抗体的多顺反子表达的制作方法

专利名称：抗体的多顺反子表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型多顺反子表达系统和方法，用于使用这种表达系统在真核细胞中生产抗体。更具体地，本发明涉及真核多顺反子表达系统，其中抗体重链和轻链基因从相同的启动子转录，并且，更优选地，抗体重链和轻链基因被一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)隔开。
背景技术：
采用多顺反子表达载体在重组宿主细胞中表达所选基因的方法是众所周知的。在历史上，这样的多顺反子表达载体已经被使用，包括一个在转录区5’末端的目的产物基因序列和一个3’选择标记基因序列。这样的载体显示了3’选择基因的低效翻译，而优先地翻译在多顺反子mRNA的5’末端的目的基因序列。表达高水平的目的基因产物的重组宿主细胞通过一个单一步骤的方法获得，该方法包括在选择性培养基中培养原始转染体。这样的载体的一个缺点是上游阅读框架可能对选择标记基因的翻译施加不可预知的影响。参见Kaufman，Meth.Enzymol.，185487(1990)。例如，颁给Levinson等的美国专利第4,713,339号(在字面上转让给Genentech，Inc.)公开了一个能够在真核宿主细胞中生产目的基因产物的多顺反子表达系统。在这个Levinson等拥有专利的系统中，第二顺反子的基因序列编码了一个蛋白质，该蛋白质提供转染体或转化体的检测，该转染体或转化体表达由第一个顺反子编码的目的基因。某些生长条件在宿主细胞中诱导检测子基因的扩大表达，因而增强了编码包含在多顺反子转录单位中目的基因相关序列的表达。尤其是，Levinson构建了包含多顺反子的载体，其中编码乙型肝炎表面抗原的序列位于编码筛选标记二氢叶酸还原酶的上游。由于在Levinson的载体中的多顺反子的安排，同第一顺反子序列的表达相比，第二顺反子的下游标记基因序列存在不平衡表达。另外，多顺反子表达系统已经被用来表达多链多肽。例如，在颁给Dirks等的美国专利第6,060,273号；颁给Bublot的美国专利第6,033670；颁给Selby的美国专利第6,096,505号；颁给Marasco等的美国专利第6,143,520；颁给Audonnet等的美国专利第6,153,199号；颁给Johnston等的美国专利第6,156,558号中报告的多链多肽的多顺反子表达。研究者已经确定，通过在多顺反子内基因间加入内部核糖体进入位点，多顺反子中第二基因的水平被提高。IRES元件，最初在细小核糖核酸病毒中鉴定，通过直接招募和结合核糖体到信息上来调控翻译的起始，回避了参与典型的核糖体搜索中的7-甲基鸟苷帽。IRES序列的存在可以提高不依赖帽的目的蛋白的翻译。早期出版物说明地称IRES序列为“翻译增强子”。例如，心病毒RNA“翻译增强子”在颁给Palmenberg等的美国专利第4,937,190号和颁给Boris-Lawrie的美国专利第5,770,428号中描述。一些包含报告顺反子的IRES已经取得专利，如XIAPIRES(颁给Korneluk的美国专利第6,171,821和6,159,709号)。一个在多顺反子表达载体中具有已知用途的IRES序列是属于疱疹病毒；其它病毒也可以使用(参见美国专利6,193,980)。Korneluk公开这样构建的双顺反子载体，通过在具有CMV启动子的质粒中插入β-半乳糖糖苷酶和氯霉素乙酰转移酶报告序列，这样两个顺反子被一个100bp的包含IRES序列的顺反子间连接区域分隔。编码β-半乳糖糖苷酶的第一顺反子通过常规的依赖帽的机制翻译。编码氯霉素乙酰转移酶的第二顺反子只在前面的连接区域包含IRES位点时翻译。因此，Korne1uk表明IRES序列可以调控在双顺反子mRNA构建体中第二开放阅读框架的翻译，该mRNA构建体意在测定对压力的细胞反应。然而，只有标记序列被用在第二顺反子中，因为技术发展水平认识到在双顺反子安排中和第二序列表达相关的低效率。另外，采用多顺反子表达系统的可扩增标记的共表达已经被描述。例如，WO92/17566公开了一种用内含子修饰的选择基因和编码目的蛋白基因共转染宿主细胞的方法。内含子修饰的基因通过在一个选择基因的转录区域内插入一个内含子产生，这样内含子以降低的效率从mRNA上正确剪接下来。和未修饰选择基因序列相比，这种性质的低效率剪接导致低量的选择标记蛋白从内含子修饰选择基因上产生。尽管数量减少的选择基因和目的蛋白质同时产生时，这种模型并不在选择基因序列和目的基因序列间采用转录连接，因为这两个序列被不同的启动子驱动。使用双顺反子表达载体的抗体生产已经被公开，采用在二氢叶酸还原酶(DHFR)和编码目的抗体产物的核酸序列间具有转录连接的载体。参见颁给Crowley的美国专利5,561,053。Crowley的方法使用具有单一启动子的DNA构建体驱动选择标记序列和编码目的蛋白质的单一序列的表达。目的抗体的重链插入选择基因DHFR的下游，DHFR放置于DNA构建体5’末端的内含子内。内含子位于巨细胞病毒即早期启动子(CMV)和编码抗体重链序列之间。抗体轻链放置入第二载体，第二载体这样构建，放置轻链序列在SV40启动子/增强子的控制下并且可选择的潮霉素B抗性基因序列被CMV启动子/增强子和SV40 poly-A驱动。包含轻链和重链序列的载体线性化并且共转染入宿主细胞用以表达并且随后在轻链和重链间二硫键连接。因此，为了根据Crowley获得完整的抗体结构，两个载体必须被构建以分别表达抗体的重链和轻链组分。由于使用多载体，这个方法是低效的。Crowley的方法例证了与传统的多顺反子相关的位置效应引起的多个亚基的蛋白质表达的局限性。在多顺反子中5’和3’基因间表达的不平衡降低了用它来产生商业规模产量的多链蛋白质或相似目的产物的效率。颁给Dirks的美国专利第6,060,273号公开了这样的多顺反子表达单位，该多顺反子表达单位允许位于相应顺反子的基因的等摩尔表达。根据Dirks，可构建双顺反子表达载体以在IRES的帮助下表达两个目的基因，如PDGF-A和PDGF-B。在双顺反子表达载体中，增强第二顺反子表达的非洲爪蟾(Xenopus laevis)5’UTRβ-球蛋白序列帮助依赖IRES的翻译，这样达到顺反子1和2的等摩尔表达。双顺反子载体可以安排如下启动子-第一顺反子-IRES-β-球蛋白序列-第二顺反子。尽管Dirks的教导暗示了克服和一些多链蛋白质亚基多顺反子表达相关的低效率的方法，但本领域技术人员不认为其是一个令人满意的下游顺反子表达的不可预知性的解决方案。Mizuguchi等(IRES-dependent second gene expression is significantly lowerthan cap-dependent first gene expression in a bicistronic vector.Mol.Therapy，1(4)376-382(April，2000)研究了与几个培养细胞系的体外以及小鼠肝中的体内依赖帽的第一基因表达相比的依赖IRES的第二基因表达的效率。依赖IRES的第二基因表达是第一基因表达的6-100％，取决于在载体构建体种采用何种细胞类型和报告基因。另外，在双顺反子载体中何种基因位于第一的选择影响位于下游基因的表达。而且，Borman等指出IRES驱动第二顺反子序列不依赖帽翻译的效率极大地受到所选作为表达宿主的细胞类型的影响。(Comparison of picornaviral IRES-driven internal initiation oftranslation in cultured cell of different origins.Nucleic AcidsRes，25(5)925-932(1997))。注意到对于转染入不同细胞系的载体的各个IRES元件在活力上的显著差异。这些与在多顺反子表达系统中序列的下游翻译的不可预知性相关的事件与抗体的高效生产特别相关，因为轻链和重链表达的比例对于保证正确的抗体折叠和分泌是关键的。在这点上，Horwitz和同事推断因为一些抗体轻链天然分泌不足，轻链和重链的共表达和正确结合对于至少一些完整抗体的有效分泌是重要的。(Chimericimmunoglobulin light chains are secreted at different levelsinfluence of framework-1 amino acids.Mol.Immun.31(9)683-699(1994))。有趣地，Kolb等报道了在下面的基因组DNA双顺反子表达载体中的第二顺反子基因的低效表达CMV启动子-抗体轻链基因序列-IRES-抗体重链序列-多聚腺苷酸信号(Expression of arecombinant monoclonal antibody from a bicistronic mRNA.Hybridoma，16(5)421-426(1997))。Western印迹表明转染入小鼠骨髓瘤细胞后这种构建体产生了大量的轻链，但是重链蛋白几乎检测不到。由于考虑到未配对的重链引起的宿主细胞毒性，研究者特别设计这种双顺反子表达构建体来低效表达重链。完整的功能的抗体只在柱纯化后的这些细胞的上清中被检测到，表明这种IRES载体/细胞结合体不是商业使用规模上生产所选抗体的良好模型。就发明者所知，一个采用适合商业生产方案的多顺反子表达系统用于生产功能多链蛋白质(如抗体)的有效方法，迄今还没有在文献中报道。因此，存在着对在重组宿主细胞系统中生产商业上可接受的数量的抗体的有效方法的需要，其中可以用单一的构建体来表达两个或多个目的蛋白质产物，如目的抗体的轻链和重链。
发明概述本发明关于在真核宿主细胞中通过多顺反子表达系统以足够的水平表达功能(抗原结合)抗体。更具体地，本发明涉及采用多顺反子表达系统在真核细胞中表达功能的抗体分子，优选地是哺乳动物细胞、真菌或酵母细胞并且更优选地是(中国仓鼠卵巢)CHO细胞。本发明优选实施方案的一个方面是采用多顺反子表达系统在哺乳动物细胞中表达功能抗体，该多顺反子表达系统包含与至少一个抗体轻链编码序列以及至少一个抗体重链编码序列有效地连接的真核启动子，其中这种抗体编码序列被至少一个IRES隔开。在这个表达系统中，启动子最3’端的基因在它的3’末端具有一个poly A序列，在多顺反子的另外一个编码序列缺少poly A序列，在每个基因之前是起始密码子并以终止密码子结束。本发明的另外一个实施方案提供了一个多顺反子表达单位，该多顺反子表达单位包含在5’-3’方向上同抗体轻链编码序列有效地连接的CMV启动子，抗体轻链编码序列侧翼是起始和终止密码子，后面是一个或多个抗体重链编码序列。每个重链编码序列的侧翼也是起始和终止密码子。每对重链编码序列至少被一个IRES隔开，优选地是来自心病毒的，如人脑心肌炎病毒或脊髓灰质炎病毒。编码抗体轻链的DNA序列表达相对于编码抗体重链基因表达的比例优选地在10∶1-1∶2。更优选地，抗体轻链相对于重链以相对平衡的比例表达，即大约5/1-1/1并且甚至更优选地大约3/1-1/1，并且甚至更优选地大约1.5/1-1/1。本发明的另外一个实施方案是分泌抗体的真核细胞系，如CHO细胞系，其中所述抗体的表达是通过此处描述的多顺反子。在本发明的一个方面中，多顺反子在5’-3’方向上在CMV启动子后面包含分泌信号；抗体轻链编码序列，该抗体轻链编码序列包含起始和终止密码子但是并不包含poly A序列；IRES，该IRES优选地选自心病毒、脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒；至少一个抗体重链编码序列，每个有效地与分泌信号序列连接；并且每个重链编码序列3’是IRES，该IRES优选地选自心病毒、脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒，IRES，以及包含在位于多顺反子3’末端基因的3’末端的poly A序列。优选地，包含多顺反子的真核细胞每个细胞每天分泌大约5-100皮克的功能抗体。优选地，至少在连续3-4天的期间每个细胞每天分泌至少1-5皮克。在优选的实施方案中，真核细胞是CHO细胞或酵母细胞，如毕赤酵母(Pichia)。本发明的另外一个实施方案是哺乳动物或酵母细胞的培养物，该哺乳动物或酵母细胞包含能够生产功能抗体的多顺反子表达系统。根据本发明包含多顺反子序列的载体可以导入到哺乳动物或酵母细胞中。在细胞培养中，目的外源DNA序列可以导入目标哺乳动物和酵母细胞中，这样外源DNA通过同源重组插入到哺乳动物或酵母细胞的基因组中。依赖于所用的序列，可以从细胞培养物生物质或细胞培养基中回收功能抗体。通过同源重组在真核细胞(如哺乳动物细胞)的特定位点整合基因的方法和适合这种重组方法的载体在美国专利第5,998,144,5,830,698和6,413,777中公开，其全部内容此处引用作为参考。另外的实施方案是一种生产功能抗体的方法，该方法包括培养包含表达抗体轻链和重链序列的多顺反子表达系统的真核细胞，优选地哺乳动物或酵母细胞，以及从细胞培养物中回收功能抗体。功能抗体可以在适合治疗使用的水平上并在为最大商业产量而优化的条件下以成批饲养细胞培养生产。例如，在成批饲养培养物中生长的CHO细胞，其中葡萄糖水平被连续控制，可以生产重组蛋白至少12天或更多。参看，例如，参见美国专利第6,180,401号的关于在成批饲养培养中生长的细胞的重组蛋白的产量的讨论。
附图简述在此处讨论的图中进一步举例说明本发明，其中

图1描绘了编码HuCC49的多顺反子表达构建体的示意图，HuCC49是人源化抗TAG72抗体；图2描绘了NEOSPLA载体和在轻链和重链序列间的IRES位置的示意图；图3描绘了NEOSPLA载体的示意图，其中免疫球蛋白的轻链和重链基因序列位于独立的转录盒；图4描绘的是用HuCC49重链探针检测的多顺反子HuCC49G418抗性细胞分离物22E6和22B6的Southern印迹；图5描绘的是用HuCC49重链探针检测的多顺反子HuCC49G418抗性细胞分离物25A2和 2H10的Southern印迹并且图6显示表达构建体HuCC49的序列，HuCC49是结合TAG72的人源化抗体。图7示意地描述根据本发明的多顺反子表达构建体的构建。“L”表示前导序列，VL表示编码抗体轻链可变区DNA，以及VH表示编码抗体重链可变区的DNA。图8描绘用来构建根据本发明的多顺反子载体的质粒PCEMPTY A4。图9包含质粒PCEMPTY A4的核酸序列。图10描绘用来构建根据本发明的多顺反子载体的质粒PCEMPTY B。图11包含质粒PCEMPTY B的核酸序列。图12描绘根据本发明的表达HuCC49Gly/Ser的多顺反子载体Polycis 2。图13包含HuCC49Gly/Ser的核酸序列，HuCC49Gly/Ser包含在Polycis 2载体中。
实施方案详述在提供优选实施方案详述前，给出下面的定义。“IRES”或内部核糖体进入位点的含义是核酸分子如mRNA分子的区域，它允许内部核糖体的进入/结合在不依赖帽翻译的分析中足够起始翻译，例如在美国专利第6,715,821号中描述的双顺反子报告基因分析。在mRNA分子内部的IRES的存在使得连接的蛋白质编码序列的不依赖帽的翻译得以发生，否则，将不能被翻译。IRES首先在细小核糖核酸病毒中鉴定，并且被看作是不依赖帽翻译的范例。所有细小核糖核酸病毒的5’UTRS都是长的并且通过直接招募和结合核糖体调控翻译的起始，由此回避了最初的依赖帽的结合步骤。IRES元件常在病毒mRNAS中被发现，并且很少在非病毒mRNAs中被发现。迄今，在各自5’UTRS中显示含有功能IRES元件的非病毒mRNAs包括那些编码下列蛋白的mRNA免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)(Macejak，D.J.等，Nature 35390-94(1991))；果蝇触角足(Drosophila Antennapedia)(Oh，S.K.等，Genes Dev.61643-53(1992))；和超双胸(Ultrabithoran)(Ye，X等，Mol.Cell.Biol.171714-21(1997))；成纤维细胞生长因子2(Vagner等，Mol.Cell.Biol.1535-47(1915)；起始因子(Gan等，J.Biol.Chem.2735006-12(1992))；蛋白癌基因c-myc(Nambru等，J.Biol.Chem.27232061-6(1995))；Stonely M.Oncogene 16423-8(1998))；血管内皮生长因子(VEGF)(Stein J.等，Mol.Cell.Biol.183112-9(1998))。细胞IRES元件和IRES序列或相互间没有明显的序列和结构相似性并且因此使用翻译分析鉴定。另外已知的IRES是公开在美国专利第6,171,821中的XIAP IRES，此处完全引用作为参考。“依赖帽翻译(Cap-dependent translation)”的含义是7-鸟苷(7-guano)，7-甲基鸟苷帽必须出现在mRNA分子5’末端以起始mRNA翻译成蛋白质。“不依赖帽翻译”的含义是7-甲基鸟苷帽对于mRNA分子的翻译是不需要的。不依赖帽翻译机制包括核糖体的再起始，核糖体转轨(shunting)以及内部核糖体结合。“顺反子”的含义是“编码序列”或编码单一蛋白质或多肽的核酸序列。“报告顺反子”的含义是编码可检测基因产物的核酸片段；它可以在IRES的翻译控制下表达。“报告基因”的含义是编码产物的任何基因或可翻译的核酸序列，通过免疫学的、化学的、生物化学的或生物的分析，该产物的表达是可检测的和/或可计量的。报告基因可以具有，例如下面的性质之一荧光(如绿色荧光蛋白)、毒性(如蓖麻毒蛋白)、酶活性(如Lacz/β-半乳糖苷酶、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶)，并且具有被另一分子(如生物素或可检测的标记抗体)结合的能力。“启动子”的含义是足够指导转录的最小的序列，优选是在真核细胞中。具体地，启动子元件足够致使启动子依赖的基因表达可以细胞类型特异、组织特异或时间特异方式被控制，或可被外部信号或物诱导，这些元件可以位于特定基因的5’或3’或内含子序列区内。用于本发明的优选的启动子包括可以提供高水平表达的病毒、哺乳动物和酵母启动子，如哺乳动物CMV启动子、酵母乙醇氧化酶、磷酸甘油激酶启动子、乳糖可诱导启动子、半乳糖苷酶启动子、腺伴随关病毒启动子、杆状病毒启动子、痘病毒启动子、逆转录病毒启动子、腺病毒启动子、40启动子、HMG(羟甲基戊二酰辅酶A)启动子，TK(胸苷激酶)启动子，7.5K或H5R痘病毒启动子，腺病毒2型MPC晚期启动子，alpha-antrypsin启动子，因子IX启动子、免疫球蛋白启动子、CFTR表面活性剂启动子、白蛋白启动子和转铁蛋白启动子。“表达载体”是指DNA构建体，该构建体包含至少一个和下游基因有效地连接的启动子、顺反子或RNA编码区。此处，启动子可以和一个或多个基因或顺反子有效地连接，每个基因或顺反子的前面是起始密码子并且其后是终止密码子。将表达载体转染入受体细胞，即真核细胞，例如哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞，使得细胞能够表达由表达载体编码的RNA。表达载体包括，例如基因工程构建的质粒或病毒。“转化”或“转染”指将多顺反子载体或构建体导入合适的真核细胞以表达在其中的基因。“真核细胞”指任何可以用本发明的多顺反子表达系统生产或表达目的基因的真核细胞。这包括例如哺乳动物细胞如CHO、骨髓瘤、BHK、免疫细胞，昆虫细胞、鸟类细胞、两栖类动物细胞如蛙卵母细胞、真菌和酵母细胞。用于表达的酵母包括例如酿酒酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母(Hansenula)、念珠菌(Candida)、光滑假丝酵母(Torulopsis)、耶氏酵母(Yarrowia)、毕赤酵母(Pichia)等。特别优选的用于表达的酵母包括甲基酵母菌株(methylotrophic)如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、汉逊酵母、多形酵母(polymorpha)、季也蒙毕赤酵母(Pichia methanolica)、Pichia methanolica、Pichiainositovera等(参见如美国专利第4,812,405、4,818,700、4,929,555、5,736,383、5,955,349、5,888,768和6,258,559)。这些和其它的专利进一步描述了用于促进异源基因(如本发明的抗体基因)在酵母中表达的启动子、终止子、增强子、信号序列和其它调节序列。从本说明书中显而易见，采用本发明的多顺反子表达系统用于生产抗体的基因序列可以从许多不同来源获得。例如，多种人抗体基因可以以对公众开放的保藏形式获得。许多抗体和抗体编码基因序列已经发表，并且正如此处描写的合适的抗体基因可以从这些序列中合成。另外，抗体产生细胞系可以用本领域技术人员众所周知的技术筛选和培养。这些技术在多种实验室手册和初级出版物中描述。在这方面，如以下所述的适合用于本发明的技术在Current Protocols inImmunology，Coligan等，Eds.，Green Publishing Associate andWiley-Interscience，John Wiley和Sons，New York(1991)中描述，此处完全引用(包括增刊)作为参考。应该进一步理解本发明的范围进一步包含此处描述的DNA序列的等位基因、变体和突变。正如众所周知的，抗体编码RNA可以用标准技术从原始的产生抗体的杂交瘤细胞或从其它转化细胞中分离出来，标准技术如异硫氰酸胍提取和沉淀，随后离心或层析。如果需要，mRNA可以通过标准技术从总RNA中分离，标准技术如在OligodT纤维素上层析。适合用于这些目的的技术在本领域中是熟悉的并且在前述的文献中描述。编码抗体轻链和重链的cDNA可以同时或分别应用反转录酶和DNA聚合酶依照众所周知的方法制备。可以用通用的恒定区引物或用更多的基于发表的重链和轻链DNA和氨基酸序列的特异引物起始。如上面讨论的，PCR也可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在此情形中，可以用通用引物或更大的同源探针筛选文库，如小鼠恒定区探针。根据在前述关于重组DNA技术的文献中详细阐明的标准的众所周知的技术，编码轻链和重链的DNA可以通常以质粒DNA的形式从此处描述的细胞中分离、限制性酶谱测定以及测序。当然，根据本发明，在分离过程或随后的分析中的任何时候，可以修饰DNA。虽然发明的组合物和方法适合于任何抗体或任何多链蛋白质，在此处公开优选的抗体序列。适合本发明这个方面确切的寡核苷酸合成技术为本领域技术人员众所周知并且可以使用几种商品化的自动合成仪的任何一个来完成。另外，此处阐明的编码几种类型重链和轻链的DNA序列可以通过商品DNA经销商提供获得。采用任何一种前述的方法获得的遗传物质然后可以被改变或修饰以提供适于本发明的抗体和这种抗体所需的用途。多种不同类型的抗体可以根据本发明表达。此处所用的“抗体”指对某一抗原(如肿瘤相关抗原)具有显著的已知的特异免疫反应活性的装配物(assembly)，包括轻链和重链，在它们之间有或没有共价键并且因此包括单链抗体等。根据本发明的“修饰的抗体”是指免疫球蛋白、抗体或其免疫反应片段或重组体，其中至少一个或多个恒定区结构域的一部分已经被缺失或改变以提供所需的生化性质，例如当与具有大致相同的免疫原性的完整的、未改变的抗体(scAb)相比，前者具有非共价二聚化的能力，提高的肿瘤定位或改变的血清半衰期。用于本申请的用途，已经改变或删除了恒定区结构域的免疫反应性的单链抗体构建体可以被认为是修饰的抗体。正如上面所讨论的，采用本发明的多顺反子系统表达的优选的修饰的抗体或结构域缺失抗体可以使至少一个恒定区结构域的一部分被缺失。更优选地，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域被缺失，并且甚至更优选地完整的CH2结构域被缺失。脊椎动物系统中基本的免疫球蛋白结构(如抗体等)是比较清楚的。正如将在下面更详细地讨论，通用术语“免疫球蛋白”包括五种可以生物化学区分的不同类别的抗体。虽然所有五种类别明确地在本发明范围之内，下面的讨论将通常指IgG分子类别。关于IgG，免疫球蛋白包含两条分子量大约为23,000道尔顿的相同的轻多肽链，和两条分子量为53,000-70,000的相同的重链。这四条链通过二硫键连接成“Y”构型，其中轻链在“Y”的口开始括住(bracket)重链并且连续通过可变区。此处公开的二聚体装配物可以比作为两个结合的Y(H4L4)，于是将有四个结合位点。由此术语“四价体”抗体。更具体地，轻链和重链二者均被划分为结构和功能同源的区域。术语“恒定”和“可变”是功能性使用。在这点，可以理解轻(VL)链和重(VH)链的可变区都决定了抗原的识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物学特性，如分泌、通过胎盘迁移、Fc受体结合、补体结合等。随着恒定区结构域与抗原结合位点或抗体的氨基末端变远，按照规定恒定区结构域的编号升高。因此CH3和CL结构域实际上分别包括了重链和轻链的羧基末端。轻链被分类为κ或λ。每一重链类别可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链通过共价键彼此连接，并且在免疫球蛋白被杂交瘤、B细胞或基因工程构建的宿主细胞产生时，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键互相连接。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉子的末端的N-末端开始到每个链底部的C-末端。在N-末端的是可变区且在C-末端的是恒定区。本领域技术人员可以理解重链分为γ、μ、α、δ或ε，并且在它们中又分一些亚类。正是这个链的性质决定了抗体的“类”为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1等，被充分地测定性质并且已知赋予功能性特殊化。根据本公开内容对于本领域技术人员来说这些类和亚类的每个修饰的形式是易于理解的，因此，它们在本发明的范围之内。正如上面所示，可变区使得抗体选择性识别和特异性结合免疫反应性抗原上的表位。即，抗体的VL结构域和VH结构域结合形成可变区，该可变区确定了三维的抗原结合位点。这个四级(quaternary)抗体结构提供了存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由在每个VH和VL链上的三个互补决定区(CDR)确定。存在于每个单体抗体(H2L2)的六个CDR是短的、非连续的氨基酸序列，当在水溶液环境中抗体呈现它的三维构型时，该氨基酸序列特异性地定位以形成抗原结合位点。重链和轻链的可变结构域的其余部分在氨基酸序列上表现更少的分子间变异性并且被称为构架区。构架区大部分采用β-折叠构像而CDR形成环连接β-折叠结构，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，这些构架区形成支架，通过链间非共价相互作用使六个CDR定位在正确的方向。在任何情况下，通过定位的CDR形成的抗原结合位点确定了一个互补于免疫反应性抗原表位的表面。这个互补表面促进了抗体和免疫反应性抗原表位的非共价结合。用于本发明的用途，应该理解采用本发明的多顺反子表达系统表达的抗体可以包括任何类型使抗体和所选抗原结合的可变区。在这点上，所述可变区可以包括或来自任何类型的哺乳动物，该哺乳动物可被诱导发生体液应答并且产生针对目的抗原的免疫球蛋白。因此，修饰抗体的可变区可以是，例如，人、鼠、非人类灵长类(如猕猴、短尾猴等)或狼(lupine)源的。在特别优选的实施方案中适合的修饰的抗体的可变区和恒定区都是人的。在其它所选实施方案中适合的抗体的可变区(通常是来自非人源)可以工程构建或特异剪裁以提高分子的结合特性或减低免疫原性。在这方面，在本发明中有用的可变区可以是人源化或通过包含引入的DNA或氨基酸序列而改变。用于本申请用途的术语“人源化抗体”是指来自一种非人抗体的抗体，通常是鼠抗体，该抗体保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性，但是在人体内具有更小的免疫原性。这可以通过多种方法获得，包括(a)在人的恒定区上接入完整的非人可变区产生嵌合抗体；(b)接入至少一个或多个非人互补决定区(CDR)的一部分到人构架区和恒定区，同时保留或不保留关键的构架区残基；或(c)移植完整的非人可变区，但是通过取代表面残基用类人的部分将它们掩饰起来。这种方法公开于Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-5(1984)；Morrison等，Adv.Immunol.4465-92(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31169-217(1994)和美国专利第5,585,089、5,693,761和5,693,762，所有这些此处完全引用作为参考。本领域技术人员应理解在上面选项(a)中阐明的技术将产生“典型的”嵌合抗体。在本申请的背景下，术语“嵌合抗体”是指任何这样的抗体，其中的免疫反应性区域或位点获得于或来自一个物种，并且恒定区(根据本发明可以是完整的、部分的或修饰的)从另一物种获得。优选实施方案中，抗原结合区域或位点来自非人源(如鼠)并且恒定区是人的。可变区的免疫原性特异性通常不受其来源影响，而人恒定区比来自非人源的恒定区更小可能引发来自人受试者的免疫反应。某些嵌合抗体通过首先用目的抗原免疫猴子、分离针对该抗原产生的抗体并且用具有目的功能(如人效应分子功能等)的恒定区(如人)替代重链和轻链的恒定区而产生。这种“Primatized”抗体和产生该抗体的方法进一步在美国专利第5,658,570号中描述，此处完全引用作为参考。优选地，嵌合抗体重链和轻链的可变区均被一个或多个CDR的至少部分取代并且，如果必要，被部分构架区取代和序列改变而改变。尽管CDRs可以来自和获得构架区的抗体同一类别甚至亚类的抗体，但是CDR可以来自不同类别的抗体并且优选地来自不同物种的抗体。必须强调不必要用来自供体可变区的完整CDR替换所有的CDR以将一个可变区的抗原结合能力转移到另外一个。当然，可能只是有必要转移那些对维持抗原结合位点活性必须的残基。在美国专利第5,585,089,5,693,761和5,693,762号中所示的解释下，本领域技术人员完全能通过进行常规实验，或通过试验和错误检验来获得具有降低的免疫原性的功能抗体。尽管是对可变区的改变，本领域技术人员将理解适于本发明的修饰的抗体将包括抗体或其免疫反应性片段，其中至少一个或多个恒定区的一部分已经被缺失或被改变以提供目的生物化学性质，例如当与包含天然或未改变的恒定区的具有大约相同免疫原性的抗体相比时，提高的肿瘤定位或改变的(如减少的)血清半衰期。在优选的实施方案中，使用本发明的多顺反子载体表达的抗体的恒定区包括人的恒定区。适于本发明相的恒定区的修饰包括在一个或多个结构域中添加、缺失或替换一个或多个氨基酸。即，此处公开的修饰的抗体可以包括对三个重链恒定区(CH1，CH2或CH3)和/或轻链恒定区(CL)中的一个或多个的改变或修饰。正如下面的更详细的讨论和实施例所示，本发明的某些实施方案包含具有修饰的恒定区的抗体的表达，其中一个或多个结构域被部分或完全缺失(“结构域缺失抗体”)。在特别优选实施方案中适合的修饰的抗体将包括结构域缺失的构建体或变异体，其中完整的CH2被去除(ΔCH2构建体)。对于其它优选实施方案可用一个短的氨基酸间隔取代缺失的结构域以提供可变区的灵活性和自由运动。如前所示，不同免疫球蛋白类别的亚基结构和三维构型是众所周知的。例如，人的IgG Fc区域的CH2结构域用常规的编号方案通常大约从残基231延伸到残基340。CH2结构域独特性在于它不同其它结构域紧密配对。而且，在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域间插入两个N-连接分枝糖链。也有许多文件证明CH3结构域从CH2结构域延伸到IgG分子的C-末端，并且包括大约108个残基，同时IgG分子的铰链区连接CH2结构域和CH1结构域。该铰链区包括属于一类的(on theorder of)25个残基并且是灵活的，因而使得两个N-末端抗原结合区域可以独立地移动。除了它们的构型，本领域已知恒定区介导一些效应物功能。例如，补体的C1成分和抗体的结合激活补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理和裂解中是重要的。补体的激活也刺激炎症反应并且也参与自体免疫超敏性。而且，抗体通过Fc区和细胞结合，抗体Fc区域上的Fc受体位点和细胞上的Fc受体结合(FcR)。有许多的针对不同抗体种类特异的Fc受体，包括IgG(γ受体)，IgE(η受体)，IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体和细胞表面的Fc受体结合引发许多重要的和多样的生物学反应，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、抗体包被的目标细胞被杀伤细胞裂解(称作抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，或CDCC)、释放炎症调节因子、经胎盘的转移和免疫球蛋白产生的控制。尽管多种Fc受体和受体位点已经被研究到相当的程度，关于他们的位置、结构和功能仍有许多未知。如上讨论，通过一些此处描述的方法对恒定区的修饰使得公开的修饰的抗体能够自发装配或结合为稳定的抗体。而且，不限定本发明的范围，据认为包含如此处描述修饰的的恒定区抗体提供了改变的效应物功能，最终影响施用的抗体的生物学特性。例如，恒定区的缺失或失活(通过点突变或其它方法)可能减少循环的修饰的抗体的Fc受体结合因而增强肿瘤的定位。在其它情况下可能本发明的恒定区修饰缓和了补体结合并因此降低了血清半衰期和缀合的细胞毒素的非特异性结合。恒定区的其它修饰还可能用来消除二硫键或寡糖部分，使得由于增加的抗原特异性和抗体灵活性而增强定位。更通常的，本领域技术人员将意识到如此处描述修饰的抗体可能发挥能够或不能很容易地理解的许多微妙的(subtle)作用。然而修饰导致的生理特性、生物学利用率或其它生物化学效应，如肿瘤定位和血清半衰期，可以很容易地使用众所周知的免疫学技术测定和定量，而不需要过度的实验。相似地，根据本发明对于恒定区的修饰可以应用本领域技术人员众所周知的生物化学或分子工程技术容易地完成。在这方面，所附的实施例提供了多种具有根据本发明修饰的恒定区的构建体。更具体地，举例的构建体包括具有人恒定区的嵌合抗体和人源化抗体，该恒定区已经被改造以缺失CH2结构域。本领域技术人员将理解由于CH2结构域对于抗体的分解代谢速率的调节特性，这样的构建体尤其优选。ΔCH2结构域缺失的抗体在2002年1月29日申请的PCT/US02/02373和PCT/US02/02374中阐明，并且此处完全引用作为参考，ΔCH2结构域缺失的抗体来自嵌合C2B8抗体和人源化CC49抗体，嵌合C2B8抗体对于CD20panB细胞抗原是免疫特异的，并且人源化抗体CC49特异的针对TAG72抗原。正如下面的更详细讨论，两种结构域缺失构建体均来自编码IgG1人恒定区的专利载体(IDEC Pharmaceuticals，San Diego)。基本上，载体被改造以缺失CH2结构域并提供表达结构域缺失的IgG1恒定区的修饰的载体。然后将编码鼠C2B8抗体可变区或人源化CC49抗体可变区的基因插入到修饰的载体并且克隆。当这些载体在转化细胞中表达时，它们分别提供huCC49.ΔCH2或C2B8.ΔCH2。如下所述，这些构建体显示了许多特性，这些特性使他们成为单体亚基的非常有吸引力的候选者。应该指出前述举例的构建体被改造，将CH3结构域直接和各自的修饰的抗体的铰链区融合。在其它构建体中，可能希望在铰链区和修饰的CH2和/或CH3结构域间提供一个肽段间隔。例如，可能表达适合的构建体，其中CH2结构域被缺失并且存留的CH3结构域(修饰的或者未修饰的)通过一个5-20个氨基酸间隔和铰链区连接。例如可以添加这样的间隔，以保证恒定区的调控元件能够保持自由和可接近，或铰链区保持灵活。然而，应该指出氨基酸间隔可以在一些情况下证明具有免疫原性或抑制想要的单体亚基的二聚作用。例如结构域缺失的CC49构建体具有短的氨基酸间隔GGSSGGGGSG(Seq.ID No.1)以代替CH2结构域(CC49.ΔCH2[gly/ser])，因为其不会自发地装配为二聚体形式，在实例中用作对照。相应地，适于本发明的任何间隔将是相对非免疫原性，并且不抑制修饰的抗体的非共价结合。除了整个恒定区结构域的缺失，应该理解本发明的多顺反子抗体构建体可以通过部分缺失或替换一些或甚至单个氨基酸而获得，只要允许在单体亚基间的所需的非共价结合。例如，在CH2结构域中所选区域的一个氨基酸的突变足以基本上降低Fc结合并因此提高肿瘤的定位。相似地，可能希望缺失控制被调节的效应物功能的一个或多个恒定区结构域的一部分(如补体CLQ结合)。这种恒定区的部分缺失可能提高抗体的所选性质(血清半衰期)，同时保留和该恒定区结构域完整相关的其它所需的功能。而且，正如上面间接提到，本发明的抗体的恒定区可能通过突变或替换一个或多个氨基酸而被修饰，以加强所产生的构建体的性质。在这方面，可能破坏保守结合位点提供的活性(例如Fc结合)而相当大地保留修饰的抗体的构型和免疫原特性。其它的优选实施方案还可能包括向恒定区添加一个或更多个氨基酸以加强所需的性质，如效应物功能或提供更多的细胞毒素或糖附加物。在这种实施方案中，可能希望插入或复制来自所选恒定区结构域的特定序列。操作分离的遗传物质以提供如前面所阐述的抗体或修饰的抗体的基因后，然后将该基因插入到本发明的多顺反子表达载体中用于引入宿主细胞，该细胞可以用于生产所需数量的抗体。这些构建体的构造过程在下文详细描述。术语“载体”或“表达载体”在说明书和权利要求书中被使用，来表示用于本发明的载体作为将目的基因引入细胞并在细胞中表达目的基因的运载工具。正如本领域技术人员所公知，这样的载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒。通常，适于本发明的载体将包含选择标记、合适的限制酶位点，以促进目的基因的克隆和能够进入和/或在真核或原核细胞中复制。用于本发明的目的，可以使用许多多顺反子表达载体系统。例如，多顺反子载体可以包含来自动物病毒的DNA元件，如牛乳头瘤病毒、polyma病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40病毒。而且，已经在它们染色体内整合了多顺反子构建体DNA的细胞可以通过引入一个或多个能够选择已转染的宿主细胞的标记来选择。所述标记可给营养缺陷型宿主提供原养、杀生物剂抗性(如抗生素)或重金属(如铜)抗性。选择标记基因可以直接连接在待表达DNA序列上，或通过共转化导入相同的细胞中。也需要额外的元件用于mRNA的最佳合成。这些元件可包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。在优选的实施方案中，本发明将采用本发明新型的多顺反子表达系统表达抗体，包括修饰的抗体。在这些新型表达系统中，目的多基因产物，如抗体重链和轻链，可从单一多顺反子构建体产生。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)在真核宿主细胞中提供相对高水平的修饰的抗体。适合的IRES序列在U.S.P.N.6,193,980号中公开，该专利此处也完全引用。本领域技术人员将理解这样的表达系统可用来有效地生产本发明公开的全部修饰的抗体。更通常地，一旦编码单体亚基(如修饰的抗体)的载体或DNA序列已经被制备，可将该表达载体引入合适的宿主细胞。即，转化宿主细胞。可以通过本领域技术人员众所周知的多种技术完成质粒导入宿主细胞。这些包括，但不局限于，转染(包括电泳和电穿孔)，脂质体融合、磷酸钙沉淀、细胞和被膜DNA融合、显微注射和完整病毒感染。参见Ridgway，A.A.G..“Mammalian Expression Vectors”第24.2章，第470-472页Vectors，Rodriguez和Denhardt，Eds.(Butterworths，Boston，Mass.1988).最优选地，通过电穿孔将质粒导入宿主细胞。转化的细胞在适合于轻链和重链产生的条件下生长，并且分析重链和/或轻链蛋白质合成。用于鉴定和定量的目的基因产物的示例性分析技术包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或荧光激活细胞分选分析(FACS)、免疫组化等。此处所用术语“转化”应该广义上用于指任何DNA导入受体宿主细胞，它改变了基因型因而导致了受体细胞的改变。此处所用“宿主细胞”指已经用这样的载体转化的细胞，该载体是采用重组DNA技术构建并且编码至少一种异源基因。正如此处定义，抗体或其修饰体由通过这种转化而重组的宿主细胞产生。从重组宿主分离抗体的方法的描述中，除非另外明确规定，术语“细胞”和“细胞培养物”交互使用表示抗体的来源。换言之，抗体从“细胞”中回收可意味着从离心下的完整细胞或从包含培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收。用于蛋白质表达的宿主细胞系最优选的是哺乳动物来源；本领域技术人员能够容易地确定最适合表达目的基因产物的特定宿主细胞系。举例的宿主细胞系包括，但不局限于，DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR缺陷)、HELA(人宫颈癌细胞)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI的衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(卵巢肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤细胞)，P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤细胞)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾细胞)。CHO细胞是尤其优选的。宿主细胞系通常可以从商业、美国组织培养中心或发表的文献获得。体外生产允许放大以供给大量采用多顺反子表达系统生产的目的多肽，优选地是抗体。用于真核细胞，如，在组织培养条件下哺乳动物和酵母细胞培养的技术为本领域公知，并且包括均一悬浮培养(如在一个气举式(airlift)反应器内或在连续的搅拌反应器内)，或固定化或俘获细胞培养(如，在中空纤维、微囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷片上)。为了抗体的分离和回收，可首先浓缩在培养上清中的免疫球蛋白，如通过硫酸铵沉淀、对吸湿物质(如PEG)透析，通过选择膜过滤等方法。如果必要和/或需要，浓缩的多价抗体溶液用常规的层析方法纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素层析或(免疫)亲和层析。此处公开的是一个新型的表达系统，用于从单一多顺反子构建体生产目的多基因产物。和以前已知的多顺反子构建体不同，发明的表达系统产生足够水平有商业价值的位于在第一和随后的顺反子中的目的基因。这是令人惊奇的，迄今，与在第一顺反子中表达的基因序列相比，在多顺反子系统中位于第一顺反子后的基因序列以非常低的水平被表达。因此，以前的多顺反子表达系统通常局限于在第二顺反子表达标记序列，而不是目的基因序列。换言之，第二顺反子基因不被有效表达，由此阻止从包含在每个顺反子中的基因的可检测的翻译产物的产生。相反，根据本发明的多顺反子构建体可以含有两个、三个或更多顺反子，每个编码一个目的基因，如果需要的话。在优选的实施方案中，本发明采用多顺反子表达系统表达按照此处描述修饰的抗体，并且进一步包括二聚抗体，其中两个或多个抗体基因从相同的真核启动子开始表达，其中这样的抗体基因被一个或多个IRES隔开。尤其地，如前所述，本发明包括在2002年1月29日提交的PCT/US02/02373和PCT/US02/02374中描述的结构域缺失的抗体和其它修饰的抗体的表达，此处完全引用作为参考。用于表达的真核细胞优选哺乳动物或酵母细胞，最优选CHO细胞和其它可以被有效培养产生高水平蛋白质的细胞。正如上面指出的，用于整合入根据本发明的多顺反子表达系统的抗体重链和轻链基因的获得或克隆完全在常规技术范围之内。正如指出的，这样的抗体基因可编码成熟的重链或轻链抗体基因，如，鼠、兔、人、仓鼠等的，或这些重链和/或轻链基因可被修饰，如通过嵌合、人源化、结构域缺失或定点诱变。本发明进一步包含任何这样的重链和轻链序列的表达，当其使用本发明的多顺反子表达系统表达时，重链和轻链序列结合产生功能抗体，即可以和目标抗原(如肿瘤相关抗原)特异结合的抗体。正如所讨论的，可以选择在多顺反子构建体中的重链和轻链基因的拷贝数以获得优选的轻链/重链比例，如轻链通常以相对于重链10/1-1/1、更优选地是5/1-1/1、仍然更优选地是大约3/1-1/1的水平表达。在优选的实施方案中，表达系统在真核细胞中产生抗体，优选地是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、成纤维细胞系和骨髓瘤细胞。例如，使用CHO细胞作为包含多顺反子的表达系统的宿主，该多顺反子在5’-3’方向包括至少下面的序列真核启动子序列(该启动子序列在特定的用于表达的真核细胞中是有功能的，如CMV、SV40早期或肌动蛋白启动子序列，优选地是CMV)；编码抗体轻链的DNA序列和，优选地在它的5’末端的真核分泌前导序列；位于抗体轻链序列之后的内部核糖体进入位点(IRES)，优选地是来自心病毒、脊髓灰质炎病毒或疱疹病毒；至少一个编码抗体重链的DNA序列，优选地在每个重链序列的前面是真核分泌前导序列，两侧是5’的起始密码子和3’的终止密码子，其中编码抗体重链的一些或所有DNA与随后的重链序列被IRES隔开，并且其中最终的抗体重链编码序列在3’末端包括Poly A序列。在重链和轻链序列间一个合适的IRES位点的位置在图2的NEOSPLA载体内举例说明。正如此处指出，真核细胞优选地包括哺乳动物细胞，并且更优选地是CHO细胞。在一个优选的实施方案中，启动子是CMV启动子，并且IRES来自心病毒，如脑心肌炎病毒、门戈病毒(Mengo Virus)、Mous-Elberfiel病毒、MM病毒、和Columbia SK病毒，最优选地是人脑心肌炎病毒(hEMCV)。本发明的多顺反子优选地包含一个抗体轻链编码序列和一个或两个抗体重链编码序列。然而，根据本发明的多顺反子构建体可以包括3或4个基因序列或顺反子，例如，可以包含一个轻链和两个或多个重链。另外，本发明的多顺反子将优选地包括Poly A序列，优选地是来自牛生长激素(bGH)基因。多顺反子系统可以任选地用在同源重组的位置靶向(loci targeting)。在这个实施方案中，多顺反子构建体将包含促进在靶位点的同源重组的序列，如在重组后失活的基因。在一个优选实施方案中，本发明的多顺反子根据特定抗体重链和轻链基因表达的化学计量，包含一个或两个拷贝的重链编码序列。在这点上，众所周知在多顺反子表达系统中，第二基因通常比第一基因以更低的效率表达。因此，在一个实施方案中，本发明的多顺反子(其中第一顺反子编码抗体的轻链)可包含编码两个或多个重链编码序列的第二顺反子(如果认为必要)以次促进重链相对于轻链的充分表达。通常，优选重链以至少相等于重链和轻链的非多顺反子的共表达的水平(当用非多顺反子表达系统在相同的真核细胞中表达时)表达。这样是允许的，并且事实上是想要的，更多的抗体轻链相对于重链被表达，因为这是和内源的抗体产生细胞中所发生的是相似的。因为轻链指导抗体重链和轻链正确装配，并且过多的未配对的重链被认为引发细胞毒性，所以不同的表达水平是存在的。轻链对于指导已装配的抗体折叠以在内质网中产生功能(抗原结合)抗体也是关键的。优选地，抗体轻链相对于抗体重链以大约10/1-1/1被表达。然而，重链的水平绝不可以是微量的，并且应该以相对轻链足够的比例存在以商业可接受水平产生功能的、可分泌的抗体。因此，重链表达相对于轻链过于低是不合需要的，因为表达不足导致功能抗体的产量不充足。为了工业应用目的，功能抗体的产量不充足致使表达系统在商业上是不可行的，并且使得从批式培养回收完整抗体分子难以达到。通常地，功能抗体以每天每个细胞大约5-100皮克的量从培养细胞中回收，然而可以达到更高的表达水平。例如，培养细胞每天每个细胞可以分泌至少1-5皮克功能抗体，或至少3-4天内至少3-10毫克/升。关于上面的，相对与其它表达系统，给定的多顺反子表达系统是否能导致足够水平的抗体产生通常是难以预测的。因为在一些例子中，相对于第一基因，在多顺反子复合物中的第二目的基因以非常低的水平表达，所以产生了这种难以预测性。因此，多顺反子载体的优选的实施方案应该提供抗体轻链表达相对于抗体重链表达的比例为大约10/1-1/1。更优选地，轻链相对于重链基因表达的比例大约3/1-1.5/1。构建最初的IRES构建体，在第一顺反子中包含一个抗体轻链序列，随后是两个IRES-抗体CH2结构域缺失的重链序列对，由此保证了充足的重链蛋白的产生，以使适当水平的抗体能够在宿主细胞中产生和分泌。本发明的多顺反子载体通过合适的重链抗体序列的选择、通过有效的IRES的选择(如来自hEMCV的IRES)、或通过整合多拷贝抗体重链基因能获得所需的重链和轻链的表达水平。更进一步，对应于重链基因的5’末端的DNA可以通过定点诱变被修饰，而在ATG密码子周围的编码结构没有被改变，通常是最初的10个密码子，但是相对于未修饰的重链基因，该修饰导致重链编码序列表达的改变。采用本发明多顺反子表达系统的重链的产量通常低于轻链的产量，正如在内源抗体生成细胞中的典型的表达关系。轻链产量相对于重链产量的比例将足够使蛋白质能够分泌和折叠。轻链相对重链表达的比例可以例如通过增加在第一顺反子的轻链序列后的IRES连接的下游基因序列的数目而改变。可选择特定的IRES和表达细胞组合以最大增加系统中第二顺反子的表达量。根据本表达系统表达的抗体可特异于任何目的抗原。优选地，该抗体将是可以引发治疗效应的功能抗体，如对治疗自身免疫、炎症、感染、过敏或肿瘤疾病有用的抗体。该抗体可以和其它治疗剂组合来发挥协同效应。例如，该抗体可以和放射源组合用作癌症化疗剂。通常，根据本发明表达的抗体可以用在许多缀合的(也就是免疫缀合的)或非缀合形式的任何一个。尤其是，本发明的抗体可以缀合细胞毒素缀合，如放射性同位素、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素或前体药物。另外，本发明的抗体可以以非缀合或裸(naked)的形式使用以利用受试者本身的天然防御机制来消除恶性细胞。在尤其优选的实施方案中，根据本发明的表达系统生产的抗体可以被修饰，如缀合放射性同位素。使用许多众所周知的鳌合剂的任何一种或直接标记，根据本发明有用的同位素的实例包括90Y，125I，131I，123I，111In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166Ho，177Lu，186Re和188Re。缀合和非缀合的抗体可以在相同的治疗法中一起使用，如用在现在已批准的采用Zevalin治疗某种非何杰金淋巴瘤的疗法。在其它的实施方案中，本发明的抗体可以包括在组合物中，该组合物包含偶联药物、前体药物或生物应答调节剂如氨甲蝶呤、阿霉素和淋巴因子(如干扰素)的修饰的抗体。本发明还有其它的实施方案包括使用缀合特定生物毒素(如蓖麻毒素或白喉毒素(diptheriatoxin))的修饰的抗体。在其它实施方案中，修饰的抗体还可以和其它免疫活性配体(如抗体或其片段)复合，其中产生的分子与癌细胞和效应细胞(如T细胞)均结合。使用缀合和/或非缀合的修饰的抗体的选择将取决于癌症的种类和阶段、辅助治疗的使用(如化学疗法或外照射)和患者病情。应该理解鉴于此处教导对于本领域技术人员可以容易地做出这样的选择。此处所用“细胞毒素或细胞毒性剂”是指任何对细胞生长和/或增殖有害，并且可降低、抑制或破坏接触到这些试剂的细胞或恶性肿瘤的作用的物质。举例的细胞毒素包括，但不局限于，放射性核素、生物毒素、酶活性毒素、细胞抑制剂或细胞毒性治疗剂、前体药物、免疫活性配体和生物应答调节剂(如细胞因子)。正如下面将要更详细讨论的，在本发明中尤其优选地使用放射性核素细胞毒素。然而，阻止或减慢免疫反应性细胞或恶性细胞的生长或消除这些细胞，以及和此处公开的多顺反子产生功能抗体结合的细胞毒素在本发明的范围内。应该理解，在前面的研究中，用上面指出的同位素标记的抗肿瘤抗体已经被成功使用在动物模型和人体上，以破坏实体瘤以及淋巴瘤/白血病中的细胞。放射性核素通过产生电离辐射引起核DNA的多链断裂而导致细胞死亡来发挥作用。用于产生治疗缀合物的同位素通常产生具有短径长度(path length)的高能的α-或β-粒子。这些放射性核素杀伤与其极接近的细胞，例如缀合物已经附着或已经进入的肿瘤细胞。它们对于未定位(non-localized)的细胞有很小或没有作用。放射性核素基本上是非免疫原性的。关于和本发明结合的放射性标记缀合物的使用，修饰的抗体可以直接被标记(如通过碘化)或可以通过使用螯合剂间接被标记。此处所用短语“间接标记”和“间接标记方法”均指螯合剂共价连接于抗体以及至少一种放射性核素与螯合剂相结合。这样的螯合剂通常称作为双功能螯合剂，因为它们既结合多肽又结合放射性同位素。尤其优选的螯合剂包括1-异硫氰基苄基-3-methyldiothelene三氨基五乙酸(“MX-DTPA”)和环己基二亚乙基三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。其它鳌合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。尤其适合间接标记的放射性核素包括111In和90Y。此处所用短语“直接标记”和“直接标记方法”均指放射性核素直接共价连接于抗体(通常通过一个氨基酸残基)。更具体的，这些连接技术包括随机标记和定点标记。在后者的情况中，标记针对抗体上的特异位点，如只在缀合物的Fc部分上的N连接糖残基。直接标记可能产生标记物连接的多聚抗体。多种直接标记技术和方法适合于本发明。例如，锝-99m标记的四价抗体可以通过配体交换方法制备，通过用锡离子溶液还原高锝酸盐(TcO4-)，将还原的锝螯合到Sephadex层析柱上并且将抗体施加于这个层析柱上，或者通过成批标记技术，如通过将高锝酸盐、还原剂(如SnCl2)、缓冲液(如邻苯二甲酸钠-钾溶液)和抗体温育。在任何情况下，优选的用于直接标记抗体的放射性核素在本领域是众所周知的，并且尤其优选的用于直接标记的放射性核素是131I，131I可以通过酪氨酸残基被共价连接。根据本发明的修饰的抗体可以例如，使用放射性碘化钠或碘化钾和化学氧化剂(如次氯酸钠、氯胺T等)，或酶氧化剂(如乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖)。然而，用于本发明目的，间接标记方法通常是优选的。涉及螯合剂和螯合剂缀合物的专利为本领域所公知。例如Gansow的美国专利第4,831,175号涉及多取代的二乙三胺五乙酸螯合剂和包含该螯合剂的蛋白质缀物、以及它们的制备方法。Gansow的美国专利第5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和5,124,471号也涉及多取代的DTPA螯合剂。这些专利此处完全引用。其它适合的金属螯合剂的实例是乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，11-四氮杂十四烷、1，4，8，11-四氮杂十四烷基-1，4，8，11-四乙酸、1-氧-4，7，12，15-四氮杂十七烷基-4，7，12，15-四乙酸等。环己基-DTPA或CHX-DTPA是尤其优选的并且下面将详尽举例说明。仍然有其它的适合的鳌合剂，包括那些将会发现的，可以容易地为技术人员了解并且在本发明的范围内。优选选择适合的螯合剂提供三价金属的高亲和力、表现提高的肿瘤/非肿瘤的比例和降低的骨吸收以及放射性核素在目标位点(即，B细胞淋巴肿瘤位点)更大的体内保留，适合的螯合剂包括在序列号为08/475,813，08/475,815和08/478,967共同未决的申请中用于促进螯合的特异的双功能螯合剂。然而，其它的具有或不具有这些所有性质的双功能螯合剂为本领域所公知并且也可以对肿瘤治疗有用。也应该理解，根据此处的教导，修饰的抗体可能和不同的放射性标记缀合用于诊断和治疗的目的。可以制备用于给予治疗抗体之前的肿瘤诊断“成像”的放射性标记的治疗缀合物。“In2B8”缀合物包括鼠单克隆抗体2B8，(rituximab)特异于人CD20抗原，通过双功能螯合剂，即MX-DTPA(包括1-异硫氰基苄基(isothiocyanatobenzyl)-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-异硫氰基苄基-DTPA的1∶1混合物)连接到111In。特别优选111In作为诊断放射性核素是因为可以安全给予大约1-约10mCi而无可检测的毒性；并且成像数据通常预知随后的90Y标记的抗体的分布。多数的成像研究使用大约5mCi111In标记的抗体，因为同更低的剂量相比，这个剂量既安全又具有提高的成像效率，同时最佳成像发生在给予抗体后3-6天。参见，例如，Murray，J.Nuc.Med.263328(1985)和Carraguillo等，J.Nuc.Med.2667(1985)。正如上面所示，多种放射性核素可应用于本发明，并且本领域技术人员能容易地决定在不同情况下何种放射性核素最合适。例如，131I是用于靶向免疫治疗的众所周知的放射性核素。然而，131I的临床有效性受限于几种因素，包括8天的物理半衰期；碘化抗体在血液和肿瘤位点的脱卤作用；发射性质(如大的γ成份)可能不最适于肿瘤中的局部化剂量沉积。随着优良的螯合剂的出现，在蛋白质上结合金属螯合基团的可能性已经提高了使用其它放射性核素的机会，如111In和90Y。90Y提供了在放射免疫治疗应用中使用的几种益处90Y的64小时的半衰期长得足够使抗体在肿瘤处积聚，并且不像如131I，90Y是纯的高能β发射体，在它的衰变中不伴随γ辐射，在组织内作用范围为100-1,000个细胞直径长。而且，最低量的穿透辐射可以患者外(outpatient)给予90Y标记的抗体。另外，细胞杀伤不要求标记抗体的内化，并且电离辐射的局部发射应该对缺乏靶抗原的临近肿瘤细胞是致死的。有效的90Y标记的修饰的抗体的单次治疗剂量(即治疗有效量)为大约5-约75mCi，更优选地为大约10-40mCi。131I标记抗体的有效单次治疗非骨髓去除剂量为大约5-约70mCi，更优选为约5-40mCi。131I标记抗体有效的单次治疗去除剂量(即可能要求自体的骨髓移植)为大约30-约600mCi，更优选地为大约50-低于约500mCi。和嵌合抗体缀合，由于与鼠抗体相比较长的循环半衰期，有效的131I的单次治疗非骨髓去除剂量为大约5-约40mCi，更优选地是低于大约30mCi。虽然已经获得大量使用131I和90Y的临床经验，本领域已知其它放射性标记并已经用于相似的治疗用途。仍然有其它的放射性同位素用于显像。例如，其它同本发明范围相适合的放射性同位素包括，但不局限于，123I，125I，32P，57Co，64Cu，67Cu，77Br，81Rb，81Kr，87Sr，113In，127Cs，129Cs，132I，197Hg，203Pb，206Bi，177Lu，186Re，212Pb，212Bi，47Sc，105Rh，109Pd，153Sm，188Re，199Au，225Ac，211At，和213Bi。在这个方面，α，γ，β发射体均与本发明相适合。而且考虑到本公开内容应该认为本领域的技术人员可以容易地决定哪种放射性核素和所选的治疗过程相适合而无需过度的实验。为此，已经用于临床诊断的其它的放射性核素包括125I，123I，99Tc，43K，52Fe，67Ga，68Ga以及111In。抗体已经被标记上多种可能用于靶向的免疫治疗中的放射性核素。Peirersz等.Immunol.CellBiol.65；111-125(1987)。这些放射性核素更小程度上包括188Re和186Re以及199Au和67Cu。美国专利第5,460,785号提供关于这种放射性同位素的额外的数据并且此处引用作为参考。除了放射性核素，本发明的功能抗体可能和许多生物应答调节剂、药剂、毒素或免疫活性配体的任何一个缀合或结合。本领域技术人员将理解，取决于所选的细胞毒素，可以使用多种技术形成这些非放射性的缀合物。例如，通过二聚抗体和生物素活化酯(如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应制备生物素缀合物。相似地，荧光标记缀合物可以在偶联剂存在下(例如那些上面列出的)或通过和异硫氰酸酯(优选地异硫氰酸酯荧光素)反应来制备。本发明的四价抗体和细胞抑制剂/细胞毒素物质以及金属螯合剂的缀合物以相似的方法制备。优选的用于本发明的试剂是细胞毒素药物，尤其是那些用于癌症治疗的药物。这样的药物通常包括细胞抑制剂、烷化剂、抗代谢物、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂等。适合本发明的示例性的细胞抑制剂包括烷化物质，如mechlorethamine、三亚乙基磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安(busulfan)、美法仑(melphalan)或triaziquone，还有亚硝基脲复合物，如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)或司莫司汀(semustine)。其它优选的细胞毒剂种类包括，例如，蒽环霉素家族的药物、长春花生物碱家族药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒性核苷、蝶啶家族药物、diynene和鬼臼毒素。这些类别中尤其有用的成员包括，例如阿霉素、洋红霉素、道诺红霉素(道诺霉素)、阿霉素、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、甲基蝶呤、光辉霉素、链黑菌素、二氯甲基蝶呤、丝裂霉素C、放线菌素-D、甲基丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、floxuridine、替加氟(ftorafur)、6-巯嘌呤、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、podophyllotoxin或其衍生物如鬼臼亚乙苷或鬼臼亚乙苷衍生物、美法仑、长春花碱、长春花新碱、异长春碱、长春地辛(vindesine)、环氧长春碱等。其它适合本发明教导的细胞毒素包括紫杉醇、taxane、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、tenoposide、秋水仙碱、dihydroxyanthracin dione、mitoxantrone、普鲁卡因(procaine)、tetracaine、利多卡因(lidocaine)、propranolol、嘌呤霉素和它们的类似物和同系物。合适的细胞毒素也包括美登木素生物碱。激素或激素的拮抗剂，如类固醇(如强的松)、孕酮(如hydroxyprogesterone或medroprogesterone)、雌激素(如二己基己烯雌酚)、抗雌激素(如它莫西芬)、雄激素(如睾丸激素)，和芳香化酶抑制剂(如aminogluthetimide)，也适于此处的教导。正如前面指出的，本领域技术人员可以对目的化合物进行化学修饰以使该化合物的反应更加易于制备本发明的缀合物。尤其优选的细胞毒素的一个实例包括抗肿瘤抗生素的烯二炔(enediyne)家族的成员或衍生物，包括加利车霉素、埃斯波霉素或dynemicins。这些毒素极其有效并且通过切割核DNA导致细胞死亡发挥作用。蛋白质毒素可以在体内被切割而得到许多失活但是具有免疫原性的多肽片段，和蛋白质毒素不一样，如加利车霉素、埃斯波霉素和其它烯二炔的毒素是基本上非免疫原性的小分子。这些非肽毒素通过前面已经使用的标记单克隆抗体和其它分子的技术与二聚体或四聚体化学连接。这些连接技术包括定点连接，通过只出现在构建体Fc部分上的N连接糖残基。这样的定点连接方法有其优势，它可降低连接对构建体结合特性的可能的作用。正如前面提及，适合的细胞毒素可包括前体药物。此处所用术语“前体药物”指药物活性物质的前体或衍生物形式，前体药物和亲本药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性更小，并且能够被酶促激活，或转变为更加活性的母本形式。和本发明相适合的前体药物包括，但不局限于含有磷酸盐的前体药物、含有硫代磷酸盐的前体药物、含有硫酸盐的前体药物、含有肽的前体药物、含有β-内酰胺的前体药物，含有可任选取代的苯氧乙酰胺的前体药物或任选取代的苯乙酰胺前体药物，5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。这些前体药物可转变为更有活性的细胞毒性的游离的药物。细胞毒性药物的另外的实例包括那些上面描述的化学治疗剂，这些细胞毒性药物可衍化为本发明中使用的前体药物形式。在其它细胞毒素中，应该理解抗体也可以和生物毒素结合，生物毒素，如蓖麻毒素亚基A、相思豆毒素、白喉毒素(diptheria)、肉毒杆菌毒素、cyanginosins、石房蛤毒素、志贺氏毒素(shigatoxin)、破伤风毒素、河豚毒素、单端孢霉烯、疣孢菌毒素或毒酶。优选地，这样的构建体将采用基因工程技术获得，该技术使得抗体毒素构建体能够直接表达。其它的可以和本发明修饰的抗体结合的生物应答调节剂包括细胞因子，如淋巴因子和干扰素。鉴于本公开内容可以认为本领域技术人员能够容易地使用常规技术制成这样的构建体。另外一类可以用于与本发明的抗体缀合的适合的细胞毒素是可有效地针对肿瘤或免疫反应性细胞的放射敏化药物。这样的药物增强了对电离辐射的灵敏度，因而提高了放射治疗的效率。被肿瘤细胞内化的抗体缀合物会将放射敏化剂送至更靠近核，在那里放射敏化作用达到最大。游离的放射敏化剂连接的修饰的抗体将很快从血液中清除，存留的放射敏化剂局部化在目标肿瘤并且在正常组织给出最低的吸收。在很快从血液清除后，辅助的放射治疗将以三种方式之一给予1)特异针对肿瘤的外部射线辐射，2)直接注入肿瘤的放射性或3)使用相同导向抗体的全身的放射免疫治疗。这种方法的一个潜在的有吸引力的改变是将治疗的放射性同位素结合到放射敏化的免疫缀合物，因而提供给予病人单一药物的便利。无论公开的功能抗体是否以缀合或非缀合形式使用，应该理解本发明的一个主要优点是能在骨髓抑制患者中使用这些抗体构建体，尤其是那些正在经历或已经经历了辅助治疗，如放射治疗或化学治疗的患者。即，二聚抗体的有益的递送特性(即相对短的血清驻留时间、高的结合亲和性和增强的定位)使得它们尤其在治疗具有减少的红骨髓储量和对骨髓毒性敏感的患者有用。在这点上，功能抗体的独特的递送特性使得他们对于向骨髓抑制癌症患者给药放射标记的缀合物上特别有效。因此，缀合或非缀合形式的修饰的抗体对以前经历过辅助治疗(如外部射线辐射或化学治疗)的患者是有用的。根据本发明产生的功能抗体可结合肿瘤特异或肿瘤相关抗原(表达在特定细胞类型上的抗原，如T细胞或B细胞)、病毒抗原、细菌抗原或寄生虫。合适的抗原包括TAG-72，CD4，CD11，CD19，CD20，CD22，CD23，CD37，CD40，CD45，CD80，CD86和CD154。在本发明的一个优选的实施方案中，抗体将结合T细胞或B细胞表达的抗原，如CD4，CD19，CD20，CD22，CD23，CD40，CD80和CD154。在另外优选的实施方案中，抗体针对癌抗原(如CEA)、前列腺特异抗原、HER-2(erb B2)和肿瘤黏附分子等。所选抗体可以是人、人源化或嵌合抗体。尤其地，抗体可以是特异于CD20或TAG-72的人、人源化或嵌合抗体。CD20是B细胞表达的抗原，已被指定用来治疗B细胞疾病(如B细胞淋巴瘤和白血病)。Rituxan是已经被FDA批准的用于治疗非何杰金代淋巴瘤的嵌合抗CD20抗体。Tag-72是已知在众多人类癌症中过表达的抗原，包括消化道癌症(胃癌，结肠直肠癌，胰腺癌)和生殖器官相关的癌症(前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌)以及其它癌症，包括例如头颈癌和淋巴结转移。(参见如Galietta等，Oncol.Rep.9(1)135-40(2002)；Meredith等，Cancer Biother.Radiopharm 16(4)303-15(2001)；Karan等，Oncol.Rep.8(5)1123-26(2001)；Allende等，Int.J.Biol.Marker15(2)1997-99(2000)和Altimissi等，HNO 38*10)364-66(1998)，此处完全引用作为参考)。抗TAG-72的抗体已经报道在治疗这些癌症中具有治疗效果。编码抗体轻链和重链的DNA序列可以包含完整的或修饰的可变区和恒定区。恒定区优选的是人。可变区可以是灵长类和啮齿类动物来源，并且可以被人源化。灵长类可变区可以是人源。啮齿类可变区可以是，例如大鼠或小鼠(鼠)源。正如指出，结构域缺失的恒定区在本发明的范围内。被特定癌症类型特征性地过表达的抗原为本领域众所周知。优选的实施方案包含识别CD22或CD20的抗体的表达。在最优选的实施方案中，抗体将特异性结合CD22。甚至更优选地，抗体将包含抗体rituximab(RITUXAN，IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA，美国)的重链和轻链，如在例如美国专利第5,736,137；5,776,456和5,843,439号中讨论的。在颁给Hanna等的美国专利第6,136,310号(CD4)；颁给Reff的美国专利第6,011,138号(CD23)；颁给Anderson的美国专利第6,113,898号(CD80)；和颁给Black的美国专利第6,001,358号(CD54)中公开了适合用于本发明的抗体的实例。这些专利的完整内容此处引用作为参考。尽管本发明已经利用抗体举例说明，本发明适合表达任何不会破坏他们的哺乳动物细胞宿主生存力的多链蛋白质。第一和相继的顺反子的基因产物的比例通过提高在第一顺反子之后的亚基的数目而改变。因此，例如，两个或更多个顺反子，每个编码相同的目的基因产物，可以整合入多顺反子表达载体以增强目的基因产生的肽的绝对量。然而，如果需要每个在第一顺反子后面的相继的顺反子可以编码不同的产物。将通过下列非限制性实施例进一步阐明本发明。
实施例1多顺反子DNA表达载体根据本发明构建，表达人源化的抗TAG72抗体的重链和轻链，被称为HuCC49。
A.表达载体构建在图1中描绘的表达构建体包含小鼠β球蛋白主要启动子(β)，该启动子位于构建体内以驱动编码新霉素磷酸转移酶基因的序列的表达。属于细菌来源的新霉素磷酸转移酶基因由两个外显子组成，N1和N2，并且包含一个人造内含子。选择标记的内含子区插入的方法意在增强表达载体系统中基因产物的表达，该方法公开于，例如均颁给Reff的美国专利第5,648,267号，美国专利第5,733,779号，美国专利第6,017,733号和美国专利第6,159,730号。这些专利的每个的全部内容此处引用作为参考。所选抗体由于治疗实体瘤的适宜性为本领域公知。为了作用于实体瘤细胞，要求高水平的组织穿透，并且因此在血清内抗体应该比Fab片段具有相对更长的半衰期。用在这个实施例中的结构域缺失的构建体包含人γ1重链恒定区，其中大部分CH2结构域已经被缺失，除了在铰链区后面的CH2的前九个氨基酸以外。正如图1所示，猿猴病毒SV40复制起点(SVO)位于新霉素磷酸转移酶表达盒的第一外显子(N1)的后面并且在新霉素磷酸转移酶基因内含子内部，这促进瞬时转染后表达构建体(载体)在COS细胞中的复制。位于其后的是目的基因序列的表达盒，在这个例子中是免疫球蛋白编码区。在盒子里的最首端是人巨细胞病毒启动子(CMV)，它驱动多顺反子的免疫球蛋白(Ig)信息的表达。在构建体中Ig信息编码人源化的抗TAG-72抗体(称为HuCC49)，它依次由这些组成(按照顺序提出)轻链前导序列(L)/HuCC49轻链可变区(VL)/人κ恒定区(κ)/来自脑心肌炎病毒的IRES(IRES)/合成的重链前导序列(L)/HuCC49重链可变区(VH)/人γ1CH2结构域缺失恒定区(CH2 linkG1DelCH2)。跟随Ig信息后面的是牛生长激素多聚腺苷酸信号(BGH)。处于其后的是二氢叶酸还原酶编码区域的表达盒，其中小鼠鼠β球蛋白主要启动子(β)驱动鼠二氢叶酸还原酶基因(DHFR)的表达。DHFR序列的后面是牛生长激素多聚腺苷酸信号(BGH)。在新霉素内含子的后面是新霉素表达盒的第二外显子(N2)，它的后面依次是SV40早期多聚腺苷酸信号(SV)。载体也含有在细菌中复制需要的序列，包括colE1复制起点和使其具有氨苄青霉素抗性(Amp)的β内酰胺酶基因。EMCV商业可获得的，并且从ATCC获得(VR-129B脑心肌炎株EMC(TC adapted)。病毒颗粒被破坏并且对其应用本领域所知的方法分离单链病毒RNA。在病毒基因组内IRES区域的特定cDNA被生成。进行eDNA的PCR(聚合酶链式反应)扩增以扩增DNA，以及添加适合在轻链和重链Ig编码区域插入的5’和3’末端。没有多聚腺苷酸信号被放置于恰在IRES前轻链后。位于834-836的ATG三核苷酸(Genbank收录号NC-001479)被用来作为合成的重链前导序列的起始密码子。因为文献表明IRES下游的开放阅读框的翻译比上游开放阅读框(5’CAP起始的翻译)效率低，引入限制性位点使得IRES和重链序列可以在载体内复制。Mun I和Bgl II位点被引入BamH I位点的下游。用EcoR I和BamH I消化后，包含IRES的片段和重链基因序列可以容易地插入Mun I和Bgl II位点。产生的构建体然后包含CMV-轻链-IRES-重链-IRES-重链。添加第二重链以补偿任何和内部核糖体进入相关的低效。
B.CHO细胞表达既使用瞬时转染方法又使用意在产生具有高表达能力的稳定转染细胞系的方法，将包含表达载体的质粒转染入CHO细胞内，该表达载体使用SV40增强子表达重链。这些转染与包含单独的轻链和重链表达盒(CMV-轻链-BGH)(CMV-重链-BGH)的常规的表达构建体平行进行。实验结果表示在表达水平上没有明显的区别发生，意味着没有检测到由于低效率的IRES功能重链翻译的下降。相应地，本发明的多顺反子构建体的实施方案被预见到会以令人满意的量表达包含在第一和随后的顺反子中的其它基因序列。实验已经显示这些构建体在双顺反子构建体中表达下游重链基因，表达水平与那些使用常规的非多顺反子的表达系统相等，正如此处下面所讨论。
实施例2A.G418抗性细胞系的产生本实施例中多顺反子表达构建体编码特异于人TAG72蛋白的修饰的人源化抗体。这个抗体由人源化的鼠可变区(轻链和重链)、人κ轻链恒定区和CH2结构域特异缺失的人γ1重链恒定区组成。这种表达构建体被称为“HuCC49 CH2 Linker in N5KIRESG1DelCH2”，在图3中描绘了其示意图，以及在图6中阐明了其序列。HuCC49 CH2 Linkerin N5KIRESG1DelCH2转染入CHO-DG44亲本细胞系。每96孔板每4×106CHO细胞使用0.5，1.0，2.0或4.0μg线性化DNA进行转染。通过编码新霉素抗性标记的表达构建体和包含G418的培养基(CHO-S-SFMII+HT)显性选择稳定转染细胞。存活细胞的孔被鉴定出来，被扩大到小量(120ml)旋转培养，并且细胞产量用ELISA分析测定。获得多种产生易于检测的分泌抗体的G418抗性细胞分离株。尤其是四种，22B6，22E6，22H10和25A2被测定3-4天产生3-10mg/L或1-5皮克/细胞/天(pcd)。如图4和5所示，进行了Southern印迹分析并且观察到这四个细胞株系每个都有整合于每个细胞系内的单一位点处的表达构建体。标记“M”的泳道包含大小标记物。中国仓鼠卵巢细胞核酸作为阴性对照，并且在标记为“CHO”的泳道运行。样品14H9CD是NEOSPLA构建物。
B.确定轻链相对重链比例的ELISA分析与这些细胞系产生平行的，相同抗体的NEOSPLA表达构建体被构建和转染。图3所示的HuCC49 CH2 Linker in N5KG1DelCH2在单独的转录盒上编码免疫球蛋白轻链和重链基因，每个的翻译由5’CAP翻译起始复合物介导。通过转染这个表达构建体而分离的一个特别的G418抗性细胞株系称为14H9。分析来自14H9和多顺反子分离株22B6的培养基上清以研究分泌的轻链和重链的相对比例。使用ELISA通过用轻链或重链特异的第二抗体捕获和检测进行分析。双份样品的结果在表1展示，数据表示为和免疫球蛋白标准一致的mg/L。测定的总的轻链(κκ)和测定的总的装配的抗体(γκ)相比较(比例栏)。
表1构建体类型细胞系κκγγγκ比例κκ/γκ多顺反子 5F7 20.62.2 7.1 2.95F7 8.4 0.972.5 3.4NEOSPLA 14H9 79.56.9 33.62.414H9 56.06.7 23.92.3由高基因拷贝数，细胞系14H9异常高地产生G418的细胞系。此处值得注意的是大约相等的游离或装配的免疫球蛋白轻链和重链的相对比例。这个数据证明，令人惊讶地，多顺反子表达系统中置于IRES后的免疫球蛋白重链的表达和NEOSPLA系统相比没有显著降低。κκ/γκ的比例大于1的结果是未预料到的并且可能是游离轻链容许性细胞分泌的结果。因而，在这个多顺反子表达系统中，IRES驱动的重链蛋白质的产生看来非常有效。
C.比较轻链与重链表达的比例的进一步的ELISA分析随后进行由NEOSPLA或多顺反子表达系统产生的多种细胞系的培养上清的分析以研究分泌的轻链和重链的相对比例。使用ELISA通过用轻链或重链特异的第二抗体捕获和检测完成分析。双份样品的结果在此处展示，并且被表示为和免疫球蛋白标准一致的mg/L。ELISA这样进行，用“捕获”抗体包被96孔微量滴定板，随后是细胞培养上清的结合，随后通过结合HPRO(辣根过氧化物酶)缀合的第二抗体“检测”，随后光学定量。
κκ表示由山羊抗人κ捕获由山羊抗人κ-辣根过氧化物酶检测γγ表示由山羊抗人IgG捕获由山羊抗人IgG-辣根过氧化物酶检测γκ表示由山羊抗人IgG捕获由山羊抗人κ-辣根过氧化物酶检测γγ表示由山羊抗人κ捕获 由山羊抗人IgG-辣根过氧化物酶检测表2 该数据进一步证明，令人惊讶地，多顺反子表达系统中置于IRES后的免疫球蛋白重链的表达和NEOSPLA系统相比没有显著降低。κκ/γγ的比例大于1的结果可能是由于游离轻链容许性细胞分泌。因而，在这个多顺反子表达系统中，IRES驱动的重链蛋白质的产生看来非常有效。
实施例3A.通过基因组扩增增加表达NEOSPLA和多顺反子表达系统都包含编码鼠DHFR基因的表达盒。用于表达的亲本CHO-DG44细胞系完全缺失DHFR酶活力(双缺失)，整合的靶基因(鼠DHFR)的扩增可通过在包含氨甲蝶呤(MTX)的培养基中生长选择。在这种扩增过程中，直接连接的免疫球蛋白基因被伴随扩增。因此可分离产生升高的免疫球蛋白量的细胞系。我们第一轮G418抗性细胞系的筛选在5nM MTX中进行。最高水平生产者(ELISA测定)被鉴定并且然后用升高浓度的MTX(50nM然后500nM)进行两轮连续的扩增。相继三轮在500nM的MTX中扩增后，抗性细胞系被鉴定。对于来自G418抗性细胞系25A2的多顺反子细胞系，多种分离株的每一步表达水平列于下面。用于比较目的，下面列出用NEOSPLA表达系统表达的不相关的抗体(抗CD23)的表达水平。这种抗体是具有灵长类来源的轻链和重链可变区、人κ轻链恒定区和完整的人γ1重链区(包括CH2结构域)的Primatized抗体。同时包括生长在可控的生物反应器中的多顺反子系统和NEOSPLA系统的生产水平的比较。对于每个系统，多顺反子和NEOSPLA，在生物反应器中均重复进行两次。
表3多顺反子表达系统HuCC49 CH2 Linker in N5KIRESG1DelCH2培养基细胞毫克/升pcd加倍时间G418 25A2 4.5 2.0 30小时5nM MTX 25A2-5B3 16.6 11.53250nM MTX 25A2-5B3-50A5 45.6 20.335500nM MTX25A2-5B3-50A5-500D878.0 26.842500nM MTX25A2-5B3-50A5-500F284.2 27.540500nM MTX25A2-5B3-50A5-500F689.9 25.135在生物反应器中500nM MTX25A2-5B3-50A5-500F6729.028.6生长结束15天500nM MTX25A2-5B3-50A5-500F6701.028.2生长结束15天NEOSPLA表达系统Anti-CD23 P5E8N-SHL in N5KG1培养基细胞毫克/升pcd加倍时间G418 8B914.9 4.5 335nM MTX 8B9-5A12 11.0 6.5 4050nM MTX 8B9-5A12-50F1 56.1 22.0 35500nM MTX8B9-5A12-50F1-500G853.5 28.6 44在生物反应器中500nM MTX8B9-5A12-50F1-500G8927.029.1生长结束12天500nM MTX8B9-5A12-50F1-500G8680.029.1生长结束12天正如从上面表3可以看见，筛选的每个阶段(G418，5，50或500nM MTX)的表达水平在多顺反子和NEOSPLA表达系统间是相当的。而且，从可控生物反应器生长条件的生产水平看来是相当的。因而，在这个系统中，将免疫球蛋白重链放置在轻链下游的EMCV IRES的翻译控制下导致有效的免疫球蛋白的产生。
实施例4产生表达构建体的方法产生本发明多顺反子表达构建体的一般方法在此处描述。在这个方法中通过在一个单一克隆步骤中插入编码目的基因(如免疫球蛋白轻链和重链)的DNA片段而产生最终的表达构建体。DNA片段通过使用常规的重组DNA技术产生，常规技术包括寡核苷酸合成和连接、重叠(overlapping)PCR、完整DNA合成或任何前面描述的这些方法的组合。图7包含总结用于产生适合在哺乳动物细胞中表达免疫球蛋白(如HuCC49)的载体的示意图。这个方法证明使用重叠PCR产生编码轻链和重链可变区的DNA片段。这个片段然后在一个单一步骤中克隆入目的载体DNA的单一插入位点以产生最终的免疫球蛋白表达构建体。然而，虽然这个方法是优选的，也能使用其它方法，如分别的重链和轻链基因可选择地插入载体构建体的不同插入位点。而且，在多顺反子构建体中的轻链和重链基因的数目可以改变。所述免疫球蛋白轻链可变区从合适的来源被分离或克隆(即杂交瘤、B细胞、质粒克隆)并且克隆入合适的载体如PCEMPTY A4，包含轻链前导序列(取决于情况可以保留或不保留)、轻链恒定区、IRES序列以及重链前导序列。而且，重链可变区被分离和克隆入相同的空载体(不包含轻链可变区)。最初希望在不同的载体中含有轻链和重链可变区，因为它允许对一个基因可变区域的后续核酸修饰，且不会潜在地影响其它可变区域。包含轻链和重链可变区的两个单独的载体作为独立的同源(cognate)PCR扩增反应的DNA模板。设计5’和3’PCR引物使得两个产生的PCR产物间共有某一核苷酸序列。这个共有序列然后产生用于随后PCR扩增步骤的重叠区域。这个最终PCR扩增步骤的产物于是编码轻链前导序列/轻链可变区/恒定区/IRES/合成的重链前导序列/重链可变区或它的片段，如结构域缺失片段。图7举例说明一个实例，其中一个包含被IRES分隔的轻链和重链的单一DNA序列插入到载体上的单一限制酶位点。通过上面5’和3’PCR引物的明智的设计，其包括两侧的限制性内切酶切割位点如Nhe I。这些Nhe I或其它的限制酶位点然后使DNA片段克隆入合适的载体，如PCEMPTY B，PCEMPTY B包含所有其它用于在哺乳动物细胞中有效表达免疫球蛋白的元件。最终的载体(如HuCC49 Gly/Ser in Polycis2)然后转染入目标细胞以产生目的基因产物，如(免疫球蛋白)。
实施例5通过基因组扩增提高表达HuCC49 CH2 Linker in N5KIRESG1DelCH2也包含编码鼠DHFR基因的表达盒。因为亲本CHO-DG44细胞系完全缺失DHFR酶活力(双缺失)，整合的目的基因(鼠DHFR)的扩增可通过在包含氨甲蝶呤的培养基中生长选择。在这种扩增的过程中，直接连接的HuCC49的免疫球蛋白基因被伴随扩增。因此可分离产生升高的免疫球蛋白量的细胞系。第一轮G418抗性细胞系的筛选在5nM MTX中进行。最高水平生产者(ELISA测定)被鉴定并且然后用升高浓度的MTX(50nM然后500nM)进行两轮连续的扩增。相继三轮在MTX中的扩增后，鉴定了三个500nM MTX抗性细胞株系。对于来自G418抗性细胞系25A2的细胞谱系，每一步表达水平列于表4。用于比较目的，表5显示用NEOSPLA表达系统表达的不相关的抗体(抗CD23)的表达水平。这种抗体是具有灵长类来源的轻链和重链可变区、人κ轻链恒定区和完整的人γ1重链区(包括CH2结构域)的Primatized抗体。
表4多顺反子表达系统HuCC49 CH2 Linker in N5KIRESG1DelCH2培养基细胞毫克/升pcd加倍时间G418 25A2 4.5 2.0 30小时5nM MTX 25A2-5B3 16.6 11.53250nM MTX 25A2-5B3-50A5 45.6 20.335500nM MTX25A2-5B3-50A5-500D878.0 26.842500nM MTX25A2-5B3-50A5-500F284.2 27.540500nM MTX25A2-5B3-50A5-500F689.9 25.135表5NEOSPLA表达系统Anti-CD23 P5E8N-SHL in N5KG1培养基细胞毫克/升pcd加倍时间G418 8B914.9 4.5335nM MTX 8B9-5A12 11.0 6.54050nM MTX 8B9-5A12-50F1 56.1 22.0 35500nM MTX8B9-5A12-50F1-500G853.5 28.6 44正如从上面表4和表5可以看见，筛选的每个阶段(G418，5，50或500nM MTX)的表达水平在多顺反子和NEOSPLA表达系统间是相当的。因而，在这个系统中，将免疫球蛋白重链放置在轻链下游的EMCV IRES的翻译控制下导致有效的免疫球蛋白的产生。本发明连同它的特定的实施方案和实施例已经被描述，但对于本领域一般技术人员可以理解公开的本发明能够进一步明显改变。这个公开内容包含与优选实施方案的明显偏离，属于其本领域中已知的或惯例的实践，这一原则可应用于上文中阐明的基本特征，亦可应用于所附权利要求的范围。
权利要求
1.用于在真核宿主细胞中表达功能抗体的多顺反子载体，该载体包括多顺反子转录系统，该多顺反子转录系统包括下面的在5’-3’方向上有效地连接的元件(i)在真核细胞中有效的启动子；(ii)包含编码抗体轻链的第一DNA序列的第一顺反子，该第一DNA序列可选择地在它的5’末端包含在真核细胞中有效的信号肽编码序列，其中所述的第一DNA序列在它的3’末端不包括polyA序列，并且其中所述的第一DNA序列包含5’起始密码子和3’末端终止密码子；(iii)从选自心病毒、疱疹病毒和脊髓灰质炎病毒之一的成员获得的内部核糖体进入位点(IRES)；和(iv)至少一个第二顺反子，该第二顺反子包含下面的元件(a)编码抗体重链的第二DNA序列，其中所述的第二DNA可选择地在它的5’末端包含在真核细胞中有效的信号肽编码序列，并且其中所述的第二DNA序列只在该DNA序列是多顺反子中最3’端编码序列时，在它的3’末端包含poly A序列，并且进一步分别在所述的第二DNA序列的5’和3’末端包含起始和终止密码子；其中在包含多顺反子载体的真核宿主细胞中，第一DNA序列以相对第二DNA序列10∶1-1∶1的比例被表达。
2.权利要求1的多顺反子载体，其中第一和第二DNA序列分别编码灵长类来源的抗体重链和轻链恒定区。
3.权利要求2的多顺反子载体，其中所述的灵长类是人。
4.权利要求1的多顺反子载体，其中第一和第二DNA序列分别编码灵长类来源的抗体重链和轻链可变区。
5.权利要求4的多顺反子载体，其中所述的灵长类是人。
6.权利要求5的多顺反子载体，其中重链和轻链可变区是人源化的。
7.权利要求1的多顺反子载体，其中第一和第二DNA序列分别编码啮齿类来源的抗体重链和轻链恒定区。
8.权利要求7的多顺反子载体，其中所述的啮齿类是小鼠。
9.权利要求1的多顺反子载体，其中第一和第二DNA序列分别编码啮齿类来源的抗体重链和轻链可变区。
10.权利要求9的多顺反子载体，其中编码抗体重链和轻链可变区的DNA序列来源于小鼠。
11.权利要求1的多顺反子载体，其中真核启动子是哺乳动物启动子或病毒启动子。
12.权利要求11的多顺反子载体，其中启动子是CMV启动子。
13.权利要求1的多顺反子载体，其中IRES从心病毒中获得。
14.权利要求13的多顺反子载体，其中心病毒是人脑心肌炎病毒。
15.权利要求1的多顺反子载体，其中由多顺反子载体表达的功能抗体特异地结合肿瘤相关抗原，表达在B细胞上的抗原或表达在T细胞上的抗原。
16.权利要求15的多顺反子载体，其中由多顺反子载体表达的功能抗体特异地结合选自TAG-72，CD4，CD11，CD19，CD20，CD22，CD23，CD37，CD40，CD45，CD80，CD86和CD154的抗原。
17.权利要求16的多顺反子载体，其中抗原是TAG-72。
18.权利要求16的多顺反子载体，其中功能抗体是特异于TAG-72的人、人源化灵长类化或嵌合抗体。
19.权利要求15的多顺反子载体，其中抗体是rituximab或ibritumomab。
20.权利要求1的多顺反子载体，其中编码抗体轻链的DNA序列以相对于抗体重链3∶1-1∶1的比例被表达。
21.包括根据权利要求1-20的任何一项的多顺反子载体的真核细胞，其中真核细胞每天分泌大约5-大约100皮克的功能抗体。
22.权利要求21的真核细胞，其中真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
23.权利要求22的哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞选自幼仓鼠肾细胞、成纤维细胞、骨髓瘤细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。
24.权利要求23的哺乳动物细胞，是CHO细胞。
25.权利要求23的酵母细胞，其中所述的酵母细胞选自酿酒酵母、裂殖酵母、汉逊酵母、耶氏酵母、毕赤酵母和假丝酵母。
26.权利要求26的酵母细胞，其中所述的毕赤菌株是巴斯德毕赤酵母。
27.一种产生功能抗体的方法，包括在细胞培养中培养根据权利要求21的真核细胞以生产功能抗体，并且从真核细胞培养物中回收功能抗体。
28.权利27的方法，其中培养的真核细胞每天产生至少大约1-5皮克的抗体/细胞。
29.权利要求28的方法，其中所述的真核细胞是哺乳动物或酵母细胞。
30.权利要求28的方法，其中功能抗体从细胞培养基中回收。
31.权利要求28的方法，其中功能抗体特异地结合TAG-72。
32.权利要求31的方法，其中所述的功能抗体包括人源化、人或嵌合抗CH2结构域被删除的HuCC49抗体。
33.权利要求28的方法，其中所述嵌合抗体是rituximab或ibritumomab。
34.权利要求27的方法，其中功能抗体的产生进一步包括同源重组的步骤。
35.权利要求28的方法，其中功能抗体在成批饲养细胞培养中产生。
全文摘要
此处描述的是一个新型的表达系统，用以从一个单一多顺反子构建体中产生目的多基因产物。尤其是，该表达系统包含一个多顺反子载体，能够在真核宿主细胞中表达功能抗体，其中载体在5′－3′方向上至少包含下面的可操作连接的元件在真核细胞可操作的启动子；编码至少抗体轻链可变区的DNA序列；内部核糖体进入位点(IRES)；以及至少一个编码抗体重链的DNA序列。也公开了包含多顺反子表达载体的哺乳动物细胞，和一种在用多顺反子表达载体转染的哺乳动物细胞中产生功能抗体的方法。
文档编号A61K47/48GK1585822SQ02826215
公开日2005年2月23日 申请日期2002年11月18日 优先权日2001年11月16日
发明者M·里夫, R·巴尼特 申请人:拜奥根Idec公司