(例如西洛他唑)可用于患有IC、中风或冠状动脉硬化性心脏病和充血性心力衰竭(CHF)的患者。
背景技术：
PAOD感染了美国(US)高达5％的老年患者，患有PAOD的患者死亡风险是心脏病和脑血管死因的6倍。IC是PAOD的一种常见的残废症状。患者通常声称不舒适，其特征变化不定，例如有步行时感觉病腿痛苦、疼痛或疲劳感等。美国仅有两种已批准的药物用于治疗IC。己酮可可碱面市已经二十年，但是它疗效有限。1999年美国食品和药物管理局(FDA)批准西洛他唑(Pletal)(6-[4-(1-环己基-1H-四唑-5基)丁氧基]-3，4-二氢-2(1H)-喹啉酮)用于治疗IC。在安慰剂-对照试验中，与安慰剂和己酮可可碱相比，西洛他唑显著地增大了踏车上的最大步行距离。
西洛他唑一直是公知的一种环状核苷酸PDE3抑制剂。环式核苷酸例如环腺苷单磷酸(cAMP)和环鸟苷单磷酸(cGMP)，在心血管系统内调解许多细胞反应中起重要作用。环状核苷酸的细胞内含量由两类酶的平衡活性控制。腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶分别调节cAMP和cGMP的从头合成。相反地，PDE的遗传上不同的十一个异构体，其生化和药理学属性不同，但都调节cAMP和/或cGMP的降解。PDE3异构体特定地作用于cAMP，并导致细胞内cAMP的消耗。PDE3在多种不同类型的细胞中得到表达，其中包括心肌细胞(cardiomyocytes)、血管平滑肌细胞(VSMC)和血小板。因此，PDE3分别影响心肌收缩性、VSMC紧张性和增殖，以及血小板活性。对PDE3的抑制导致细胞内cAMP的选择性积聚，并导致蛋白激酶A(PKA)诱发效应的增加。因此，减小上述细胞中PDE3活性导致增加心肌收缩性、血管舒张、减少细胞增殖，并减少血小板聚集。西洛他唑对IC患者的有益效果已被主要归因于PDE3抑制带来的血管舒张和抗血小板聚集效果，尽管其它效果也可能起作用。
PDE3抑制剂通常对心脏施加正面的变力性和变时性作用(即增强的收缩性和心率)。实际上，已经证实PDE3抑制剂对CHF患者中具有增加心输出量并减少肺充血的效果。例如，米力农作为一种原型的PDE3抑制剂目前在临床中用于CHF的急性治疗。然而，在CHF患者中长期使用米力农已与致心律失常活动有关(可能由于cAMP导致心肌收缩性过度增加(Packer，1992；Thadani和Roden，1998))。美国IC临床试验中尚未显示西洛他唑会增加心血管死亡率，而且在亚洲国家中已经证明了该药长期使用的安全性(西洛他唑的NDA(新药注册)，Otsuka AmericaPharmaceutical，Inc.，1997)。通常，CHF患者没有参与美国的西洛他唑IC试验，因为运动受限制的CHF是排除标准。因此，CHF患者(而且没有严重CHF患者)几乎没有参与美国的临床试验，所以该药对这个群体的患者的死亡率的影响是未知的。然而，基于之前的PDE3抑制剂例如米力农临床经验，FDA已经指示将西洛他唑用于治疗任何程度CHF的患者都是不可取的。不幸地是，IC患者的群体有可能与CHF患者重叠，因此PDE3抑制的有益效果通常不能及至这些患者。因此，重要的是研究出新的药理学方法以消除或减少西洛他唑和其它PDE3抑制剂可能的强心副作用，从而使西洛他唑疗法的益处得以延伸至同时患有IC和心脏功能障碍的患者。

发明内容
本发明通过提供抑制PDE3活性和腺苷吸收的药物组合物满足了这些需要。该药物组合物包括组合至少一种MPDEI(例如西洛他唑)和至少一种腺苷吸收抑制剂(例如双嘧达莫)。本发明中，至少一种MPDEI与至少一种腺苷吸收抑制剂的组合发挥协同作用以增加抗血小板效果和血管舒张，同时限制PDE3抑制的正面的变力性作用。在用于治疗包括PAOD(例如IC)、中风、冠状动脉血栓形成和再狭窄等多种症状和疾病时，与单独使用的任一种药剂相比，至少一种MPDEI与至少一种腺苷吸收抑制剂的组合应该比之更安全并且更有效。


图1图解说明了腺苷(adenosine，以下附图中也表示为Ado或A；1μM(10-6摩尔/升))和西洛他唑(cilostazol，以下附图中也表示为Cil、CLZ或C；1μM)对于胶原诱发的血小板聚集的协同效应。箭头表示洗涤血小板被胶原(1μg/ml)活化。
图2图解说明了双嘧达莫(dipyridamole，以下附图中也表示为Dip、DPY或D；1、3和10μM)和西洛他唑(10pM(10-9摩尔/升)～100μM)对于洗涤血小板中血小板聚集的剂量依赖性协同效应。
图3图解说明了存在腺苷(1μM)和西洛他唑(30nM((10-12摩尔/升)和100nM)的条件下，双嘧达莫(1、3和10μM)对于洗涤血小板中血小板聚集的协同效应。
图4图解说明了存在腺苷(1μM)和双嘧达莫(1、3和10μM)的条件下，西洛他唑(30和100nM)对于洗涤血小板中血小板聚集的协同效应。
图5图解说明了存在腺苷(0.3μM和1μM)的条件下，双嘧达莫(3μM)和西洛他唑(3μM)对于PRP(血小板丰富的血浆)的血小板中细胞内cAMP含量升高的协同效应。
图6图解说明了存在或不存在腺苷(1μM)的条件下，双嘧达莫(0.5、1、5和10μM)和西洛他唑(1μM)对于腺苷A2A表达的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中细胞内cAMP含量升高的协同效应。
图7图解说明了存在或不存在腺苷(1μM)的条件下，双嘧达莫(0.5、1、5和10μM)和西洛他唑(3μM)对于腺苷A2A表达的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中细胞内cAMP含量升高的协同效应。
图8图解说明了西洛他唑与米力农(milrinone，以下附图中也表示为Mil)在腺苷吸收进入洗涤的人血小板(WP)和洗涤红细胞(wRBC)的抑制效果方面的比较结果。
图9图解说明了全血中存在或不存在双嘧达莫(1μM)的条件下，由胶原(2μg/ml)刺激产生的血浆中腺苷含量的增加。
图10图解说明了双嘧达莫(0.1、0.3、1和3μM)和西洛他唑(10μM和30μM)对于由0.5μg/ml胶原诱发的全血中血小板聚集的协同效应。
图11图解说明了双嘧达莫(1和3μM)和低浓度西洛他唑(0.3、0.7、1和3μM)对于由0.1或0.3μg/ml胶原诱发的全血血小板聚集的协同作用。
图12图解说明了双嘧达莫(～1μM)和西洛他唑(～1μM)对于抑制活体外(Ex vivo)的全血血小板聚集的协同作用。
图13图解说明了用于研究西洛他唑和双嘧达莫对离体的家兔Langendorff心脏的心脏功能影响的试验方案。
图14图解说明了西洛他唑(1、3和10μM)和双嘧达莫(0.3、1和3μM)单独或组合使用对于收缩性(A)、心率(B)和冠脉血流(C)的影响。
图15图解说明了用于测试在腓肠肌肌肉静止、运动(使用电刺激)和通过闭塞股动脉造成局部缺血及再灌注期间，低含量西洛他唑和双嘧达莫组合对腓肠肌血流影响的试验方案。
图16图解说明，使用西洛他唑(1μM)和双嘧达莫(1μM)组合的治疗显著地增加了运动的腓肠肌肌肉中的血流，与未经治疗的肌肉相比，该治疗改善了在局部缺血一段时期后的血流恢复。
具体实施例方式
本发明致力于满足本领域中用于诸如PAOD(例如IC)、中风、冠状动脉血栓形成和再狭窄等病症的安全和有效药物组合物的需要。西洛他唑可以有效治疗IC，并已经证明可有效预防中风(Gotoh，Tohgi，Hirai，Terashi，Fukuuchi，Otomo，Shinohara，Itoh，Matsuda，Sawada，Yamaguchi，Nishimaru和Ohashi，2000)、冠状经皮冠状动脉血管成形术(PTCA)后的冠状动脉血栓形成(Park，Lee，Kim，Lee，Park，Hong，Kim和Park，1999)和再狭窄(Tsuchikane，Fukuhara，Kobayashi，Kirino，Yamasaki，Izumi，Otsuii，Tateyama，Sakurai，和Awata，1999)。西洛他唑抑制PDE3，所产生的抗血小板和血管舒张作用看起来有助于其治疗作用。然而，PDE3抑制剂可能的强心副作用令人担忧。实际上，由于之前的使用米力农的临床经验，西洛他唑用于任何程度的CHF都是不可取的。
最近的研究表明西洛他唑具有一种料想不到的作用机理，该机理不同于米力农。实际上，已经证实西洛他唑具有抑制腺苷吸收进入多种细胞的效果，其中包括心肌细胞、冠状平滑肌细胞、内皮细胞、红细胞和血小板。西洛他唑以约5-10μM的IC50抑制腺苷吸收。与此相反，米力农在高达100μM(Liu等，2000)的浓度时却仍没有明显的抑制效果。由于其抑制PDE3和腺苷吸收的能力，本发明人考虑西洛他唑作为MPDEI。
因为腺苷诱发广泛的包括血管舒张和抑制血小板聚集在内的生物效应，所以抑制腺苷吸收是重要的。腺苷还对心脏施加负面的变力性和变速性作用。腺苷对于脉管系统和血小板的作用是通过活化腺苷A2受体间接施加的。腺苷A2受体触发Gs蛋白质以刺激腺苷酸环化酶，从而增加细胞内cAMP浓度。腺苷对于心肌的已知抗肾上腺素能作用是通过活化腺苷A1受体间接施加的。腺苷A1受体触发Gi蛋白质以抑制腺苷酸环化酶，从而减少细胞内cAMP浓度(Dobson和Fenton，1998；George等，1991；Narayan等，2000)。抑制腺苷吸收增加了腺苷的间质和循环水平。细胞外腺苷的增加的有利后果是增加PDE3抑制的抗血小板(Sun等，2001)和血管舒张作用，并减少PDE3抑制的正面变力性作用(Wang等，2001)。与米力农相比西洛他唑诱发心肌收缩性上升较少(Cone等，1999)，而且离体家兔心脏中腺苷A1拮抗物具有增加西洛他唑的强心作用的能力(Wang，Cone，Fong，Yoshitake，Kambayashi和Liu，2001)，由此证明PDE3抑制引起的腺苷对正面变力性的潜在拮抗效应。此外，腺苷已经涉及心脏保护(cardioprotection)中的重要局部介质(Downey等，1994)，并已经证实其可减少由骨骼肌和神经原中局部缺血和再灌注造成的伤害(Wang等，1996；Whetzel等，1997)。总之，腺苷可以在通过运动训练促使增加跛行距离中起一定作用，并且可以对IC相关症状施加有利影响(Laghi等，1997；Pasini等，2000)。
西洛他唑抑制腺苷吸收的效力比抑制PDE3的效力低了不止一个数量级(5-10μM相对0.32μM)(Liu等，2000)。西洛他唑引起的细胞外腺苷增加，虽然足以减少正面变力性并增强抗血小板聚集，但与强力的腺苷吸收抑制剂双嘧达莫(IC5010nM)相比仍然是温和的。因此，一种接近于增加功效并降低西洛他唑在治疗IC时可能的强心副作用的疗法是结合这种MPDEI与至少一种腺苷吸收抑制剂(例如双嘧达莫)。申请人已经发现西洛他唑与强力的腺苷吸收抑制剂的组合所产生的抗血小板效果大于PDE3抑制剂或腺苷吸收抑制剂单独使用时所产生的效果加和。实际上，这种组合产生的血小板协同抑制功能证实了不同作用机理的贡献。此外，已经发现这种组合减少了单独西洛他唑的正面变力性作用。此外，低含量西洛他唑与双嘧达莫的组合增加了运动中的腓肠肌肌肉的血流量并改善了局部缺血一段时期后的组织流量的恢复性(然而，每个药单独均不明显改变血流)。因此，所得到的组合提供了一种安全有效的治疗涉及血小板聚集和血管收缩的疾病的方法。这些疾病包括PAOD(例如IC)、中风和冠状动脉血栓形成。由于西洛他唑抑制平滑肌增殖，该组合也可以用来治疗冠状动脉再狭窄。
除了对IC的有益作用之外，已经证明西洛他唑可有效预防中风复发(Gotoh等，2000)。虽然不知道单独使用双嘧达莫是否有效，但双嘧达莫与阿斯匹林结合目前以Aggrenoxe市售(Boehringer Ingelheim)用于预防中风。Aggenoxe的有益疗效归因于双嘧达莫和阿斯匹林的加和抗血小板效果。多种研究已经证明西洛他唑具有超过例如阿斯匹林等其它抗血小板药剂的优点(Igawa等，1990；Matsumoto等，1999)。因为西洛他唑和双嘧达莫协同抑制血小板聚集，所以这两种药的组合应该至少在预防中风中有效。
西洛他唑已经成功地用于预防冠状动脉PTCA后的血栓形成(Park等，1999)，并已用于预防采用或者不采用斯坦特人工瓣膜固定架(stent)的PTCA后的再狭窄(Tsuchikane等，1999)。西洛他唑和双嘧达莫的组合通过减少有害的强心副作用，应该比单独的西洛他唑有效并且更安全。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含至少一种MPDEI和至少一种腺苷吸收抑制剂，所述成分的用量能够提供对血小板聚集的协同抑制。本发明的另一实施方案提供了包含至少一种MPDEI和至少一种腺苷吸收抑制剂的组合物，所述成分的用量能够提供协同升高细胞内cAMP含量。本发明同时提供了一种使用该组合物治疗PAOD(例如IC)、中风、冠状动脉血栓形成和再狭窄的方法，以获得增强的治疗效能和功效，该方法的副作用小于单独使用PDE3抑制剂或腺苷吸收抑制剂治疗期间可能出现的副作用。
这里使用的″PDE3抑制剂″是指能够抑制或选择性减少PDE III型的活性的药剂。本发明的PDE3抑制剂可以是任何已知的或还有待于发现的抑制PDE3的化合物。可接受的PDE3抑制剂包括下列物质联吡啶类，例如米力农和氨力农；咪唑啉酮类，例如匹罗昔酮和依诺昔酮；咪唑啉类，例如伊马唑旦和5-甲基伊马唑旦；二氢哒嗪酮类，例如吲哚利旦和LY181512；二氢喹啉酮类化合物，例如西洛酰胺、西洛他唑和OPC 3911；和其它化合物，例如阿那格雷、贝莫拉旦、异丁司特、伊索马唑、利沙齐农、莫他匹酮、奥普力农、酞嗪酰酯、匹莫苯、喹齐酮、氰胍佐旦和曲喹辛。
在这里使用的″MPDEI″是指能够抑制或选择性降低PDE3的活性并有效阻挡腺苷转移进入细胞的药剂。本发明的MPDEI可以是任何已知或还有待于发现的、抑制PDE3并减少腺苷的吸收的多官能PDE抑制剂化合物。可接受的MPDEI包括西洛他唑等其它还有待于发现的药剂。
在这里使用的″腺苷吸收抑制剂″是指有效阻挡腺苷转移进入细胞的任何药剂。该腺苷吸收抑制剂包括已证实可抑制腺苷转移的化合物、其类似物和衍生物，以及其它还有待于鉴定的腺苷吸收抑制剂。可接受的腺苷吸收抑制剂包括下列物质双嘧达莫；丙戊茶碱；地拉卓(dilazep)；硝基苄基硫代嘌呤苷；S-(4-硝基苄基)-6-硫代鸟苷；S-(4-硝基苄基)-6-硫代嘌呤苷；碘羟基-硝基苄基硫代嘌呤苷；米氟嗪；及它们的酯、酰胺和前药，以及它们的可药用盐。
本发明涉及通过施用药物有效量的至少一种MPDEI与至少一种腺苷吸收抑制剂的组合(即本发明药物组合物)来治疗PAOD(例如IC)、中风、冠状动脉血栓形成或特征为由过度血小板聚集或动脉阻塞等引起的其它症状或疾病，以及由平滑肌增殖引起的冠状动脉再狭窄。在这里使用的药物有效量是指能降低上述任何症状或疾病的发作率或严重程度的药剂的用量。如本领域普通技术人员所知，上述症状包括发病肢体的不适或痛苦以及坏疽等。总之，所述药物组合物的有效剂量将在血小板等血细胞以及血管平滑肌细胞中促使PDE3活性和腺苷吸收的降低，其用量足以防止、改善或治疗上述症状和疾病。
本领域普通技术人员能够使用本领域已知的技术确定和优化本发明的各种MPDEI和腺苷吸收抑制剂的剂量。这些技术列于，例如Goodman和Gilman所著的“The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗学的药理学基础)，第九版(1996)，3-41页”(此处全部引入作为参考)。通过利用已建立的分析方法、常规的剂量响应和时间响应研究以及常规药动学和新陈代谢研究可以确定和优化剂量。此外确定用于治疗的适当剂量所需的精确计算由本领域普通技术人员按常规的方法作出，这种计算是在其日常进行工作范围内而不需要过多实验。例如，细胞培养分析和动物研究得到的数据可用于制定供患者使用的剂量范围。根据所用的剂型和所用的给药途径，所述剂量可以在此范围内变化。至于本发明方法中使用的任何组合物，可以根据细胞培养分析初步估算治疗有效剂量。可以拟定剂量以获得细胞培养中测定的循环血浆浓度范围。当需施用两种或更多种化合物时，无论是以单一制剂或以分制剂形式，都可以拟定剂量以获得细胞培养中测得的循环血浆中两种或多种化合物之间的摩尔比范围。例如，本发明的一个实施方案中，包含西洛他唑和双嘧达莫的组合物产生的血液浓度对于西洛他唑是约0.3μM～约10μM，对于双嘧达莫是约0.1μM～约3μM。另一个实施方案中，包含西洛他唑和双嘧达莫的组合物产生的血液浓度对于西洛他唑是0.5μM～5μM或1μM～3μM，对于双嘧达莫是1μM～3μM的血液浓度。因此，本发明的一个实施方案中，包含西洛他唑和双嘧达莫的组合物所产生的血液中西洛他唑∶双嘧达莫的摩尔比为约0.1∶1～约1∶0.01。本发明的另一个实施方案中，包含西洛他唑和双嘧达莫的组合物所产生的血液中西洛他唑∶双嘧达莫的摩尔比为约0.16∶1～约1∶0.2，或约0.33∶1～约1∶0.33。采用目前临床上可以使用的制剂时，这些血液浓度水平相当于西洛他唑(Pletal)日剂量为20mg～300mg，双嘧达莫(Persantine-Retard)日剂量为200mg～600mg。另一个实施方案中，这些血液浓度水平相当于西洛他唑的日剂量为50mg～200mg或50mg～160mg，双嘧达莫的日剂量为200～600mg。因此，包含西洛他唑和双嘧达莫的药物制剂具有的西洛他唑∶双嘧达莫的重量比为约1∶0.7～约1∶30。另一个实施方案中，包含西洛他唑和双嘧达莫的药物制剂具有的西洛他唑∶双嘧达莫的重量比约1∶1～约1∶12，或约1∶1.25～约1∶12。可以通过高效液相色谱或本领域已知的其它方法来测定血液中含量。
此外，本发明方法中需施用的MPDEI和腺苷吸收抑制剂各自剂量的变化取决于例如有待治疗的具体症状和疾病、给药模式以及待治疗患者的年龄、体重和性别。实际上，因为个体患者在症状和疾病的严重程度上可能有很大的不同，而且每种药有其独特的治疗特性，所以对于每个患者精确的给药模式和使用剂量应由执业医师自行判断。
此处使用的″患者″是指需要治疗上述症状和疾病的任何人员或非人类的动物，或可从该治疗中受益的任何对象，其中包括人和非人类的动物。有待治疗的所述非人类的动物包括所有驯养和野生的脊椎动物，优选但是不限于老鼠、大鼠、兔子、鱼、鸟、仓鼠、狗、猫、猪、羊、马、牛和非人类的灵长类动物。
本发明的药物组合物包含有效成分(即至少一种MPDEI或其可药用盐和至少一种腺苷吸收抑制剂或其可药用盐)的制剂以及一种或多种可药用载体或赋形剂和选择性的其它治疗剂。所述载体必须是在与组合物中其它成分相容而且对其受体无害的意义上可接受的。当该组合的各个成分同时或分别给药时，它们通常以药物制剂的形式存在。
适合的制剂包括适用于口腔、直肠、鼻腔、局部(包括经皮的、面颊的和舌下的)、阴道或非肠道(包括皮下、肌肉内、静脉内和真皮内)给药的制剂。可以通过制药领域熟知的任何方法制备制剂，例如，使用例如Gennaro等人和Remington所著的“Pharmaceutical Sciences”(“药物科学”，第十八版，Mack Publishing Company，1990，特别是参见第8部分药物制剂及其生产)(此处全文引入作为参考)所述的方法。所述方法包括结合有效成分和作为一种或多种助剂的载体的步骤。所述助剂包括本领域常见的助剂，例如填充剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、滑润剂、着色剂、芳香剂和润湿剂。
适用于口服的制剂可以以分散的单元例如丸剂、片剂或胶囊剂等形式存在，这些单元中均包含预定量的粉末或颗粒状的有效成分或溶液或悬浮液状的有效成分。所述有效成分也可以以大丸剂或糊剂的形式存在，或者可以包含在脂质体内。
用于直肠给药的制剂可以以栓剂或灌肠剂的形式存在。
对于非肠胃给药，适合的制剂包括水性的和无水无菌的注射剂。该制剂可以存放在例如密封药瓶和安瓿等单位剂量的或多剂量的容器中，并可以贮存在冷冻干燥(冻干)的条件下，仅需要在使用之前加入无菌的液体载体例如水即可。
适用于通过鼻腔吸入给药的制剂包括细粉剂或雾剂，这些制剂可以通过使用剂量可计的增压气溶胶、喷雾器或吹药器产生。
本发明进一步包括制备药物组合物的方法，该方法包括将至少一种MPDEI(或其可药用盐)与至少一种腺苷吸收抑制剂(或其可药用盐)的组合与一种或多种可药用载体结合的步骤。
通过下列实施例举例说明本发明，但是决不意味着用这些实施例来限制本发明。
实施例实施例1西洛他唑和双嘧达莫协同抑制试管内(in vitro)的人洗涤血小板的聚集洗涤血小板的制备使用19G蝶形针通过双注射器技术向十名健康的志愿者(不服用药物至少10天)收集周围血样。机构审查委员会(institutional reviewcommittee)根据赫尔辛基宣言批准了该抽血程序。直接收集9体积的血液进入装有1体积柠檬酸三钠(3.8％)的注射器。以150xg在室温下用15分钟离心收集血小板丰富的血浆(PRP)。按照之前Cone等(Cone等，1999a)公开的柠檬酸盐冲洗法，由柠檬酸化PRP制备洗涤血小板(WP)悬浮液，描述该方法的文献此处引入作为参考。最后，将血小板再次悬浮于Tyrode氏HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液(136.7mM(10-3摩尔/升)NaCl，5.5mM葡萄糖，2.6mM KCl，13.8mM NaHCO3，1mM MgCl2，0.36mM NaH2PO4和10mM HEPES；pH7.4)。将血小板浓度调节至3.8×108血小板/ml。
测试用化合物的说明西洛他唑(OPC-13013)其为一种MPDEI，可通过提高cAMP含量来选择性地抑制PDE3并防止血小板聚集。(由日本德岛市的OtsukaPharmaceutical Co.Ltd.提供，Lot#B8E88M。)双嘧达莫其为一种抗血小板药物，可阻挡腺苷吸收进入血管细胞和血细胞。(加利福尼亚州拉霍亚的Calbiochem提供，Cat#322328，Lot#B11755。)ZM241385一种选择性的腺苷A2A受体阻滞剂。(密苏里州Ballwin的Tocris提供，Cat#1036，Batch#2/18074)对洗涤血小板的聚集的检测使用AG-10聚集分析仪(日本Kowa)根据透光性的变化定量检测聚集。维持洗涤血小板在室温，在收集血液后3小时内进行研究。将西洛他唑溶解在DMSO(二甲基亚砜)中，腺苷溶解在水中。进行适当的稀释以得到所需工作浓度，但是保持DMSO的最终浓度至多为0.2％。将血小板悬浮液(400μl)经移液管移入聚集比色杯，于37℃采用1,000rpm的转速搅拌1分钟以进行培育。然后加入药物或载体(DMSO)(0.4μl)再培育3分钟。测定与双嘧达莫的协同作用时，在加入药物或DMSO 1分钟后再加入双嘧达莫(1、3和10μM)和1μM腺苷，以使得双嘧达莫和腺苷总培育期为2分钟。然后，用1～2μg/ml胶原(宾夕法尼亚州Havertown市的Chrono-LogCorp.提供)刺激悬浮液。所记录的总聚集时间为15分钟。按占对照聚集(DMSO+乙醇+腺苷)的百分比给出后11分钟(加入胶原后)内的最大透光率。
西洛他唑和双嘧达莫协同抑制洗涤血小板的聚集为了研究腺苷和西洛他唑对于洗涤血小板聚集的协同效应，在1μM腺苷的存在下滴定用于每种给体的胶原的量。所用的胶原浓度是1μM腺苷不对聚集产生作用时的胶原的最小浓度(1～5μg/ml)。西洛他唑(1μM)或腺苷(1μM)自身对胶原诱发的血小板聚集影响很小(图1a、1b和1c)。然而，将这两者合用则完全抑制血小板聚集(图1d)。
存在腺苷(1μM)的条件下，将西洛他唑结合双嘧达莫(1、3和10μM)以对胶原诱发的洗涤血小板聚集产生浓度依赖性抑制作用。如图2所示，西洛他唑剂量依赖性地抑制血小板聚集。加入腺苷则使抑制曲线向左侧偏移(图2)。算得的IC50从2.66±0.41μM减少至0.38±0.05μM(p＜0.001，双尾(two-tails)配对Student t-检验)。双嘧达莫剂量依赖性地使西洛他唑连同腺苷的抑制曲线进一步向左偏移。在1、3和10μM双嘧达莫的存在下IC50分别偏移至0.17±0.04μM(p＜0.05)、0.11±0.66μM(p＜0.05)和0.01±0.01μM(p＜0.005)(表1)。该数据表明双嘧达莫和西洛他唑的组合对抑制血小板聚集施加的是协同效应，而不是加合效应。
表1西洛他唑对于血小板聚集的IC50

使用来自五个其它给体的洗涤血小板对西洛他唑和双嘧达莫的协同效应进行再次确认，但是这次的重点是30和100nM的西洛他唑。图3显示了在腺苷(1μM)和双嘧达莫(1、3和10μM)的存在下，与对照组(没有药物加入)相比，加入1和3μM西洛他唑时的血小板聚集的抑制百分率。与对照组相比，在所测试的浓度下双嘧达莫(1、3或10μM)或西洛他唑(30或100nM)单独使用时对洗涤血小板的聚集没有明显抑制效果(图3和4)。腺苷的加入(1μM，在该浓度没有观察到单独使用腺苷所带来的效果)显著增强了双嘧达莫的效果(图3)。加入100nM西洛他唑时观察到了进一步的增强效果，但是加入30nM的西洛他唑没有带来多少效果。因此，存在腺苷的条件下，由于两种化合物之间的协同效应，10μM双嘧达莫对于血小板聚集的抑制效果可以通过使用1μM双嘧达莫与100nM西洛他唑的组合而获得。图4显示了，存在1μM腺苷和30或100nM西洛他唑的条件下，加入1、3或10μM双嘧达莫时，其与对照组相比对血小板聚集的抑制百分率。30或100nM西洛他唑与1μM腺苷的组合显示出与对照组的显著差异，但是这两者单独使用时则与对照组没有差异。加入含两个西洛他唑浓度(30和100nM)的组合的双嘧达莫在其全部三个浓度均明显增强抑制效果。此外，在腺苷的存在下，由30nM西洛他唑与3μM双嘧达莫的组合可以获得与100nM西洛他唑的相当的效力，这一点可以用于说明两种化合物之间的协同效应。正如预计的那样，西洛他唑与双嘧达莫的组合如果不采用腺苷，则该组合对洗涤血小板聚集没有影响(数据没有列出)，这说明腺苷为西洛他唑与双嘧达莫之间产生协同效应的介质。因此，这些实验清楚地证明西洛他唑与双嘧达莫的组合协同抑制了血小板聚集。这将使得组合中各药剂可以使用低得多的浓度获得由单独使用高浓度的各试剂时得到的相同效能。据信该协同效应是由于细胞内cAMP含量的上升得到了增强，这一点如下文所证明。
实施例2西洛他唑和双嘧达莫协同增加细胞内cAMP的浓度血小板中的cAMP的测定首先将腺苷、西洛他唑或双嘧达莫单独或以组合的形式等分放入分开的聚丙烯试管。以DMSO和乙醇作为对照物。以短时间的涡流将待测试剂单独或以组合的形式与PRP混合。最终样品体积为200μl，各试验平行进行两次。在37℃培育样品5分钟后，通过加入50μl冰冷的过氯酸(PCA，1.25N)结束反应。在冻结和解冻一次后，用50μl KHCO3(1.25N)中和混合物，并在4℃以20,000xg离心15分钟。收集得到的上清液并用试剂盒提供的乙酸酯缓冲液稀释。使用cAMP放射免疫分析试剂盒(NEK-033，NEN Life Science，波士顿市，马萨诸塞州)平行测定cAMP浓度两次。
确立CHO细胞表达的人腺苷A2A受体从新鲜的人血小板提取全部RNA，将5μg逆转录为cDNA并用作聚合酶链式反应(PCR)的模板。设计具有用于腺苷A2A受体的Kozak序列(CCCACC)的特定引物(正向引物5′-CCCACCATGCCCATCATGGGCT-3′，反向引物5′-TCAGGACACTCCTGCTCC-3′)，并由Life Technologies(罗克维尔，马里兰州)合成。使用这些引物，用PCR扩展全部编码区并进一步重组成为克隆载体，pCR2.1(Invitrogen，卡尔斯巴德市，加利福尼亚州)。插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1+(Invitrogen)之前，确认该插入片段的DNA序列。从Stratagene(拉霍亚，加利福尼亚州)购得启动子区域包含cAMP响应单元(c-AMP-response elementCRE)的表达载体(pCRE-Luc)，所述CRE驱动萤光素酶的表达。萤光素酶表达水平反映了细胞内cAMP的浓度。已知腺苷A2A受体与Gs蛋白质发生偶合(Huttemann等，1984)。因此，这些受体的活化将由萤光素酶的表达反映出来，其中可以用萤光素酶活性试验来测定表达水平。通过磷酸钙沉淀进入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来进行萤光素酶报告载体与包含腺苷A2A受体的载体的共转染。用1.0mg/ml G418(Life Technologies)选择稳定的转染子12天。在腺苷的刺激下通过萤光素酶表达来测定具有细胞克隆过度表达官能的腺苷A2A受体。
萤光素酶试验为了测试存在或者不存在腺苷时的西洛他唑与双嘧达莫对于cAMP升高的协同效应，对细胞进行次代培养直至接近融合时放入具有透明底部的白壁96孔板(Corning Costar Co.，坎布里奇，马萨诸塞州)中。第二天，采用添加了0.5％FCS的F12K培养基将细胞洗涤一次，然后仅用100μl培养基(基准)或采用外加待测试剂的培养基在37℃使这些细胞培养4小时。平衡至室温后，在每个孔中加入100μl检测基质(Bright-GloTM萤光素酶分析体系，Promega，麦迪逊市，威斯康星州)。5分钟后使用MediatorsPhL荧光板读数器(ImmTech，New Windsor，马里兰州)测量萤光素酶活性。将半秒内检测到的荧光值(任选计量单位)记作萤光素酶活性。
西洛他唑和双嘧达莫协同增强细胞内cAMP含量首先研究PRP中双嘧达莫和西洛他唑对于细胞内cAMP浓度的影响。如图5A和5B所示，与单独使用时相比，在0.3或1μM腺苷的存在下，双嘧达莫(3μM)结合西洛他唑(3μM)进一步增加了血小板内的cAMP含量(n＝2的平行试验2次)。由于血小板中基准cAMP含量较低，我们在过度表达人血小板腺苷A2A受体的CHO细胞中设立了萤光素酶试验。萤光素酶活性的量反映了细胞内cAMP含量。双嘧达莫对于腺苷吸收的抑制效果在血小板和红细胞中是类似的。图6显示出在0.03μM腺苷和/或1μM西洛他唑的存在下双嘧达莫对于萤光素酶活性的影响。类似地，图7显示出在0.03μM腺苷和/或3μM西洛他唑的存在下双嘧达莫对于萤光素酶活性的影响(至少三次独立实验中重复三次测定的代表性数据)。如图6和7所示，在双嘧达莫的存在下，1和3μM西洛他唑协同提高了萤光素酶活性，甚至在采用3μM西洛他唑的情况下无腺苷时也是如此。双嘧达莫在0.5μM～10μM的范围内剂量依赖性地增强了西洛他唑的作用，峰值在约5μM。总之，这些研究证实西洛他唑和双嘧达莫协同增加了细胞内的cAMP浓度，这些研究还提供了一种可能的机理，通过这个机理这些药剂协同抑制了血小板聚集。
实施例3西洛他唑抑制腺苷吸收腺苷吸收进入洗涤血小板和红细胞的试验按如下所述制备洗涤红细胞(wRBC)。初步离心并除去PRP和血沉棕黄层后，将100μl红色颗粒部分稀释进入12毫升包含钙和镁的PBS(磷酸缓冲溶液)。以150xg旋转RBC 5分钟。再一次用PBS洗涤后，在PBS中再悬浮颗粒状物，使其浓度为1×108RBC/ml。根据之前公开的方法进行腺苷吸收实验(Liu，Fong，Cone，Wang，Yoshitake和Kambayashi，2000)。用50μl西洛他唑或米力农以37℃培育100μl WP或wRBC 5分钟。然后，加入50μl的1μCi[3H]-腺苷(Amersham Pharmacia，皮斯卡塔市，新泽西州)、1μM腺苷和25μM红色9-(2-羟基-3-壬基)腺苷(EHNA，最终浓度，Sigma Chemical)，随后加入200μl油(邻苯二甲酸二丁酯∶邻苯二甲酸二辛酯＝1∶1，Aldrich)，然后培育1分钟。以16,000xg离心2分钟以将细胞与水相中的游离腺苷分离。除去油相和水相后，使用β-液体闪烁计数器(1209 Rackbeta，LKB，土尔库市，芬兰)测量细胞颗粒的放射性。
西洛他唑抑制腺苷吸收用洗涤血小板和洗涤红细胞进行[3H]腺苷吸收实验，结果示于图8。西洛他唑抑制了血小板和红细胞中的腺苷吸收，IC50约7μM(n＝3)。西洛他唑对于吸收抑制的效能类似于之前报道的家兔心肌细胞、人血管平滑肌和内皮细胞的值(5～10μM)(Liu，Fong，Cone，Wang，Yoshitake和Kambayashi，2000)。与此相反，米力农实际上对血小板或红细胞吸收腺苷没有影响。用CHO细胞过度表达的官能人A2A受体进一步证实西洛他唑在抑制腺苷吸收中的作用。西洛他唑抑制[3H]腺苷吸收进入这些CHO细胞的效能类似于对血小板和红细胞的效能，然而米力农没有作用(数据没有列出)。
实施例4西洛他唑和双嘧达莫协同抑制试管内(in vitro)的人全血中血小板的聚集全血的制备使用装有4μl水蛭素(250U/μl)/10ml血液的注射器由双注射器技术从十名健康的志愿者(不服用药物至少10天)收集周围血样品。
全血血小板聚集的研究用生理盐水1∶1稀释血样，使用Chrono-Log全血聚集度计以1000rpm的搅拌速度进行测试。开始，将搅拌棒放入塑料比色杯，随后加入1ml稀释的全血。然后将电极置于该比色杯中，使样品在37℃培育同时校准仪器。将西洛他唑和ZM241385溶解在DMSO中，原液浓度达到100mM。将双嘧达莫稀释在乙醇中(EtOH)至原液浓度100mM。进一步稀释使得加入到1ml全血时将得到适当测试浓度的西洛他唑(10μM和30μM，由于西洛他唑与蛋白质的结合性)、双嘧达莫(0.1、0.3、1或3μM)和ZM241385(0.1μM)。加入1μl体积的药物和载体使得DMSO的最终浓度不超过0.2％。加入胶原之前将悬浮液培育3分钟。用于该项研究的胶原浓度为0.5μg/ml，该浓度由初备筛选(preliminary screening)确定。为了测试西洛他唑和双嘧达莫之间的协同作用，加入西洛他唑1分钟后加入双嘧达莫(1μl原液)。为了了解这些药物的反向作用，加入这些药物之前1分钟加入0.1μM ZM241385(1μl)。加入药物3分钟后加入胶原，所以使得ZM241385培育共4分钟，西洛他唑或DMSO培育3分钟，双嘧达莫培育2分钟。刺激后，观察幅度11分钟并取最大幅度用作数据显示。为了测试是否更低浓度的西洛他唑也可以与双嘧达莫协同以抑制全血中的血小板聚集，我们以产生更小强度聚集但是与患者条件更为相关的稍低浓度的胶原(0.1或0.3μg/ml)来刺激血小板。检查西洛他唑(0.3、0.7、1和3μM)与双嘧达莫(1和3μM)组成的不同组合。数据表示为相对于无任何抑制时检测值的百分率。
血浆中腺苷浓度的测量提取血液并将其与重组体的人水蛭素(100U/ml)混合。使用与血小板聚集相同的程序以胶原(2μg/ml)来刺激血小板。5分钟培育后，快速混合500μl WB与500μl冰冷的盐水。将细胞在4℃以20,000xg旋转4分钟。首先将上清液(600μl)与300μl PCA(2.5 N)混合，然后用300μl的KHCO3(2.5M)中和。最后，在4℃以20,000xg来离心混合物15分钟。使用具有Hypersil 3μC18柱(150mm×4.6mm)和20mM KH2PO4中5～20％甲醇梯度的逆相高效液相色谱(HPLC，Waters Alliance 2690)来测量上清液的腺苷浓度。使用二极管阵列探头(Water 996)检测腺苷在258纳米处的吸收变化，并通过与已知的外标物比较保留时间和峰高进行定量。使用WatersMillennium 32 Client/Server软件进行定量分析。
血小板活化期间全血中产生大量腺苷通过使用HPLC，在使用2μg/ml胶原刺激后5分钟时测量全血的细胞外介质中的腺苷浓度。如图9所示，胶原刺激后在全血中产生大量腺苷(3152±428nM，与基准240±53nM相比，n＝5)，这可能是由于释放自活化血小板的ATP和ADP的降解造成的。在双嘧达莫(1μM)的存在下，血小板聚集未受影响，但是腺苷含量显著地进一步增加至5916±641nM(n＝3)。
西洛他唑和双嘧达莫协同抑制全血中的血小板聚集如同上述观察到的，无需在该试验中加入任何外源性的腺苷，因为大量腺苷可以在血小板活化期间产生。全血中，实验已经表明西洛他唑(10或30μM)或双嘧达莫(0.1、0.3、1或3μM)单独使用时对血小板聚集没有显著影响(图10)。然而，10μM西洛他唑和3μM双嘧达莫的组合显著地抑制血小板聚集(从单独使用10μM西洛他唑时的98.9±2.0％和单独使用3μM双嘧达莫时的97.9±0.7％降低到74.8±6.2％，n＝8，p＜0.005，图10A)。使用30μM西洛他唑与甚至较低浓度的双嘧达莫的组合可以得到更清楚的证明(n＝5～14，图10B)。该协同效应对于西洛他唑和双嘧达莫来说都是剂量依赖性的。另外，在作为选择性的腺苷A2A受体拮抗物的ZM241385(0.1μM)的存在下，双嘧达莫和西洛他唑的协同效应回复到了单独使用西洛他唑的基准水平(n＝8)，这说明该协同效应受血浆中腺苷的积聚的调解。
由0.1或0.3μg/ml胶原诱发全血聚集时，我们注意到西洛他唑(0.3μM～3μM)和双嘧达莫(1或3μM)的组合显著地抑制了血小板聚集(图11)。例如，0.7μM西洛他唑与3μM双嘧达莫的组合使血小板聚集下降了57±11％，1μM西洛他唑与3μM双嘧达莫的组合使血小板聚集下降了72±11％(p＜0.001)。以这些浓度单独使用的西洛他唑或双嘧达莫没有导致任何显著的抑制。
实施例5西洛他唑和双嘧达莫协同抑制活体外(Ex Vivo)的人全血内血小板的聚集临床研究的设计设计一周期、开放标记(open label)、连续进行的交叉研究以测试是否可以以临床上相关的剂量在健康志愿者中观察到西洛他唑和双嘧达莫对于抑制血小板聚集的协同效应。在研究期第一日六名受验者服用了100mg西洛他唑片剂(Pletal)。研究期第四日，受验者服用了200mg双嘧达莫片剂。研究期第六日，对受验者合用西洛他唑与双嘧达莫。
全血血小板聚集剂量给药之前和给药后2和4小时，抽取5毫升血液进入装有10U/ml分馏肝素的注射器。然后用生理盐水稀释血样，使用Chrono-Log全血聚集度计以1000rpm的搅拌速度测量血小板聚集。通过加入胶原来诱发血小板聚集(最终浓度0.3μg/ml，Nycomed Arzneimittel，Munchen，德国)。每个时间点记录聚集百分率。为了比较药物治疗效果，将2小时和4小时的聚集值归一化为剂量给药前的值的百分率。
西洛他唑与双嘧达莫的组合协同抑制了活体外的全血血小板聚集100mg单剂量给药后2小时和4小时，西洛他唑血液浓度为约2μM。基于上述药动学数据，200mg单剂量给药后2小时和4小时，双嘧达莫血液浓度也在2μM范围内。因为根据聚集度计制造商的说明书要求必须以盐水1∶1稀释血液，所以估算活体外的血小板聚集试验中有效药物浓度为西洛他唑1μM，双嘧达莫1μM。正如预计的那样，在这些浓度，西洛他唑和双嘧达莫都不能单独抑制血小板聚集(图12)。然而，受验者合用西洛他唑与双嘧达莫治疗后，4小时的血小板聚集受抑制而降低了45％(p＜0.001，相对于剂量给药之前)。这些结果非常类似于实施例4所述的试管内(in vitro)全血聚集研究得到的数据。
实施例6双嘧达莫抵消了西洛他唑对心脏功能的潜在有害作用外科手术准备该项研究是根据″实验动物照顾及使用指引″(由美国国家研究委员会出版，1996，华盛顿哥伦比亚特区)来进行的，并由Otsuka MarylandResearch Institute，LLC的机构动物照顾和使用委员会批准。使用静脉内戊巴比妥(30mg/kg)通过耳末稍血管麻醉称重2～2.5kg的雄性家兔(新西兰白兔)。进行气管切开术并把管子插进动物。经由哈佛(Harvard)小动物呼吸器使用充入了100％O2的室内空气进行换气。调节呼吸率以保持动脉血PO2、PCO2和pH在生理范围中。使用加热毯保持体温接近38℃。经由胸部中线切口暴露心脏，并由心脏基部的切口快速切除心脏并将其放入冰冷的Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液。然后将心脏通过主动脉根连接至Langendorff装置，并在75mmHg恒压灌注非再循环Krebs-Henseleit缓冲液。用95％O2和5％CO2气体混合物在灌注液中鼓泡，调节鼓泡率以保持生理pH(7.35～7.45)。通过缓冲贮器周围的循环水夹套维持灌注液温度为38℃。还通过具有水夹套的外壳维持在其中悬浮的心脏为38℃。该夹套顶部开口用一片半透膜覆盖以维持湿度和温度。装插管于主动脉根右侧附近的肺动脉，以用于收集冠状动脉流出物，以及用于以刻度量筒进行冠脉血的流速的测量。将经由导管连接至压力传感器的装满盐水的胶乳气球插入左心室并膨胀产生0～5mmHg的末端舒张压。将压力传感器连接到Grass Chart记录仪(7型)以记录左心室压力及其一阶导数(dp/dt)以及心率。该项研究中不包括15分钟平衡周期结束时左心室展开压力少于85mmHg的心脏。
心脏功能的测量所测的心脏功能的指标为LVDP(左心室的展开压力)、dp/dtmax(LVDP一阶导数的最大值)、心率和冠脉血流量。该试验方案示于图13。15分钟平衡后，用西洛他唑处理心脏5分钟，随后用西洛他唑和双嘧达莫处理5分钟。10分钟无药灌注后，用双嘧达莫处理心脏5分钟。在每5分钟药物处理结束时测量心脏功能。药物处理效果用每次药物处理前后值改变的百分率来表示自基线起的变化率(％)＝[(给药后数值-给药前数值)/给药前数值]×100统计分析使用平均值±SEM(标准均方误差)的方式给出数据，使用配对t-检验来检测显著性(p＜0.05)(Sigma Stat2.0，Jandel Corporation，圣拉斐尔市，加利福尼亚州)。
双嘧达莫抵消了由西洛他唑诱发的增加心肌收缩性和心率的上升以前的研究揭示西洛他唑在低于1μM的浓度下对心脏功能影响极小。还已证实在0.3～1μM浓度下双嘧达莫为非常强烈和有效的腺苷吸收抑制剂。因此，使用浓度1、3和10μM的西洛他唑和浓度0.3、1、和3μM的双嘧达莫进行这些实验。
正如预计的那样，0.3、1或3μM的双嘧达莫单独使用时对心脏功能没有明显影响。然而，3或10μM的西洛他唑显著地增大了心肌收缩性、心率和冠脉血流量。0.3、1或3μM的双嘧达莫显著地降低了西洛他唑诱发的心肌收缩性(图14A)和心率(图14B)的上升。1和3μM的双嘧达莫也加大了西洛他唑(10μM)诱发的冠脉血流量的上升(图14C)。最后，本研究说明双嘧达莫可以抵消西洛他唑对心脏功能的潜在有害作用。
实施例7低含量西洛他唑与双嘧达莫的组合增加了运动期间腓肠肌肌肉中的血流量并改善了局部缺血后血流的恢复性本实施例证明施用西洛他唑与双嘧达莫的组合将增加对运动骨骼肌的血液供给并改善体内局部缺血一段时期后的血流恢复性。准备家兔后肢以用于输注药物、刺激肢体以模仿运动和按如下所述测量血流。
外科手术准备用静脉内戊巴比妥(30mg/kg)经由耳末稍血管麻醉重量2.5～3.5kg的雄性家兔(新西兰白兔)。进行气管切开术并把管子插进动物。经由Harvard小动物呼吸器采用充入了100％O2的室内空气进行换气。使用加热毯保持体温接近38℃。在颈静脉装插管用于其它的麻醉和药物施用。将有腔管(4F)的Millar压力传感器(Miller Instruments，休斯顿市)插入左侧颈动脉并前进至左心室以用于测量左心室压力(LVP)和注入荧光微球。在右颈动脉中插管以用于测量动脉血压。两个后肢的股动脉经由从腹股沟韧带到膝部的大腿中间纵向的皮肤切口暴露。用动脉钳进行动脉阻塞，并通过除去夹钳进行再灌注。为了刺激肌肉收缩，在左后肢的坐骨神经上放置一对电极并将电极连接到Grass SD9刺激器。采用频率为1Hz、最大值为10V的8ms矩形脉冲产生刺激。将后肢摆成与大腿成90度的姿势。对侧的后肢作为对照物而不加刺激。
特定区域的血流测定根据″使用荧光微球测量器官灌流手册″(荧光微球资源中心，华盛顿大学，西雅图，华盛顿州)使用荧光微球来测量血流。从Molecular probes(尤金，俄勒冈州)购买荧光标记的青绿色、黄绿色、橙黄色、红色和深红色聚苯乙烯微球(直径15μM)。将每种颜色的微球以每公斤体重50万的量经由导管在20秒中注入左心室。同时，注射微球30秒前开始以2.5ml/min从右颈动脉抽取血样2分钟。最后，用致死量戊巴比妥钠(100mg/kg)令家兔安乐死。从左心室游离壁、肾和两个后肢的腓肠肌肌肉中取得组织样品(每片约1g)。称重样品，放置在试管中，处理以作消化和荧光测定。用荧光分光计测量荧光(Fluomax-2，Instruments S.A.，Inc，埃迪逊，美国新泽西州)。根据标准参考流量技术计算局部血流量，并将其表示为ml/min/100g。
实验方案实验时间过程显示在图15中。外科手术准备六十分钟后，将动物分成四组并对其施用载体(对照组)或西洛他唑(0.225mg/kg大丸剂，随后使用0.0175mg/kg/min静脉内注射)与双嘧达莫(20μg/kg/min静脉内注射)的组合(Cil+Dip)。预先确定药物注入方案，以便产生约1μM西洛他唑和约1μM双嘧达莫的血液浓度。手术六十分钟后，开始载体或药物组合的注射。20分钟后，在剩下的实验过程中一直刺激左后肢的腓肠肌肌肉。刺激二十分钟后(图15中40分钟时间点)，用夹钳夹住左侧股动脉20分钟以诱发局部缺血，然后松开以进行再灌注。通过注射0、20、40、60和80分钟的青绿色、黄绿色、橙黄色、红色和深红色荧光微球以测定局部血流。
统计以平均值±SEM的方式给出数据。把P＜0.05作为统计显著性水平(Sigma Stat 2.0，Jandel Corporation，圣拉斐尔市，加利福尼亚州)。这些数据在重复测量的同时通过使用双向(将群体和时间视作差异)的ANOVA(差异分析)分析，随后进行置后(post hoc)的Student-Newman-Keuls测试。
低含量西洛他唑与双嘧达莫的组合增加了运动肌肉中的血流量并改善了局部缺血后的血流恢复性施用西洛他唑和双嘧达莫的组合没有显著地改变静止的腓肠肌肌肉的血流量。在刺激显著地增加两个组中的腓肠肌肌肉血流时，该组合药物处理的肌肉中的血流显著地高于载体处理的肌肉中的血流(从载体处理的肌肉中35±7ml/min/100g到组合药物处理的肌肉中56±11ml/min/100g，p＜0.05)(图16)。药物组合处理的肌肉具有的左股动脉完全结扎20分钟后的血流也明显较高(51±9ml/min/100g相对于载体处理的肌肉中的29±6ml/min/100g，p＜0.05)。结果说明西洛他唑与双嘧达莫的组合增加了运动骨骼肌的血液供给，并改善了局部缺血一段时期后的血流恢复性。
上述实施例证明腺苷吸收抑制剂可以减少PDE3抑制剂的正面变力性和变速性作用。此外，实施例证明MPDEI与腺苷吸收抑制剂的组合导致了血小板聚集的协同降低，因此与单独使用任一种药剂相比，可以以以较低浓度同时使用这两种药剂，而不会对心肌收缩性产生不利的影响。实施例也证明虽然单独使用时预计将不能增加肌肉血流，但是低含量MPDEI与腺苷吸收抑制剂的组合显著地增加了运动肌肉中的血流，并改善了局部缺血一段时期后的血流恢复性。例如，血液浓度0.3～10μM的西洛他唑与血液浓度0.1～10μM的双嘧达莫的组合产生了血小板聚集的最佳曲线，而且心脏副作用可以忽略。因此，至少一种MPDEI与至少一种腺苷吸收抑制剂的组合例如西洛他唑和双嘧达莫，可以提供用于例如IC和中风的疗法，该疗法具有改善的功效，但是心脏副作用更小。
按照本说明书内引用的参考文献的教导可最彻底地了解本说明书，所有参考文献的全部内容在此引入作为参考。说明书内实施方案提供了本发明实施方案的例证说明，不应该解释为对本发明范围的限制。熟悉本领域的技术工人将认识到所要求保护的这项发明包括了许多其他实施方案，说明书和实施例应视为仅用于示范，本发明真正的范围和要旨由以下权利要求表示。
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权利要求
1.一种组合物，该组合物包含至少一种多官能磷酸二酯酶抑制剂即MPDEI或其可药用盐和至少一种腺苷吸收抑制剂或其可药用盐。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，至少一种MPDEI为西洛他唑。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，至少一种腺苷吸收抑制剂选自于由以下物质组成的组双嘧达莫、丙戊茶碱、地拉卓、硝基苄基硫代嘌呤苷、S-(4-硝基苄基)-6-硫代鸟苷、S-(4-硝基苄基)-6-硫代嘌呤苷、碘羟基-硝基苄基硫代嘌呤苷、米氟嗪及它们的酯、酰胺和前药，以及它们的可药用盐。
4.如权利要求1所述的组合物，该组合物包含西洛他唑和双嘧达莫。
5.一种组合物，该组合物基本上由西洛他唑和双嘧达莫或它们的盐组成。
6.如权利要求4或5所述的组合物，其中，所述组合物产生血液浓度为约0.3μM～约10μM的西洛他唑和血液浓度为约0.1μM～约3μM的双嘧达莫。
7.如权利要求4或5所述的组合物，其中，所述组合物产生血液浓度为约0.5μM～5μM的西洛他唑和血液浓度为1μM～3μM的双嘧达莫。
8.如权利要求4或5所述的组合物，其中，所述组合物产生血液浓度为约1μM～3μM的西洛他唑和血液浓度为1μM～3μM的双嘧达莫。
9.如权利要求4或5所述的组合物，其中，所述组合物产生的西洛他唑∶双嘧达莫的摩尔比在血液中为约0.1∶1～约1∶0.01。
10.如权利要求4或5所述的组合物，其中，所述组合物产生的西洛他唑∶双嘧达莫的摩尔比在血液中为约0.16∶1～约1∶0.2。
11.如权利要求4或5所述的组合物，其中，所述组合物产生的西洛他唑∶双嘧达莫的摩尔比在血液中为约0.33∶1～约1∶0.33。
12.如权利要求4或5所述的组合物，其中，所述组合物具有的西洛他唑∶双嘧达莫的重量比为约1∶0.7～约1∶30。
13.如权利要求4或5所述的组合物，其中，所述组合物具有的西洛他唑∶双嘧达莫的重量比为约1∶1～约1∶12。
14.权利要求4或5的组合物，其中，所述组合物具有的西洛他唑∶双嘧达莫的重量比为约1∶1.25～约1∶12。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1～14任一项所述的组合物以及一种或多种其可药用的载体。
16.一种方法，该方法用于(a)治疗患者的外周动脉阻塞性疾病即PAOD或中风；(b)诱导患者的血管舒张和/或阻断患者的血小板聚集；(c)治疗患者的冠状动脉再狭窄；或(d)减少患者的平滑肌增殖；该方法包括给所述患者施用治疗有效量的如权利要求1～15任一项所述的组合物。
17.如权利要求16所述的方法，其中，施用所述组合物时，对于西洛他唑是约20毫克/天～约300毫克/天，对于双嘧达莫是约200毫克/天～约600毫克/天。
18.如权利要求16所述的方法，其中，施用所述组合物时，对于西洛他唑是约50毫克/天～约200毫克/天，对于双嘧达莫是约200毫克/天～约600毫克/天。
19.如权利要求16所述的方法，其中，施用所述组合物时，对于西洛他唑是约50毫克/天～约160毫克/天，对于双嘧达莫是约200毫克/天～约600毫克/天。
20.如权利要求16所述的方法，其中，所述组合物产生血液浓度约0.3μM～约10μM的西洛他唑和血液浓度约0.1μM～约3μM的双嘧达莫。
21.如权利要求16所述的方法，其中，所述组合物产生血液浓度为约0.5μM～5μM的西洛他唑和血液浓度为1μM～3μM的双嘧达莫。
22.如权利要求16所述的方法，其中，所述组合物产生血液浓度为约1μM～3μM的西洛他唑和血液浓度为1μM～3μM的双嘧达莫。
23.如权利要求16所述的方法，其中，所述组合物产生的西洛他唑∶双嘧达莫的摩尔比在血液中为约0.1∶1～约1∶0.01。
24.如权利要求16所述的方法，其中，所述组合物产生的西洛他唑∶双嘧达莫的摩尔比在血液中为约0.16∶1～约1∶0.2。
25.如权利要求16所述的方法，其中，所述组合物产生的西洛他唑∶双嘧达莫的摩尔比在血液中为约0.33∶1～约1∶0.33。
26.如权利要求16所述的方法，其中，所述方法用于治疗患者的PAOD或中风。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述的PAOD为间歇性跛行。
28.如权利要求16所述的方法，其中，所述方法用于诱导患者的血管舒张和/或阻断患者的血小板聚集。
29.如权利要求16所述的方法，其中，所述方法用于治疗患者的冠状动脉的再狭窄。
30.如权利要求16所述的方法，其中，所述方法用于减少患者的平滑肌增殖。
全文摘要
本发明涉及药物组合物，该组合物包含至少一种多官能磷酸二酯酶抑制剂(MPDEI)和至少一种腺苷吸收抑制剂。本发明还涉及包含西洛他唑和双嘧达莫的组合物及其用途。
文档编号A61P21/00GK1607952SQ02826147
公开日2005年4月20日 申请日期2002年12月26日 优先权日2001年12月27日
发明者刘永革, 孙兵, 吉武益弘, 上林顺一 申请人:大塚制药株式会社