抑制器官移植排异反应的组合物及其使用方法

专利名称：抑制器官移植排异反应的组合物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，其包含与染色体上的转录调控因子结合的位点特异结合的化合物(例如，核酸及其同系物(homolog))及其使用方法。更特别的，本发明涉及一种包含诱饵化合物(decoy compound)的组合物及其使用方法。
背景技术：
急性同种异体移植排异反应(acute allogenic rejection)是一种T细胞介导的免疫学现象，其中涉及大量的炎症介质和粘附分子(Hancock，1983)。此复杂事件的发作需要多种转录因子的协同激活(Shannon，1995)。
NF-κB是编码在炎症和免疫中起重要作用的基因产物的基因的转录因子之一(Baeuerle，1994)。NF-κB对多种胞外信号发生反应并从细胞质迅速移动到细胞核，在一些细胞因子和粘附分子基因的协同反式激活中发挥关键作用。Cooper等证明NF-κB的DNA结合活性存在时间依赖性的增加，同种异体心脏移植模型发生排异前三天有一个峰值(Cooper，1998)。但是，施用潜在的NF-κB抑制剂PDTC在所述模型中降低了NF-κB活性峰值，显著延长了受者的存活。
新的免疫抑制剂，FK506和CsA，通过抑制钙调磷酸酶(calcineurin)(一种信号转导磷酸酶，其是NF-κB激活中的关键因素)上调基因转录(Mattila，1990；McCaffrey，1994；Kanno，1995)。已知另一种主要免疫抑制剂糖皮质激素的作用部分来自对NF-κB激活的抑制(Scheinman，1995；Auphan，1995)。
人NF-κB正常的活性形式是两个DNA结合亚基的异源二聚体，所述亚基是50KDa亚基(p50)和65KDa亚基(relA或p65)(Lenardo，1989；Libermann，1990；Satriano J，1994；Brennan，1990；Neish，1992)。在未受刺激的细胞内，NF-κB与一种抑制分子IκB结合并隐藏在细胞质中。细胞受到刺激后，IκB发生磷酸化，然后被迅速降解。之后，NF-κB从IκB释放，因此可使得转录因子转位到细胞核，在核内转录因子与多种DNA识别位点结合以调控基因表达(Baeurerle，1994，见上)。已经提出转录因子NF-κB从复合体的解离诱导了基因的受调控的反式激活作用，并在炎症改变的调控中发挥关键作用，这些基因包括白细胞介素(IL)-1，白细胞介素-6和白细胞介素-8；细胞间粘附因子；血管细胞粘附因子；内皮细胞粘附因子(Lenardo，1989；Libermann，1990；SatrianoJ，1994；Brennan，1990；Neish，1992Yamazaki，1993)。因此，阻断NF-κB可减弱基因介导的心脏缺血再灌注。
一种合成的寡核苷酸作为顺式元件“诱饵化合物”(以下称作ODN)，阻断一种核因子与相应基因的启动子区域的结合，因此抑制体内和体外分析系统的基因反式激活作用(Sullenger，1990；Bienlinska，1990；Yamada，1995；Morishita，1996)。已提出用这样一种诱饵策略治疗某种人类疾病。本发明人先前报道了E2F诱饵ODN作为再狭窄的基因治疗模型进行转染，抑制了气囊损伤后的过度增生(Morishita，1995)。最近，本发明人在大鼠中使用一种NF-κB诱饵成功保护了心肌免受缺氧损伤。

发明内容
本发明的一个目的是预防器官移植的急性排异反应，由此改善预后。
本发明人假定合成的双链DNA对NF-κB有高效的亲和力，将其作为一种顺式元件诱饵化合物导入体内，可结合转录因子并阻断基因介导的急性同种异体移植反应的激活，因此为肾脏急性排异反应提供一种有效的治疗方法。
本发明人发现，包含NF-κB顺式元件的足够量的诱饵ODN，其被转染进入供体肾脏的内皮细胞，可与NF-κB有效结合，因此防止了必需的细胞因子和粘附分子的基因表达的反式激活，所以防止了急性排异现象的出现或发展。由此实现了本发明。
此外，本发明人发现，通过在灌注溶液中使用超声心动图对比剂Optison(商标Molecular Biosystems公司，美国)以施加超声暴露，足够量的包含NF-κB顺式元件的诱饵ODN被成功转染进入大鼠肾脏同种异体移植体中。由此实现了本发明。
本发明涉及一种治疗剂，其抑制器官移植的排异反应。该治疗剂包含NF-κB诱饵化合物。靶器官的实例包括，但不局限于，肾脏，心脏，肺，肝脏，脾，胰腺，胆囊，胃，小肠，大肠，膀胱和类似器官。
优选地，上述排异反应是同种异体反应。
优选地，上述同种异体反应是急性的。
优选地，上述器官移植是肾脏移植。
优选地，上述治疗剂还包含超声检查的对比剂。
优选地，上述超声检查对比剂包含一种选自半乳糖，白蛋白，半乳糖和棕榈酸，脂质体，高分子膜(Polymer film)，脂肪酸或乳酸聚合物中的底物。这样的超声检查对比剂的实例包括Echovist(注册商标)(Schering)，Alubunex(注册商标)(Molecular Biology公司)，Levovist(注册商标)(Schering)，DMP 115(Imagent)(Dupon Merk)，EchoGen(注册商标)(Sonus)，Sonovist(注册商标)(Schering)，Sono Vue(注册商标)(Bracco)，BY963(注册商标)(Byk-Gulden)，NC100100(Nycomed)，PESDA，Quantison(注册商标)(Andaris)，Quantison Depo(注册商标)(Andaris)，QUC82755和类似产品。
优选地，上述超声检查对比剂是Optison(注册商标)。Optison是来自白蛋白的含有微泡的小球体(microbubble-containing small sphere)，Optison包含全氟碳化合物(perfluorocarbon)，所述全氟碳是一种惰性气体。
本发明还涉及改善器官移植的预后的治疗剂。所述治疗剂包含NF-κB诱饵化合物。
将所述治疗剂施用于供体器官，并通过超声处理增强NF-κB诱饵化合物高效转染进入该器官。
本发明还涉及一种抑制器官移植排异反应的方法，包含将包含一种诱饵化合物的治疗剂施用至供体器官，并对含有所述诱饵化合物的供体器官进行超声处理的步骤。
本发明也涉及改善器官移植的预后的一种方法，包含将包含诱饵化合物的治疗剂施用至供体器官，并对含有所述诱饵化合物的供体器官进行超声处理的步骤。
本发明还涉及一种增强寡核苷酸转染进入生物组织的方法，包含将所述寡核苷酸导入所述生物组织，并对含有所述寡核苷酸的所述生物组织进行超声处理的步骤。
优选地，以上描述的超声处理是在超声检查对比剂存在的条件下进行。
具体实施例方式
以下，描述本发明的实施方案。如下描述的实施方案仅用于说明目的而不是限制本发明的范围。
术语“诱饵”或“诱饵化合物”是指与染色体上的一个位点(该位点是一种转录因子如NF-κB的结合位点、或是由转录因子如NF-κB控制的基因的另一种转录调控因子的结合位点(以下称为靶结合位点))相结合的化合物，以拮抗NF-κB或其他转录因子与这些靶位点的结合。典型地，诱饵或诱饵化合物是一种核酸或其类似物。
当一种诱饵存在于核内时，诱饵与一种转录调控因子发生冲突，竞争转录调控因子的靶结合位点。结果，通过转录调控因子与靶结合位点结合导致的生物学功能被抑制。诱饵包含至少一种能与靶结合序列结合的核酸序列。依据本发明，只要一种诱饵具有与靶结合序列结合的活性，它就可用于制备本发明的药物组合物。
优选的诱饵的实例包括5’-CCT TGA AGG GAT TTC CCT CC-3，(SEQ ID NO1)(NF-κB诱饵)，或包含其互补序列、其突变体的寡核苷酸，或包含这些分子的化合物。寡核苷酸可以是DNA或RNA。寡核苷酸也可包括修饰的核酸和/或假核酸。此外，这些寡核苷酸也可能是其突变体，或包含它们的化合物。寡核苷酸具有单链或双链，或呈线性或环形。突变体指具有上述序列的核酸，其中所述序列中的一部分序列具有突变、取代、插入、或缺失，并且根据不同因子结合的核酸结合位点的不同，所述核酸特异性拮抗转录因子如NF-κB，或拮抗由转录因子如NF-κB控制的基因的另一种转录调控因子。
更优选的诱饵实例包括含有一或多种上述核酸序列的双链寡核苷酸，或其突变体。当所含有的核酸序列数是2个时或所含有的核酸序列数是3个时，含有一或多种上述核酸序列的核酸称为嵌合(双)诱饵或三诱饵，以指示核酸序列的数目。
本发明使用的寡核苷酸包括修饰的寡核苷酸，以对抗体内降解和类似情况，例如具有一个硫代磷酸二酯键的寡核苷酸(S-oligo)，所述硫代磷酸二酯键是磷酸二酯键的氧原子被一个硫原子代替，磷酸二酯键被一个无电荷的甲基磷酸酯基团取代的寡核苷酸，或类似的情况。
本发明的诱饵可用本领域已知的化学或生化合成方法制备。例如，当一种核酸被用作一种诱饵化合物时，可以采用基因工程的常规核酸合成方法。例如，一种DNA合成仪可被用于直接合成所需的诱饵核酸。此外，可以合成这些核酸、含有所述核酸或其部分的核酸，随后采用PCR方法、克隆载体及类似方法扩增。而且，使用限制性酶或类似物切割这些方法获得的核酸，并使用DNA连接酶或类似的方法连接或用类似的方法来制备所需的核酸。为了获得在细胞中更稳定的诱饵核酸，所述核酸的碱基、糖和磷酸部分可进行化学修饰，如烷基化、丙烯酸酯化或类似修饰。
本发明的治疗剂可包含药物学可接受的载体。这样的药物学可接受的载体的实例包括生理盐水、生理盐水缓冲液、葡萄糖、水等等。通常，药物学可接受的载体具有药物学惰性。
本发明的治疗剂可包含一种诱饵化合物、一种赋形剂、一种佐剂、和一种药物学可接受的载体。此外，除了诱饵化合物以外，治疗剂可与其它药物一起施用于病人。
本发明的治疗剂可通过口服或胃肠外施用。胃肠外施用包括局部，表面，动脉内，肌肉，皮下，髓鞘内，蛛网膜下腔，脑室内，静脉内，腹腔内，或鼻腔内施用。优选地，本发明的组合物通过静脉内注射或动脉内注射施用。处方和施用技术为本领域内熟知，如“REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES”(Maack出版社，Easton，PA)所述。
本发明的治疗剂包括含有可达到所述诱饵化合物的目的的有效量的诱饵化合物的药物。典型的，本发明的治疗剂包含的诱饵化合物具有的浓度大约为5-15μM。“治疗有效量”或“药理学有效量”是本领域技术人员公认的术语，并且其指有效产生所需药理学结果的药物量。因此，所述治疗有效量是足够的可减轻治疗的疾病症状的量。通过测量从靶疾病恢复的程度可以分析治疗有效量。治疗有效量也可能依赖于治疗的个体情况。所述量也可被优化以便达到一种所需效果而无明显副作用。治疗有效量也可使用本领域常规方法确定。例如，使用细胞培养分析，适当的动物模型或类似分析估计治疗有效量。其后，使用这些信息确定给予人的有效的量和途径。
本发明使用的诱饵化合物的治疗有效量指改善疾病症状或情况的诱饵化合物的量。例如，在细胞培养或实验动物中通过标准的药物学步骤可以决定一种诱饵化合物的治疗效果和毒性(如，ED50，半数有效量和LD50，半数致死量)。这个剂量依据用药形式，病人的易感性和给予途径而改变。通常，诱饵化合物的使用浓度是5到15μM。


图1A显示一种表明USE和Optison的基因转染功效的图示。通过萤光素酶分析评估了USE的基因转染的功效。直到2分钟，超声处理的功效(以下称为USE)与它的持续时间成比例(图1A中的左图)。Optison以剂量依赖的关系显著地增强了基因转染(图1A中的右图)。
图1B显示的是移植肾切片的照片，显示了通过荧光显微镜评估的FITC标记的NF-κB诱饵ODN的转染结果。应用USE 30秒而无Optison时，可以观察到FITC染色的表达量在肾小球(a)上很少，在肾小管(b)上有少量。在同种异体移植中，应用USE 1分钟，该表达量在肾小球(c)和肾小管(d)都增强了，通过使用Optison，则其更进一步增强，肾小球(e)和肾小管(f)显示明显的FITC染色。
图2显示了一个测试中动物的存活情况。使用USE通过NF-κB诱饵ODN基因转染处理供体肾脏，动物存活期显著延长(组1和组2)。另外，和其它所有组比较，组1中显著延长的动物存活证实了使用Optison增强了基因转染的功效在这个组内，3/10的动物存活20天或更长。组1的受体动物与所有其它组比较显示了明显延长的存活；3/10的动物存活20天或更长。这些结果显示了USE在基因转染上的功效，且Optison的使用增强了USE在基因转染上的功效。组4和组5的受体动物在存活时间上没有显著差异，其表明灌注液中加入Optison或使用USE都不会影响动物的存活。
图3显示了一个测试中的移植肾的功能的图示。通过尿量(a)和血清肌酐(S-Cr)水平(b)评估移植体的功能。与组1的受体比较，组4的受体在移植2天后尿量明显减少。移植6天后大多数动物无尿，而组1的受体动物保持正常尿量水平(a)。血清肌酐水平也确证了这些结果，与组1的受体动物比较，组4的受体动物的血清肌酐水平有显著提高。
图4显示肾切片的照片，指示试验中肾移植体的组织学。从对照动物同种异体移植器官移植后2天，显示大量的广泛的单核细胞浸润(a)。一些肾小球显示明显的单核细胞浸润伴有大量的系膜基质(b)。大多数肾小管的结构变形，有明显的蛋白质沉积和管型(c)。在第4天，所有区域的细胞浸润变得更加突出，正常肾结构遭到明显破坏并出血(d)。伴随大量单核细胞浸润，一些肾小球(e)和肾小管(f)发生严重的结构残缺和坏死。第6天，这些改变迅速和恶化，显示严重的结构变形，伴有广泛的坏死组织(g)。大多数肾小球(h)和肾小管(i)被严重的坏死所取代。相反，第2天时，NF-κB诱饵处理的同种异体移植器官保持完好，只有少量的单核细胞浸润(i)。大多数肾小球显示没有明显改变(k)。在移植组织中，肾小管结构大多保持正常没有明显蛋白质沉积(l)。第4天，仅在间质中观察到细胞浸润(m)，大多数肾小球(n)和肾小管(o)保持完整。虽然在第6天组织中出现相当多的细胞浸润(p)，大多数肾小球(q)和肾小管(r)显示较小的改变。
图5显示的电泳照片示出了逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析结果。
以下，本发明将举例描述。本发明不仅局限于这些实施例。实施例中使用的材料，试剂和类似物，除了特殊声明的，都可以从商业来源获得。
实施例本发明将通过以下实施例详细描述。注意，以下实施例用于举例目的，而没有限制本发明的范围。
1.材料和方法1.1.合成ODN和选择靶序列使用的硫代磷酸酯ODN序列如下；NF-κB诱饵ODN5’-CCT TGAAGG GAT TTC CCT CC-3’(SEQ ID NO1)，3’-GGA ACT TCC CTA AAGGGA GG-5’；竞争诱饵(scrambled decoy)ODN5’-TTG CCG TAC CTGACT TAG CC-3’(SEQ ID NO2)，3’-AAC GGC ATG GAC TGA ATCGG-5’，和PRE(黄体酮结合序列)5’-GAT CCT GTA CAG GAT GTT CTAGCT ACA-3’(SEQ ID NO3)，3’-CTA GGA CAT GTC CTA CAA GAT CGATGT-5’。
依据常规使用的方法合成这些ODN。合成的ODN用70％乙醇洗涤，晾干，溶于无菌Tris-EDTA缓冲液(10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA)。上清经过NAP10柱纯化(Parmacia，瑞典)，采用分光光度计定量。使用一种内标记试剂盒(Clonetech，Inc.，Palo Alto Calif)，用FITC标记NF-κB和竞争诱饵的3’和5’端。
1.2.肾移植的急性排异模型以200到250克雄性Lewis大鼠(LEW，RTl1)作为肾移植受体，雄性WF(RTlu)大鼠作为供体。通过肾脏动脉灌注冰冷肝素盐水(hepalinizedsaline)(50U/ml)后，将WF大鼠左肾切除。采用显微外科技术通过将左肾导管和左输尿管首位相接，肾脏被同侧移植到双测肾切除的Lewis受体。所述技术已经很好的建立，缺血时间已稳定。手术期间，供体肾脏进行30分钟冷缺血性损伤。所有试验方案均符合发明人学院的动物伦理委员会的方针。在这个模型中，动物典型地发生急性排异反应，变得无尿，10天内死于尿毒症(CTLA-9)。肾同种异体移植后的存活时间定义为从移植开始的时间到死亡的时间。在移植后24小时内死于外科技术失败的动物在分析时被排除。
1.3.通过在灌注溶液中应用超声心动图对比剂(以下称为USE)Optison施加超声处理将NF-κB诱饵转染进入供体肾脏。
本发明完成如下研究以确定大多数在供体肾脏发生转染的条件。灌注后，使用动脉夹固定肾血管和输尿管。50μg萤光素酶报道基因或FITC标记的100μg NF-κB诱饵ODN溶解在0.5ml盐水中，并分别含三种不同浓度的Optison(0，10，或25％)，经肾动脉灌注肾脏。切除肾脏并在水浴中暴露在2MHz频率的超声中，其信号强度是4bars，暴露持续的时间从30秒到8分钟。然后，将肾脏移植进入Lewis受体。同种异体移植器官分别在第1，2和4天切除，并分别通过萤光素酶分析和荧光显微术评估萤光素酶报道基因和NF-κB诱饵ODN的表达。
(试验设计)本发明设有6个组，列在表1中，以检验使用USE的超声处理的功效，并为使用NF-κB诱饵ODN处理肾同种异体移植器官建立新的步骤。
表1

组l，100μg NF-κB诱饵ODN(NF)溶于0.5ml含10％Optison(Opt)的盐溶液，灌注每个供体肾脏。通过应用超声处理(USE)1分钟，进行基因转染；组2，供体肾脏被同样量的含USE的但是不含Optison的NF-κB诱饵处理；组3，肾脏被同样量的Optison和NF-κB诱饵处理，但没有USE；组4，肾脏仅被同样量的无Optison和USE的NF-κB诱饵处理；组5，肾脏被同样量的含如NF-κB那样的Optison，USE的竞争诱饵处理；组6，供体肾脏不进行任何处理。
NF-κB诱饵(100μg)溶于0.5ml含10％Optison的盐溶液(组1；Gp1)或100μg NF-κB诱饵溶于0.5ml不含Optison的盐溶液(组2；Gp2)灌注每个供体肾脏。肾脏以2MHz载波频率，USE水浴处理1分钟，同侧移植到Lewis大鼠受体。供体肾脏以同样量含10％Optison(组3；Gp3)或无Optison(组4；Gp4)的NF-κB诱饵处理，不使用USE，将供体肾脏移植到受体。作为对照组，将以同样量含有Optison和应用USE的竞争诱饵处理的供体肾脏移植到受体，为组5(Gp5)。未经这些处理的肾脏同种异体移植受体作为另一个对照组(组6；Gp6)。从每组随机选择动物并评估器官移植的存活。肾移植的存活时间被定义为从移植到死亡的时间。移植后24小时内死于外科技术失败的动物已排除在分析之外。从每组随机选出的5只动物的供体肾脏在第4天被切除，并且用于评估ODN转染，组织学分析，和免疫组织学。
(移植器官功能)移植后，在隔天的24小时，收集尿，连续测量尿量，通过测试尿沉积物来检验尿的特性。然后，本发明人通过测试组1到组5受体的一系列血清肌酐水平定量评估移植器官的功能。隔天从鼠尾静脉获得血清，采用Jaffe反应方法检测血清肌酐(S-Cr)。
(移植器官形态学)肾的组织经4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定。石蜡切片被苏木精和伊红(HE)以及高碘酸希夫(PAS)染色，之后采用光学显微术观察。以Banfu’s标准进行组织学观察。
使用DAKO APAAP试剂盒(DAKO日本，京都，日本)，依照厂商说明书，通过采用碱性磷酸酶和抗碱性磷酸盐(APAAP)方法，对ED1、CD4和CD8阳性细胞染色。抗ED1、CD4或CD8的单克隆抗体购自QuantumAppligene(Parcd’innovation，illkirch，法国)。通过采用免疫过氧化物酶方法，对细胞因子和粘附分子包括IL1，IL2，IL6，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，TNF-α，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和VCAM-1进行染色。抗IL1，IL2，TNF-α，ICAM-1，VCAM-1(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，加拿大)和MCP-1(Pepro Tech，伦敦，英国)的兔抗大鼠多克隆抗体被作为一抗使用。二抗为生物素标记的山羊抗兔Ig(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)。反应使用3，3’二氨基联苯胺显色观察。
阳性标记细胞量表示为每个视野(c/FV)细胞的平均数±标准差(M±SD)。每个切片/样品以放大率400X观察20个或更多的视野。粘附因子，细胞因子和胞外基质的表达被量化为0到4+等级(4+＝密集)。
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析依据厂商说明书，使用RNeasy Total RNA试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)从组织提取RNA。通过甲醛-琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA量，按上述描述制备cDNA(Azuma，2001)。通过GeneAmp 9600 PCR系统(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)，使用对MCP-1，TNF-α，IL-6，诱导的氧化氮合酶(iNOS)和β-肌动蛋白的引物完成PCR。引物序列，退火温度和循环次数如下MCP-1，5’ATG CAG GTC TCT GTC ACG(SEQ ID NO4)和3’CTA GTT CTC TGT CAT ACT(55℃，33个循环)；TGF-β1，5’CTG CAGCTC CAC AGA GAA GAA CTG C和3’CAC GAT CAT GTG GGA CAACTG CTC C(SEQ ID NO5)(64℃，28个循环)；TNF-α，5’TAC TGA ACTTCG GGG TGA TTG GTC C(SEQ ID NO6)和3’CAG CCT TGT CCCTTG AAG AGA ACC(60℃，34个循环)；IL-1，5’TGA TGT CCC ATT AGACAG C(SEQ ID NO7)和3’GAG GTG CTG ATG TAC CAG TT(55℃，35个循环)；IL-6，5’CAA GAG ACT TCC AGC CAG TTG C(SEQ ID NO8)和3’TTG CCG AGT AGA CCT CAT AGT GAC C(30个循环)；iNOS，5’TGC CAG GGT CAC AAC TTT ACA GG(SEQ ID NO9)和3’(35个循环)；ICAM-1，5’AGA AGG ACT GCT GGG GAA(SEQ ID NO10)和3’CCT CTG GCG GTA ATA GGT G(60℃，28个循环)；VCAM-1，5’CTGACC TGC TGC TCA AGT GAT CG(SEQ ID NO11)和3’GTG TCT CCCTCT TTG ACG CT(60℃，26个循环)；β-肌动蛋白，5’TTG TAA CCA ACTGGG ACG ATA TGG(SEQ ID NO12)和3’GAT CTT GAT CTT CAT GGTGCT AGG(60℃，23个循环)。DNA扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，使用溴化乙啶染色(0.05mg/mi，染色10分钟)，紫外灯下观察条带。通过扫描光密度计量学，使用SCANJET 4c(Hewlett Packerad，Corvallis，OR)Adobe PHOTOSHOP软件(Adobe Systems，Mountainview，加拿大)检测竞争模拟和靶cDNA的密度。描绘条带密度的比例并经一系列模板稀释度以建立一种线性关系。以样品和模拟扩增子的密度为基础计算mRNA表达每个结果表示为样品与β-肌动蛋白的比例。RNA也直接进行扩增以排除DNA基因组污染。每个样品完成2次以上描述的操作。结果的数值以平均数±标准差表示。
(统计学分析)对获得的尿量和血清肌酐数值采用单变量方差分析(ANOVA)。通过Kaplan-Meier实验评价移植器官存活。使用非配对学生t-检验分析免疫组织化学的细胞浸润。对组织学分析和免疫组织化学的粘附分子，细胞因子和细胞外基质的表达数据进行Mann Whitney-U test分析。RT-PCR结果采用非重复的ANOVA分析。如果ANOVA结果显著，则使用学生t-检验进行个体比较。P值小于0.05被认为具有统计学显著性差异。
2.结果2.1.发生没有导致明显不良反应的最大基因转染的条件。
首先，本发明人检查了使用萤光素酶报道基因和FITC标记的NF-κB诱饵ODN时USE对基因转染进入供体肾脏的功效。结果显示在图1A和1B。USE持续时间达到1分钟时，USE成比例地显著增强萤光素酶报道基因的转染，结果显示在图1A左边。NF-κB诱饵ODN的表达结果证明它的功效(图1B)。
图1B显示肾脏转染了FITC标记的NF-κB诱饵ODN切片的图片，使用荧光显微术观察。如图1B显示，NF-κB诱饵ODN表达结果证明它的功效，在同种异体移植物的肾小管细胞内显示明显的FITC染色。显著地，如图1B显示，FITC染色的表达在肾小球(a)内很少，经不含Optison的USE处理30秒的肾小管(b)内，仅观察到少量。经USE处理1分钟，在肾小球(c)和肾小管(d)的表达都增加，在使用Optison时进一步增强，在同种异体移植器官的肾小球(e)和肾小管(f)显示一种明显的FITC染色。
再次提及图1A，当使用USE达到2分钟或更长时，提示有明显的组织损伤，使用USE达到1分钟，没有观察到显著的损伤。因此，本发明人设置USE持续时间为1分钟。使用USE时，本发明人检测超声波心动图对比剂，Optison的功效。如图1A右边所示，使用Optison可显著增强萤光素酶报道基因的基因转染并有剂量依赖效应。但是，当Optison的浓度是25％时，发生明显的组织损伤，浓度是10％时，没有明显的组织损伤。因此，本发明人确定灌注液中Optison的浓度为10％，USE的持续应用时间为1分钟。
2.2.转染NF-κB诱饵进入供体肾脏以延长动物的存活图2显示每组动物存活的结果。未经任何处理模型的存活时间稳定(平均值±标准差＝7.5±1.2，n＝10)；所有动物第9天死亡。相反，应用USE的NF-κB诱饵ODN处理供体肾脏的受体动物与所有其它组比较，显示延长的动物存活。此外，使用对比剂Optison，增强了USE应用在基因转染上的功效，显著的延长组1的动物存活；该组中，3/10动物存活20天或更长。这些结果指示使用USE转染NF-κB诱饵ODN进入供体肾脏对于延长移植存活有益并且使用Optison增强了USE的功效。
2.3.移植功能图3显示，在测试组中移植器官功能检测的结果。竞争诱饵(组5)处理的同种异体移植受体显示移植后第2天，有明显的血尿。与组1受体比较，此时尿量显著减少，如图3上面图片显示(平均值±标准差＝9.77±3.68和21.81±6.85ml/天，n＝10)。移植器官后第6天，大多数动物变得无尿(1.29±1.12ml/天，n＝9)，而大多数受体经NF-κB诱饵处理的同种异体移植器官后，保持正常的尿量，在第6天，没有出现明显的血尿(13.93±6.42ml/天，n＝10)。
如图3下面图片所示，血清肌酐水平证实这些结果，移植后第2天，与组1受体比较，组5受体的血清肌酐量显著提高(1.84±0.23mg/天与0.97±0.16mg/天 n＝10)。移植功能的这些数据清楚证实动物死于肾移植失败和延长生命决定于移植器官的存活。
2.4.NF-κB处理很好地保持了移植器官组织图4显示每组移植器官组织。在移植后第2天，从对照动物收获的同种异体移植器官显示有大量广泛的单核细胞浸润(a)。许多的肾小球显示明显单核细胞浸润和大量系膜基质(b)。大多数肾小管结构畸形并伴有明显的蛋白质沉积和管型(c)。在第4天，细胞浸润在所有区域变得更加突出，并有明显的正常肾脏结构破坏和产生血尿(d)。一些肾小球(e)和肾小管(f)显示严重的结构畸形和伴大量单核细胞浸润的坏死。在第6天，改变快速出现和恶化，显示严重的结构畸形并伴随广泛的组织坏死(g)。大多数肾小球(h)和肾小管(i)被严重的坏死取代。相反，NF-κB诱饵处理的移植器官，在第2天，保持完好，只有少量单核细胞浸润(j)。大多数肾小球没有明显改变(k)。肾小管结构大部分保持正常，没有明显的蛋白质沉淀在移植组织(l)。第4天(m)仅在间质中观察到很少细胞浸润，大多数肾小球(n)和肾小管(o)保持完整。在第6天，虽然，尽管在组织中出现可观数量的细胞炎症(p)，大多数肾小球(q)和肾小管(r)显示很小改变。
2.4.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析图5显示一种RT-PCR分析结果。图5显示的电泳照片显示组2(给予NF-κB，应用USE)和组5(给予竞争诱饵，应用USE)的RT-PCR分析结果。如图5显示，当组5大鼠TGF-β的表达被抑制时，观察组2大鼠IL-1，MCP-1，TNF-α和TGF-β的表达。因此，证明细胞因子的产生和粘附分子的表达在NF-κB处理的供体肾脏被抑制。
以上描述的结果总结如下。
本发明人合成了一种抗NF-κB结合位点的异硫氰酸萤光素(FITC)标记的顺式元件诱饵化合物(NF-κB诱饵)并应用超声处理(USE)用所述的诱饵转染了Wister Firth(WF)肾脏。另外，超声对比剂，Optison，进一步加强了使用USE的转染，在肾小管和肾小球细胞显示显著的FITC染色。转染了NF-κB诱饵的供体肾脏阳性移植进入双测肾切除的Lewis受体动物。接受了代替NF-κB诱饵的竞争诱饵(SD)处理的供体肾脏的受体动物作为对照。
在对照组，具有大量单核细胞浸润的明显肾组织破坏出现在第4天。免疫组织学和RT-PCR证实，在移植肾脏中细胞因子产生和粘附分子表达的增加。第10天，所有动物死于肾脏移植失败。相反，NF-κB诱饵转染的同种异体移植受体动物显示了延长的存活，特别是应用了USE和Optison后(17.9±8.3(存活的平均天数)和7.7±1.6(对照组存活的平均天数)，n＝10)。3/10动物存活达20天或更长。肾脏移植功能和组织学保持良好(在第4天，血清肌酐＝0.69±0.12和2.45±0.12mg/dl(对照))，细胞因子的产生和粘附分子的表达明显减少。
因此，此新的步骤，使用Optison的USE应用增强了转染NF-κB诱饵化合物ODN进入肾脏移植体并提高动物存活，同时抑制了细胞因子的产生和粘附分子的表达。新的方法对于肾脏同种异体移植是一种新的和有效的策略。
提供以上描述的实施例阐明本发明的多个方面而且并不限制本发明的范围。
工业实用性对于器官移植，本发明提供了一种新的和有效的策略。本发明提供了一种防止对移植器官急性排异反应和改善其预后的治疗剂和方法。
序列表<110>安琪士多摩奇株式会社<120>抑制器官移植排异反应的组合物及其使用方法<130>
<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述NF-κB诱饵<300>
<400>1ccttgaaggg atttccctcc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述Scramble诱饵<400>2ttgccgtacc tgacttagcc 20<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PRE<400>3gatcctgtac aggatgttct agctaca 27<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述Mcp-1引物<400>4atgcaggtct ctgtcacg 18<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述TGF-β1引物<400>5ctgcagctcc acagagaaga actgc 25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述TNF-α引物<400>6tactgaactt cggggtgatt ggtcc 25<210>7<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述IL-1引物<400>7tgatgtccca ttagacagc 19<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述IL-6引物<400>8caagagactt ccagccagtt gc 22<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述iNOS引物<400>9tgccagggtc acaactttac agg 23<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述ICAM-l引物<400>10agaaggactg ctggggaa 18<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述VCAM-1引物<400>11ctgacctgct gctcaagtga tcg 23<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述β-肌动蛋白引物<400>12ttgtaaccaa ctgggacgat atgg 2权利要求
1.一种用于抑制器官移植排异反应的治疗剂，其包含一种NF-κB诱饵化合物。
2.权利要求1的治疗剂，其中所述排异反应是同种异体移植反应。
3.权利要求1的治疗剂，其中同种异体移植反应是急性的。
4.权利要求1的治疗剂，其中所述器官移植是肾脏移植。
5.权利要求1的治疗剂，其进一步包含一种超声检查对比剂。
6.权利要求5的治疗剂，其中所述超声检查对比剂包含一种底物，所述的底物选自半乳糖、白蛋白、半乳糖和棕榈酸、脂质体、高分子膜、脂肪酸或乳酸聚合物。
7.权利要求5的治疗剂，其中所述超声检查对比剂是Optison(注册商标)。
8.一种改善器官移植的预后的治疗剂，其包含一种NF-κB诱饵化合物。
9.权利要求8的治疗剂，其中所述治疗剂被施用于供体器官，并且所述NF-κB诱饵化合物转染入所述器官的功效通过超声处理而增强。
10.一种抑制器官移植排异反应的方法，包含如下步骤将包含诱饵化合物的治疗剂施用于供体器官；和对含有所述诱饵化合物的所述供体器官进行超声处理。
11.用于改善器官移植的预后的方法，包含如下步骤将包含诱饵化合物的治疗剂施用于供体器官；和对含有所述诱饵化合物的所述供体器官进行超声处理。
12.一种用于增强寡核苷酸转染入生物组织的方法，包含如下步骤将所述寡核苷酸导入所述生物组织；和对含有所述寡核苷酸的所述生物组织进行超声处理。
13.权利要求10到12的方法，其中在存在超声对比剂的情况下进行所述超声处理。
全文摘要
本发明为器官移植提供了一种新的和有效的策略。本发明提供了一种防止移植的器官发生急性排异反应并改善预后的治疗剂和方法。本发明提供了一种用于抑制器官移植的排异反应的治疗剂，其包含一种NF－κB诱饵化合物。典型地，所述器官移植是肾脏移植。所述治疗剂进一步包含一种超声检查对比剂。本发明还提供了一种用于改善器官移植的预后的治疗剂。将所述治疗剂施用于一种供体器官。通过超声处理可以提高所述NF－κB诱饵化合物转染所述器官的功效。
文档编号A61P43/00GK1615157SQ0282742
公开日2005年5月11日 申请日期2002年11月20日 优先权日2001年11月22日
发明者森下竜一, 富田奈留也, 荻原俊男, 东治人 申请人:安琪士多摩奇株式会社