专利名称：治疗重症急性呼吸综合征的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗患有或疑似患有重症急性呼吸综合征(SARS)对象的一种组合物的生产领域。
背景技术：
2002年末及2003年初，许多国家对具有极高死亡率的迅速扩散的病毒性肺炎的报道而极度警觉。这种疾病根据其有时引起死亡的最突出特点迅速获得一个名称——重症急性呼吸综合征(SARS)。这种疾病导致高热，肌痛和寒战，随后干咳和呼吸困难。接近10％的病人的另一种阶段是随后干咳，呼吸困难和组织缺氧。目前报道的死亡率为5-7％。许多国家现在正积极努力挽救生命及其医疗卫生体系使之免于垮掉。一个个体有时就足以关闭一所医院；并迅速传染医护工作者及威胁其它病人和家庭成员。
SARS已经确认是通过喷嚏和咳嗽产生的飞沫传播的，其症状包括高热，寒战，干咳，鼻塞，肌痛和呼吸困难。根据世界卫生组织报告，从11月份以来在世界范围内已经报道目前已经有300人死于SARS，有5000多人患有这种神秘的肺炎。第一个已知的爆发是在与香港毗邻的中国南部的广东省，但目前已经报道这种疾病从越南至加拿大均有爆发，但大多数确诊病例在中国，香港和新加坡。
目前认为SARS是由病毒导致的，所述病毒在此也称为SARS病毒，认为其是冠状病毒的一种变体，与迄今为止已知的人体冠状病毒具有大约50％同源性。在SARS感染后潜伏期通常较短，1-3天(但也见到接近16天)，随后出现头痛，咽喉痛，肌痛，寒战及鼻塞。然后通常流大量清涕，逐渐稠厚并成为粘脓性的，量减少。在一些情况中，感染在大约一周内消退，然而，在其它情况中，这种疾病通常持续发热超过100.4华氏度。发热有时还伴有寒战，头痛，不适及周身头痛。一些病人在起病时还经历轻度呼吸困难症状。在大约3-7天后，病人可以出现干咳，伴随或进一步发展为血氧不足。在这个阶段中，在X光或CAT扫描检测中通常见到片状肺炎表现。
大多数病人在第一阶段开始出现通常类似流感的症状，然后表面上康复，在第二阶段一些病人甚至在表面上好转后突然恶化。表示发生严重问题的临床征象和实验室检查异常如下LDH升高，肌酸激酶升高，中性粒细胞增多，血小板通常被抑制，凝血酶原时间延长及全身血凝加速，可以用d二聚体分析反映。其它指示性临床征象包括迁移性肺炎(通过X光或CT扫描证实)，及许多病人表现组织缺氧。在10％-20％的始发SARS情况中，问题特别严重以至于病人需要进行机械通气。这种无法抵抗的肺炎的组织病理学示出少量或没有病毒包涵体，而且通常描绘出一种与其它ADRS或急性呼吸窘迫综合征以及BOOP或细支气管消失机化肺炎几乎相同的病理图。这两种综合征通常由促炎细胞因子和其它炎症介质产生的损害而引起。
参加WHO实验室合作网中的科学家已经揭示一些SARS的诊断测试。包括所谓的“PCR”测试，其可以检测病毒的特殊遗传信息，并可以确定所述病毒在任何特殊样品中的拷贝数。对PCR而言关键的是引物，其可以通过网络实验室在4月4日开放的WHO网站上公开获得(http//www.who.int/csr/sars/primers/en/)。所述引物已经为世界上许多国家所利用。WHO科学家现在愈加乐观，因为目前对SARS的PCR诊断测试可以进行迅速的精细调整(fine-tune)。需要精细调整是因为现有测试在排除SARS中存在其它冠状病毒的能力上存在重大的局限性。
检测早期感染SARS病毒人群的能力是一个关键措施。现有的PCR测试非常特异性，但无法检测所有排泄冠状病毒的病人。在样品中早期及可靠检测SARS病毒非常有助于医护工作者确定存在发热及其它疑似症状的病人应根据控制传染的严格措施立即隔离并控制。这种程序随之明显降低传染扩散至其它人的可能。
然而，诊断技术似乎迅速开展起来，但目前没有特异性治疗SARS感染的方法，针对SARS的第二阶段只是对症或马马虎虎治疗。使第二阶段状况进一步恶化的并发症多种多样，例如包括需要抗生素治疗的细菌感染或衣原体感染。其它并发症包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，多器官失调综合征(MODS)或多器官衰竭(MOF)，全身性炎症反应综合征(SIRS)，这是宿主中病毒引起免疫激活以及由此发生的免疫调节异常的直接继发性效应，及脓血症，脓毒性休克及死亡，死亡部分由于原发感染或组合感染。医生试图断定什么样的处理是最佳的。CDC推荐只要病人疑似患有“群体获得的病原不清的肺炎”就应加以治疗。他们应隔离在负压室中，给予抗生素及其它护理。还给予他们一些标准抗病毒药物如病毒唑或tamiflu以及给予得自逐渐康复或存活的SARS感染病人的球蛋白制品。大约90％的病人在6天后康复。剩余的10％中有一半需要呼吸机。然而，还没有治疗SARS的特效药物。
发明内容
本发明提供了至少一种基因调节肽或其功能类似物在生产治疗患有或疑似患有重症急性呼吸综合征(SARS)或相关疾病的对象、优选人的药物组合物中的用途。本发明特别提供了至少一种基因调节肽或其功能类似物在生产治疗患有或疑似患有重症急性呼吸综合征(SARS)或相关疾病的对象的药物组合物中的用途，尤其当重症急性呼吸综合征是由SARS病毒引起的，而且特别当所述对象处于患有或疑似患有晚期的并可能是致死阶段的SARS的危险中时。
本发明提供了一种从未揭示的令人意想不到的治疗模式，包括针对SARS患者免疫活性的细胞因子基因调节，在患有或疑似患有SARS相关疾病病人的治疗中取得显著进展。
本发明涉及重要免疫作用的机体先天调节途径。在一个优选实施方案中，本发明提供了至少一种基因调节肽或其功能类似物在生产治疗患有或疑似患有重症急性呼吸综合征(SARS)或相关疾病的对象的药物组合物中的用途，其中所述综合征由病毒感染所致，如由流感病毒或其它引起严重呼吸疾病的病原体所致，所述疾病具有ARDS免疫学发病机理迹象，有或无DIC，SIRS(全身性炎症反应综合征)或MODS迹象。
本发明特别提供了使用至少一种基因调节肽或其功能类似物，生产治疗患有或疑似患有SARS病毒感染所致SARS的对象的药物。然而引人注目地，在SARS的第二阶段中，SARS病毒通常未发现在肺系统中是活性的，病人状况恶化的主要因素是显著的炎症反应，针对这种状况用本发明的药物组合物治疗是最优选的。我们提供了这样的认识大多数病人可以经免疫作用控制这种病毒，少数可能发生ARDS免疫功能异常并发症，具有一些DIC和MODS迹象；在所述少数病人中，没有调节宿主免疫系统促炎症损害的能力，这是ARDS，DIC，和MODS的关键发病机制。这种免疫学应答异常通过用本发明药物治疗而加以调节，减轻或消除促炎症损害，随之宿主病人疾病呈良性进程，病人康复及靠自身控制病毒感染。
本发明的用途在其中所述病人处于患有或疑似患有这种继发或晚期的并可能是致死阶段的SARS的危险的那些情况中特别有效，所述晚期的并可能是致死阶段的SARS的特征在于一或多个表示存在这种免疫反应的临床征象或化验所见，例如特征在于选自以下的临床征象或化验所见乳酸脱氢酶水平提高，激素激酶水平提高，中性粒细胞增多，凝血酶原时间延长，血小板抑制，d-二聚体增加，迁移性肺炎和渐进性组织缺氧，进展为ARDS，有或无DIC、SIRS或MODS。
在本发明申请中，阐述了小的基因调节肽或其功能类似物的用途，其天然存在于妊娠妇女体内，及衍生自胎盘促性腺激素如在妊娠期间产生的人绒毛膜促性腺激素(hCG)的蛋白酶解。这些肽(其活性状态通常只有大约4-6个氨基酸长)示出具有非常卓越的免疫活性，通过调节编码炎症介质如细胞因子的基因表达而发挥作用。令人惊奇地，发现hCG的分解提供了有助于维持孕妇的免疫稳态的一系列肽。这些肽或其功能类似物是天然的自身物质，其平衡免疫系统以保证母亲保持免疫状态的稳定而其胎儿在妊娠期间不过早被排斥，而是在母体内安全地度过直到出生，这些物质在治疗患有特别是SARS第二阶段的病人中特别有效，所述SARS第二阶段的特征在于具有上述严重并发症的。所述肽或其功能类似物例如可得自尿液或其它有机产物来源，如包含促性腺激素或其功能等价化合物的血清、乳清、胎盘提取物、植物、细胞或组织。在此，可获得是指从所述来源中直接或间接获得所述肽或其功能类似物，肽或其功能类似物例如还可通过化学合成获得，或从自然界中动物或植物原料中获得。肽或其功能类似物可例如在得自妊娠妇女的尿液级分中或在hCG或其它促性腺激素的商业制品中发现；至少在那些含有足量hCG或其它促性腺激素的分解产物并具有基因调节及尤其免疫调节活性的制品中。
在一个实施方案中，本发明提供了至少一种基因调节肽或其功能类似物在生产药物中的用途，所述药物是治疗患有或疑似患有重症急性呼吸综合征(SARS)或相关疾病，其中所述肽或其类似物可得自妊娠妇女的尿液，特别是其中所述妇女处在其妊娠前3个月内。这种药物可以方便地从用于分离及化学制备人促性腺激素的其它丢弃的尿液残余物中制备。
在另一个实施方案中，本发明提供了至少一种基因调节肽或其功能类似物在生产药物中的用途，所述药物是治疗患有或疑似患有重症急性呼吸综合征(SARS)或相关疾病，其中所述肽或其类似物尤其可通过蛋白酶解从促性腺激素制品中制备，尤其其中所述促性腺激素或其级分包含天然或重组的人绒毛膜促性腺激素(hCG)或其级分。
在另一个实施方案中，本发明提供了至少一种基因调节肽或其功能类似物在生产药物中的用途，所述药物是治疗患有或疑似患有重症急性呼吸综合征(SARS)或相关疾病，其中所述肽或其类似物通过化学合成获得，尤其其中所述肽或其类似物选自LQG、AQG、LQGV、AQGV、LQGA、VLPALPQVVC、VLPALP、ALPALP、VAPALP、ALPALPQ、VLPAAPQ、VLPALAQ、LAGV、VLAALP、VLPALA、VLPALPQ、VLAALPQ、VLPALPA、GVLPALP、GVLPALPQ、LQGVLPALPQVVC、VCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL、RPRCRPINATLAVEK、EGCPVCITVNTTICAGYCPT、SKAPPPSLPSPSRLPGPS、SIRLPGCPRGVNPVVS、LPGCPRGVNPVVS、LPGC、MTRV、MTR、VVC、QVVC或其衍生物。
本发明最优选的用途是其中所述组合物包含肽LQGV、AQGV和VLPALP的混合物。另外，本发明提供了任一种用途，其中所述组合物或其代表性样品在一种体内生物分析中测试其免疫调节活性，如在本发明详述部分中提供的动物实验中，或者其中所述组合物在一种体外生物分析中测试其免疫调节活性或根据所提供的指导方针用于治疗SARS的免疫调节化合物的存在与否，如在本发明提供的NF-κB易位分析或基因阵列中。在那种方式中，制备针对治疗SARS的适当药物组合物的指导可见于在生产过程期间或之后的一或多个阶段，测试所述组合物或一或多个其化合物或代表性样品的所需免疫调节或基因调节功能活性，例如在进行动物实验的体内生物分析中，在体外生物分析中，以确定在细胞因子基因的控制下调节免疫过程的功能活性，或通过确定测试的组合物或化合物中所需基因调节肽或其功能类似物的生理存在与否。当然，当从有机原料如尿液，从可以进行蛋白酶解具有例如白细胞弹性蛋白酶活性的(重组)促性腺激素制品，或从原始合成的组合物或化合物如分批或化学合成的肽中纯化时，纯化过程可以方便地操纵由此选择最需要的免疫调节活性级分，以进一步纯化或包涵在治疗SARS的药物组合物中。
图1该图示出了在LPS引起的休克中疾病早期阶段中具有抗炎症活性的级分是III和V，而在疾病晚期阶段中具有炎症消除活性的级分是IV和VI。
图2在体内生物分析中测试级分1，2及集合的级分3，4和5，证明只有集合的级分3，4和5在LPS引起的休克中具有抗炎症活性。
图3G25柱上Pregnyl(206nm)分离图。
图4GPC 300A柱上Pregnyl洗脱图。
图5得自在GPC 60A柱上分离的GPC 300A柱的级分3的洗脱图。
图6得自具有抗炎症活性的妊娠3个月妇女尿液的GPC 300A柱的级分3的GPC 60A层析图。该图示出级分3.2和3.3之间的比率为大约1∶2.2。
图7得自没有抗炎症活性的Pregnyl的GPC 300A柱的级分3的GPC 60A层析图。该图示出级分3.2和3.3之间的比率为大约1∶3.4。
图8得自具有抗炎症活性的Pregnyl的GPC 300A柱的级分3的GPC 60A层析图。该图示出级分3.2和3.3之间的比率为大约1∶1。
图9Pregnyl的GPC 60A层析图。
图10Bio-gel P2(妊娠前3个月尿液)(206nm)的层析图。
图11Bio-gel P2(pregnyl)(206)的层析图。
图12本图示出BEAS 2B细胞系的结果地塞米松(DX)能抑制BEAS 2B细胞系中TNF-α诱导的IL-6和RANTES产生。活性级分也能抑制TNF-α诱导的炎症细胞因子的产生。此外，地塞米松能恢复由TNF-α诱导的抗炎TGF-β细胞因子的下调，而活性级分不仅能恢复TNF-β的产生，还进一步升高该抗炎细胞因子。此外，地塞米松和活性级分均能抑制IFN-γ诱导的RANTES产生。流式细胞仪分析BEAS 2B细胞系示出，地塞米松和活性级分均能负调节TNF-α诱导的HLA-DR和ICAM-1表达。
具体实施例方式
一般认为蛋白质的最小分解产物对其自身无特异性生物学功能(除了作为免疫系统抗原之外)，但目前显示机体事实上常规利用蛋白质的正常蛋白酶解过程产生重要的基因调节化合物，这是控制机体自身基因表达的短肽。显然，机体恰恰使用由其自身基因编码的蛋白质的小分解产物控制的基因控制系统。
长期以来已知在妊娠期间，母体产生一种暂时免疫调节状态，导致母体针对胎儿的排斥应答抑制。自相矛盾地，在妊娠期间通常母体的感染抗性提高，而且发现其对各种自身免疫系统疾病如风湿和多发性硬化的临床症状的防护性更好。因此胎儿的保护不仅解释为免疫抑制的结果，而且应视为母体防护和胎儿防护之间免疫平衡的结果。
已知hCG的一些小分解产物(即如果需要显示可易于通过化学或重组方法合成的，并用作药物组合物的小肽)，发挥对重要转录因子家族控制的促炎或抗炎细胞因子级联的主要调节活性，NF-κB家族在调节定形机体免疫应答的基因表达中起重要作用。
在妊娠期间产生的大多数hCG由胎盘细胞产生，胎盘是母体和胎儿的细胞和组织密切接触的部位，而且此处最需要免疫调节以竭力避免排斥。局部产生的从胎盘hCG中分解的基因调节肽，立即平衡在母体和胎儿之间的真空地带(no-man’s land)中发现的促炎或抗炎细胞因子级联。由典型的胎盘细胞产生的滋养层，所述肽穿经其至胞外空间；进入免疫系统细胞并通过调节NF-κB-和AP-1介导的细胞因子基因表达而发挥其免疫调节活性，从而在胎盘内抑制免疫应答。
本发明提供了针对总体上hCG衍生的肽过量进入机体而产生的对孕妇自身免疫疾病的发生及其严重程度的有益作用；然而，对这些作用不能过高评价，因为易于了解到离胎盘越远，针对防止胎儿排斥的免疫调节活性越小，只是因为总体上胎盘产生的肽在遍及机体时稀释。然而，所述肽的免疫调节和基因调节活性决不应只在妊娠期间和在胎盘中发生；男人和女人以同样方式产生hCG，例如在其垂体中，而且自然界很大程度上的确利用肽的基因调节活性。
因此，本发明提供了一种新的治疗措施，使用具有药物学潜力的基因调节肽及其衍生物。确实，在用所述基因调节肽在体外处理免疫细胞及在体内处理实验动物之后，通过表达分布图研究，在矽肺基因阵列中发现NF-κB或AP-1驱动的各自及一致针对机体免疫应答的促炎或抗炎细胞因子级联的特异性正或负调节迹象。还认为NF-κB(及AP-1)是疾病主要效应器，使用hCG衍生的基因调节肽具有治疗SARS的重要潜力，从而查清有助于平衡母体免疫系统以便安全地保持其妊娠状态的准确物质的药物潜力。
本发明提供了患有或疑似患有SARS病毒感染所致疾病的对象的治疗，其通过为对象施用一种药物组合物，所述药物组合物包含药物学有效量的一种基因调节肽或其功能类似物及一种药物学适当稀释剂。特别有益的药物学稀释剂是无菌水或等渗盐溶液如0.9％盐水或磷酸盐缓冲溶液(PBS)。在一个优选实施方案中，本发明提供了患有或疑似患有SARS病毒感染所致疾病的对象的治疗，其通过为对象施用一种药物组合物，所述药物组合物包含药物学有效量的两或多种基因调节肽或其功能类似物及一种药物学适当稀释剂。
本发明提供了调节肽药物组合物的用途，以用于患有或疑似患有SARS病毒感染的对象，通过全身性调节所述对象全身细胞中的基因表达而进行。这种基因调节肽或其功能类似物例如选自寡肽LQG、AQG、LQGV、AQGV、LQGA、VLPALPQVVC、VLPALP、ALPALP、VAPALP、ALPALPQ、VLPAAPQ、VLPALAQ、LAGV、VLAALP、VLPALA、VLPALPQ、VLAALPQ、VLPALPA、GVLPALP、GVLPALPQ、LQGVLPALPQVVC、VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL、RPRCRPINATLAVEK、EGCPVCITVNTTICAGYCPT、SKAPPPSLPSPSRLPGPS、SIRLPGCPRGVNPVVS、LPGCPRGVNPVVS、LPGC、MTRV、MTR、VVC、QVVC及其功能类似物或衍生物。功能类似物例如可见于得自孕妇的尿液级分或hCG或其它促性腺激素的商业制品中；至少在含有足量hCG或其它促性腺激素分解产物并具有调节活性的那些制品中。
本发明药物组合物中包涵的具有调节肽的优选大小为至多15个氨基酸，尽管更小的分子也示出特别效力。令人惊奇地，本发明提供了这样的见识，即SARS感染病人中的基因表达可以通过小肽及其功能类似物系统调节或控制。优选的肽是较大多肽的分解产物，所述较大多肽如是绒毛膜促性腺激素(CG)和生长激素或生长因子如成纤维细胞生长因子、EGF、VEGF、RNA 3′末端磷酸盐环化酶及CAP18，或其合成物。原则上，这种调节肽序列可以衍生自原核和/或真核细胞产生的任何多肽分子蛋白，而且本发明提供了这样的见识，即可以应用所提供大小的多肽优选寡肽的分解产物以产生全身性和有益作用，所述分解产物作为基因调节肽自然地参与基因表达的调节。特别地，本发明提供了一种(合成的)基因调节肽，其可得自或衍生自β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)，优选得自或衍生自带切口的β-hCG。以前认为β-hCG的分解产物通过调节基因表达参与免疫调节(WO99/59671，WO01/72831，PCT/NL02/00639)，或参与消耗性综合征的治疗(WO97/49721)，但在这些出版物中未体现出系统调节细胞因子基因表达在SARS感染的对象中的关系。当然，这种基因调节肽或其功能等价物或衍生物可以得自或衍生自进行分解或蛋白酶解并接近基因调节级联的其它蛋白质。优选地，所述肽分子得自具有至少10个氨基酸的肽，如具有以下氨基酸序列的肽MTRVLQGVLPALPQVVC、SIRLPGCPRGVNPVVS、VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL、RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT、CALCRRSTTDCGGPKDHPLTC、SKAPPPSLPSPSRLPGPS、CRRSTTDCGGPKDHPLTC、TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ。
非限于理论所束缚，本发明揭示了一种意外的基因调节模式，达到治疗患有SARS相关疾病的对象的目的。将多肽如内源CG、EGF等，但也包括病原体多肽如病毒，细菌或原生动物多肽，分解为独特的寡肽，例如通过胞内蛋白酶解进行。独特的蛋白酶解酶可在细胞中广泛获得，例如在真核细胞的溶酶体或蛋白酶体系统中。一些所得分解产物是长度为3-15，优选4-9，最优选4-6个氨基酸的寡肽，令人惊奇地其对细胞不是没有任何功能或作用，在此表明其可能通过在内源多肽分解的情况中作为信号分子通过反馈机制参与基因表达的调节，通过例如以下肽调节基因转录因子如NF-κB的活性或易位证明，所述肽为LQGV、VLPALPQVVC、LQGVLPALPQ、LQG、GVLPALPQ、VLPALP、VLPALPQ、GVLPALP、VVC、MTRV和MTR。本发明提供了上述这些肽的合成物，及这些分解产物的功能类似物或衍生物，以调节细胞中基因表达并用于治疗SARS相关疾病的方法中。寡肽如LQG、AQG、LQGV、AQGV、LQGA、VLPALP、ALPALP、VAPALP、ALPALPQ、VLPAAPQ、VLPALAQ、LAGV、VLAALP、VLPALA、VLPALPQ、VLAALPQ、VLPALPA、GVLPALP、GVLPALPQ、LQGVLPALPQVVC、SIRLPGCPRGVNPVVS、SKAPPPSLPSPSRLPGPS、LPGCPRGVNPVVS、LPGC、MTRV、MTR、VVC，或其较长序列的功能类似物或衍生物(包括分解产物)，是特别有效的。
在一个优选实施方案中，本发明提供了患有或疑似患有SARS病毒感染所致炎症疾病的对象的治疗，通过为其施用一种药物组合物进行治疗，所述药物组合物包含一种药物学有效量的基因调节肽，所述基因调节肽能调节编码炎症介质如细胞因子的基因表达。用于治疗SARS相关疾病尤其在SARS感染第二阶段中常见的致死炎症疾病的药物中包涵的有效基因调节肽，是那些肽或其功能类似物，其天然存在于孕妇体内及衍生自胎盘促性腺激素的蛋白酶解产物，所述胎盘促性腺激素如在妊娠期间产生的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，然而，本领域技术人员可容易合成这些肽的功能上相同或相似活性的合成(例如重组产生的)变体及修饰物，并使用例如动物实验测试其活性，如本发明所述用小鼠进行实验。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗SARS相关疾病一种药物组合物，所述药物组合物包含一种基因调节肽或其功能类似物，及提供了基因调节肽或其功能类似物在生产治疗SARS相关疾病的药物组合物中的用途。术语“药物组合物”既指单独的活性功能化合物，又指含有所述化合物和药物学适当载体，稀释剂或赋形剂的组合物。所述药物组合物的适当稀释剂例如是生理盐水溶液或磷酸盐缓冲溶液。在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物以有效浓度全身性施用于动物或人体，例如通过静脉内，肌内或腹膜内施用。
实施例综述处于SARS晚期免疫功能异常综合征发作或期间的病人，优选使用本发明提供的治疗SARS的药物组合物治疗。这种病人通常存在渐进性组织缺氧迹象，通过其动脉血中氧分压及氧饱和度较低以及通过血氧定量法可表明。这些病人典型存在前文所述的SARS样疾病所特有的征象和症状的汇合，并伴有一些化验所见，其包括以下淋巴细胞减少，血小板减少，d-二聚体阳性，部分凝血酶原时间延长，LDH升高，及CK升高。这些病人非常需要补充氧或者甚至需要人工通气的支持。这些病人可以根据确定的治疗方案用抗病毒药物治疗，如病毒唑400mg日三次口服，或通过静脉内施用抗生素，如头孢噻圬和甲红霉素(或左氧氟沙星)，以对抗导致群体获得性肺炎的普通病原体，用皮质类固醇激素(强的松龙，1mg/kg体重/天)，或用其它抗炎药物，或特别针对SARS病毒的药物(如疫苗)。
治疗的适当病人通常具有ARDS形式的进展性肺炎，通过X光或CT结果可证实。对他们每8小时服用一种药丸或持续滴用全部治疗剂量直至认为不再需要治疗。通过存活率，组织缺氧消除时间，及肺炎和其它免疫功能异常的消除时间和进程测定结果，包括凝血时间，CK，LDH，及TH1和TH2细胞因子/趋化因子级联的正常化。
实施例1在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，对其已经在发明详述部分中阐述，其中所述活性成分以分子量显然小于15kD的洗脱级分呈现，通过凝胶渗透层析确定，例如其中所述活性成分以分子量显然小于2kD的洗脱级分呈现，通过凝胶渗透层析确定。尽管所述本发明药物组合物易于从尿液中获得，例如其中所述哺乳动物绒毛膜促性腺激素制品得自尿液，或得自其中只微不足道地存在活性激素的尿液级分，如在商业促性腺激素生产过程期间丢弃的尿液级分，但还可以应用其它原料如包含促性腺激素或其分解产物的血清，细胞或组织。本发明还提供了从所述原料中获得的一种药物组合物，其能例如调节Th1和/或Th2细胞活性，和/或能调节树突细胞分化。
优选地，本发明提供的药物组合物得自妊娠的哺乳动物，优选人，例如制备一种药物制品使其含有(胎盘)促性腺激素如在妊娠母马血清中发现的妊娠母马血清促性腺激素(PMSG)，或从妊娠小鼠子宫中提取的妊娠小鼠子宫提取物(PMUE)，或在孕妇胎盘，血液或尿液中发现的人绒毛膜促性腺激素(hCG或HCG)。本发明提供的药物组合物可以有或无促性腺激素，例如存在于妊娠3个月的孕妇尿液中或商业hCG制品中的促性腺激素。
本发明提供了一种治疗免疫介导疾病的方法，包括用得自妊娠哺乳动物的至少一种药物组合物对动物进行治疗。所述治疗可以是直接的，例如包括为所述个体提供一种药物组合物，如hCG或PMSG制品，其包含本发明提供的一种免疫调节因子。也可以提供具有得自妊娠动物级分的所述药物组合物，例如对尿液或血清或胎盘(源于母体或胎儿)或其它组织或细胞取样，并通过本领域已知的分级分离方法(例如凝胶渗透层析)从所述尿液或血清或组织或细胞中制备包含所述活性成分的所述免疫调节因子，及测试其活性成分。
实施例1从孕妇尿液级分中通过纯化制备治疗SARS的药物组合物尿液纯化(方法1)将从妊娠3个月的健康志愿者中收集的孕妇尿液(2L)置于瓶中，并冷却直至在两天内运至实验室。在运输中，加入1g/L叠氮化钠并用氢氧化钠将pH调节为7.2-7.4，并在室温(RT)沉淀1小时。轻轻倒出大约75％的上清，将接近沉淀的剩余物离心(10分钟，25000rpm，4℃)以除去沉淀物，并加入其余的上清中。将上清通过以下两种方法之一进行浓缩。在第一种方法中，将上清在0.45μm Minitan(Millipore)横向过滤设备中过滤。随后，将滤物(2L)在装备10kD孔径的YM Dipole膜的Amicon超滤设备中浓缩。终体积(250ml)用10L的Milli Q水透析两次。接着将样品通过10kD孔径在Amicon中超滤至终体积为3ml。在第二种方法中，将上清(2L)在装备5kD孔径的Pellicon XL滤膜(Millipore，cat.No.PXC010C50)的Pellicon超滤设备中浓缩。
终体积为150ml。
利用以下方法之一，将所述原料进一步用于凝胶过滤中以获得治疗SARS的级分。
1.脱盐柱G25使用装备HPLC的Sephadex G-25 Fine(Pharmacia)。柱的尺寸为5×60cm，加样样品体积为6-10ml，流速为3ml/分钟。使用的运转缓冲液是50mM碳酸氢铵加上5％甲醇。Sephadex G-25是用于分离小肽和小蛋白质的脱盐柱。该柱的分级分离范围是100 Dalton-5000 Dalton。收集级分(通常为50ml)并冻干(针对分离图示，见图1)。将分子量低于1000Dalton的冻干级分溶解于2-4ml PBS中(pH7.4)，并在体内生物分析中测试以确定药物组合物在用于SARS治疗中的适应性。此生物分析表明在LPS诱导的休克疾病早期阶段中具有抗炎活性的级分是III和V，而在疾病晚期阶段中具有消除炎症活性的是IV和VI(图1)。
2.凝胶过滤柱Superdex 75使用装备10×300mm柱床FPLC的Superdex 75(Pharmacia)柱。加样样品为50μl，流速为1ml/分钟，共52分钟。使用的运转缓冲液是50mM碳酸氢铵加上5％甲醇。Superdex 75柱是分离单体和二聚体形式较低分子量重组蛋白质和肽的极佳设备。针对球状蛋白质此柱的级分范围是3,000Dalton-70,000Dalton。收集级分(通常为1ml)，并根据分离图示(见图2)集合在分子量低于15,000Dalton洗脱的级分(级分3、4和5；图2)。将得自至少20次不同运转集合的级分冻干。冻干的级分溶解于1-2ml的10mM磷酸盐缓冲盐水pH7.4中，以在体内生物分析测试中确定药物组合物在用于治疗SARS中的适应性，或者溶解于2-4ml的50mM碳酸氢铵中，并如第1点所述进一步分级分离。
级分1，2和集合的级分3，4和5在体内生物分析中测试，表明集合的级分3，4和5在LPS诱导的休克疾病早期阶段中具有抗炎活性。
3.凝胶渗透柱(GPC)300A我们使用装备Alltech大球型大小排阻(GPC)柱300(250×4.6mm或300×7.5mm)的Shimadzu HPLC系统，使用50mM碳酸氢铵运转缓冲液。此柱的分离范围是1,200,000-7,500Dalton。样品加样体积为10-50μl浓缩的妊娠3个月孕妇尿液。流速为0.5ml/分钟，运转45分钟。使用客观分子量标准以校准柱洗脱位置。根据洗脱图示收集50μl级分并集合(见图3)。将得自在分子量低于7,000Dalton洗脱至少20次的级分集合冻干，并溶解于10mM磷酸盐缓冲盐水pH7.4中，并在体内生物分析测试中确定药物组合物在用于治疗SARS中的适应性，或者溶解于1-2ml的50mM碳酸氢铵中，并如第1和第4点所述进一步分级分离。
将所有级分在体内生物分析中测试，并表明在分子量低于7,000Dalton洗脱的级分3具有抗炎活性。
4.凝胶渗透柱(GPC)60A在另一个实验中，将得自GPC300A柱的分子量低于7,000Dalton的冻干集合级分(见第3点)，在GPC60A柱上进一步分离。我们使用装备Alltech大球型大小排阻(GPC)柱60(250×4.6mm或300×7.5mm)的Shimadzu HPLC系统，使用50mM碳酸氢铵运转。此柱的分离范围是28,000-250Dalton。样品加样体积为10-50μl浓缩的分子量低于7,000Dalton的集合级分，得自GPC300A柱。流速为0.3ml/分钟，运转25分钟。也使用客观分子量标准校准柱洗脱位置。得自GPC300A柱的浓缩的集合级分3在GPC60A柱上分离，选择3个区域分级分离，称为级分3.1，其用分子量＞2000Da洗脱，级分3.2，其用分子量在2000-300Da洗脱，及级分3.3，其在分子量低于300Da洗脱(图3.)。将得自至少20次不同运转的所有这些级分冻干，并溶解于1-2ml PBS(pH7.4)中，并在体内生物分析测试中确定药物组合物在用于治疗SARS中的适应性。
将所有级分均在体内生物分析中测试，表明在分子量在2000-300Da之间洗脱的级分3.2具有抗炎活性，在分子量低于300Da洗脱的级分3.3具有消除炎症活性。将浓缩的10-50ml妊娠3个月孕妇尿液直接在GPC60A柱上分离，选择3个区域进行分级分离，称为1，2和3(见图4)，并从至少20次运转中收集(针对分离图示，见图4)。将集合级分1，2和3冻干并溶解于1-2ml PBS中。所有级分均在体内生物分析中测试，表明级分2具有抗炎活性，级分3在LPS诱导的休克晚期有消除炎症活性。这两种级分均是在分子量低于1,000Dalton洗脱的。
5.Bio-Gel P-2将从superdex G25柱在分子量低于5,000Dalton洗脱的冻干集合级分和得自GPC60A柱的级分3，在Bio-Gel P-2柱上(96×1.5cm)通过凝胶过滤层析进一步分离。将材料(13-17mg)悬浮于双蒸馏水(8-12ml)中。所述材料未完全溶解。通过离心(Sigma201、10分钟，3000rpm)将沉淀物(8-11mg)与上清分离。将上清在Bio-Gel P-2柱上通过凝胶过滤分级分离。将此柱用水以15ml/分钟流速洗脱。用LKB 2142示差折光计和LKB 2238 Uvicord SII(206nm)监测洗脱情况。通过Pharmacia Frac 100级分收集器收集级分(20分钟)(针对分离图示，见图10)集合一定的级分并冻干。将每种级分溶解于1ml PBS中，并测试其抗炎活性。这些实验表明分子量低于1,000Dalton的级分具有抗炎活性(见图10；箭头表示抗炎活性洗脱位置)。
实施例2
从商业促性腺激素制品，重组促性腺激素制品或其较小级分中制备治疗SARS的药物组合物在以下所有分离方法中，均将30,000IU商业hCG制品(Pregnyl、Profasi等)溶解于2ml 50mM碳酸氢铵中。
1.脱盐柱G25使用装备HPLC的Sephadex G-25 Fine(Pharmacia)。柱的尺寸为5×60cm，加样样品体积为2-4ml(15,000IU/ml)，流速为3ml/分钟。使用的运转缓冲液是50mM碳酸氢铵加上5％甲醇。Sephadex G-25是用于分离小肽和小蛋白质的脱盐柱。该柱的分级分离范围是100Dalton-5000Dalton。收集级分(通常为50ml)并冻干(针对分离图示，见图3)。将分子量低于1000Dalton的冻干级分溶解于2-4ml PBS中(pH7.4)，并在体内生物分析中测试以确定药物组合物在用于SARS治疗中的适应性。此生物分析表明在LPS诱导的休克疾病早期阶段中具有抗炎活性的级分是III和V，而在疾病晚期阶段中具有消除炎症活性的是IV和VI(图3)。
2.凝胶过滤柱Superdex 75使用装备10×300mm柱床FPLC的Superdex 75(Pharmacia)柱。加样样品为50μl(15,000IU/ml)，流速为1ml/分钟，共52分钟。使用的运转缓冲液是50 mM碳酸氢铵加上5％甲醇。Superdex 75柱是分离单体和二聚体形式较低分子量重组蛋白质和肽的极佳设备。针对球状蛋白质此柱的级分范围是3,000Dalton-70,000Dalton。收集级分(通常为1ml)，并根据分离图示(见图2)集合在分子量低于15,000Dalton洗脱的级分(级分3、4和5；图2)。将得自至少20次不同运转的集合级分冻干。冻干级分溶解于1-2ml的10mM磷酸盐缓冲盐水pH7.4中，以在体内生物分析测试中确定药物组合物在用于治疗SARS中的适应性，或者溶解于2-4ml的50mM碳酸氢铵中，并如第1点所述进一步分级分离。
级分1，2和集合的级分3，4和5在体内生物分析中测试，表明集合的级分3，4和5在LPS诱导的休克疾病早期阶段中具有抗炎活性。
3.凝胶渗透柱(GPC)300A我们使用装备Alltech大球型大小排阻(GPC)柱300(250×4.6mm或300×7.5mm)的ShimadzuHPLC系统，使用50mM碳酸氢铵运转缓冲液。此柱的分离范围是1,200,000-7,500Dalton。样品加样体积为10-50μl商业hCG制品(30,000IU/ml)。流速为0.5ml/分钟，运转45分钟。使用客观分子量标准以校准柱洗脱位置。使用的标记物是抑酶肽(6,500Da)、细胞色素C(12,400)，碳酸酐酶(29,000)，白蛋白(66,000)和蓝葡聚糖(2,000,000)。根据洗脱图示收集50μl级分并集合(见图4)。将得自在分子量低于7,000Dalton洗脱至少20次的级分集合冻干，溶解于10mM磷酸盐缓冲盐水pH7.4中，并在体内生物分析测试中确定药物组合物在用于治疗SARS中的适应性，或者溶解于1-2ml的50mM碳酸氢铵中，并如第1和第4点所述进一步分级分离。
将所有级分在体内生物分析中测试，并表明在分子量低于7,000Dalton洗脱的级分3具有抗炎活性。
4.凝胶渗透柱(GPC)60A在另一个实验中，将得自GPC300A柱的分子量低于7,000Dalton的冻干集合级分(见第3点)，在GPC60A柱上进一步分离。我们使用装备Alltech大球型大小排阻(GPC)柱60(250×4.6mm或300×7.5mm)的Shimadzu HPLC系统，使用50mM碳酸氢铵运转。此柱的分离范围是28,000-250Dalton。样品加样体积为10-50μl浓缩的分子量低于7,000Dalton的集合级分，得自GPC300A柱。流速为0.3ml/分钟，运转25分钟。也使用客观分子量标准校准柱洗脱位置。得自GPC300A柱的浓缩的集合级分3在GPC60A柱上分离，选择3个区域分级分离，称为级分3.1，其用分子量＞2000Da洗脱，级分3.2，其用分子量在2000-300Da洗脱，及级分3.3，其在分子量低于300Da洗脱(图5)。将得自至少20次不同运转的所有这些级分冻干，并溶解于1-2ml PBS(pH7.4)中，并在体内生物分析测试中确定药物组合物在用于治疗SARS中的适应性。
级分3.2和3.3的比率接着，我们在GPC60A柱上从在所述疾病早期无活性和有活性的hCG制品中进一步纯化得自GPC300A柱的级分3。对妊娠3个月孕妇尿液进行相同分析，并确定级分3.2和3.3的比率。我们发现在所述疾病早期具有抗炎活性的妊娠3个月孕妇尿液中比率为大约1∶2.2(级分3.2级分3.3)(图5)，在所述疾病早期无抗炎活性的hCG制品(Pregnyl)中比率为1∶3.4(图7)，而在所述疾病早期具有抗炎活性的hCG制品中比率为1∶1(图8)。
将10-50μl商业hCG制品(15,000IU/ml)直接在GPC 60A柱上分离，选择3个区域进行分级分离，称为1，2和3(见图9)，并从至少20次运转中收集级分(针对分离图示，见图9)。将集合级分1，2和3冻干并溶解于1-2ml PBS中。所有级分均在体内生物分析中测试，表明级分2在所述疾病早期具有抗炎活性，级分3在所述疾病晚期具有消除炎症活性。这两种级分均在分子量低于1,000Dalton洗脱。
5.Bio-Gel P-2将从superdex G25柱在分子量低于5,000Dalton洗脱的冻干集合级分和得自GPC60A柱的级分3，在Bio-Gel P-2柱上(96×1.5cm)通过凝胶过滤层析进一步分离。将材料(13-17mg)悬浮于双蒸馏水(8-12ml)中。所述材料未完全溶解。通过离心(Sigma201、10分钟，3000rpm)将沉淀物(8-11mg)与上清分离。将上清在Bio-Gel P-2柱上通过凝胶过滤分级分离。将此柱用水以15ml/分钟流速洗脱。用LKB 2142示差折光计和LKB 2238 Uvicord SII(206nm)监测洗脱情况。通过Pharmacia Frac 100级分收集器收集级分(20分钟)(针对分离图示，见图11)集合一定的级分并冻干。将每种级分溶解于1ml PBS中，并测试其抗炎活性。这些实验表明分子量低于1,000Dalton的级分具有抗炎活性(见图11；箭头表示抗炎活性洗脱位置)。
实施例3从商业合成肽中制备治疗SARS的药物组合物在另一个实施例中，其中本发明提供的基因调节肽用作NF-κB的调节因子用于治疗疾病，本发明的肽或其功能衍生物或类似物用于生产一种药物组合物，以治疗或减轻在SARS病毒感染后的病人中通常见到的各种水平的炎症细胞因子(TNF-α，IL-1同种型，IL-6、IL-8、I1-12、IL-23)应答及对化合物如氧化一氮(NO)和花生四烯酸代谢物应答。在这种药物组合物中包含的有效NF-κ3负调节肽例如是VLPALPQVVC、LQGVLPALPQ、LQG、LQGV、GVLPALPQ、VLPALP、VVC、MTR和环形LQGVLPALPQVVC，其例如有效用于在重症急性呼吸综合征(SARS)中见到的IL-6过强应答的治疗中。优选包括伴随抗病毒剂如ribavirine和基因调节肽治疗，以降低例如NF-κB介导的IL-6活性。
在另一个实施例中，其中本发明提供的基因调节肽用作NF-κB调节因子以用于治疗疾病，本发明提供了NFκB调节肽或其衍生物在生产治疗灵长类动物炎症疾病的药物组合物中的用途，及提供了一种治疗灵长类动物炎症性SARS疾病的方法。优选所述治疗包括为患者施用一种药物组合物，其包含NF-κB负调节肽或其功能类似物。有效的NF-κB负调节肽是VLPALPQVVC、LQGVLPALPQ、LQG、LQGV、GVLPALPQ、VLPALP、VVC、MTR和环形LQGVLPALPQVVC。使用本发明提供的方法可发现更多的负调节肽及其功能类似物。
肽合成使用基于fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)/tert-butyl的方法(Atherton、1985)，用2-chlorotrityl chloride树脂(Barlos、1991)作为固体支持物，通过固相合成(Merrifield、1963)制备所述肽。谷氨酰胺的侧链用三苯甲游基功能保护。人工合成所述肽。每次偶联包括以下步骤(i)在二甲基甲酰胺(DMF)中通过哌啶除去α氨基保护，(ii)在DMF/N-甲基甲酰胺(NMP)中将二异丙基碳二亚胺(DIC)/1-hydrozybenzotriazole(HOBt)与Fmoc氨基酸(3eq.)偶联，及(iii)用乙酸酐/二异丙基乙胺(DIEA)在DMF/NMP中帽化剩余氨基功能。在合成完成的基础上，将所述肽树脂用三氟乙酸(TFA)/H2O/三异丙基硅烷(TIS)95∶2.5∶2.5的混合物处理。在30分钟后，加入TIS，直至脱色。将溶液真空蒸发并用二乙基乙酯沉淀所述肽。将粗制肽溶解于水中(50-100mg/ml)并通过反相高效层析(RP-HPLC)纯化。HPLC条件如下层析柱Vydac TP21810C18(10×250mm)(层析柱的选择很关键，因为肽具有较短的保留时间)；洗脱系统水中0.1％TFAv/v(A)和乙腈(ACN)中0.08-1％TFAv/v(B)梯度系统；流速6ml/分钟；在190-370nm检测吸光度。可以使用不同的梯度系统。例如针对肽LQGV10分钟100％A，随后线性梯度0-10％B进行50分钟。针对肽VLPALP5分钟5％A，随后线性梯度1％B/分钟。将收集的级分在40℃在减压下通过旋转膜蒸发浓缩为大约5ml。剩余的TFA用乙酸经过具有阴离子交换树脂(Merck II)的柱通过两次洗脱以乙酸盐形式交换。将洗脱物浓缩并在28小时内冻干。然后将冻干的肽在体内生物分析中测试以确定药物组合物在用于治疗SARS中的适应性，通过测试其在BALB/c小鼠模型中对LPS诱导的炎症的作用而进行。
表1
表1有益的肽活性。从±至+表示在LPS诱导休克中的微小活性至十足活性实施例4治疗方案用本发明药物组合物进行治疗可例如包括在前24小时注入Ringer’s乳酸，所述Ringer’s乳酸中具有本发明提供的一种药物组合物，优选1-1000mg/l肽，如VLPALPQ、GVLPALP或MTRV，或两或三种这些肽的混合物。在严重感染病人的治疗期间，例如在借助机械呼吸下，通常重要的是保持容量稳定，而且如果需要，在甚至更低渗溶液中提供所述药物组合物(例如肽或其功能类似物)，如在0.3-0.6％盐水中。
基因调节肽可以在相同注入液中给予，所述肽(或类似物)优选浓缩为从大约1-1000mg/l，但所述肽也可以药丸注射给予。在药丸注射或每次注入液中推荐剂量为1-5mg/kg体重，每8-12小时一次，直至病人病情稳定。
实施例4SARS的治疗方案药物组合物1(Superdex G25)针对SARS病人的单一治疗，可以使用以下方案。
将1L妊娠3个月孕妇尿液过滤并浓缩13倍(根据实施例1)。这提供大约75ml浓缩的妊娠3个月孕妇尿液(脱盐的)。将此75ml浓缩的妊娠3个月孕妇尿液在Superdex G25上分级分离，每次运转样品体积为6ml。集合活性级分并冻干。
药物组合物2(Superdex G25)针对SARS病人的单一治疗，可以使用以下方案。
将150,000IU商业hCG制品溶解于2-4ml 50mM碳酸氢铵中。将此2-4ml的hCG制品在Superdex G25上分级分离，从至少3次运转中集合活性级分并冻干。
药物组合物3(GPC 300A)针对SARS病人的单一治疗，可以使用以下方案。
将1L妊娠3个月孕妇尿液过滤并浓缩13倍(根据实施例1)。这提供大约75ml浓缩的妊娠3个月孕妇尿液(脱盐的)。将此75ml浓缩的妊娠3个月孕妇尿液在GPC 300A上分级分离，每次运转样品体积为50-100μl。集合活性级分3并冻干。将此冻干物用于治疗或在GPC 60A柱上进一步分级分离，并将级分3.2和3.3冻干并用于治疗。
药物组合物4(GPC 300A)针对SARS病人的单一治疗，可以使用以下方案。
将150,000IU商业hCG制品溶解于6ml 50mM碳酸氢铵中。将此6ml的hCG制品在GPC 300A柱上分级分离，集合活性级分3并冻干。将此冻干物用于治疗或在GPC 60A柱上进一步分级分离，将级分3.2和3.3冻干并用于治疗。
药物组合物5(GPC 60A)针对SARS病人的单一治疗，可以使用以下方案。
将1L妊娠3个月孕妇尿液过滤并浓缩13倍(根据实施例1)。这提供大约75ml浓缩的妊娠3个月孕妇尿液(脱盐的)。将此75ml浓缩的妊娠3个月孕妇尿液在GPC 60A上分级分离，每次运转样品体积为50-100μl。集合活性级分3并冻干。
药物组合物6(GPC 60A)针对SARS病人的单一治疗，可以使用以下方案。
将150,000IU商业hCG制品溶解于6ml 50mM碳酸氢铵中。将此6ml的hCG制品在GPC 60A柱上分级分离，每次运转样品体积为50-100μl，集合活性级分3并冻干。
药物组合物7(Superdex 75)针对SARS病人的单一治疗，可以使用以下方案。
将1L妊娠3个月孕妇尿液过滤并浓缩13倍(根据实施例1)。这提供大约75ml浓缩的妊娠3个月孕妇尿液(脱盐的)。将此75ml浓缩的妊娠3个月孕妇尿液在Superdex 75上分级分离，每次运转样品体积为50-100μl。集合活性级分3-5并冻干。
药物组合物8(Superdex 75)针对SARS病人的单一治疗，可以使用以下方案。
将150,000IU商业hCG制品溶解于6ml 50mM碳酸氢铵中。将此6ml的hCG制品在Superdex 75柱上分级分离，每次运转样品体积为50-100μl，集合活性级分3-5并冻干。
药物组合物10(肽)针对SARS病人的单一治疗，可以使用以下方案。
使用单一肽(见实施例3表)或肽混合物进行治疗。以下是用于治疗的肽混合物实例肽1和2、肽1、2和4、肽1、2和3、肽3和5、肽4和6、肽4、6和7、肽3、6和7、肽1、2和6、肽1、2、和7、肽1、2和9、肽1、2、和10、肽1、2、和11、肽1，2 12、肽4，5、和6、肽4，5、和46、肽4，5和48、肽4，6，和46、肽4，6、和48、肽66和6、肽66和7、肽66和5、肽64和65、肽4和68、肽66和76、肽9和11、肽10和12、肽46，49和59、肽48，49和59、肽46、48、49和59、肽48和60、肽46、48、49、59和60、肽14和48、肽14和46、肽14和7、肽14和6、肽14和3、肽14和4。单一肽或肽混合物也可以与妊娠3个月孕妇尿液级分，商业hCG制品或重组hCG制品联合或混合使用。另外，妊娠3个月孕妇尿液级分也可以与商业hCG级分混合。在一个更优选的实施方案中，在攻击治疗阶段在药丸注射中以5mg/kg体重给予病人1∶1∶1混合的肽AQGV、LQGV和VLPALP，随后在4小时后定期及持续注入上述Ringers乳酸或低渗液，所述溶液中含有100mg/l三种肽中的每一种，流速为20-200ml/小时。优选监测治疗病人血浆中细胞因子分布图，如TNF-α，IL-10或IL-6水平、NO、及花生四烯酸水平，而且在只有当认为这些水平在正常范围内时才结束治疗。
实施例5体内生物分析以确定药物组合物在用于治疗SARS中的适应性动物实验将动物在特异的无病原体条件下根据研究小组对动物健康在欧洲实验动物科学协会的报告(FELASA)中所述方案进行饲养(实验动物281-24、1994)。
实施例5确定药物组合物在用于SARS治疗中适应性的体内生物分析1.LPS诱导炎症为确定抗炎活性，将8-10周龄的雌性BALB/c小鼠(Harlan)经i.p.注射30mg/kg LPS(E.coli 055B5；DifcoLab，Detroit，MI，USA)或9-10 mg/kg LPS(E.coli 026B6；Difco Lab，Detroit，MI，USA)。对照组小鼠(10只)在LPS注射后2小时用100μlPBS(pH 7.4)处理，而其它组中小鼠(10只)用100μl(1mg/ml)级分，100-600IU商业hCG(Pregnyl，Profasi)或肽(0.05-5mg/kg)经i.p.处理。在其它实验中，将小鼠在LPS注射后24小时或36小时用级分，商业hCG制品或肽处理。在实验期间，从0时间点(LPS注射前)开始观察疾病情况。之后，对小鼠只观察其进一步康复情况。在这个实验中，LPS导致PBS组在注射LPS后48-60小时内死亡。当死亡率从100％降至至少40％时，认为级分，商业hCG制品或肽是能起作用的。
2.TSST-1诱导的炎症为确定抗炎活性，将8-10周龄的雌性BALB/c小鼠(Harlan)腹膜内注射溶解于100μl无菌盐水溶液(9％)中的20mg D-半乳糖胺。然后经皮下注射给予它们溶解于100μl无菌盐水溶液(9％)中的4μg TSST-1，注射部位在每侧肩胛下大约0.5cm的两个部位。对照组用没有D-半乳糖胺的4μg TSST-1皮下注射，或只用D-半乳糖胺处理。对D-半乳糖胺致敏的Balb/c小鼠组在TSST-1注射后也用100μl(1mg/ml)级分，100-600IU商业hCG制品(Pregnyl、Profasi)或肽(0.05-5mg/kg)进行处理。在其它实验中，将小鼠在注射TSST-1后24或36小时用级分，商业hCG制品或肽处理。在实验期间，从0时间点(TSST-1注射前)开始观察疾病情况。之后，对小鼠只观察其进一步康复情况。在这个实验中，TSST-1导致PBS组在注射TSST-1后48-60小时内死亡。当死亡率从100％降至至少40％时，认为级分，商业hCG制品或肽是能起作用的。
3.猴子实验在此临床前研究中只使用首次用于实验的猴子，以排除与先前处理的任何相互作用。将所述动物用盐酸克他命(ketamine)麻醉。将动物经口腔插管并使其自由呼吸。用O2/N2O/isoflurane保持动物麻醉状态。给予动物阿托品作为O2/N2O/isoflurane麻醉的预处理药物。在大肠杆菌的2小时输注期间保持外科麻醉水平，并在大肠杆菌攻击6小时后，取出呼吸道内插管，并使所述动物安乐死。在导入细菌之前，进行1小时预输注心率和血压监测。
4.将两只恒河猴输注1010CFU/kg革兰氏阴性菌大肠杆菌，以产生致命的脓毒性休克。将一只猴子接受安慰剂处理，并在输注所述细菌后7小时内处死，不从麻醉中恢复，将第二只猴子接受所述测试化合物处理，并在同样时间点处死。例如，在一个实验中测试化合物是3种肽的混合物；在输注大肠杆菌后30分钟，为动物施用一种单一静脉内药丸注射液，一种含有以下肽的混合物FLQGV(5mg/kg)、AQGV(5mg/kg)和VLPALP(5mg/kg)。将这些肽溶解于0.9％氯化钠溶液中以注射(N.P.B.I.、Emmer Compascuum、The Netherlands)。当死亡率从100％降至至少40％时，认为级分，商业hCG制品或肽是活性的。
实施例6体外生物分析以确定药物组合物在用于SARS治疗中的适应性1.NF-κB分析将小鼠巨噬细胞系(RAW 264.7小鼠巨噬细胞)在37℃、5％CO2，在含有10％或2％FBS、青霉素、链霉素和谷氨酰胺的DMEM中培养。将总体积为1ml的细胞在12孔平板中种植2小时(3×106细胞/ml)，然后用LPS(大肠杆菌026B6；DifcoLaboratories，Detroit，MI，USA)和/或肽(1μg/mL)，级分(1μg/mL)或hCG制品(100-300IU/mL)刺激。温育30分钟后，将平板离心并收集细胞以进行核提取。
2.核提取根据Schreiber等所述方法制备核提取物和EMSA(Schriber等，1989，核酸研究17)。将细胞收集在试管中并在4℃以2000rpm(转/分钟)离心5分钟(Universal 30 RF，HettichZentrifuges)。用冰冻的Tris缓冲盐水(TBS pH7.4)冲洗沉淀，并再悬浮于400μl低渗缓冲液A中(10mM HEPES pH7.9、10mM KCl、0.1mM EDTA、0.1mM EGTA、1mM DTT、0.5mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(CompleteTMMini，Roche)，置于冰上15分钟。加入25μl10％NP-40并将样品离心(2分钟、4000rpm、4℃)。收集上清(胞质级分)并贮存于-70℃。将含有细胞核的沉淀用50μl缓冲液A冲洗并再悬浮于50μl缓冲液C中(20mM HEPES pH7.9、400mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM DTT、0.5mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物及10％甘油)。将样品在4℃摇动至少60分钟。最后，将样品离心并将上清(核级分)贮存于-70℃。
使用Bradford试剂(Sigma)确定提取物中最终蛋白质浓度。
3.EMSA针对电泳迁移率变动分析，合成一种寡核苷酸表现NF-κB结合序列(5’-AGC TCA GAG GGG GAC TTT CCG AGA G-3’)。将100pl有义和反义寡聚物退火并根据厂商指导使用T4多核苷酸激酶用γ-32P-dATP标记(Promega，Madison，WI)。将核提取物(5-7.5μg)用75000cpm探针在结合反应混合物(20μl)中在室温温育30分钟，所述混合物含有0.5μg聚dI-dC(Amersham Pharmacia Biotech)和结合缓冲液BSB(25mM MgCl2、5mM CaCl2、5mM DTT和20％Ficoll)。将DNA-蛋白质复合物通过在4-6％聚丙烯酰胺凝胶中电泳(150V，2-小时)，从游离寡核苷酸中解离。然后将该凝胶干燥并暴露于X光。
4.NO测定将得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)的RAW 264.7小鼠巨噬细胞系在37℃在5％CO2中用DMEM培养，所述DMEM中含有10％胎牛血清(FCS)，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素，0.2M丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺和50μM 2-巯基乙醇(Bio Whittaker，Europe)。每2天更换一次培养基。
亚硝酸盐测定在RAW 264.7巨噬细胞上清中测定亚硝酸盐产生。将细胞(7.5×105/ml)在48孔平板中在500μl培养基中培养。细胞用LPS(10μg/ml)和/或肽或级分(1pg/ml、1ng/ml、1μg/ml)刺激24小时，然后收集培养基。在100μl培养基样品中加入100μl Griess试剂(Sigma)测定亚硝酸盐。使用微平板读数器测定OD540，通过与使用标准亚硝酸钠溶液在培养基中产生的OD540相比较计算亚硝酸盐浓度。
PM1 T-细胞系或RAW 264.7得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并在37℃在5％CO2中培养。针对基因组实验，将PM1 T-细胞(2×106/ml)在6孔平板中用2ml的植物血球凝集素(PHA、10μg/mL)和IL-2(200 IU/ml)或PHA、IL-2和肽例如LQGV(10μg/mL)温育。在培养4小时后，冲洗10×106细胞并制备以进行基因芯片探针阵列实验。针对巨噬细胞，RAW 264.7细胞用LPS(1μg/mL)或LPS和肽例如LQGV(10μg/mL)温育。在培养1小时后，将10×106细胞进行冲洗并制备以进行基因芯片探针阵列实验。根据厂商指导进行基因芯片表达分析(表达分析技术指导，Affymetrix基因芯片)。以下主要步骤概括了基因芯片表达分析1)靶制备，2)靶杂交，3)实验和应用流体学设备，4)探针阵列冲洗和染色，5)探针阵列扫描和6)数据分析。
5.Th1/Th2极化分析将小鼠经i.p.用PBS或测试的化合物(级分1-100μg，肽1-100μg，hCG100-300IU)处理3天。然后在无菌条件下取出脾细胞并制备单一细胞悬浮液。来自脾的纯化CD4+T细胞通过用热稳定抗原(HAS)、CD16/32、II型MHC(BALB/c、M5/114；NOD、M10/216)和GR-1的抗体经补体损耗获得。将细胞使用磁性激活细胞经生物素酰化的mAbs混合物分选而进一步纯化，所述mAbs是抗CD11b(M1/70)、B220(RA3 6B2)、CD8(YTS-169)和CD40(FCK-45.5)抗体，随后用链霉抗生物素缀合的微珠(MiltenyBiotech，Bergisch Gladbach，Germany)温育。用于实验中的CD4+细胞经流式细胞计量术测定通常为90-95％纯度。
针对极化分析，通过以下步骤初步刺激纯化的CD4+在96孔平底平板(Nalge Nunc Int.、Naperville、IL.、USA)中培养1×105细胞/孔，并用结合平板的抗CD3 mAb(145-2C11；25μg/ml)在存在可溶的CD28 mAb(37-51；10μg/ml)和IL-2(50U/ml)情况下刺激。针对Th1细胞分化，将抗IL-4mAb(11B11；10ng/ml)和IL-12(10ng/ml)加入培养物中。用IL-4(35ng/ml)和抗IFN-γmAb(XMG 1.2、5microg/ml)引发Th2细胞。非极化的培养物只含有抗CD3，抗CD28和IL-2。在初步实验中对所有剂量最佳化。在培养4天后，将细胞冲洗3次，并移至新的抗CD3包被的96孔平板中，并在存在IL-2(50U/ml)和抗CD28(10μg/ml)的情况下再刺激。48小时后，收集上清并通过ELISA分析IL-4，IFN-γ和IL-10产生情况，作为Th1/Th2极化示值读数。
6.TNF-α，IFN-γ和MHC II表达分离得自例如BALB/c或NOD小鼠的脾细胞，并用结合平板的抗CD3 mAb(145-2C11、25μg/ml)在存在IL-2(50U/ml)或IL-2及级分或肽的情况下刺激。48小时后，收集培养上清并通过ELISA分析IFN-γ。在其它实验中，将脾细胞，分离的巨噬细胞，DC或抗原呈递细胞(APC)用LPS或LPS和级分，肽或hCG刺激24小时。然后通过ELISA测定TNF-α或通过流式细胞计量分析(FACS)测定MHC II表达。
人支气管上皮细胞系BEAS 2B特征在于呼吸道炎症的疾病影响大部分人群。这些疾病包括SARS。应答刺激，感染和炎症介质而产生的细胞因子和生长因子，在急性和慢性呼吸道炎症的开始，持续和抑制中起重要作用。
呼吸道炎症与呼吸道中炎症细胞和居住细胞释放的一些介质和细胞因子的过量产生和活性相关。现在清楚上皮细胞不仅是炎症介质的一个重要作用目标，而且在自身炎症进程中也是一个积极参与者。支气管上皮细胞能通过释放化学引诱物在呼吸道中补充炎症细胞，通过细胞粘着分子的表达引导炎症细胞经过上皮迁移，并通过释放介质调节其它细胞炎症活性，所述介质如细胞因子，趋化因子，花生4烯酸代谢物及松弛和收缩因子。
支气管上皮细胞不仅形成一层被动屏障，而且还在免疫应答中发挥作用。它们能产生许多介质产生促炎或抗炎作用。另外，支气管上皮细胞可以表达许多不同类型细胞的粘着分子，从而有助于其募集。
呼吸道中存在的由炎症细胞产生的TNF-α能引发其它炎症细胞因子和趋化因子如RANTES和IL-6。其还可以负调节抗炎细胞因子的产生，并从而破坏上皮细胞的屏障功能。糖皮质激素抑制与哮喘相关的大多数细胞因子和趋化因子的转录，包括IL-6、RANTES、IL-4。这种抑制至少部分与糖皮质激素的治疗作用相关。
将BEAS 2B细胞在存在测试化合物的情况下用TNF-α或TNF-γ刺激。在此我们示出得自pregnyl的活性级分的结果作为实例。如图12所示，我们的结果示出地塞米松能抑制BEAS 2B细胞系中TNF-α诱导的IL-6和RANTES产生。正如在此所测试的，本发明提供的治疗SARS的一种药物组合物也能抑制TNF-α和IL-6诱导的炎症细胞因子。另外，地塞米松能恢复TNF-α诱导的抗炎TGF-β细胞因子的负调节，而级分不只恢复TGF-β产生，而且还促进这种抗炎细胞因子。另外，地塞米松和组合物均能抑制IFN-γ诱导的RANTES产生。TNF-α也能诱导细胞粘着标记如上皮细胞表面上的HLA-DR和ICAM-1，其然后补充炎症细胞。在此方式中，上皮细胞也能作为抗原呈递细胞(APC)。我们的结果示出地塞米松和治疗SARS的药物组合物均能负调节TNF-α诱导的HLA-DR和ICAM-1表达。
权利要求
1.至少一种基因调节肽或其功能类似物在生产治疗患有或疑似患有重症急性呼吸综合征(SARS)的对象的药物组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述重症急性呼吸综合征由SARS病毒感染所致。
3.权利要求1或2的用途，其中所述对象处于患有或疑似患有晚期的并可能是致死阶段的SARS的危险中，所述晚期的并可能是致死阶段的SARS的特征在于选自以下的一或多个临床征象或化验所见乳酸脱氢酶水平升高，肌酸激酶水平升高，中性粒细胞增多，血小板减少，凝血酶原时间延长，迁移性肺炎及组织缺氧。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述肽或其类似物可得自妊娠妇女的尿液。
5.权利要求4的用途，其中所述妇女处于其妊娠的前3个月内。
6.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述肽或其类似物可得自促性腺激素制品。
7.权利要求6的用途，其中所述促性腺激素包含人绒毛膜促性腺激素(hCG)。
8.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述肽或其类似物可通过化学合成获得。
9.权利要求8的用途，其中所述肽或其类似物选自LQG、AQG、LQGV、AQGV、LQGA、VLPALPQVVC、VLPALP、ALPALP、VAPALP、ALPALPQ、VLPAAPQ、VLPALAQ、LAGV、VLAALP、VLPALA、VLPALPQ、VLAALPQ、VLPALPA、GVLPALP、GVLPALPQ、LQGVLPALPQVVC、VCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL、RPRCRPINATLAVEK、EGCPVCITVNTTICAGYCPT、SKAPPPSLPSPSRLPGPS、SIRLPGCPRGVNPVVS、LPGCPRGVNPVVS、LPGC、MTRV、MTR、VVC、QVVC或其衍生物。
10.权利要求9的用途，其中所述组合物包含肽LQGV、AQGV和VLPALP的混合物。
11.权利要求1-10中任一项的用途，其中在一种体内生物分析中测试所述组合物的免疫调节活性。
12.权利要求1-11中任一项的用途，其中在一种体外生物分析中测试所述组合物的免疫调节活性。
13.权利要求1-12中任一项的用途，其中测试所述组合物中具有免疫调节活性的化合物的存在与否。
全文摘要
本发明涉及治疗患有或疑似患有重症急性呼吸综合征(SARS)的对象的药物组合物的生产领域。本发明提供了至少一种基因调节肽或其功能类似物在生产治疗患有或疑似患有重症急性呼吸综合征(SARS)的对象的药物组合物中的用途，尤其当重症急性呼吸综合征是由SARS病毒感染引起的，特别是当所述对象处于患有或疑似患有晚期并可能是致死阶段的SARS的危险中时。
文档编号A61K38/17GK1541707SQ0313122
公开日2004年11月3日 申请日期2003年4月30日 优先权日2003年4月30日
发明者尼萨尔·艾哈麦德·卡恩, 罗伯特·本纳, 格特·文斯福尔特, 杰弗里·埃利奥特·加尔平, 埃利奥特 加尔平, 本纳, 尼萨尔 艾哈麦德 卡恩, 文斯福尔特 申请人:比奥滕普特公司