专利名称：一种早老性痴呆大鼠动物模型的构建方法
技术领域：
本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉及一类用于筛选因蛋白激酶过度激活引发的骨架蛋白Tau AD样异常过度磷酸化、神经原纤维缠结样病理变化和学习、记忆障碍共存的早老性痴呆动物模型的建立，以用于治疗药物的筛选，以及研究蛋白激酶与AD发病之间的内在联系。
背景技术：
早老性痴呆(Alzheimer Disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要症状表现为记忆力减退，认知能力低下和思维迟钝，且进行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程一般5～20年。随着社会老龄化进程的加快，AD的发病率和发病人数急剧上升，已成为威胁老龄特别是高龄人口身心健康的严重疾病，并带来了严重的社会、经济和家庭问题。
AD病人主要脑病理改变是大量神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)、大量老年斑、突触和神经元丢失，与之相对映的两大分子标志物是tau蛋白和β-淀粉样蛋白。目前国外学者已采用转基因技术，在小鼠成功地复制出β-淀粉样沉积引起的老年斑病变，使得未来AD治疗将减少β淀粉样蛋白沉积作为药物干预的目标成为可能，尽管如此，但在临床上并不能从根本上治疗AD。
AD的另一主要脑病理改变NFTs是AD患者神经元变性的基础，其数量与AD临床痴呆程度正相关。因此，对NFTs干预显得尤为重要。蛋白tau属于一种微管相关蛋白，主要参与调与微管组装、运输和空间结构(Mandelkow EM，1995)，而NFTs的主要成分是异常、过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的双螺旋丝，国内外学者普遍公认，骨架蛋白tau的异常、过度磷酸化是NFTs形成的关键步骤。过度磷酸化tau蛋白的聚集不仅以缠结的形式存在，它也是神经毡纤丝和老年斑中的营养不良突起的主要成分。有关神经元细胞骨架蛋白发生过磷酸化的机制十分复杂，目前研究认为蛋白激酶(催化磷酸化反应，如GSK-3，Cdk5和MAPK等)与磷酸酯酶(催化去磷酸化反应，如PP1，PP-2A，PP-2B等)的相对活性失衡，是造成骨架蛋白磷酸化的主要原因。因此，以蛋白激酶激动剂或抑制剂和磷酸酯酶抑制剂为工具药，都可以在体诱导tau蛋白的异常、过度磷酸化，从不同的角度探讨在此过程中的细胞病理改变、与动物学习、记忆的联系，这作为研究NFTs的首选，将为AD早期诊断和防治AD样神经细胞退化提供理论和实践依据。
目前国外相关的动物模型有两类，一类是岗田酸(Okadaic acid，OA)慢性损害模型，OA，一种磷酸酯酶抑制剂，通过微渗透泵输送到侧脑室，持续六周后，大鼠脑的纹状体、海马和皮质等部位出现高磷酸化tau蛋白免疫阳性神经元，并伴有工作记忆和参考记忆的损害(Arent T，1995)；另一类是转染tau蛋白激酶基因的大鼠模型，该模型能高表达过度磷酸化的tau蛋白(野生型或人类tau蛋白的突变异构体)，可重复间歇饥饿刺激和对胰岛素信号转导途径作用的药物如atreptozotocin、tolbutamide、LY294002、wortmannin、PD98059等实验，但无行为学记忆障碍(JP2000253774)。目前国内外尚无通过大鼠侧脑室或海马注射蛋白激酶激动剂或抑制剂诱导蛋白tau过度磷酸化的动物模型，尤其是联合用药。
本发明特点主要是针对大鼠海马骨架蛋白tau，通过大鼠侧脑室或海马注射蛋白激酶激动剂或抑制剂，不仅出现AD样异常、过度磷酸化tau蛋白的免疫阳性神经元和神经原纤维缠结样病理变化，而且还伴有学习、记忆障碍，且所需费用低廉，重现性好，适用于筛选因不同蛋白激酶活性增高引发的骨架蛋白Tau AD样异常过度磷酸化、形成神经原纤维缠结样病理变化及行为异常的AD治疗药物，以及研究因不同蛋白激酶活性增高和AD发病机制之间内在联系，与上述相关动物模型的比较见下表。
表几种早老性痴呆大鼠模型的比较
发明内容本发明的目的在于提供一种利用非转基因技术构建早老性痴呆动物模型的方法，即通过大鼠侧脑室或海马注射蛋白激酶激动剂或抑制剂，在体诱导特定蛋白激酶活性增高，构建AD样骨架蛋白异常过度磷酸化、神经原纤维缠结样形成等病理变化与学习、记忆障碍共存的动物模型的方法。具体方法是在大鼠侧脑室或双侧海马注射蛋白激酶激动剂或/和抑制剂。
所选用的蛋白激酶抑制剂是磷脂酰肌醇3激酶抑制剂或/和蛋白激酶C的抑制剂，磷脂酰肌醇3激酶抑制剂的浓度是100μm，蛋白激酶C的抑制剂的浓度是100μm。所选用的蛋白激酶激动剂为反式异丙肾上腺素，其浓度为5至40mM。
在大鼠侧脑室或双侧海马注射wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶抑制剂)和GF-109203X(蛋白激酶C的抑制剂)，直接复制出AD样大鼠海马骨架蛋白异常过度磷酸化、神经原纤维缠结样病理变化和学习、记忆障碍动物模型的具体步骤如下(1)侧脑室注射给药选择适当的大鼠，麻醉后固定在脑立体定位仪上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.0～1.2mm，中线旁侧1.5～1.gmm垂直进针至硬膜下约3.5～3.8mm，分别缓慢注入wortmannin和GF-109203X药液10μl，wortmannin的浓度为100μM；GF-109203X浓度为100μM，用灭菌人工脑脊液配置，留针10min使药液得到充分吸收。
(2)Morris水迷宫训练及测试目的通过训练及测试来判断造模前后以及与对照组大鼠学习、记忆能力的变化。
实验所采用Morris水迷宫测试系统主要包括大鼠行为学测试系统、图象采集系统及微机数据处理分析系统。测试用圆形水池直径120cm，高60cm；圆柱形有机玻璃平台直径10cm，高40cm。大鼠在训练前2小时移入水迷宫室，并用染发剂将头颈部涂黑，涂染面积不小于3×3cm2，以与背景形成反差。水池中水面高约45cm，室温及水温均保持在26±2℃，水以奶粉搅浑；平台用双层白色纱布覆盖扎紧后任意放置于某一象限的中心位置，并没于水面下约2cm。整个背景均为乳白色，以避免老鼠用视觉搜寻平台。用于指导大鼠游泳找到平台的红色或兰色标记物分别置于平台所在象限边缘1m左右。
训练时将大鼠从任一象限1/2弧度处头面向池壁轻放于水中，其游泳图象经水面上方1.5m处的摄象机拍摄并连接于路径追踪系统采集，最后通过微机分析，可提供潜伏期(即大鼠从入水点起到找到平台所用的时间)、路径、搜索策略等指标，本实验选用潜伏期作为衡量大鼠学习记忆和测试成绩的指标。每只大鼠每天在4个象限共训练4次，每次游泳时限为60s，即在60s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为60s，由测试者引导其上台，休息30s后进行下一次训练。
(3)分子病理学检测目的通过免疫印迹和免疫组化来反映造模前后以及与对照组大鼠海马骨架蛋白的分子病理学变化。
①免疫印迹法颈椎脱臼断头处死雄性Wistar大鼠，迅速取出大脑脑组织置于0-4℃ 0.05M Tris缓冲盐溶液(TB，PH7.0)内，快速分离双侧海马，制成10％的蛋白匀浆，在1000rmp离心5分钟，取上清，测定蛋白含量后备用。
②免疫组化法用4％多聚甲醛磷酸缓冲盐溶液(PB)进行心脏灌注固定脑组织，待取出脑组织后再在上述固定液中后固定6h，即可作振荡切片。免疫组化采用ABC法，二氨基联苯氨(diaminobezidin，DAB)显色。
(4)糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性测定目的通过同位素标记法来检测造模前后以及对照组大鼠海马GSK-3的活性改变。
大鼠海马蛋白匀浆的糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性主要是依靠磷光体GS肽II作为底物进行测定(Pei et al.，1997；Tsujio et al.，2000)，具体方法如下在反应管中先一定体积的缓冲液(其组成为30mM Tris，pH7.4，10mM MgCl2，10mM NaF，1mM Na3VO4，2mM EGTA，and 10mM β-mercaptoethanol)，再分别加入7.5μg大鼠海马蛋白匀浆、250μM底物肽和200μMγ-32P-ATP(1,500cpm/pmol ATP)，终体积为25μl，在30℃条件下孵育30min，用25μl of 300mM邻磷酸终止反应，然后从中取出25μl在液态闪烁记数分析仪进行检测。
(5)统计分析全部数据均采用X±SD表示，利用SPSS统计软件进行统计分析。
(6)模型构建评估根据上述实验步骤进行操作，结果显示同时在大鼠侧脑室注射wortmannin(100μM)和GF-109203X(100μM)，大鼠出现明显行为学障碍，即水迷宫测试潜伏期明显延长(见图1～3)。酶活性检测结果显示手术48h后，与对照组相比，模型组大鼠海马GSK-3酶活性增加到原来的3.7倍；免疫组化和免疫印迹结果显示(见图4～17)手术48h后，与对照组相比，模型组大鼠tau蛋白Ser198/Ser199/Ser202(抗体Tau-1识别非磷酸化位点)和Ser396/404位点(抗体PHF-1识别磷酸化位点)磷酸化明显增强，并出现神经原纤维缠结样病理变化；而骨架蛋白Tau的这些特殊位点的磷酸化程度与动物的学习、记忆障碍正相关，即Tau蛋白过度磷酸化程度越高，大鼠学习记忆能力越差。上述结果说明模型构建成功。
本发明提供的动物模型的构建方法，同时适用于(1)在大鼠双侧海马或大鼠侧脑室注射反式异丙肾上腺素(β-肾上腺素能受体激动剂，蛋白激酶A激动剂)；(2)在大鼠双侧海马或大鼠侧脑室注射异丙肾上腺素前1h及后6h，并同时腹腔注射尼莫地平(钙离子拮抗剂)；(3)通过大鼠双侧海马注射或大鼠侧脑室注射其它药物，如花萼海绵诱癌素(Calyculin A，蛋白磷酸酯酶PP-2A和PP-1抑制剂)、缓激肽(Bradykinin，钙/钙调素依赖性蛋白激酶-II激动剂)、环胞菌素A(Cyclosporine A，蛋白磷酸酯酶PP-2B抑制剂)、forskolin(环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶激动剂)等，都可以直接复制出AD样大鼠海马骨架蛋白异常过度磷酸化、神经原纤维缠结样病理变化和学习、记忆障碍。
图1为wortmannin单独用药对大鼠空间学习、记忆的影响与手术前相比较，单独使用100μM的wortmannin能明显延长大鼠水迷宫潜伏期，而10μM浓度却没有相同的作用(n＝15；*，p＜0.01与对照组相比较)图2为GF-109203X单独用药对大鼠空间学习、记忆的影响与手术前相比较，单独使用100μM的GF-109203X能明显延长大鼠水迷宫潜伏期，而10μM浓度却没有相同的作用(n＝15；*，p＜0.01与对照组相比较)图3为wortmannin and GF-109203X联合用药对大鼠空间学习、记忆的影响不同浓度的wortmannin and GF-109203X联用对大鼠水迷宫潜伏期的影响，结果显示100μM的wortmannin和100μM的GF-109203X联用比单独使用其中一种药物更明显延长大鼠水迷宫潜伏期(n＝15；*，p＜0.01与对照组相比较)图4为免疫印迹结果显示wortmannin单用用药对大鼠海马骨架蛋白tau Ser199/202位点磷酸化的影响单独使用100μM的wortmannin能明显降低tau-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)。
图5为免疫印迹结果显示GF-109203X单用用药对大鼠海马骨架蛋白tau Ser199/202位点磷酸化的影响单独使用10μM或100μM的GF-109203X都能明显降低tau-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)。
图6为免疫印迹结果显示wortmannin and GF-109203X联合用药对大鼠海马骨架蛋白tau Ser199/202位点磷酸化的影响不同浓度的wortmannin and GF-109203X联用不同程度地降低tau-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)。
图7为免疫组化结果显示空白对照组大鼠海马骨架蛋白tau Ser199/202位点磷酸化的情况空白对照组在大鼠海马CA3和CA4区tau-1抗体着色的免疫组化结果(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)，Bar＝200μm。)图8为免疫组化结果显示wortmannin单用用药对大鼠海马骨架蛋白tau Ser199/202位点磷酸化的影响100μM wortmannin单独用药在大鼠海马CA3和CA4区tau-1抗体着色的免疫组化结果(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)，Bar＝200μm。)图9为免疫组化结果显示GF-109203X单用用药对大鼠海马骨架蛋白tau Ser199/202位点磷酸化的影响100μM GF-109203X单独用药在大鼠海马CA3和CA4区tau-1抗体着色的免疫组化结果(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)，Bar＝200μm。)图10为免疫组化结果显示wortmannin and GF-109203X联合用药对大鼠海马骨架蛋白tau Ser199/202位点磷酸化的影响(100μM wortmannin和100μM GF-109203X联合用药在大鼠海马CA3和CA4区tau-1抗体着色的免疫组化结果100μM wortmannin和100μMGF-109203X联用比单独使用其中一种药物更明显降低tau-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)，Bar＝200μm。)图11为免疫印迹结果显示wortmannin单用用药对大鼠海马骨架蛋白tauSer395/404位点磷酸化的影响单独使用100μM的wortmannin能明显增高PHF-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较。)图12为免疫印迹结果显示GF-109203X单用用药对大鼠海马骨架蛋白tauSer395/404位点磷酸化的影响单独使用10μM或100μM的GF-109203X都能明显增高PHF-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较。)图13为免疫印迹结果显示wortmannin and GF-109203X联合用药对大鼠海马骨架蛋白tau Ser395/404位点磷酸化的影响不同浓度的wortmannin and GF-109203X联用不同程度地增高PHF-1的免疫活性(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较。)图14为免疫组化结果显示空白对照组大鼠海马骨架蛋白tau Ser395/404位点磷酸化的影响空白对照组大鼠海马CA3和CA4区PHF-1抗体免疫组化结果(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)，Bar＝200μm。)图15为免疫组化结果显示wortmannin单用用药对大鼠海马骨架蛋白tauSer395/404位点磷酸化的影响(100μM wortmannin单独用药在大鼠海马CA3和CA4区PHF-1抗体免疫组化结果(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)，Bar＝200μm。)图16为免疫组化结果显示GF-109203X单用用药对大鼠海马骨架蛋白tauSer395/404位点磷酸化的影响(100μM GF-109203X以及后两者的联合用药在大鼠海马CA3和CA4区PHF-1抗体免疫组化结果(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)，Bar＝200μm。)图17为免疫组化结果显示wortmannin and GF-109203X联合用药对大鼠海马骨架蛋白tau Ser395/404位点磷酸化的影响100μM wortmannin和100μMGF-109203X联合用药在大鼠海马CA3和CA4区PHF-1抗体免疫组化结果显示100μM wortmannin和100μM GF-109203X联用比单独使用其中一种药物更明显升高PHF-1的免疫活性，且出现神经原纤维缠结样细胞(n＝7；$，p＜0.05与对照组相比较；*，p＜0.01与对照组相比较)，Bar＝200μm。)具体实施方式
实例1侧脑室注射wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶抑制剂)和GF-109203X(蛋白激酶C的抑制剂)构建AD样大鼠动物模型(1)实验动物及分组雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物实验中心提供)，SPF级，体重250～320克，150只，常规环境饲养。分十组，每组15只①正常组；②假手术组；③wortmannin组1(10μM)；④wortmannin组2(100μM)；⑤GF-109203X组1(10μM)；⑥GF-109203X组2(100μM)；⑦wortmannin(10μM)+GF-109203X(10μM)组1；⑧wortmannin(10μM)+GF-109203X(100μM)组2；⑨wortmannin(100μM)+GF-109203X(10μM)组3；⑩wortmannin(100μM)+GF-109203X(100μM)组4。
(2)主要试剂丙烯酰胺(Arc)，N，N-亚甲基双丙烯酰(bis)，四甲基乙二胺(TEMED)，十二烷基磺酸钠(SDS)，甘氨酸(Glycine)，牛血清白蛋白(BSA)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，矾酸钠(Na3 VO4)，β-磷酸甘油(β-PG)，氟化钠(NaF)，wortmannin和GF-109203X，均为Sigma产品；过硫酸铵(AP)及考马斯亮蓝蛋白显色液从Pierce(美国)公司购买；预染的高分子量蛋白标准从Gibco公司购买。
(3)主要仪器WDT-V型脑立体定位仪(西安西北光电仪器厂)STT-III型三维手动推进器(西安西北光电仪器厂)垂直型电泳槽和湿式电转膜槽(Hoefer，USA)电泳仪(DF-C型，东方特力科贸中心)转膜仪(BIO-RAD，北京市六一仪器厂)台式高速离心机(Sigma，德国)酶标仪(DG-3022型)图象分析系统(Image pro-plus kodak，USA)衡温杂交孵育箱(Biometra)(4)侧脑室注射给药选择适当的大鼠，麻醉后固定在脑立体定位仪上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.0～1.2mm，中线旁侧1.5～1.8mm垂直进针至硬膜下约3.5～3.8mm，分别缓慢注入wortmannin和GF-109203X药液各10μl，wortmannin的浓度为100μM；GF-109203X浓度为100μM，用灭菌人工脑脊液配置，留针10min使药液得到充分吸收。
(5)Morris水迷宫训练及测试实验所采用Morris水迷宫测试系统主要包括大鼠行为学测试系统、图象采集系统及微机数据处理分析系统。测试用圆形水池直径120cm，高60cm；圆柱形有机玻璃平台直径10cm，高40cm。大鼠在训练前2小时移入水迷宫室，并用染发剂将头颈部涂黑，涂染面积不小于3×3cm2，以与背景形成反差。水池中水面高约45cm，室温及水温均保持在26±2℃，水以奶粉搅浑；平台用双层白色纱布覆盖扎紧后任意放置于某一象限的中心位置，并没于水面下约2cm。整个背景均为乳白色，以避免老鼠用视觉搜寻平台。用于指导大鼠游泳找到平台的红色或兰色标记物分别置于平台所在象限边缘1m左右。
训练时将大鼠从任一象限1/2弧度处头面向池壁轻放于水中，其游泳图象经水面上方1.5m处的摄象机拍摄并连接于路径追踪系统采集，最后通过微机分析，可提供潜伏期(即大鼠从入水点起到找到平台所用的时间)、路径、搜索策略等指标，本实验选用潜伏期作为衡量大鼠学习记忆和测试成绩的指标。每只大鼠每天在4个象限共训练4次，每次游泳时限为60s，即在60s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为60s，由测试者引导其上台，休息30s后进行下一次训练。
(6)分子病理学检测目的通过免疫印迹和免疫组化来反映造模前后以及与对照组大鼠海马骨架蛋白的分子病理学变化。
免疫印迹法颈椎脱臼断头处死雄性Wistar大鼠，迅速取出大脑脑组织置于0-4℃ 0.05M Tris缓冲盐溶液(TB，PH7.0)内，快速分离双侧海马，制成10％的蛋白匀浆，在1000rmp离心5分钟，取上清，测定蛋白含量后备用。
免疫组化法用4％多聚甲醛磷酸缓冲盐溶液(PB)进行心脏灌注固定脑组织，待取出脑组织后再在上述固定液中后固定6h，即可作振荡切片。免疫组化采用ABC法，二氨基联苯氨(diaminobezidin，DAB)显色。
(7)糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性测定目的通过同位素标记法来检测造模前后以及对照组大鼠海马GSK-3的活性改变。
大鼠海马蛋白匀浆的糖原合成激酶(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)酶活性主要是依靠磷光体GS肽II作为底物进行测定(Pei et al.，1997；Tsujio et al.，2000)，具体方法如下在反应管中先一定体积的缓冲液(其组成为30mM Tris，pH7.4，10mM MgCl2，10mM NaF，1mM Na3VO4，2mM EGTA，and 10mMβ-mercaptoethanol)，再分别加入7.5μg大鼠海马蛋白匀浆、250μM底物肽和200μMγ-32P-ATP(1,500cpm/pmol ATP)，终体积为25μl，在30℃条件下孵育30min，用25μl of 300mM邻磷酸终止反应，然后从中取出25μl在液态闪烁记数分析仪进行检测。
(8)统计分析全部数据均采用X±SD表示，利用SPSS统计软件进行统计分析。
(9)模型构建评估根据上述实验步骤进行操作，结果显示同时在大鼠侧脑室注射wortmannin(100μM)和GF-109203X(100μM)，大鼠出现明显行为学障碍，即水迷宫测试潜伏期明显延长；酶活性检测结果显示手术48h后，与对照组相比，模型组大鼠海马GSK-3酶活性增加到原来的3.7倍；免疫组化和免疫印迹结果显示在手术48h后，与对照组相比，模型组大鼠骨架蛋白tau磷酸化异常程度明显增强，并出现神经原纤维缠结样病理变化。上述结果说明模型构建成功。分组、实验及结果列表如下
实例2 海马注射wortmannin和GF-109203X构建AD样大鼠动物模型(1)实验动物及分组雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物实验中心提供)，SPF级，体重250～320克，150只，常规环境饲养。分十组，每组15只①正常组；②假手术组；③wortmannin组1(1μM)；④wortmannin组2(10μM)；⑤GF-109203X组1(1μM)；⑥GF-109203X组2(10μM)；⑦wortmannin(1μM)+GF-109203X(1μM)组1；⑧wortmannin(1μM)+GF-109203X(10μM)组2；⑨wortmannin(10μM)+GF-109203X(1μM)组3；⑩wortmannin(10μM)+GF-109203X(10μM)组4。
(2)主要试剂和仪器同实例1(3)海马注射给药 依次按以下步骤进行①Wistar大鼠称重后，以5％水合氯醛0.6～0.8ml/100g腹腔注射麻醉；②麻醉后之大鼠固定于脑立体定位仪上，头顶局部剪毛，碘酊、酒精依次消毒；③头顶正中皮肤矢状切开约1.5cm长，清晰暴露前、后囟；
④确定前后囟在同一水平线上后，于前囟后3.8～4.8mm，矢线旁侧2.0mm用手钻各钻一孔；分别进针至硬膜下约3.0mm，慢速注入；⑤用5μl微量注射器吸取wortmannin液、GF-109203X(1μM或10μM))或0.9％的NaCl灭菌液2μl，在上述矢线旁两侧所钻孔部位分别进针至硬膜下约3.0mm，慢速注入，或分别缓慢注入wortmannin和GF-109203X药液各10μl，注射完毕后留针8～10min，再缓慢退针，以防药物沿针道返流颅外；⑥局部涂抹青霉素粉末，缝合皮肤，再次消毒创处，将鼠置于空笼内待其苏醒。
(4)行为学训练、测试及分子病理学检测方法、统计分析方法同实例1(5)模型构建评价根据上述实验步骤进行操作，结果显示同时在大鼠海马注射wortmannin(10μM)和GF-109203X(10μM)，大鼠出现明显行为学障碍，即水迷宫测试潜伏期明显延长；酶活性检测结果显示手术48h后，与对照组相比，模型组大鼠海马GSK-3酶活性明显增强；免疫组化和免疫印迹结果显示在手术48h后，与对照组相比，模型组大鼠海马骨架蛋白tau磷酸化异常程度明显增强，并出现神经原纤维缠结样病理变化。上述结果说明模型构建成功。
实例3 侧脑室射注反式异丙肾上腺素((-)Isoproterenol，IP)，并在射注反式异丙肾上腺素前1h及后6h腹腔注射尼莫地平构建AD样大鼠动物模型(1)实验动物及分组雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物实验中心提供)，体重250至320克，常规环境饲养。实验大鼠随机分为七组，每组15只正常组；NS注射24h组(假手术对照组，C-24h)，IP注射+NIM腹腔注射24h组(IP+NIM 24h)，NIM腹腔注射24h组(NIM 24h)；NS注射48h组(C-48h)，IP注射+NIM腹腔注射48h组(IP+NIM 48h)，NIM腹腔注射48h组(NIM 48h)。尼莫地平腹腔注射于IP注射前1h及后6h进行，0.2mg/kg。
(2)其他同实例1(3)模型构建评估根据上述实验步骤进行操作，结果显示在大鼠侧脑室注射IP(浓度为5-40mM均可，优选浓度为20mM，注射量10μl)，并于注射IP前1h及后6h腹腔注射尼莫地平，大鼠出现明显行为学障碍，即水迷宫测试潜伏期明显延长；免疫组化和免疫印迹结果显示在手术48h后，与对照组相比，模型组大鼠海马骨架蛋白tau磷酸化异常程度明显增强。上述结果说明模型构建成功。
实例4 海马注射反式异丙肾上腺素，并在注射反式异丙肾上腺素前1h及后6h腹腔注射尼莫地平构建AD样大鼠动物模型
(1)实验动物及分组同实例3(2)其他同实例2(3)模型构建评估根据上述实验步骤进行操作，结果显示在大鼠海马注射IP(浓度为5-40mM，优选浓度为20mM，2μl)，并于海马注射IP前1h及后6h腹腔注射尼莫地平，大鼠出现明显行为学障碍，即水迷宫测试潜伏期明显延长；免疫组化和免疫印迹结果显示在手术48h后，与对照组相比，模型组大鼠海马骨架蛋白tau磷酸化异常程度明显增强。上述结果说明模型构建成功。
权利要求
1.一种早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于在大鼠侧脑室或双侧海马注射蛋白激酶激动剂或/和抑制剂。
2.根据权利要求1所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于所说的蛋白激酶抑制剂是磷脂酰肌醇3激酶抑制剂或/和蛋白激酶C的抑制剂。
3.根据权利要求2所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于所说的磷脂酰肌醇3激酶抑制剂的浓度是100μM，蛋白激酶C的抑制剂的浓度是100μM。
4.根据权利要求1所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于所说的蛋白激酶激动剂为反式异丙肾上腺素。
5.根据权利要求4所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于所说的反式异丙肾上腺素的浓度为5至40mM。
6.根据权利要求4所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于在大鼠侧脑室或双侧海马注射反式异丙肾上腺素前1h及后6h对该大鼠腹腔注射尼莫地平。
7.根据权利要求6所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于腹腔注射尼莫地平的用量为0.2mg/kg。
8.根据权利要求1所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于所说的蛋白激酶激动剂为缓激肽或forskolin。
9.根据权利要求1所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于所说的大鼠侧脑室注射包括将大鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上，清晰暴露前后囟，于前囟后1.0～1.2mm，中线旁侧1.5～1.8mm垂直进针至硬膜下约3.5～3.8mm缓慢注入所选药物10μl。
10.根据权利要求1所述的早老性痴呆动物模型的构建方法，其特征在于所说的海马注射包括将大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上，头顶局部剪毛，碘酊、酒精依次消毒，头顶正中皮肤矢状切开约1.5cm长，清晰暴露前、后囟，确定前后囟在同一水平线上后，于前囟后3.8～4.8mm，矢状线两侧2.0mm处用手钻各钻一孔，在所钻孔处分别进针至硬膜下约3.0mm，慢速注入所选药物2μl。
全文摘要
本发明提供了同时在大鼠侧脑室注射wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶抑制剂)和GF－109203X(蛋白激酶C的抑制剂)构建早老性痴呆大鼠动物模型的方法，该方法能直接诱导出海马骨架蛋白的AD样异常过度磷酸化、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)样病理变化和学习、记忆障碍共存的大鼠动物模型，该类模型可用于筛选因蛋白激酶过度激活引发的骨架蛋白Tau AD样异常过度磷酸化、神经原纤维缠结样病理变化及学习、记忆障碍的早老性痴呆治疗药物，以及研究蛋白激酶和AD发病机制之间的内在联系。
文档编号A61K49/00GK1636601SQ0312534
公开日2005年7月13日 申请日期2003年8月28日 优先权日2003年8月28日
发明者王建枝 申请人:华中科技大学同济医学院