专利名称：一种海洋芽孢杆菌生产抗真菌抗生素的发酵方法
技术领域：
本发明涉及海洋芽孢杆菌，具体地说是一种海洋芽孢杆菌发酵生产抗真菌抗生素活性物质的方法，选优了发酵培养基、优化了发酵条件。
背景技术：
众所周知，抗生素对人类健康至关重要，人们不断开发新的抗生素、免疫制剂等药物来对付耐药菌株、真菌感染、爱滋病等各种新老顽固疾病。由于陆地资源的长期开发，从土壤微生物中寻求能够产生新天然生理活性物质的微生物已经越来越困难，而海洋生物资源是陆地生物资源的10倍，而且已发现产生新化合物的海洋微生物资源较陆地微生物多得多，所以人们把目光投向了海洋，海洋是新资源的宝库，现在全世界每天都能发现一些新的海洋微生物，随着海洋科学研究的不断深入，应用现代生物技术开发海洋新资源已成为当今全球关注的热点。从海洋微生物这一巨大宝库中开发研究新的生物活性物质加以利用发展为高新技术产业，是实现海洋微生物资源持续发展利用的重要步骤之一。
有关海洋微生物产生抗菌活性物质的研究，早在四十年代就有研究报道，从海洋分离的微生物中，20～30％具有抗菌活性，头孢霉素和硫酸小诺霉素就是海洋微生物产生而应用到临床的。国外像美国、日本、欧洲投入很大力量对海洋生物资源进行研究开发(方金瑞等，日本从海洋微生物开发新型生物活性物质研究的新进展，中国海洋药物，1995，40，21-25、张荣庆，海洋天然活性物质国外研究动态，中国第五届海洋湖沼药物学术开发研讨会论文集(上册)，1998，237-241、郭跃伟，欧洲海洋药物的研究现状及对我国海洋药物研究的启事，海洋天然产物与生化药物论文汇编，2000，35-40)；国外一些学者(Abbanat D.et al，Cell wall active antifungal compounds producedby the marine fungus hypoxylon oceanicum LL-15G256.I.Taxonomy andfermentation.J Antibiot(Tokyo).1998；51(3)296-302.、冈见吉郎，发酵と工业，1979，37(6)504-513、Okami，Y.and Hotta，D.J.Antibiotics，1979，32964～966)从海洋微生物中获得了新的或已知的抗生物质。我国对海洋微生物的研究多集中在广东、福建沿海海域，黄维真、方金瑞在福建沿海海洋微生物研究中也获得了新的和已知的抗生素(黄维真等，福建沿海底栖放线菌及其产生的抗菌物质，中国海洋药物，1991，31～6、方金瑞等，海洋放线菌产生的抗生素2B-B的分离和鉴定，中国抗生素杂志，1991.(4)305～306)。
陆地上的芽孢杆菌和海洋芽孢杆菌都能产生抗真菌的肽类抗生素，近年来抗真菌抗生素的筛选非常活跃，其中发现芽孢杆菌属(Bacillus)、微球菌属(Micrococus)等能产生陆地上所未见过的抗生素(Murry，1989；William，1993；张士璀等，1998；王书锦等，1998)；申请人在中国海洋微生物资源考察中，分离得到海洋细菌318株，海洋弧菌134株，海洋芽孢杆菌71株；抑菌活性实验表明其中多株海洋芽孢杆菌(Bacillus)的次生代谢产物能产生抗真菌抗生素，对人体病原真菌白色念珠菌、石膏样毛癣菌、新型隐球菌、红色毛癣菌及对植物病原真菌镰刀菌、葡萄孢霉、稻瘟霉菌、蔬菜根腐病菌等有较强的拮抗作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、有效组分含量高的海洋芽孢杆菌生产抗真菌抗生素的发酵方法。
为了实现上述目的，本发明在以往的试验基础上用均匀设计方法对海洋芽孢杆菌发酵生产抗真菌抗生素进行优化试验，最后选出发酵生产抗真菌抗生素的最佳培养基配方及发酵条件，具体技术方案为当所选取的海洋芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌时，其发酵培养基A的重量组成为玉米粉0.5～2.0％、豆饼粉0.2～0.8％、葡萄糖0.2-0.6％、磷酸二氢钾0.01～0.05％、硫酸锌0.01 0.05％、余量为水；当所选取的海洋芽孢杆菌为解淀粉类芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌时，其发酵培养基B的重量组成为豆饼粉0.1～2.5％、淀粉0.1～3％、玉米粉0.1～3.0％、磷酸二氢钾0.1～0.25％、微量元素母液0.05～0.15％，余量为水；所述微量元素母液组成为四硼酸钠0.05％、硫酸锰0.05％、硫酸锌0.05％、钼酸钠0.05％、硫酸铜0.002％，余量为水。
所述培养基A组成最好为玉米粉1％、豆饼粉0.6％、葡萄糖0.5％、磷酸二氢钾0.04％、硫酸锌0.04％、余量为水；所述培养基B组成最好为豆饼粉2％、淀粉0.2％、玉米粉2％、磷酸二氢钾0.64％、微量元素母液0.05％，余量为水；当所选取的海洋芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌时，其发酵时间为18--22小时，通气量为1.0∶0.5～1.0；当所选L的海洋芽孢杆菌为解淀粉类芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌时，其发酵时间为20--32小时，通气量为1.0∶0.5～1.0。
本发明采用白色念珠菌作指示菌，以制霉菌素(抗真菌抗生素)为标准单位，用二计量杯碟法对抗生素活性进行检测鉴定。
本发明具有如下优点1.本发明的培养基所用的发酵物质均是常见、廉价的农副产品，成本低，且发酵周期短，可以大规模扩大生产。
2.本发明提供的发酵生产抗真菌活性物质的方法，产生的抗生素有效组分含量高，为进一步开发和研究海洋芽孢杆菌打下了基础。
具体实施例方式
抗真菌海洋芽孢杆菌菌种的选取从中国沿海(大连黑石礁、三亚大东海、青岛栈桥等地)选取海水和海泥样品，海水和海泥样品加水稀释后涂布在1/3ZoBell2216固体选择培养基上，经28℃培养5～7天，挑取细菌进行分离纯化培养。用白色念珠菌或石膏样毛癣菌作指示菌，通过挖块法选出对白色念珠菌、石膏样毛癣菌有抑制作用的海洋细菌，参照伯杰氏手册和《常见细菌系统鉴定手册》对海洋细菌进行鉴定，同时进行16SrRNA序列分析方法鉴定海洋细菌，获得海洋芽孢杆菌中的地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amyloliquefaciens)和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)；实施例1凝结芽孢杆菌菌种的发酵过程1)取在菌种培养基培养好的凝结芽孢杆菌一环，划线接种在菌种培养基(培养基葡萄糖2％、蛋白胨0.3％、酵母膏0.8％、琼脂2％，pH自然，115℃灭菌20分钟)的平皿中，28℃恒温培养24小时；2)活性物质的发酵将上述培养1天的菌种取几环接入装有无菌水和玻璃珠的三角瓶内，摇匀后按重量含量5％的量接入到发酵培养基(基础培养基玉米粉1％、豆饼粉1％、磷酸二氢钾0.25％、淀粉0.5％、余量为水，pH自然，121℃灭菌20分钟)中，发酵培养基上摇床28℃、180rpm恒温培养，发酵时间为24(可为20～32)小时；3)发酵上清液的制备将凝结芽孢杆菌发酵液用0.5mol草酸调pH值3～4，然后在70℃水浴中保温10分钟，取出后在高速台式离心机上13000rpm离心1分钟(或3500转离心20分钟)，取上清即得；4)抗生素浓度的测量牛津杯法根据抑菌圈的大小来计量活性物质浓度的高低；试验菌的制备取一环新鲜培养的沙氏斜面上的白念珠菌接入装有20ml无菌水的三角瓶中，制成菌悬液。
液体沙氏培养基葡萄糖4％、蛋白胨1％，调PH 5.4，115℃灭菌20分钟；固体沙氏培养基即在液体沙氏培养基中加入2％琼脂。
发酵时间对活性物质产生的影响
在基础培养基中按重量含量5％的量接入凝结芽孢杆菌菌悬液，在28℃、180rpm恒温培养，不同时间取样测活性物质随时间的变化见表1；从表1可以看出活性物质浓度随着发酵时间增加而升高，并在24小时达到最高值，接着开始下降。
表1凝结芽孢杆菌活性物质随时间变化结果
实施例2采用均匀设计方法对培养基进行优化试验，发酵培养基的具体组成见表2所示，培养基需调PH6.0～6.5、121℃灭菌20分钟；其余反应条件与实施例1相同；根据优化实验方案对培养基优化的结果如表2所示，利用微机对所得结果进行回归处理得到如下方程Y＝0.4261+3.1010*X3+4.2308*X4+0.2594X1*X1-0.0102*X2*X2+1.4036*X3*X3-2.9738*X4*X4-0.1287*X1*X4-0.0661*X2*X3其中N＝10，R2＝1.0000，S＝0.0006，F＝808151.8700，查表得F＞F0.018.1，F检验通过，利用微机进行多元回归，处理优化条件如下X1＝2.0000、X2＝0.2000、X3＝0.2000、X4＝0.6400、X5＝0.0500，Ymax＝34.51，按优化配方发酵，抑菌圈直径为34.70mm，接近理论值。
从而得凝结芽孢杆菌发酵培养基最佳配方为玉米粉2.0％，豆饼粉2.0％、磷酸二氢钾0.64％、淀粉0.2％、微量元素母液0.05％、余量为水。
微量元素母液组成如下四硼酸钠0.05％、硫酸锰0.05％、硫酸锌0.05％、钼酸钠0.05％、硫酸铜0.002％，余量为水；上述各元素分别配制，用时混合在一起，按培养基溶液重量(或体积)百分比加入。
表2凝结芽孢杆菌优化发酵培养基实验方案和结果
上述实施例中所得的凝结芽孢杆菌菌体及发酵液经辽宁省卫生防疫站检测其急性毒理和皮肤刺激实验，表明凝结芽孢杆菌菌体及发酵液无毒，LD50＞15g/kg体重，对皮肤无刺激作用；其发酵液中的活性物质对人体皮肤致病真菌石膏样毛癣菌，白色念珠菌有很强的抑制作用。如应用中国科学院沈阳应用生态研究所分离纯化的海洋凝结芽孢杆菌B02效果更好。
实施例3按常规方法制取海洋地衣芽孢杆菌发酵种子液，然后进行摇瓶发酵培养；海洋地衣芽孢杆菌发酵培养基配方的选优(其中以磷酸二氢钾0.04％和硫酸锌0.04％为常量，余量为水)，采用均匀设计进行，以确定培养基最基本成分，如表3所示。
表3地衣芽孢杆菌碳、氮源均匀设计及结果因素1 2 3 4 5 6 7 8 9玉米粉0 0.20.40.60.81.01.21.41.6％豆饼粉0.20.61.01.40 0.40.81.21.6％葡萄糖0.61.40.41.20.21.00 0.81.6％蛋白胨0.60.40.20 0.70.50.30.10.8％活性(抑菌圈直径34.20 38.70 34.94 39.00 32.80 36.84 33.90 35.00 37.50mm)经计算机进行逐步线性回归得到方程Y＝35.1760+2.0558x32-6.0590x42-1.4795x1x2+1.5295x1x4+1.0906x2x3R＝0.9888，S＝0.5398，F＝26.2466，F5，3(α＝0.05)＝9.01，F＞F5，3检验通过，置信度＞95％。
其中Y为抑菌圈直径(mm)，X1玉米粉浓度，X2豆饼粉浓度，X3葡萄糖浓度，X4蛋白胨浓度。
确定发酵培养基成分中最好为玉米粉1％，豆饼粉0.6％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0，磷酸二氢钾0.04％、硫酸锌0.04％、余量为水；为验证该条件，应用上述培养基发酵罐(在7L发酵罐，70L发酵罐)发酵；在发酵培养基初始PH8.0，通风量1∶0.5～1.0，发酵时间18～22小时的条件下，发酵罐发酵中国科学院沈阳应用生态研究所分离纯化的海洋地衣芽孢杆菌9912，其产生抗真菌抗生素可达到5800制霉菌素单位/ml发酵液。
权利要求
1.一种海洋芽孢杆菌生产抗真菌抗生素的发酵方法，其特征在于当所选取的海洋芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌时，其发酵培养基A的重量组成为玉米粉0.5～2.0％、豆饼粉0.2～0.8％、葡萄糖0.2-0.6％、磷酸二氢钾0.01～0.05％、硫酸锌0.01-0.05％、余量为水；当所选取的海洋芽孢杆菌为解淀粉类芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌时，其发酵培养基B的重量组成为豆饼粉0.1～2.5％、淀粉0.1～3％、玉米粉0.1～3.0％、磷酸二氢钾0.1～0.25％、微量元素母液0.05～0.15％，余量为水；所述微量元素母液组成为四硼酸钠0.05％、硫酸锰0.05％、硫酸锌0.05％、钼酸钠0.05％、硫酸铜0.002％，余量为水。
2.按照权利要求1所述的海洋芽孢杆菌生产抗真菌抗生素的发酵方法，其特征在于所述培养基A组成为玉米粉1％、豆饼粉0.6％、葡萄糖0.5％、磷酸二氢钾0.04％、硫酸锌0.04％、余量为水。
3.按照权利要求1所述的海洋芽孢杆菌生产抗真菌抗生素的发酵方法，其特征在于所述培养基B组成为豆饼粉2％、淀粉0.2％、玉米粉2％、磷酸二氢钾0.64％、微量元素母液0.05％，余量为水。
4.按照权利要求1所述的海洋芽孢杆菌生产抗真菌抗生素的发酵方法，其特征在于当所选取的海洋芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌时，其发酵时间为18-22小时，通气量为1.0∶0.5～1.0。
5.按照权利要求1所述的海洋芽孢杆菌生产抗真菌抗生素的发酵方法，其特征在于当所选取的海洋芽孢杆菌为解淀粉类芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌时，其发酵时间为20-32小时，通气量为1.0∶0.5～1.0。
全文摘要
本发明涉及海洋芽孢杆菌，具体的说是一种海洋芽孢杆菌生产抗真菌抗生素的发酵方法，当所选取的海洋芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌时，其发酵培养基的重量组成为A.玉米粉0.5～2.0％、豆饼粉0.2～0.8％、葡萄糖0.2－0.6％、磷酸二氢钾0.01～0.05％、硫酸锌0.01－0.05％、余量为水；当所选取的海洋芽孢杆菌为解淀粉类芽孢杆菌或凝结芽孢杆菌时，其发酵培养基的重量组成为B.豆饼粉0.1～2.5％、淀粉0.1～3％、玉米粉0.1～3.0％、磷酸二氢钾0.1～0.25％、微量元素母液0.05～0.15％，余量为水。本发明为海洋芽孢杆菌生产抗真菌抗生素的进一步开发和应用打下了基础。
文档编号A61P31/10GK1472327SQ03133499
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月25日 优先权日2003年6月25日
发明者胡江春, 王烈, 马成新, 刘全永, 薛德林, 王书锦 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所