专利名称：一种硫脲衍生物在制备治疗眼黄斑变性药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于一种一氧化氮供体硫脲衍生物在药学上的应用，具体为反式硫脲衍生物在防治年龄相关性眼病方面的用途。
背景技术：
年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种常见老年病，仅美国就有200～300万患者，在我国人数更多，约有1200～1500万。AMD的特征性表现是黄斑区出现玻璃疣，伴有脉络膜新生血管(CNV)形成或地图样萎缩斑。近来，视网膜光凝用于低视力患者中心凹旁和复发性CNV的治疗。然而，这种治疗能否预防视力损害尚不清楚。至于那些视力尚好的中心凹旁CNV患者(大多数荧光血管造影为典型AMD者)通过光动力治疗(PDT)，有半数患者取得了效果。目前，对地图样萎缩斑的AMD没有治疗办法。换言之，只有三分之一或更少的AMD患者可以进行PDT治疗，而其中只有一半患者经过治疗保留视力而不至于失明。
在大多数AMD患者中，CNV形成的主要原因是AMD早期的脉络膜循环障碍。要预防AMD发生，必须改善和促进脉络膜血流。因此，当务之急是寻找能选择性增加脉络膜血流的药物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是寻找一种能够防治AMD的药物，其能够选择性地促进眼的脉络膜血流，消除脉络膜循环障碍，抑制AMD的脉络膜新生血管形成。
为解决上述问题，本发明提供下述技术方案。
反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊环-2-基]苯基}硫脲在制备治疗或预防年龄相关性黄斑变性的药物中的应用；其特征在于用于制备选择性改善脉络膜血流的药物；其特征在于用于制备抑制脉络膜新生血管形成的药物。
前述反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊环-2-基]苯基}硫脲在制备治疗或预防年龄相关性黄斑变性的药物中的应用，其特征在于用于制备外用眼药。
反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊环-2-基]苯基}硫脲在制备促使细胞释放一氧化氮的药物中的应用；尤其是在制备促使眼细胞释放一氧化氮的药物中的应用。
发明人对一氧化氮供体(NO Donor)的研究结果发现，N-苯基取代的硫脲类化合物(代号ZX-5)，化学名称为反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊环-2-基]苯基}硫脲，能引起培养细胞释放多量NO，并能增加兔眼脉络膜血流，但对虹膜和睫状体血流没有影响。其异构体(代号ZX-4)顺式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊环-2-基]苯基}硫脲，既不引起NO释放，也不增加眼组织血流。
脉络膜血流的增加可能是NO在脉络膜释放的结果。ZX-5点眼能选择性改善脉络膜血流很有价值，因为脉络膜位于眼球后部，说明药物点眼后，通过全身循环或巩膜—葡萄膜—视神经途径，能快速到达脉络膜，对AMD的脉络膜新生血管形成有抑制作用，可望用于早期AMD的治疗或预防。
1.化学合成ZX-4和ZX-5的合成以没食子醛1为起始原料，经相转移催化反应得环氧化合物2，2经水解得二醇3，3与硝基芳醛缩合得二氧戊环化合物4，柱色谱分离得顺反异构体5和6，它们经还原分别得相应的氨基物7和8。7和8与异硫氰酸苯酯反应得ZX-4和ZX-5。合成路线参见下页图示。
1-(3，4，5-三甲氧基苯基)环氧乙烷(2)的合成将没食子醛(39.2g，200mmol)、溴化四丁基铵(1.58g，4.91mmol)、CH2Cl280mL投入圆底烧瓶中，搅拌使其溶解，滴入冷的50％NaOH溶液80mL，约15分滴毕，再加入碘化三甲基锍(40.8g，200mmol)，回流反应15h。加水180mL，分出油层，水层以CH2Cl2萃取，无水硫酸镁干燥，蒸去溶媒，固化得微黄色固体，甲醇重结晶，得白色结晶33.98g，收率81.3％，mp54～56℃。
1-(3，4，5-三甲氧基苯基)乙烷-1，2-二醇(3)的合成将化合物2(11.2g，0.053mol)、蒸馏水(200mL)加入500mL三颈瓶中，室温机械搅拌，缓慢滴加0.8mL高氯酸，剧烈搅拌反应5h，溶液逐渐澄清透明，停止反应。用NaHCO3调pH值约为7，用乙酸乙酯(50mL×4)提取，合并有机相，用饱和食盐水(50mL×3)洗涤，无水MgSO4干燥过夜，浓缩，得淡黄色油状物10.1g，收率82.2％。
顺/反-2-(3-甲氧基-5-硝基-4-正丙氧基苯基)-4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊环(5，6)的合成将化合物3(5.6g，24.6mmol)、5-硝基香兰醛(3.2g，13.38mmol)、PPTS(2.8g，11.1mmol)和60mL干燥苯加入100ml三颈瓶中，氮气保护下回流分水8小时完毕。快速蒸去大部分苯，反应液中加100mL乙酸乙酯，用饱和食盐水(50mL×3)洗涤除去PPTS，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩得4，柱色谱[乙酸乙酯/石油醚(60～90℃)，V∶V＝1∶4]，得白色粉末状固体(反式，6)1.9g，收率31.7％，mp46～48℃；顺式产物(5)为淡黄色油状物1.12g，收率18.7％。 合成路线图顺/反-2-正丙氧基-3-甲氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊环-2-]苯胺(7，8)的合成将顺式硝基物5(200mg，0.445mmol)溶于20mLTHF中，加入水20mL，铁粉(56mg，1mmol)、氯化铵(53.5mg，1mmol)，加热回流6h，稍冷，分出上层有机层，水层用乙酸乙酯(20ml×3)提取，合并有机层，用无水硫酸钠干燥过夜，过滤，蒸干滤液，得一淡黄色油状物125.7mg，收率67.4％。参照7的合成方法得淡黄色油状反式苯胺化合物8(104.3mg，收率56％)。
ZX-4和ZX-5的合成将化合物7和8(0.048mmol)分别与异硫氰酸酯苯酯(0.1mmol)、四氢呋喃(5mL)混合，于70℃时搅拌反应12h后，浓缩，柱色谱分离[乙酸乙酯/石油醚(60～90℃)/二氯甲烷，V∶V∶V＝1∶3∶1]即得产品ZX-4和ZX-5。
MS化合IR vmp/℃ (ESI)1HNMR(CDCl3)δ物 /cm-1(M+H)+ZX-4oil555.233110.9(t，3H，CH3，J＝7.3Hz)，1.57～1.64(m，2H，CH2)，3.63～15953.90(m，15H，4OCH3，OCH2，C-5CH)，4.27～4.32(m，1H，C-5CH)，5.12～5.16(m，1H，C-4CH)，5.87(s，1H，C-2CH)，6.71～7.82(m，9H，ArH)ZX-543～46 555.2 33190.92(t，3H，CH3，J＝6.9Hz)，1.60～1.65(m，2H，CH2)，15933.66～3.91(m，15H，4OCH3，OCH2，C-5CH)，4.48～4.52(m，1H，C-5CH)，5.12～5.16(m，1H，C-4 CH)，6.1(s，1H，C-2CH)，6.7 1～7.77(m，9H，ArH)化合物 元素分析(％)Found(Calcd.)N C HZX-4 5.04(5.05)，62.43(62.82)，6.10(6.14)ZX-5 5.13(5.05)，62.65(62.82)，6.08(6.14)
图1ZX-5与ZX-4促使NO生成的量效曲线具体实施方式
实施例药理试验1、RLG细胞培养选择永生代兔泪腺腺泡上皮细胞(RLG细胞)的原因是它的作用类似于血管上皮细胞，能增加C-GMP的生成，从而分别增加泪液和血流。细胞培养在37℃、5％CO2的孵箱中进行。培养基为DMEM/F-12，附加5％Nu血清IV、1μM地塞米松、0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、10μl/ml胰岛素、5.5μg/ml转铁蛋白、6.7ng/ml亚硒酸钠、10ng/mlEGF和10μg/ml庆大霉素(Sigma，St.Louis，MO)。用衬以基质胶的培养皿结合0.25％胰蛋白酶-EDTA和刮除法进行细胞传代。
2、细胞活力测定培养细胞的活力用MTT细胞增殖法测定。MTT测定(细胞活力和细胞生长指数)原理是有活力的细胞能把MTT从水溶性黄色染料还原成不溶的深蓝色Formazan。MTT溶于(5mg/ml)PBS中，无菌过滤。此后，6孔培养皿中的培养基换成500μl无酚红培养基，每孔加入50μlMTT溶液，摇晃混匀，放入孵箱4小时后，吸去上清。每孔加1mlDMSO溶解Formazan，摇晃2分钟混匀。用波长570nm的板式分光光度计测量培养皿每孔光吸收力，空白孔是500μl相同培养基和50μlMTT，移去培养基后加1mlDMSO。
绘制570m波长光MTT吸收力与细胞数标准曲线。把长满的细胞从100cm培养皿平移到6孔培养皿。次日，每个培养皿中3孔做MTT测定，另3孔用Trypan blueexclusion法进行细胞计数。细胞计数前，先消化和刮离细胞。从2ml细胞混悬液中吸取500μl，加入200μl Trypan blue染料混合。取10μl混合液放在血液计数板上，在显微镜下放大100倍进行细胞计数。计算3孔细胞均数，使之与另3孔的MTT平均吸收力相对应。此后，对另外5个培养皿重复上述操作，测定后5天细胞生长情况，绘制6点标准曲线。
3、NO生成测定采用硝酸/亚硝酸盐比色测定试剂盒(Cayman Chemical，AnnArbor，MI)测定培养基中NO的浓度。试剂盒中含有硝酸盐还原酶(专用浓度)，硝酸盐还原酶辅助因子(专用浓度)，试剂缓冲液，硝酸钠标准，亚硝酸钠标准和Griess试剂。在与药物或溶媒培养24小时，6孔培养皿中80％细胞融合时，测定培养液中硝酸和亚硝酸产物含量。从6孔培养皿中每孔采80μl等量物加入96孔微量测定板，用重复进样器将10μl硝酸盐还原酶和10μl辅助因子制剂(按试剂盒中说明预先配制)快速加入标本孔和标准孔中。微量测定板覆膜后室温培养3小时，随后将50μl Griess试剂R1和R2加入每个标本孔和标准孔中，室温培养10分钟。用波长540nm板式分光光度计测得微量测定板的读数。通过标定已知硝酸盐浓度比A540，为每组实验绘制标准曲线。每份样本中硝酸盐+亚硝酸盐的最后浓度用μM/106细胞表示。
4、兔眼血流测定新西兰白兔，重2.5～3.0公斤，用35mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪混合后肌注麻醉，每小时用起始量的一半肌注维持麻醉。升高左眼眼压至40mmHg，这一眼压使眼血流降至正常值的1/3。经右颈动脉插管至左心室，用于注射微球；股动脉插管用于采血。1％药物或溶媒50μl点左眼，点药后0、30、60和120分钟用彩色微球技术测定高眼压兔眼的眼血流。在每一个时间点，注入0.2ml(含2百万)微球，微球注入后立即经股动脉采血60秒整，并置于肝素化抗凝管，记录采血量。最后一次采血后，用100mg/kg的苯巴比妥静注处死动物，摘取左眼球，分离视网膜、脉络膜、虹膜和睫状体，记录组织重量。
标本处理和微球计数的具体操作方法由E-Z Trac公司提供。简要叙述如下溶血因子加入血样管，混匀后以6000rpm的转速离心30分钟，移去上清后，加入组织/血液消化因子I和II，加盖混匀后，以同样速度离心15分钟，弃上清，微球计数因子使微球保持悬浮，用血液计数板进行微球计数。
将组织/血液消化因子I加到组织标本管，加盖后95℃水浴15分钟，震荡混匀30秒后再加热，至组织完全溶解。乘热加入组织/血液消化因子II，加盖混匀后，以6000rpm的转速离心30分钟，以后的操作和微球计数与血液标本相同。
每一个时间点组织血流的计算用以下公式Qm＝(Cm×Qr)/Cr。其中Qm代表组织血流，单位μl/分/mg；Cm是每毫克组织微球数；Qr是血液流量，单位μl/分；Cr是作为参照的血液微球数。
5、结果ZX-5使NO生成显著增加通过RLG细胞培养，检测到ZX-5使NO生成明显增加，并与ZX-5的浓度相关(图1)。另一方面，使用ZX-4时的量效曲线平坦(图1)。实验结果清楚显示，反式结构有生成NO活性，而顺式没有。
ZX-5选择性地增加眼的脉络膜血流与对照组相比，在所有观察时间点(30、60、120分钟)，均测得ZX-5能显著增加脉络膜血流(表1)。另一方面，ZX-4点眼后，在任何观测点均未测出其对脉络膜血流有影响(表2)。有趣的是，ZX-5仅仅增加脉络膜血流，而对虹膜(表3)和睫状体(表4)血流没有影响。一般认为，白兔子的视网膜近乎无血管组织，所以很难观测到血流改变。ZX-5选择性增加脉络膜血流(表1)而不影响虹膜(表3)和睫状体(表4)血流有重要意义，它可能被用于AMD(年龄相关性黄斑变性)的治疗或预防。
表1 ZX-5(1％50μl)选择性增加白免眼脉络膜血流时间 TreatmentNMean±SE P值(分) (μl/分/mg) (two tails)0 对照组 514.1±1.8治疗组 523.3±4.5 0.1130 对照组 58.1±1.7治疗组 516.4±2.5* 0.0360 对照组 54.2±0.7治疗组 514.3±2.9* 0.02120对照组 53.1±0.4治疗组 510.5±1.8* 0.01*表示与对照组相比显著增加表2ZX-4(1％50μl)对白免眼脉络膜血流的影响时间 TreatmentN Mean±SE P值(分) (μl分/mg) (two tails)0 对照组 5 14.1±1.8治疗组 5 22.4±4.9 0.1830对照组 5 8.1±1.7治疗组 5 11.1±2.9 0.4060对照组 5 4.2±0.7治疗组 5 11.3±3.4 0.10120 对照组 5 3.1±0.4治疗组 5 6.8±1.7 0.09表3ZX-5(1％50μl)对白免眼虹膜血流的影响时间 Treatment N Mean±SE P值(分) (μl分/mg) (two tails)0 对照组 5 2.6±0.4治疗组 5 3.4±0.9 0.4230 对照组 5 1.7±0.4治疗组 5 2.6±0.7 0.2760 对照组 5 1.4±0.3治疗组 5 2.1±0.6 0.32120对照组 5 0.9±0.2治疗组 5 1.4±0.5 0.33表4 ZX-5(1％50μl)对白免眼睫状体血流的影响时间 Treatment N Mean±SE P值(分) (μl分/mg) (two tails)0 对照组 5 3.0±0.2治疗组 5 9.0±4.3 0.2430 对照组 5 2.0±0.5治疗组 5 5.4±1.8 0.1360 对照组 5 1.3±0.3治疗组 5 4.9±1.7 0.10120对照组 5 1.2±0.3治疗组 5 3.8±1.3 0.1权利要求
1.反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊环-2-基]苯基}硫脲在制备治疗或预防年龄相关性黄斑变性的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述硫脲在制备治疗或预防年龄相关性黄斑变性的药物中的应用，其特征在于用于制备选择性改善脉络膜血流的药物。
3.根据权利要求1所述硫脲在制备治疗或预防年龄相关性黄斑变性的药物中的应用，其特征在于用于制备抑制脉络膜新生血管形成的药物。
4.根据权利要求1～3之一所述硫脲在制备治疗或预防年龄相关性黄斑变性的药物中的应用，其特征在于用于制备外用眼药。
5.反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊环-2-基]苯基}硫脲在制备促使细胞释放一氧化氮的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述硫脲在制备促使眼细胞释放一氧化氮的药物中的应用。
全文摘要
反式－1－苯基－3－{3－甲氧基－2－丙氧基－5－[4－(3，4，5－三甲氧基苯基)－1，3－二氧戊环－2－基]苯基}硫脲(ZX－5)，能引起细胞释放一氧化氮，选择性增加眼脉络膜血流，对虹膜和睫状体血流没有影响，能对老年性常见眼病AMD(年龄相关性黄斑变性)的脉络膜新生血管形成有抑制作用，可用于早期AMD的治疗或预防。
文档编号A61K31/357GK1437938SQ0311304
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月24日 优先权日2003年3月24日
发明者张奕华, 彭司勋, 宣波, 徐新荣, 夏晓明 申请人:中国药科大学