竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用的制作方法

专利名称：竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域。本发明涉及一种竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用。具体地说是具有抗菌、抑菌、抗炎、抗前列腺增生、抗血小板聚集、抗肿瘤和免疫促进等作用的竹叶总黄酮作为前列腺疾病防治的天然药物或膳食补充剂在药品及保健食品中的应用。
背景技术：
随着21世纪全球进入老龄化社会，疾病谱和医疗模式均发生了重要的变化，加上合成药物带来的药害及传统药物疗法在世界各地开展后取得的明显成效，都为天然药物的发展带来了良好的机遇，现在全世界对传统医学都开始进行重新认识，对天然药物“维护健康”或者“预防及治疗”都有很高的期待。安全、无副作用、作用温和、具有适应多样性的天然药物制剂将是对慢性病特别是多脏器疾病的老年患者最理想的药物。在这个意义上说，21世纪将是天然药物的时代。
近20年来，前列腺疾病呈上升和年轻化趋势，已成为威胁男性健康的常见病。前列腺疾病主要为前列腺炎和前列腺增生，前列腺癌也日渐增多。
前列腺炎综合征(Prostatitis Sysndrome，PS)是举世公认的医疗顽症，有“不是癌症的不治之症”之称。PS是男性泌尿系统的常见病、多发病，占泌尿外科门诊的25％。我国的发病率为24.3％，国外文献报道为35％～98％。两个患病年龄高峰分别为30～39岁和60～69岁。1990年Bennett等报道美国的发病率为73％，每年约有200万患者，主要以前列腺急性炎症和慢性炎症混合型为主，而我国以多灶慢性炎症为主。50％的男性一生中某个时期会受到PS的影响[CollinsMM et al.How common is prostatitis？A national survey of physician visits.J Urol1998；1591224-1228；何乐业.前列腺炎综合症.中华泌尿外科杂志2000，21(11)697-699；Roberts RO et al.A review of clinical and pathological prostatitissyndromes.Urology 1997；49809-821]。
临床上通常将PS分为四类急性细菌性前列腺炎(ABP)、慢性细菌性前列腺炎(CBP)、慢性非细菌性前列腺炎(NCP)和前列腺痛(PD)。其中ABP和CBP大约占5％，NCP占64％，PD占31％[Gerald JD et al.Prostatitis.Clin Microbiol Rev1998；11(4)604-613]。可见，慢性非细菌性前列腺炎(NCP)占了PS病例的大部分。PS病因、病理复杂，目前的研究认为其发生、发展与病原微生物感染、前列腺内尿液返流(IPUR)、机体和局部组织的免疫功能等多种因素密切相关，但确切的发病机理尚不清除。
目前临床上没有一种抗菌药物能对PS产生良好的治疗效果。一是由于前列腺解剖位置特殊，有利于尿道中的细菌进入腺体，不利于腺体引流，致使炎性分泌物易潴留而不易排出；二是前列腺组织结构特殊，前列腺上皮有脂膜存在，抗菌药物不易自血浆弥散入前列腺腺泡，且受前列腺液pH值的影响，要达到腺体内有效的杀菌、抑菌浓度，需具有一定的脂溶性、离解常数高、与血浆蛋白结合率低、毒性低，且能较长时间服用的药物，而目前临床上运用的抗菌药尚不具备这些特点。前列腺本身的病理改变，病灶周围易纤维化，又常影响抗菌药物向病灶扩散。目前市场急需治疗PS的特效药物[李卫真主编.前列腺病中医诊疗学.北京北京科学技术出版社1996.p181，186]。
在PS的治疗中抗生素是最常用的，如5-氟喹诺酮、磺胺类、四环素或红霉素等，用药时间长达8～10周，慢性PS停用抗生素后易复发。非细菌性PS一般无需使用抗生素。目前临床使用许多抗生素结合局部治疗方法，如输精管内注射、前列腺内局部注射、前列腺周围注射、前列腺周围封闭等，也有一定的疗效，但不能根治慢性PS。由于不少人合并有多种感染(同时感染衣原体、支原体、霉菌滴虫、葡萄球菌、耐药淋球菌等)，而目前的许多抗菌素难以同时对付这几种病原体，联合大剂量用药对脏腑危害甚大，服用大剂量抗菌素后易导致中毒性肝炎、中毒性肾炎和胃肠功能损伤。腺体内注射所选取的药物也并不能同时杀灭几种病原体，同时由于多次注射对腺体内腺管的机械性损伤所造成的硬结粘连可能给患者造成永久伤害，给最后的治疗带来极大的困难和无可挽救的后遗症。
α-受体阻滞剂，如盐酸坦索罗新(Tamsulosin)和多沙唑嗪(Doxazosin)，能降低后尿道压力，缓解TPUR，改善慢性PS患者的症状，与抗生素合用效果更佳。多沙唑嗪可以作为NCP的一线用药，同时也可辅助治疗CBP。非甾体抗炎剂如布洛芬能暂时改善疼痛症状，减轻炎症。别嘌呤醇能降低全身及前列腺中尿酸浓度，清除活性氧自由基，减轻炎症，缓解疼痛。另外，服用抗胆碱药Oxybutinin、横纹肌松弛剂Diazepam、花粉提取物Cenilton(舍尼通)和口服锌剂均可能对某些PS病例有效[何乐业.前列腺炎综合症.中华泌尿外科杂志2000，21(11)697-699；许明等.舍尼通和抗菌药物在慢性非细菌性前列腺炎中治疗作用比较.上海医科大学学报2000；27(6)497-498]。
前列腺增生(BPH)是老年男子常见的前列腺疾病之一。据目前统计结果表明，本病始发于40岁，高发于50～70岁。国外一组尸检结果表明，50岁以上男子半数以上有BPH，年逾70岁者发病数增至75％。我国过去发病年龄似较欧美各国要晚10年，但近年来呈上升趋势。除平均寿命延长外，还与饮食水平改善、大量烟酒及壮阳物品的刺激等多方面因素有关。
前列腺癌(PC)是欧美国家常见的男性恶性肿瘤。在美国发病率占第一位，年死亡病例超过35,000，仅次于肺癌[Parker SL，Tong T，Bolden S，et al.CancerStatistics.CA Cancer J Clin，1997；475-27]。我国PC的发病率虽远低于西方国家，但随着经济水平的提高，生活方式的改变和人均寿命的延长，男性病人中PC的发病率日益增多，发病年龄也趋向年轻化，已成为威胁我国老年男性生命的重要疾病[马腾骧.男性生殖系肿瘤.中华泌尿外科杂志，1999；20(9)521-522]。据统计，我国PC的发病率已由50年代的0.2/10万人口升至90年代的1.2～3.4/10万人口，现已排在泌尿系肿瘤的第三位[刘耀庭，李秀霞，程伟.泌尿外科肿瘤发病情况的变化.临床泌尿外科杂志，1997；1247]。
东西方国家间PC发病率的差异，已引起医学家和营养学家的高度重视，纷纷进行涉及面很广的研究，但至今真正发病机制仍不甚清楚，尚属探索阶段。PC的病因很复杂，年龄、遗传因素和环境因子均可影响PC的发生。流行病学资料显示，饮食和环境因素可能比遗传因素在PC的发生中起更重要的作用[郭应禄主编。前列腺增生及前列腺癌症。北京人民卫生出版社1998；141-143]。在PC发病较低的东方人的食物中含有大量的水果和蔬菜。然而，这种神奇的食物成分至今还没有确定下来[夏同礼编.前列腺癌的基础与临床.北京科学出版社，2000；p331]。目前虽有外科手术、激素、化学治疗药物等多种治疗方法，但无一种方法能显著提高PC患者的存活率，而且一旦诊断明确，大多已失去手术时机。因此寻求天然化学预防剂(尤其是植物化学素)用于膳食干预，减少或缓慢PC的进展具有重要意义。
流行病学资料和临床研究发现，番茄制品的消费可以明显降低PC的危险性。对14,000名男性宗教人士进行了6年随访研究，发现每周食用5次以上番茄红素，则忠PC的危险性明显下降[Mills PK，Beeson WL，Phillips RL，et al.Cohortstudy of diet，life style and prostate cancer in Adventist men.Cancer，1989；64598-604]。哈佛公共卫生学院营养研究室[Giovannucci EL，Ascherio A，Rimm EB，et al.Intake of carotenoids and retinol in relationship to risk of prostate cancer.J NatlCancer Inst，1995；871767-1776]在1986～1992年间对美国48,000名医务人员进行的随访研究也证实，摄入大量富含番茄红素的制品与PC危险性呈负相关。
中医学将前列腺疾病归入“淋浊”、“白浊”、“劳淋”、“隆闭”等范畴。中医临床辩证分型论治湿热久蕴者，治宜清热解毒，利湿通淋；阴虚火旺者，治宜滋阴清热，利湿导浊；肾气不足者，治宜补肾固精，佐以利湿导浊；气滞血瘀者，治以活血化瘀，行气导滞[陈武山编著.前列腺与精囊疾病.科学技术文献出版社200176]。中医各家对前列腺疾病的辩证分型各不相同，因而用药也无雷同，目前的研究大多缺乏随机对照、严谨的临床观察和疗效评价，限制了中医药在治疗前列腺疾病中的应用。
由于前列腺组织的特殊解剖结构，腺管狭长，尿道病原菌进入后，不易随分泌物排除和清除。前列腺～血液之间的屏障作用，药物不易透过前列腺上皮脂膜进入腺体，在腺体中难以达到有效浓度。延误治疗和对抗菌素的耐药导致慢性炎症，而慢性炎性病变又使官腔狭窄，纤维组织增生，细菌长期滞留在前列腺组织内，形成慢性病灶，以至治愈率极低，复发率极高。另一方面，目前对慢性PS的病因及发病机制的认识不够，临床表现易与前列腺增生和前列腺癌的症状重叠，造成临床诊断的困难和不确定性，慢性PS至今缺乏合理有效的治疗方法和药物。2000年10月的NIH-IPCN会议建议对慢性PS治疗，以抗生素、α-受体阻滞剂、抗炎药物为第一线治疗，理疗(包括微波)、植物制剂为第二线治疗，保列治、聚硫酸酯戊糖酸为第三线治疗[唐孝达.慢性前列腺炎诊断与治疗进展.中国男科学杂志2002；16(3)193-196]。
卫生部制定的中药新药临床指导原则将慢性PS分为湿热下注、气滞血瘀、肝肾阴虚、肾阳虚症等4个主要症型。中成药前列腺丸、茴香橘核丸、六味地黄丸、肾气丸、野菊花栓等均可不同程度地缓解前PS症状。现代研究证实，丹参、牛膝、王不留行等活血化瘀药能消除病灶部位水肿，解除炎性梗阻，畅通前列腺管，使纤维组织软化，局部血行增加，从而使药物易达病灶，提高有效药物浓度；败酱草、生薏苡仁等化湿解毒药具有抗菌、清除炎性病灶、促进炎性分泌物排除、提高免疫功能、促进组织修复的作用。中西药的联合使用可起到事半功倍的效果[贾金铭等.前列腺炎的治疗.中国中西医结合杂志2002；22(3)217-220]。
根据PC的发病年龄多在50岁以上，及前列腺解剖位置的特殊性，中医认为，PC的发生主要是正气不足，湿热邪毒侵袭，日积月累，引起机体阴阳失调、脏腑功能障碍、气血运行障碍，而致瘀血、痰浊、邪毒等相互交结，形成肿瘤[陈武山编著.前列腺与精囊疾病.北京科学技术出版社，2001，pp180-182，74-75]。根据PC的病机转变及症情的虚实变化，早期邪毒蕴积，治以清热解毒为主；中期痰瘀互结，治以化痰软坚、祛瘀散结为法；晚期正气消残，气血阴阳皆虚，治以补益气血、滋阴和阳为要。根据临床实际，常用的内治法主要有清热、祛湿、活血化瘀、补益、泻下、理气、化饮祛痰和固涩法[李卫真主编.前列腺病中医诊疗学.北京北京科学技术出版社1996.pp181，186]。
(淡)竹叶是常用方剂中的一味清热、解毒、利尿药，如《济生方》中的小蓟饮子等。据《中药大辞典》记载，淡竹叶功用主治清热除烦，生津利尿；治热病烦渴，小儿惊痫，咳逆吐血，面赤，小便短赤，口糜舌疮等。1998年(淡)竹叶被列入了“药食两用”的天然物名单。近年来的研究表明，以淡竹[Phyllostachys nigra var.hnonis(Bean)Stepf ex Rendle]为代表的刚竹属的竹叶中含有大量的黄酮、内酯、酚酸、蒽醌、多糖、特种氨基酸、芳香成分和锰、锌、硒等微量元素，具有多重生理和药理活性。
我国素有“竹子王国”之称，拥有十分丰富的竹类资源和源远流长的竹文化。境内有竹类40多属400余种，竹林面积约400万ha。据不完全统计，我国有1亿多人口全部或部分从竹林和竹林产品加工中获取生活费用。竹类植物作为森林资源的重要组成部分，不仅有着较高的经济价值，而且具有广泛的生态与社会效益。竹子以其独特的生物学、生态学及多用途等特点，日益受到人们的重视，在中国可持续发展战略中正发挥着越来越重要的作用。
我国在竹子有效成分的研究和开发方面处于国际领先水平。竹叶提取物是张英等于20世纪90年代开发的一种植物类黄酮制剂，其发明专利“一种添加竹叶黄酮提取物的保健啤酒(ZL 98 1 04563.4)”和“从竹叶中提取黄酮类化合物浸膏或粉剂的生产方法(ZL 98 1 04564.2)”分别于2000年和2001年获得国家专利局的授权。大量的研究表明，竹叶黄酮具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒及保护心脑血管、防治老年退行性疾病等生物学功效。并以其丰富的原料来源、明确的功能因子、令人信服的安全性、高效稳定的制剂品质和清新甜香的竹子风味，近年来在功能性食品和医药保健品领域崭露头角[张英，天然功能性添加剂——竹叶提取物，精细与专用化学品，2002，10(7)20～22]。
竹叶总黄酮的功能因子主要是C-糖苷黄酮，四种主要的竹叶碳苷黄酮分别是荭草苷(Orientin)、异荭草苷(Homoorientin)、牡荆苷(Vitexin)和异牡荆苷(Isovitexin)。碳苷黄酮与氧苷黄酮相比，具有以下几方面的突出优点(1)结构稳定，不易被降解；(2)能深入病灶部位，直接发挥疗效；(3)亲水性增强，有利于药品、食品、化妆品的开发。国际学术界从90年代起开始关注碳苷黄酮，此领域属最新的研究前沿。
黄酮类化合物(Flavonoids)广泛分布于瓜果、蔬菜、茶叶、大豆及其制品中，且足许多中草药的有效成分。天然来源的生物黄酮，分子量小，能被人体迅速吸收，能透过血脑屏障。目前对其生理作用的研究主要集中在抗自由基活性，抗氧化活性，与癌症的相关性，与内分泌的关系，抗菌、抗病毒作用，类雌激素活性等。但迄今为止，罕见有关黄酮类化合物与前列腺病理直接相关的公开报道，尤其是无任何有关竹叶黄酮对前列腺的生理和药理活性的研究报告。

发明内容
本发明的目的是提供一种竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用。
竹叶总黄酮应用于防治前列腺疾病的药物及保健食品产品中。
本发明的优点是提供了一种来源广阔、安全有效、经济适用的植物提取物——竹叶总黄酮(EOB-f)，对其与前列腺病理相关的特性进行了系统研究，表明其具有显著的抗菌、抗炎、抗前列腺增生、抗血小板聚集、抗肿瘤和免疫促进等作用；先前的大量研究已表明，其具有优良的抗自由基、抗氧化、抗辐射、保护心脑血管等生理和药理活性，安全、无毒，长期使用无副作用；且性能稳定，风味清香，可以制成各种不同的剂型，并可与多种药品和食品体系复合，使用方便，尤为适合于前列腺疾病这类多靶点的老年慢性退行性疾病的防治。


图1是竹叶总黄酮(EOB-f01)的HPLC谱图(示4种主要的碳苷黄酮)；图2是竹叶总黄酮(EOB-f01)的红外谱图(经溴化钾压片)；图3是竹叶总黄酮(EOB-f01)的紫外谱图(溶于光谱纯的甲醇)；图4是正常大鼠前列腺组织病理学切片图；图5EOB-f01剂量为400mg/kg时大鼠的前列腺炎组织病理学切片图；图6EOB-f01剂量为200mg/kg时大鼠的前列腺炎组织病理学切片图；图7模型组(角叉菜胶)大鼠前列腺炎组织病理学切片图。
具体实施方法张英及其合作者在先前研究的基础上，近年来又对竹叶总黄酮(EOB-f)与前列腺药理相关的功能进行了系统研究，归纳如下。
1抑菌作用1.1菌株来源粪肠球菌(E.faecalis)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、普通变形杆菌(P.vulgaris)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)来自浙江省人民医院临床泌尿生殖道标本中，实验前3个月内分离所得。标准菌种金黄色葡萄球菌S.aureus(ATCC25923)、大肠埃希菌E.coli(ATCC25922)由浙江省临床检验中心提供。
1.2竹叶总黄酮试样产品代码EOB-f01，标准总黄酮糖苷含量≥50％，实测值为56.7％，为冻干的棕褐色结晶样粉末，由杭州浙大力夫生物科技有限公司提供。置干燥器内储存，临用时以蒸馏水配制，超声波助溶。
1.3实验方法参照《中华人民共和国卫生部医政司全国临床检验操作规程》第二版有关内容进行。
1.4结果一般认为感染因素在急、慢性细菌性前列腺炎的发病中占主导地位，但随着病因学研究的深入，表明慢性非细菌性前列腺炎也与细菌感染有关。目前已证明细菌性前列腺炎的革兰氏阴性致病菌以大肠杆菌为主，还有变形杆菌、绿浓杆菌、克雷伯氏菌等，革兰氏阳性致病菌以金黄色葡萄球菌为主，另有表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、淋球菌等。申请者选用了七种常见泌尿系统致病菌进行体外抑菌试验，结果表明，EOB-f01对上述细菌均有不同程度的抑制作用，见表1。
表1 EOB-f01对常见泌尿系统致病菌的抑制作用

2抗炎作用2.1对巴豆油所致小鼠耳廓肿胀的影响小鼠按体重随机分成5组，每组12只，设置如下①空白对照组等体积生理盐水，0.8mL/20g；②阳性对照组消炎痛10mg/kg；③高剂量组10mg/mL的EOB-f01，剂量为400mg/kg；④中剂量组5mg/mL的EOB-f01，剂量200mg/kg；⑤低剂量组2.5mg/mL的EOB-f01，剂量100mg/kg。动物每天ip给药1次，连续7d(消炎痛仅给药1次)，末次给药后1h，小鼠右耳涂2％巴豆油0.02mL/只、致炎，4h后处死，沿耳廓剪下左右耳，以9mm环钻冲下左右耳片，称重，以左右耳片重量之差值作为肿胀率。
实验结果表明，小鼠灌胃给予200mg/kg和400mg/kg剂量的EOB-f01连续7d后，对巴豆油所致的耳廓肿胀具有显著(p＜0.05)和极显著(p＜0.01)的抑制作用，并呈明显的剂量依赖关系(表2)。
表2 EOB-f01对小鼠巴豆油所致耳廓肿胀的影响(X±SD)

*p＜0.05，**p＜0.01，与对照组相比。
2.2对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响小鼠按体重随机分成5组，每组10只，设置同2.1。动物每天ig给药1次，连续7d(消炎痛仅给药1次)，末次给药后30min，小鼠右耳涂二甲苯0.05mL/只、致炎，15min后处死，沿耳廓剪下左右耳，以9mm环钻冲下左右耳片，称重，以左右耳片重量之差值作为肿胀率。并与对照组比较，判断疗效。
表3 EOB-f01对小鼠二甲苯所致耳廓肿胀的影响(X±SD)


*p＜0.05，**p＜0.01，与对照组相比。
表3显示，小鼠灌胃给予400mg/kg剂量的EOB-f01连续7天后，对二甲苯所致耳廓肿胀具有显著(p＜0.05)的抑制作用，中、低剂量时作用不明显。
2.3对角叉菜胶所致大鼠前列腺炎的影响SD雄性大鼠，体重204～252g，按体重随机分成7组，每组10只(1)对照组1mL/100g的等体积生理盐水；(2)模型组1mL/100g的等体积水；(3)吲哚美辛组12mg/kg(1.2mg/mL)；(4)高剂量组EOB-f01 400mg/kg(40mg/mL)；(5)中剂量组EOB-f01 200mg/kg(20mg/mL)；(6)低剂量组EOB-f01 100mg/kg(10mg/mL)。大鼠每天ig给药1次，连续7d(吲哚美辛仅手术前给药1次)，末次给药后0.5h，开始手术。
大鼠用乙醚麻醉后，仰位固定，腹部剪毛，用碘酊和乙醇消毒，在无菌条件下，腹部正中切开约1.5cm，暴露前列腺腹叶，以4.5号针头向(2)～(6)组大鼠的前列腺腹叶注射1％角叉菜胶生理盐水溶液0.02mL/只，立即将前列腺回纳腹腔，在腹腔内加1滴青霉素后，即刻双层缝合腹腔。对照组(1)以生理盐水0.02mL/只代替角叉菜胶，进行假手术处理。手术后4h，处死大鼠，解剖分离前列腺各叶，称取湿重，比较给药组与模型组之间前列腺肿胀的程度。取大鼠前列腺腹叶，以10％福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋切片，HE染色，在电子显微镜下观察病理变化。
各组大鼠前列腺组织病理观察标准①间质水肿或血管充血程度评分间质无水肿或血管充血为0分，间质轻度水肿或血管充血为1分，间质中度水肿或血管充血为2分，间质严重水肿或血管充血为3分；②炎症细胞浸润程度评分间质无炎症细胞浸润为0分，间质少量炎症细胞浸润为1分，间质中量炎症细胞浸润为2分，间质多量炎症细胞浸润为3分，间质弥漫性炎症细胞浸润为4分。
实验显示，角叉菜胶致炎4h后，大鼠前列腺发生严重水肿，炎症明显。经统计分析，模型组与对照组相比，前列腺腹叶的重量增加极其显著(p＜0.001)，对前列腺背叶和侧叶重量的影响无统计学意义(p＞0.05)。EOB-f01高、中、低剂量组和吲哚美辛组与模型组相比，明显抑制了前列腺腹叶重量的增加(p＜0.001、(p＜0.01、p＜0.05、p＜0.01)，并呈显著的剂量依赖关系；而对背叶和侧叶的影响无统计学意义(p＞0.05)，见表4。
表4 EOB-f01对角叉菜胶所致大鼠前列腺重量的影响(X±SD)

###p＜0.001，与空白对照相比；***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05，与模型组相比。
大鼠前列腺腹叶病理组织学研究显示，对照组前列腺组织正常，呈分叶状，腺上皮大多单层柱状，有刷状缘，部分腺上皮呈乳头状增生；部分腺体内见浅红色分泌物，腺体之间少量间质，间质内均未见炎症改变和纤维增生；模型组、EOB-f01各试验组、吲哚美辛组腹叶组织结构类似与对照相比，腺上皮略增高，呈复层状；腺体稍增生，或部分腺上皮乳头状增生；间质血管扩张或水肿，伴中性粒细胞弥漫性或多量到少量浸润，间质内未见纤维增生，显示为无菌性间质炎症。其中EOB-f01各试验组与对照相比，炎症程度显著减轻。组织病理学观察数据的评分统计结果见表5，相应的病理切片见附图4～7。
表5 EOB-f01对角叉菜胶所致大鼠前列腺腹叶炎症的组织病理学观察(X±SD)

###p＜0.001，与空白相比；**p＜0.01，*p＜0.05，与模型组相比。
3抗前列腺增生作用ICR小鼠，雄性，体重18-21g，按体重随机分成7组，每组10-11只①对照组0.8mL/20g的等体积水ig；②模型组0.8mL/20g的等体积水ig；③雌二醇组0.5mg/kg的雌二醇sc，每3天1次，共5次；④高剂量组EOB-f01 400mg/kgig；⑤中剂量组EOB-f01 200mg/kg ig；⑥低剂量组EOB-f01 100mg/kg ig。每天给药1次，连续14d。除对照组①外，②～⑥各组5mg/mL的丙酸睾丸素每日sc，连续14d。第15天，处死小鼠，解剖，称取前列腺腹、侧、背各叶的重量，评价EOB-f01抗前列腺增生的作用。
结果显示，模型组小鼠给予丙酸睾丸素后前列腺腹、侧、背叶重量增加，增生明显，与对照组相比有显著的统计学意义。EOB-f01各给药组与模型组比较，高、中剂量组对小鼠前列腺腹叶增生有明显抑制作用(p＜0.01，p＜0.05)，但对其他各叶的影响无统计学意义(p＞0.05)；而雌二醇对小鼠前列腺各部位的增生均有显著的抑制((p＜0.001，p＜0.01)，见表6。
表6 EOB-f01对丙酸睾丸素所致小鼠前列腺增生的影响(X±SD)组别剂量 n前列腺重量(mg_(mg/kg) (只) 腹叶 侧叶 背叶空白对照-- 107.6±2.1 14.1±5.2 5.8±1.6模型组 51011.3±2.8##23.6±6.2##7.8±1.8#雌二醇组5+0.5107.0±1.7***15.1±2.7*** 5.1±1.6**高剂量组5+400118.1±2.1** 22.7±4.9 6.5±1.5中剂量组5+200108.5±1.9* 23.9±6.28 6.2±2.1低剂量组5+100109.1±1.5 22.4±6.0 6.8±2.0##p＜0.01，#p＜0.05，与空白对照相比；***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05，与模型组相比。
前列腺增生是老年男性的常见病，流行病学研究已证明前列腺增生仅发生于有正常睾丸功能的老年期，其发病机制尚未完全阐明。大多数学者认为，性激素平衡失调或有关激素分泌失调是其病变的主要基础。雄激素的存在是前列腺生长发育的基础，也是其增生的重要原因；而雌激素低剂量时促进前列腺基质细胞的增殖、高剂量则抑制其增殖。EOB-f01在高、中剂量时对幼年小鼠前列腺腹叶的生长有明显的抑制作用，但不影响幼年小鼠储精囊、提肛肌和睾丸的生长，提示EOB-f01可能对前列腺有直接作用。同时，EOB-f01对丙酸睾丸素所致小鼠前列腺腹叶增生的抑制作用，显示其对性激素引起的前列腺增生也有作用。
4对幼年小鼠前列腺及附性器官生长的影响ICR幼年雄性小鼠，体重10～12g，按体重随机分组，每组10～11只①对照组0.8mL/20g的等体积水ig；②雌二醇组0.5mg/kg的雌二醇sc，每3天1次，共5次；③高剂量组EOB-f01 400mg/kg ig；④中剂量组EOB-f01 200mg/kgig；⑤低剂量组EOB-f01 100mg/kg ig。小鼠每天给药1次，连续14d。第15天，处死小鼠，解剖并称取前列腺腹、侧、背各叶及储精囊、睾丸、提肛肌的重量。结果显示，EOB-f01高、中剂量组对幼鼠前列腺腹叶的生长有明显的抑制作用(p＜0.05)，但对侧叶和背叶的影响不明显(p＞0.05)；而雌二醇对幼鼠前列腺各叶的生长均有明显的影响(p＜0.001)，见表7。
表7 EOB-f01对幼年小鼠前列腺生长的影响(X±SD)

***p＜0.001，*p＜0.05，与空白对照组相比。
除EOB-f01高剂量组使幼鼠储精囊重量显著减轻外(p＜0.01)，其他各组对幼鼠储精囊、睾丸、提肛肌的重量无明显影响(p＞0.05)；而雌二醇对幼鼠储精囊、睾丸、提肛肌的生长均有显著的抑制作用(p＜0.01)，见表8。
表8 EOB-f01对幼鼠储精囊、睾丸、提肛肌生长的影响(X±SD)组别 剂量 n 睾丸 储精囊 提肛肌(mg/kg) (只)(mg) (mg) (mg)空白对照 11 151.3±28.234.1±11.3 42.5±10.6雌二醇组0.510 58.0±12.8*** 7.3±2.5*** 14.1±3.3***高剂量组40010 140.0±30.920.5±8.8** 35.6±8.3中剂量组20011 158.9±14.133.5±12.0 47.1±12.8低剂量组10010 141.4±14.833.9±10.8 43.4±11.5
***p＜0.001，*p＜0.01，与空白对照组相比。
5抗血小板聚集作用2001年，申请者又委托沈阳药科大学对EOB-f01抗血小板聚集作用进行了试验。由表9及表10可以看出无论是体内还是体外，EOB-f01均具有明显的抗家兔血小板聚集的作用，与阴性对照组比较差异显著，其中在体内抗血小板聚集实验中，中剂量及高剂量组的抗血小板聚集作用强于复方丹参片组。
表9 EOB-f01对家兔体外血小板聚集的影响(X±SD，n＝8)组别 剂量(mg/kg) 动物数 血小板聚集率(％)抑制率(％)对照组 --836.36±6.65 --高剂量组10810.97±4.70**69.82中剂量组5 817.13±3.25* 52.88低剂最组2.5 821.91±2.05* 39.74**p＜0.01，*p＜0.05，与对照组比较，表10 EOB-f01对家兔半体内血小板聚集的影响(X±SD，n＝8)组别 剂量(g/kg) 动物数血小板聚集率(％)抑制率(％)对照组 -- 851.17±4.96--高剂量组0.4827.27±4.85***46.57中剂量组0.2831.66±2.64***38.13低剂量组0.1838.63±2.65** 24.51复方丹参组 0.1835.67±6.67** 30.30***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，与对照组比较.。
6免疫促进作用竹叶总黄酮试样产品EOB-f03，标准总黄酮糖苷含量≥10％，实测值为13.6％，棕黄色粉末，由杭州浙大力夫生物科技有限公司提供。雄性昆明种小鼠，体重18～22g，由南京铁道医学院实验中心提供，随机分为阴性对照组及低、中、高三个剂量组，分别相当于人体推荐摄入量的5、10和30倍。试验按照卫生部监督司《保健食品功能学评价程序和检验方法》中免疫调节功能所规定的方法进行。
6.1对小鼠血清溶血素抗体形成的影响小鼠血清溶血素抗体含量以样品半数溶血值(HC50)表示，实验显示(表11)，中剂量组与对照相比有显著差异(p＜0.05)，高剂量组有显著差异(p＜0.01)，表明EOB-f03可以促进小鼠体内抗体的产生，提高体液免疫功能。
表11EOB-f03对小鼠血清溶血素的影响(X±SD)组别 剂量(mg/kg) n(只)半数溶血值(HC50)对照组 -- 10132.06±24.77高剂量组90010155.21±3.79**中剂量组30010152.04±4.51*低剂量组15010150.42±15.02*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较。
6.2对小鼠碳粒廓清速率的影响表12 EOB-f03对小鼠碳粒廓清速率的影响(X±SD)组别剂量(mg/kg)n(只) 吞噬指数(a)对照组 -- 102.33±0.96高剂量组900103.71±1.14**中剂量组300103.2±0.69*低剂量组150102.77±1.12*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较。
对表12中各组的吞噬指数进行单因素方差分析，F＝3.491，P＜0.01，可以判断不同剂量组的吞噬指数的均数差异有高度显著性；两两比较结果表明，EOB-f03 300mg/kg以上剂量组与对照组相比差异显著。表明EOB-f03能明显增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能。
6.3对DNFB诱导的小鼠迟发性变态反应的影响表13 EOB-f03对小鼠迟发性变态反应(DTH)的影响(X±SD)组别 剂量(mg/kg) n(只)耳壳重量差值(mg)对照组 -- 107.10±2.69高剂量组900109.30±1.70*中剂量组300109.20±1.32*低剂量组150107.20±2.49*P＜0.05，与对照组比较。
对小鼠左右耳片重量差进行单因素方差分析，F＝3.004，P＜0.05，可以判断为不同剂量组的左右耳片重量有显著性差异；各剂量组左右耳片重量差与对照组比较，中、高剂量组的差异有显著意义(P＜0.05)。表明EOB-f03能促进小鼠的细胞免疫功能。
7抗肿瘤活性2002年起，申请者又在EOB-f01的基础上，进一步采用高速逆流色谱(High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)分离技术，得到了荭草苷和异荭草苷含量之和在95％以上的二种竹叶碳苷黄酮的混合物[徐维娅，色谱技术和伏安法在竹叶提取物成分分析中的应用研究，浙江大学硕士学位论文，2002.6]，并进行了体外抗肿瘤活性的筛选，显示其对DU145(人前列腺癌细胞株)、P388(小鼠白血病)、A549(人肺腺癌)、A375(人黑色素瘤)、L929(小鼠肺上皮癌)、Hela(人宫颈癌)、THP-1(人巨噬组织瘤)等癌细胞的增殖均有不同程度的抑制作用，且其抑制率具有时间和剂量的依赖性。
8临床观察在竹康宁胶囊(卫食健字 第0564号；核准的保健功能为调节血脂和增强免疫力；以EOB-f03为内容物，250mg/粒，总黄酮糖苷含量≥10％；)的消费过程中，发现对多例消费者经久不愈的前列腺增生和前列腺炎症收到了意外的疗效。举例如下干××，男性，73岁，浙江宁波人，离休干部，有家族性高血压史，血脂偏高。20多年来，长期服用心痛定、复方卡托普利以及复方降压片、复方罗布麻片、开博痛等降压药和鱼油降脂丸、血脂清、多烯康等降脂药，并辅以地奥心血康、银杏叶片、天保宁等。但效果仍不理想。血压最高达到220/120mmHg，通常为180/90mmHg；血甘油三酯和血胆固醇均高出正常范围。自1998年7月7日起，在坚持服用心痛定的同时，停用鱼油降脂丸和银杏叶片，改服竹康宁胶囊，每日2次，每次3粒，连续2个月。停用一周后，于9月14日去医院复查，测得血压为170/85mmHg，血脂各项指标均转为正常(其中TG从1.83下降至0.90mmol/L，TC从5.90下降至4.82mmol/L，载脂蛋白A从1.26升高到1.67g/L，载脂蛋白B从1.14下降到1.00g/L)。在服用1个多月时，无意中发现，原先每晚平均需小便3～4次，现每晚起夜1次即可，效果显著。
候×，男，74岁，湖南长沙人，离休干部。于1986年患了一场重感冒，一个多月身体不适，后发现小便异常，经医院检查患了前列腺炎，主要症状是早晨首次如厕时，尿道烧灼感十分强烈；平时小便常不能一次解完，尿流断续呈线，解时尿道有疼痛感。10多年来曾四处求医，邮购药品，花钱很多，效果全无，病情逐渐加重，痛苦不堪。自1999年6月开始服用竹康宁胶囊，坚持了半年左右，感到上述症状显著减轻，生活质量大幅度提高。
结论由于前列腺疾病的发病机理目前尚无定论，根据它的病理特点及可能的发病机理，选用了以上实验体系，结合起来阐述了竹叶总黄酮(EOB-f)对前列腺炎、前列腺增生以及前列腺癌症可能的防治效果，表明其具有作为前列腺疾病的二线治疗药物和/或保健食品开发的潜力。
本发明所指的竹叶总黄酮(EOB-f)是从禾本科(Graminae)、竹亚科(Bambusoideae)、刚竹属(Phyllostachys Sieb.et Zucc)品种的叶子中得到的不同精度的黄酮制剂，其生产工艺在张英以前的二项发明专利(专利号分别为ZL 981 04564.2和ZL 98 1 04563.4)中已有涉及。需要指出的是，本专利所指的竹叶总黄酮既可以是采用上述专利工艺得到的产品，也可以是在此基础上进一步运用吸附～解吸、柱层析、膜分离、重结晶、色谱分离等技术及其组合方法精制得到的竹叶黄酮制品。
竹叶总黄酮(EOB-f)的外观为黄色或棕黄色粉末(也可以浸膏形式存在)，总黄酮糖苷含量(硝酸铝～亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品，以干基计)可以变化在10～90％之间，四种主要的碳苷黄酮是荭草苷(orientin)、异荭草苷(homoorientin)、牡荆苷(vitexin)和异牡荆素(isovitexin)，见附图1。经溴化钾压片后的红外光谱图显示，竹叶总黄酮在3408、2934、1652、1610、1118、1078cm-1等处有特征性吸收(附图2)；将其溶于光谱纯甲醇后，在200～600nm的波长范围内进行扫描，谱图显示在240～280nm之间有一强吸收峰，在340～380nm之间有一次强吸收峰，符合黄酮类化合物的典型特征(附图3)。
竹叶总黄酮(EOB-f)的化学试剂鉴别取试样0.5g溶于100mL95％的乙醇中，①取上述溶液1mL，加1％FeCl3-乙醇溶液2～3滴，应显深蓝色或兰紫色。②取上述溶液1mL，加1％AlCl3-乙醇溶液2～3滴，应呈鲜黄色。③取试样0.5g，加入10mL乙醚，超声波辅助萃取30s，过滤。取滤液1mL，置70～90℃的水浴中挥干乙醚后，依次加入2％的间二硝基苯溶液(用95％乙醇配制)和2.5mol/L的KOH水溶液各1mL，应立即出现微红色，放入上述热水浴中，迅速变成深紫红色。
本发明所涉的最新研究表明，竹叶总黄酮对七种常见泌尿系统致病菌均有一定的抑制作用；对小鼠巴豆油和二甲苯耳炎模型有明显的抑制作用；对大鼠角叉菜胶前列腺炎模型有明显抑制作用；对幼年小鼠前列腺生长有一定的抑制作用，但对睾丸、储精囊和提肛肌的生长无明显影响；对丙酸睾丸素所致小鼠前列腺增生有明显抑制作用；在体内外均具有明显的抗家兔血小板聚集的作用；能显著促进小鼠的体液免疫、细胞免疫和巨噬细胞吞噬功能；并对多种肿瘤细胞株的增殖具有抑制作用，具有作为前列腺疾病防治的天然药物或保健食品开发的潜力。
本发明所指的防治前列腺疾病的天然药物或保健食品中，既可单独以竹叶总黄酮作为药效成分或功能因子，也可与通常用于前列腺药物的其他中、西原料药或植物提取物适量配合，这些其他的组分可以包括各种抗生素、α-受体阻滞剂、抗炎药物和他种植物提取物(如植物多糖、植物黄酮、植物甾醇、花粉提取物、番茄红素等)。
作为防治前列腺疾病的活性成分，竹叶总黄酮(EOB-f)的用量(以总黄酮糖苷含量计)为成年人每日10～1000mg，优选50～600mg，每日服用1～2次。
本发明的产品可以制成各种剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、预乳剂、微乳剂、混悬剂、糖浆剂、各种肠溶制剂、注射剂、喷雾剂、软膏剂、栓剂等直肠给药制剂，等等。
本发明的药品和/或保健品具有预防和治疗前列腺炎症(细菌性及非细菌性炎症)、前列腺增生、以及前列腺肿瘤等相关的泌尿系统疾患。
本发明将通过下列非限制性实施例进行举例说明。
实施例175mg(按总黄酮糖苷计)薄膜衣片活性成分竹叶总黄酮(EOB-f01粉末，总黄酮糖苷含量≥50％)赋型剂内填充辅料微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素(L-HPC)、十二烷基硫酸钠、硬脂酸镁。薄膜衣组成玉米朊、乙基纤维素、增塑剂、药用色素、二氧化钛等。
根据需要制成普通片或异型片。结合症状，遵医嘱或按说明书使用，每日1～2次，每次1～4片。
实施例250mg(按总黄酮糖苷计)肠溶衣片活性成分竹叶总黄酮(EOB-f01粉末，总黄酮糖苷含量≥50％)赋型剂内填充辅料微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖酸酯、硬脂酸镁。肠溶衣组成聚丙烯酸II及/或III号树脂、吐温80、苯二甲酸二乙酯、蓖麻油、药用色素等。
根据需要制成普通片或异型片。结合症状，遵医嘱或按说明书使用，每日1～2次，每次1～4片。
实施例3
100mg(按总黄酮糖苷计)胶囊剂活性成分竹叶总黄酮(EOB-f01粉末，总黄酮糖苷含量≥50％)赋型剂内填充辅料乳糖、羧甲基纤维素(CMC)、十二烷基硫酸钠、滑石粉。胶囊外壳组成明胶、药用色素、二氧化钛等。
根据需要制成普通胶囊或异型胶囊。结合症状，遵医嘱或按说明书使用，每日1～2次，每次1～3粒。
实施例450mg/mL(按总黄酮糖苷计)预微乳剂活性成分竹叶总黄酮(EOB-f01粉末，总黄酮糖苷含量≥50％)赋型剂内填充辅料非离子型表面活性剂、助溶剂、脂溶性乳化剂、植物油、抗氧剂。
根据需要制成口服液或软胶囊。结合症状，遵医嘱或按说明书使用，每日1～2次，每次1～4mL(或粒)。
实施例52mg/mL(按总黄酮糖苷计)注射剂活性成分竹叶总黄酮(EOB-f01粉末，总黄酮糖苷含量≥50％)赋型剂吐温-80、氯化钠、注射用水。
根据需要制成2mL/支、5mL/支、10mL/支、。结合症状，遵医嘱或按说明书使用。
实施例620mg/g(按总黄酮糖苷计)栓剂活性成分竹叶总黄酮(EOB-f01粉末，总黄酮糖苷含量≥50％)赋型剂内填充辅料Witepsol H15、Witepsol W45、十二烷基硫酸钠等。
根据需要制成2g/栓。结合症状，遵医嘱或按说明书使用，每日1～4次。
实施例750mg(按总黄酮糖苷计)与2mg非那雄胺复方薄膜衣片活性成分竹叶总黄酮(EOB-f01粉末，总黄酮糖苷含量≥50％)及非那雄胺(化学合成药物)赋型剂内填充辅料微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素(L-HPC)、十二烷基硫酸钠、硬脂酸镁。薄膜衣组成玉米朊、乙基纤维素、增塑剂、药用色素、二氧化钛等。
根据需要制成普通片或异型片。结合症状，遵医嘱或按说明书使用，每日1～2次，每次1片。
实施例840mg(按总黄酮糖苷计)与8mg蕃茄红素油树脂复方胶囊剂活性成分竹叶总黄酮(EOB-f01粉末，总黄酮糖苷含量≥50％)及蕃茄红素油树脂(含蕃茄红素8％)赋型剂内填充辅料乳糖、羧甲基纤维素(CMC)、十二烷基硫酸钠、滑石粉。胶囊外壳组成明胶、药用色素、二氧化钛等。
根据需要制成普通胶囊或异型胶囊。结合症状，遵医嘱或按说明书使用，每日1～2次，每次1～3粒。
权利要求
1.一种竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用，其特征在于竹叶总黄酮应用于防治前列腺疾病的药物及保健食品产品中。
2.根据权利要求1所述的一种竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用，其特征在于所说产品中的有效成分为单独含有竹叶总黄酮，或者竹叶总黄酮与用于前列腺药物的其它中、西原料药或植物提取物的组合。
3.根据权利要求2所述的一种竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用，其特征在于所说的用于前列腺药物的其它中、西原料药或植物提取物为各种抗生素、α-受体阻滞剂、抗炎药物和植物多糖、植物黄酮、植物甾醇、花粉提取物、番茄红素。
4.根据权利要求1所述的一种竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用，其特征在于所说的产品形态可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、预乳剂、微乳剂、混悬剂、糖浆剂、各种肠溶制剂、注射剂、喷雾剂、软膏剂、栓剂等直肠给药制剂。
5.根据权利要求1或4所述的一种竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用，其特征在于所说的竹叶总黄酮的用量(总黄酮糖苷含量，以芦丁计)为成年人每日10～1000mg，每日服用1～2次。
6.根据权利要求1或4所述的一种竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用，其特征在于所说的竹叶总黄酮用量(总黄酮糖苷含量，以芦丁计)为成年人每日50～600mg，每日服用1～2次。
7.根据权利要求1所述的一种竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用，其特征在于所说的前列腺疾病包括前列腺炎、前列腺增生和前列腺癌。
全文摘要
本发明公开了一种竹叶总黄酮在前列腺疾病防治药物及其保健食品中的应用，竹叶总黄酮应用于防治前列腺疾病的药物及保健食品产品中。本发明提供了一种来源广阔、安全有效、经济适用的植物提取物——竹叶总黄酮，对其与前列腺病理相关的特性进行了系统研究，表明其具有显著的抗菌、抗炎、抗前列腺增生、抗血小板聚集、抗肿瘤和免疫促进等作用；先前的大量研究已表明，其具有优良的抗自由基、抗氧化、抗辐射、保护心脑血管等生理和药理活性，安全、无毒，长期使用无副作用；且性能稳定，风味清香，可以制成各种不同的剂型，并可与多种药品和食品体系复合，使用方便，尤为适合于前列腺疾病这类多靶点的老年慢性退行性疾病的防治。
文档编号A61P13/08GK1513447SQ03128889
公开日2004年7月21日 申请日期2003年5月25日 优先权日2003年5月25日
发明者张英, 吴晓琴, 张泳华, 蔡华芳, 陆柏益, 英 张 申请人:杭州浙大力夫生物科技有限公司