专利名称：低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术的制作方法
技术领域：
本发明一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，属于生物制剂的技术领域。
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背景技术：
我国具有应用动物药物的悠久历史，远在4000年前的甲骨文就记载有40多种动物入药。明朝李时针的《本草纲目》中收录440种，《中国药用动物志》收载了1500多种，这些药物均以动物性中药出现，动物胎盘是最常用的一种。
我国现阶段的生物药物也是从动物药物开始发展起来的，从20世纪50年代后期，我国陆续开展了动物药物的研究与生产，其中关于胰岛素和脑啡肽的研究均取得了重大进展。至1985年我国已能生产200多个种类的生化药物，以酶、辅酶、多肽激素及蛋白质、核酸及其降解物、氨基酸类、脂类等药物为主。
由于生物药物在提高免疫力、疾病预防与治疗方面具有其他药物不可替代的特点，进入20世纪90年代以后，生物药物引起更加广泛的重视，特别是现代生物技术在生物药物的研究与开发中的应用，使生物药物的发展走向了一个新纪元。
羊胎盘中含有多种具有生物活性的物质，这些成份在医疗、食品、化妆品和动物保健等行业中具有广泛的用途和奇特的功效，因而成为动物脏器制药中的一个热点。
目前，国内羊胎盘制剂与剂型主要有以下几种用于医学临床的胎盘转移因子、羊胎盘注射液、口服羊胎精华素；作为功能性食品的有羊胎素口服液、羊胎肽胶囊；作为化妆品原料的有羊胎盘冻干粉、羊胎盘多肽。
现有技术状况羊胎盘冻干粉的技术工艺目前，国内用于制备羊胎盘生物制剂的技术主要有物理制备法、生物酶解法、水解法等几种。
其中物理制备法主要用于羊胎盘冻干粉及冻干粉胶囊的制备，其工艺技术如下胎盘预处理→剪碎→冷冻→低温粉碎→冻干→胶囊/包装说明胎盘预处理主要是在胎盘的清洁、去污的基础上，除去脂肪和结缔组织；剪碎用人工剪碎或机械方法破碎分离后的胎盘；冷冻-20℃条件下使胎盘碎块迅速冷冻，以便进行进一步粉碎；低温粉碎在4℃条件下，使胎盘碎块成粉末。
冻干经50-55个小时制成冻干粉。
而生物酶解法和水解法主要用于多肽活性物质的制备生物酶解法使用多种蛋白酶(如水解酶)把蛋白质降解，之后经过十分繁琐的生物化学过程进行进一步的分离或纯化。
水解法包括碱法和酸法，主要原理是通过酸、碱处理控制pH，使蛋白质变性、降解或游离，最终达到分离、纯化的目的。
现有技术存在的问题物理制备法不能使大分子结构的蛋白质降解，因而无法分离胎盘中的有效成份，更不能进行纯分离纯化，故只能用于冻干粉这样的粗制产品的生产。其产品的吸收性差，生物利用率很低。
酶解法要求条件极高，分离过程繁琐冗长，中间产物过多，不易进行纯分离，而且，由于酶的继续作用，可导致部分活性物质的失活，且极易污染。通常多适用于实验室内制备，而真正用于规模化制备的较少。再者，使用酶解法生产的产量低，产成率＜5％，产品成本高。
水解法使用较多的是酸法，但不论是酸法还是碱法均可造成某些有效成份的损失，如酸解法可造成全部色氨酸、部分丝氨酸和酪氨酸的损失，而且劳动条件差，腐蚀性强，并产生大量废物；碱法可使氨基酸发生消旋作用，使苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、胱氨酸等大部分失活。
水解法制备技术的产品出成率只有2-3％。
本发明一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其目的是对现有的技术与方法存在的不足进行改良，充分利用丰富的羊胎盘资源，简化生产技术工艺，建立适用于产业化生产的技术；保持蛋白质降解物的活性，避免主要氨基酸的失活；降低生产成本，提高产品的生物利用率；除去产品中的激素和重金属成份。
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发明内容
本发明一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，该技术的工艺流程如下胎盘预处理→胎盘变性→分散→裂解并超细分离→检验→成品其中胎盘预处理主要包括(1)分离胎盘绒毛膜、尿囊膜和脐带，去除脂肪和结缔组织；(2)清洗；(3)溶血使用去离子水进行溶血；(4)绞碎用人工剪碎或绞碎机剪成碎块。
胎盘变性过程按比例(1∶3重量比)称取胎盘和胎盘改性液(浓度0.2％)，置于容器内24小时，使之变性；之后更换改性液重复上述改性过程2次(共3次)。变性过程使胎盘蛋白质的非共价键和二硫键破坏，从而导致蛋白质三级结构的破坏，但不影响其肽键的完整性。
改性液的制备按66∶66∶132(重量比)的比例分别称取氯酸钾、氯化钠和33％的硝酸，依次加入烧瓶中。反应所放出的气体通过导管导入另一装有22升蒸馏水的瓶中，经吸收后制成改性液。其化学反应式为
分散过程取出改性后的胎盘加4倍蒸馏水清洗后，置于全密闭的分散器中进行分散。分散过程不短于3个月，在此期间发生了一系列复杂的生物化学反应，是产生活性(营养)成份的重要基础。
分散原理分散过程的化学机理就是蛋白质的水化拉伸作用，这种作用的明显与否取决于蛋白质分子的静电特性和空间结构特性。在一定的条件下，如酸碱度(pH值)偏酸时，羧基是不带电的，而碱基带有正电荷，可与氢离子发生排斥作用，这时丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸与多肽间的肽键被明显拉伸，这是因为某些功能基团(如羧基)的分子内催化作用，导致分子内质子转移，即从未电离的羧基转移至氨基上。
裂解并超细分离裂解过程分散后的胎盘物质用低温高速涡旋粉碎器(4℃，18000转/分)裂解，每次60分钟，共进行3次。最终使成高分散性水乳剂。
裂解原理在低温条件下(4℃)，高速涡旋粉碎机产生机械和超声波2种破碎功能，使胎盘组织变成纳米级微粒。
超细分离该技术步骤同样发生在高速涡旋粉碎过程，高速旋转所产生的离心力可分离重金属，将胎盘物质中的重金属成份分离出去。
需要强调的是在整个工艺流程中始终贯彻灭菌原理，整个生产加工过程是在药品生产管理规范(GMP)条件下进行的(整体10万级，局部万级)，避免了原料的污染。
胎盘改性液可释放氯离子(Cl-)，后者对细菌、病毒等病原微生物具有确实的杀灭作用。这是生产过程的一级灭菌过程。
涡旋式粉碎机在高速旋转情况下可产生超声波，利用超声波不仅可以降解大分子，而且能有效地破坏病原微生物，这是二级灭菌。
此高速涡旋机能在局部产生5000～7000个大气压的局域冲击力，该局域冲击力对病原微生物具有物理性灭活作用。
经过裂解与超细分离工艺流程后即得产品，最后检验包装出厂。
该产品羊胎盘生物制剂在进行检验时，主要是检查产品的主要成份含量是否达到如下重量百分比要求多肽含量20～26.0％核酸含量0.2％左右已糖醛酸含量1.6～1.8％磷含量0.2％左右总氨基酸8.00mg/ml以上其它含氮物11.7％其中氨基酸共有19种，6种是必需氨基酸。
本发明一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其优点和特点是大大简化了生产过程，降低了生产成本；三级灭菌过程贯穿于产品生产过程，消除了污染，确保产品质量，提高产品的产出率达50％；除去了激素和重金属成份；保证小分子产品的有效成份不失活。
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图1本发明工艺流程方框图。
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具体实施例方式取新鲜或-20℃保鲜的羊胎盘10kg，分离绒毛膜、尿囊膜和脐带，称重。用清水洗净，按重量比(1∶7)加入去离子水进行溶血，溶血时间为24小时，之后剪成碎块。
按重量比(1∶3)混合胎盘与改性液(改性液的浓度为0.2％，v/v，制备方法见前述)进行变性。变性共进行3次，每次24小时。
用4倍的蒸馏水清洗变性胎盘，置于全封闭的容器内进行胎盘分散，时间不低于90天。
分散后的胎盘物质在高速涡旋粉碎器(4℃，18000转/分)中进行裂解与超细分离，每次裂解60分钟，共3次，每台裂解器一次裂解量不超过10kg。3次裂解后所得产品即为羊胎盘高效生物制剂。最后进行产品检验包装出厂。
权利要求
1.一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其特征在于该技术的整个工艺流程中始终贯彻灭菌原理，整个生产加工过程是在药品生产管理规范条件下进行，该技术的工艺流程如下胎盘预处理→胎盘变性→分散→裂解并超细分离→检验→成品
2.根据权利要求1所述的一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其特征在于该胎盘预处理主要包括(1)分离胎盘绒毛膜、尿囊膜和脐带，去除脂肪和结缔组织；(2)清洗；(3)溶血使用去离子水进行溶血；(4)绞碎用人工剪碎或绞碎机剪成碎块。
3.根据权利要求1所述的一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其特征在于该胎盘变性过程是按1∶3的重量比称取胎盘和浓度为0.2％的胎盘改性液，置于容器内24小时，使之变性；之后更换改性液重复上述改性过程2次。
4.根据权利要求1和3所述的一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其特征在于该改性液的制备是按重量比66∶66∶132的比例分别称取氯酸钾、氯化钠和33％的硝酸，依次加入烧瓶中；反应所放出的气体通过导管导入另一装有22升蒸馏水的瓶中，经吸收后制成改性液。
5.根据权利要求1所述的一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其特征在于该分散过程是取出改性后的胎盘加4倍蒸馏水清洗后，置于全密闭的分散器中进行分散。
6.根据权利要求1和5所述的一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其特征在于该分散过程不短于3个月。
7.根据权利要求1所述的一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，其特征在于该裂解过程是分散后的胎盘物质用低温高速涡旋粉碎器在4℃、18000转/分下裂解，每次60分钟，共进行3次，使胎盘物质变成纳米级微粒而成高分散性水乳剂；在裂解过程中同时进行超细分离，该技术步骤同样发生在高速涡旋粉碎过程，高速旋转所产生的离心力可将胎盘物质中的重金属成份分离出去。
全文摘要
一种低温超声波高压蛋白裂解法制取羊胎盘生物制剂的技术，该技术的生产加工过程是在GMP条件下进行，其工艺流程如下胎盘预处理→胎盘变性→分散→裂解并超细分离→检验→成品。其中胎盘预处理包括分离胎盘绒毛膜等，去除脂肪和结缔组织；清洗；溶血；绞碎成碎块。胎盘变性过程是按重量比1∶3称取胎盘和胎盘改性液(浓度0.2％)，置于容器内24小时，使之变性；之后更换改性液重复上述改性过程2次。分散过程是取出改性后的胎盘加4倍蒸馏水清洗后，置于全密闭的分散器中进行分散。分散过程不短于3个月。用低温高速涡旋粉碎器裂解并超细分离，将胎盘中的重金属分离出去，变成高分散性水乳剂。经过裂解与超细分离后即得产品。工艺简单，成本低，质量好。
文档编号A61K35/48GK1524536SQ0310522
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月24日 优先权日2003年2月24日
发明者郝文华, 王颖, 白宏君, 孙卫, 郑润宽, 程卓刚 申请人:内蒙古神元生物工程股份有限公司