专利名称：银杏酮酯滴丸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种银杏酮酯滴丸制剂。
银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L)的叶，自1970年代以来，国内外学者对银杏叶的化学、药理制剂等进行了全方位的研究。日本、美国以及西欧等国已投入大量的人力、物力，对开发的产品，取得专利技术。我国是银杏的故乡，银杏的分布极广，北至辽宁，南到广西均有栽植。特别是华中、华北为集中产区，现在裁培面积约50万亩，年产银杏干叶1.5万余吨，这一宝贵的资源需要我们进一步攻关开发利用。据有关资料综合分析，全球银杏叶提取物制品的总销售额约50亿美元，其中美国市场约20亿美元，欧洲市场的20亿美元，其它国家约10亿美元，其中韩国1.3亿美元，我国估计为8500万美元(约合人民币7亿元)。目前，国内外的银杏制剂大都局限于片剂、胶囊、丸剂等剂型，银杏酮酯滴丸剂尚属空白。
本发明的目的在于提供一种新的银杏酮酯滴丸制剂，该剂型具有速效、使用方便、有效成分含量高、服用量少等优点。
银杏酮酯滴丸是发明人将祖国传统医学和高科技手段结合开发研制的新一代心脑血管保护剂，其中主成份银杏酮酯含总黄酮≥44％、银杏总内酯≥6％，有扩展脑血管，促进脑血液循环，增强脑血流量，提高大脑新陈代谢活力，增强记忆力等作用。无论是产品质量、还是疗效，都较现有的剂型更为提高，这可从下述实验中得到论证。
动物药效学试验表明，银杏酮酯滴丸对大鼠因注射垂体后叶而引起的心肌缺血有明显改善作用；对大鼠冠脉结扎而造成的急性心肌梗塞和代偿性心率加快可减慢心率；对大鼠外周血管微循环有明显的改善作用，并有抗血栓形成，改善血液流变学及提高耐缺氧能力等作用。其作用机理可能是1.银杏黄酮类成份具有维生素P样作用，能改善毛细血管的通透性和血管脆性，增加冠脉流量，降低心肌耗氧量。2.血小板活化因子(PAF)是迄今所知最强的血小板活化剂，它能导致血小板聚集和血栓形成，收缩冠状动脉，减少冠脉流量，在心肌缺血病理和生理过程中也起着重要作用，而银杏内酯被认为是目前最有临床应用前景的天然PAF受体拮抗剂，具有选择性拮抗PAF的作用。因此，银杏内酯作为强PAF拮抗剂，具有拮抗血小板活化因子所引起的血小板聚集和血栓形成的作用，具有血管调节剂，抗栓剂，代增强剂等功能。
毒理学研究表明，银杏酮酯滴丸急性毒性小鼠LD50＞7.2g/kg(以银杏酮酯计算)；长期毒性试验，大鼠口服给药连续3个月，1080mg/kg、360mg/kg、108mg/kg(均以银杏酮酯计算)对动物体重、食欲、活动状况、血常规、血液生化无明显影响；病理检查，肉眼及显微镜下未见心、肝、脾、肺、肾、睾丸、卵巢等主要脏器有损害性变化，胃及十二指肠解剖观察也未见有损害。
本发明目的是这样实现的本发明的银杏酮酯滴丸的组方配比为银杏酮酯1-6份 PEG-6000 1-25份其制备方法为将银杏酮酯制成细粉过筛，按上述比例称取银杏酮酯细粉和PEG-6000，取PEG-6000置于50-150℃水浴中加热熔化，熔化后，在90℃以下加入银杏酮酯细粉，边加边搅拌，搅拌时间为5分钟-5小时，使其充分混匀，再在70-90℃保温条件下滴入冷凝液中，滴制成丸。
在本发明中，银杏酮酯可按已知的常规方法提取得到，符合中华人民共和国国家药品监督管理局标准(试行)(WS-227(Z-028)-2000)银杏酮酯项下的各有关规定。本品含总黄酮以芦丁(C27H80O6)计，不得低于44％，含银杏内酯A、B、C和白果内酯BB即本品中银杏总内酯量不得少于6.0％。即，优选银杏酮酯中含总黄酮≥44％、总内酯＞6％。
其中，银杏酮酯与PEG-6000的配比优选1∶4、1∶8，更优选1∶15、1∶20。
制备滴丸时的水浴温度优选90-110℃；搅拌时间优选30分钟-2小时、更优选1小时。
本发明中的冷凝液为制备滴丸常用的冷凝液，优选液体石蜡，更优选10-25℃液体石蜡。
经过中试研究表明该工艺制成的银杏酮酯滴丸，硬度适中，耐热性和流动相均较好，丸重的变异系数为3.82％～4.58％，熔散时限在7.6～10.5min范围内，外观质量较好，经含量测定活性成分银杏酮酯分布均匀，药物释放迅速，起效块。
银杏酮酯滴丸与银杏酮酯的其它剂型相比，具有有效成分含量高，服用量小，药物计量准确，药物释放快之特点。且具有生产、运输、使用、携带、保管方便之优势，是银杏酮非常理想的剂型。
下面结合实施例对本发明进行进一步说明
实施例1取银杏酮酯50g，PEG-6000 200g，将银杏酮酯制成细粉过筛，取PEG-6000置90℃水浴中加热熔化，在80℃加入银杏酮酯细粉，边加边搅拌，搅拌30分钟，使其充分均匀，85℃保温滴入12℃液体石蜡中，滴制成丸，即得。
实施例2取银杏酮酯100g，PEG-6000 1500g，将银杏酮酯制成细粉过筛，取PEG-6000置110℃水浴中加热熔化，在60℃加入银杏酮酯细粉，边加边搅拌，搅拌1小时，使其充分均匀，75℃保温滴入20℃液体石蜡中，滴制成丸，即得。
实施例3取银杏酮酯200g，PEG-6000 1600g，将银杏酮酯制成细粉过筛，取PEG-6000置120℃水浴中加热熔化，在50℃加入银杏酮酯细粉，边加边搅拌，搅拌2小时，使其充分均匀，80℃保温滴入植物油冷凝液中，滴制成丸，即得。
本发明的研制目的银杏酮酯(本方选自中华人民共和国国家药品监督管理局标准(试行)杏灵颗粒)功能为活血化瘀，用于血瘀型胸痹(冠心病心绞痛)及血瘀型轻度脑动脉硬化引起的眩晕。为了使其达到治疗速效的目的，我们采用固体分散技术，研制出了银杏酮酯滴丸。
实验结果如下一、银杏酮酯滴丸与银杏叶片崩解时限的比较银杏叶制剂临床上常用的是片剂，为此比较了两种剂型的崩解时限。采用《中国药典》一部。附录X IIA。崩解时限检查法检查，银杏叶片的崩解时限为24.3±6.2min，银杏酮酯滴丸的崩解时限为8.5±2.3min，可见银杏酮酯滴丸的崩解时限较片剂好。
二、服用方法与服用量比较银杏酮酯滴丸既可口服又可舌下含服，而银杏片剂和杏灵颗粒，只可口服，并且需要水；这对于发病急的血瘀型胸痹(冠心病心绞痛)，有时会耽误病情。所以滴丸剂较其他剂型有明显优势。
银杏酮酯滴丸更加精制，有效成分含量高，滴丸一次仅服0.2g，而颗粒剂一次服用1.0g，片剂一次服用0.5g。滴丸中银杏酮酯含量为20％，而颗粒剂中银杏酮酯的含量为4％，片剂中银杏酮酯含量为8％。
三、利于环保滴丸生产制备工艺简单，生产周期短，无三废污染，而银杏片剂在生产过程中能够产生部分废渣、废液。
因此，银杏酮酯滴丸与银杏叶的其他剂型比较，具有崩解时间短，吸收快，有效成分含量高，服用量小，药物剂量准确，服用方便，起效快之特点。且生产、运输、携带、服用方便之优势，是非常理想的剂型。
以下是本申请银杏酮酯滴丸的有关实验研究。
I.银杏酮酯滴丸与银杏叶片治疗冠心病心较痛疗效比较银杏酮酯滴丸、银杏叶片分别治疗冠心病141例，52例，对心绞痛总有效率分别为96.7％、85.4％，对缺血性心电图改变总有效率为86％和73.1％，滴丸和片剂均能明显降低总胆固醇、甘油三脂和升高高密度脂蛋白胆固醇。对银杏酮酯滴丸治疗冠心病心胶痛的疗效进行临床研究，同时观察对高血脂症影响，并应用江苏扬子江药业生产的银杏叶片作随机对照。结果报告如下1.临床资料1.1冠心病心绞痛诊断标准依据1980年全国内科学术会议《关于冠心病命名及诊断标准的建议》。
1.2治疗观察对象参考卫生部(87)卫药字32号《中药治疗胸痹的临床研究指导原则》选择以下3种病人(1)典型心绞痛，平时或心绞痛发作时心电图有缺血性改变或运动试验阳性。(2)心绞痛虽不典型，但心电图诊断明确者。(3)心电图虽正常、但心绞痛发作典型者[1]。分2组观察(1)滴丸组141例其中典型心绞痛104例，心绞痛不典型而心电图诊断明确者39例，男82例，女59例，平均年龄60.1岁。
(2)片剂组52例典型心绞痛41例，心绞痛不典型而心电图诊断明确者11例，男28例，女24例，平均年龄57.2岁。
2.观察方法2.1治组为银杏酮酯滴丸，随机对照组为银杏叶片。剂量，片剂为1天3次。1次2片，滴丸为1天3次，1次8丸；疗程均为1个月。治疗前采访病史，体检，查血、尿、粪便常规，肝、肾功能、血脂、血糖、12导联静休心电图，均停用抗心绞痛及降脂药物2周。给药后，每周随访1次，疗程结束时，全面复查。
2.2冠心病心绞痛疗效评定标准根据1979年全国中西医结合治疗冠心病心绞痛及心律失常座谈会制订标准[1]。降血脂疗效以高血脂症患者服药前后自身对照。
3.结果下列数据由28M AST 386电脑分析处理，统计方法采用配对t检验，X2检验。
具体结果如下3.1银杏酮酯滴丸、银杏叶片治疗冠心病心绞痛疗效比较，见表1
表1.银杏酮酯滴丸、银杏叶片治疗冠心病心绞痛疗效比较组别例数显效有效 无效总有效率滴丸107 73(68.2％)**26(24.3％)8(7.5％)79(92.5％)*片剂37 17(45.9％) 12(32.4％)8(21.6％) 29(78.4％)**与片剂相比，总有效率无显著差异**与片剂相比，显效(P＜0.05)从表1可见，滴丸治疗心绞痛显效率明显高于片剂(P＜0.05)，但总有效率各组比较无显著差异。
3.2银杏酮酯滴丸、银杏叶片对缺血性心电图改变疗效情况，见表2。
表2银杏酮酯滴丸、银杏叶片对缺血性心电图改变疗效比较组别例数显效 有效 无效 总有效率滴丸132 55(42.7％)60(45.5％)17(12.9％)115(88.2％)**片剂50 15(30.0％)21(42.0％)14(28.0％)19(72.0％)**与片剂相比，P＜0.05从表2可见，对缺血性心电图总有效率滴丸高于片剂，P＜0.05。
3.3银杏酮酯滴丸、银杏叶片对高血脂症患者血脂影响，见表3。
表3银杏酮酯滴丸、银杏叶片服药前后降脂疗效比较(X±S)TG(mmol/L)TC(mmol/L) HDL-C(mg/dL)剂型治疗前治疗后 治疗前治疗后 治疗前治疗后5.80± 3.992**± 3.10± 2.56**± 30.9± 41.5**±滴丸2.14(70) 1.79(70) 0.50(23) 0.59(23)4.8(49) 5.1(49)5.62± 3.8**± 2.69± 2.18*± 34.9± 42.3*±片剂1.92(12) 1.24(12) 0.34(3) 0.32(3) 2.2(10) 3.7(10)*与治疗前比P＜0.05**与治疗前比P＜0.01从表3可见，服滴丸或片剂一个疗程后，高血症患者TG和TC平均值明显下降，P＜0.001及0.01，HDL-C明显升高，P＜0.001。
4.讨论4.1从上可见，银杏酮酯滴丸、银杏叶片对治疗冠心病心绞痛，改善缺血性心电图改变，疗效是肯定的，而且滴丸的疗效明显好于片剂。
4.2银杏叶治疗冠心病作用机制，国内外学者对其进行了研究，发现其主要有效成分为黄酮甙和银杏内酯。黄酮甙具有清除氧自由基作用，银杏内酯具拮抗血小板活化因子(PAF)作用，二者互相协同，从不同环节上发挥治疗作用。PAF是迄今所知最强的血小板活化剂，使冠状动脉收缩，减少冠脉流量，还可刺激白细胞，内皮细胞产生氧自由基，损伤心肌细胞。而银杏叶制剂具有对抗PAF作用，此外，还具有提高小鼠心，脑缺氧的耐受力，保护缺血心肌[2]。
银杏酮酯滴丸和银杏叶片具有明显降低TG、TC和升高HHL-C功能，这有利于防治冠心病，但其作用机制尚不清楚，有待继续研究。
II.银杏酮酯滴丸对实验性脑缺血大鼠的血流变影响1.材料与方法1.1动物模型健康wistar大鼠，体重150～170g，雌雄兼用，河南医学实验动物中心提供。大鼠单侧脑缺血模型制备大鼠3％戊巴比妥纳30mg/kgip麻醉后，仰卧于手术台上，切开大鼠右侧颈部皮肤，钝性分离颈总动脉，用医用手术丝线结扎颈总动脉，缝合皮肤。
1.2实验分组随机分为假手术组、生理盐水对照组(大鼠手术后每日灌胃1,5ml生理盐水，于7日处死)、滴丸组(从手术当天开始用药，剂量分别为24、12、6mg/kg/天，连续给药7天)。
1.3实验指标1.3.1脑含水量测定每组动物腹主动脉放血致死，快速完整取下右侧大脑20mg组织，采用称重法[2]测量脑含水量。
1.3.2血流变指标测定STEELLEX R20血液粘度仪测定全血粘度以及血浆粘度，WB-A型微血管红细胞比积仪测定压积，纤维蛋白原和凝血酶原时间测定采用全国临检操作规程的方法。
2结果2.1用药组脑含水量较盐水对照组相比显著降低(P＜0.05)，结果见表1。
表1银杏酮酯滴丸对大鼠脑缺血侧脑含水量的影响(±s)分组 剂量(mg/kg)样本量n 脑含水量(％)假手术组 - 877.3±0.7生理盐水组- 880.2±1.4△滴丸组12 877.7±1.1*36 878.9±1.5*
108 878.9±0.7*注与假手术组比较△P＜0.05，与生理盐水组比较*P＜0.052.2用药组的红细胞压积和全血低切粘度明显低于盐水对照组(P＜0.01)，凝血酶原和纤维蛋白原与生理盐水组比较无明显差别 结果见表2、表3。
表2银杏酮酯滴丸对大鼠脑缺血血液粘度和红细胞压积的影响(n＝8，x±s)分组剂量 粘度 (mPa·a) 红细胞压积(mg/kg)全血 血浆 (％)假手术组- 25.7±5.2 3.2±1.1 36.9±4.7生理盐水组 - 29.7±4.7▲4.8±2.2▲38.7±3.4▲银杏酮酯滴丸10826.8±3.5*3.5±1.1*36.5±1.7*36 27.7±8.4*3.8±0.4*37.8±2.3*12 28.2±1.2*4.1±0.7*38.0±1.4*注与假手术组比较▲P＜0.05，与生理盐水组比较*P＜0.05表3银杏酮酯滴丸对大鼠脑缺血纤维蛋白和凝血酶原时间的影响(n＝8，x±S)分组剂量(mg/kg)纤维蛋白原凝血酶原时间(g/L) (s)假手术组- 2.74±0.6915.75±1.26生理盐水组 - 2.45±0.5114.14±2.34银杏酮酯滴丸1082.57±0.6115.55±1.9636.0 2.48±0.5815.40±2.0712 2.59±0.6815.60±1.893结论银杏酮酯滴丸能够降低脑缺血大鼠的红细胞压积及全血低切粘度，改善缺血脑组织的血液循环，对脑缺血具有一定的预防和治疗作用。
III.银杏酮酯滴丸对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用1实验材料1.1药品与试剂 银杏酮酯滴丸(河南大学药物研究所提供，批号20010901)，戊巴比妥纳(上海试剂分装厂)，辅酶I(中国科学院上海生物化学研究所)，丙酮酸钠(上海曹杨试剂厂)，MDA，SOD测定试剂盒(南京建成生物研究所)。
1.2器材721型分光光度计(上海分析仪器厂)，LMS-2B型二道生理记录仪(成都电子仪器厂)，超级恒温水浴(重庆试验仪器设备厂)。
1.3动物健康Wistar大鼠体重250±15g(x±s)，雌雄兼用，由遵义医学院实验动物中心提供。
2方法与结果取大鼠24只，随机分为4组正常对照组、缺血再灌组和大小剂量滴丸处理的缺血再灌组。大鼠用戊巴比妥纳(40mg·kg-1，ip)麻醉后，经舌ivl％肝素0.2ml抗凝。1min后开胸，迅速取出心脏，浸入氧饱和的冷K-H平衡液中，经主动脉逆行插管、固定，进行非循环式Langendorff灌流。调节冠脉流出量约为7ml·min-1。灌流液温度37±0.5℃，持续通入95％O2+5％CO2混合气体，pH7.4，灌流后心脏即开始跳动。心尖部插管至左心室内经压力换能器与LMS-2B二道生理记录仪相连接，记录左室内压(LVP)，同时扫记心肌收缩力(ST)，心率(HR)，每5min收集冠脉流出量(CBF)。对照组常速(7ml·min-1)；缺血再灌组先常速灌流15min，低速(1ml·min-1)灌缺血40min后，再恢复常速灌流30min；滴丸给药组低速40min后再灌流时灌流液中分别含银杏酮酯10mg·L-1和20mg·L-1外，余同缺血再灌组，实验结果用t检验判断显著性。
2.1银杏酮酯滴丸对缺血再灌流大鼠心脏的影响大鼠离体心脏平衡15min，记录缺血前及再灌后5、10、15、20、25及30min的ST、LVP、HR及CBF的变化(表1)。缺血再灌流后，心肌收缩力下降，左室内压显著降低(P＜0.05)，而给药组上述指标与缺血前比较无明显变化，表明银杏酮酯10mg·L-1、20mg·L-1对缺血再灌注所致心肌收缩力及左室内压的降低有保护作用。
表1银杏酮酯滴丸对缺血再灌流大鼠心肌收缩力(ST，以缺血前为100％)，左室内压(LVP，mmHg)，心率(HR，beat·min-1)，冠脉流出量(CBF，ml·5min-1)的影响。(x±s，n＝6)剂量 再 灌 流 时 间 (min)组别 指标缺血前(mg·L-1) 5 10 15 20 25 30缺血1.0±0.00 0.6±0.10* 0.7±0.24**0.6±0.16** 0.6±0.19** 0.6±0.14** 0.6±0.12**再灌组滴丸110 1.0±0.00 0.8±0.24 0.8±0.20 0.7±0.290.7±0.230.7±0.240.7±0.28滴丸220 ST 1.0±0.00 0.9±0.09 1.0±0.05 1.0±0.051.0±0.080.9±0.080.9±0.08缺血 130±1279±11* 79±22*81±15** 86±19** 86±19** 87±21**
再灌组滴丸110 138±23110±23110±22101±33112±26101±38105±38滴丸220LVP132±19130±23129±18116±37135±31128±30131±31缺血132±25111±331 99±36 116±39116±33109±29111±30再灌组滴丸110 138±16.8 131±22137±27110±36111±36112±29115±30滴丸220HR 113±59.4 137±18131±16129±16123±27123±26126±22缺血31±2.729.52.129±4.928±4.627±4.127±4.628±4.4再灌组滴丸110 30±2.729.2±3.2 30±2.231±3.331±4.231±4.731±3.3滴丸220CBF29±2.629.6±41 30±4.431±5.431±5.130±7.530±8.3与缺血前比较*P＜0.05**P＜0.012.2银杏酮酯滴丸对缺血再灌大鼠冠脉流出液中LDH含量的影响收集各组缺血前及再灌流后5～30min内冠脉流出液，用光电比色法测定LDH含量变化，结果见(表2)。缺血再灌组心脏冠脉流出液中LDH明显升高，并随灌流时间而上升；给药组再灌流后与缺血组比较LDH明显降低(P＜0.05)，表明银杏酮酯滴丸可减少心肌LDH释放量，增加给药剂量作用进一步增强(P＜0.01，见表2)。
表2银杏酮酯滴丸对缺血再灌流大鼠冠脉流出液中LDH活性(U·100ml-1)的影响(x±s，n＝6)剂量 再灌 流 时 间 (min)组别 缺血前(mg·L-1) 5 10 15 20 25 30缺血再灌组 2.49±4.0 7±9.329±2.5511±2.5 51±2.660±23.3 66±24.0给药组1 10 2.36±5.7 12±4.8 29±7.630±8.2* 36±9.1* 36±7.9* 40±8.4*给药组2 20 2.39±5.5 12±11.5 12±9.5** 25±6.4** 28±8.4** 26±3.6** 30±4.1**与缺血再灌组比较*P＜0.05**P＜0.012.3银杏黄酮对缺血再灌大鼠心肌MDA含量、SOD活力的影响灌流结束，迅速剪下左心室壁心肌，称重后按10∶1比例加入生理盐水，制成10％心肌匀浆，按TBA比色法原理，用MDA测定试剂盒测定心肌组织中脂质过氧化产物MDA含量。取上述心肌匀浆稀释为1％，用SOD测定试剂盒，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。结果表明，缺血再灌组MDA含量明显高于正常灌流组；SOD活力明显降低(P＜0.05)。表明缺血再灌流使心肌组织中MDA明显增加，SOD活力降低。银杏酮酯滴丸明显降低心肌组织中MDA含量，减少SOD活力的降低，并与给药剂量相关(表3)。
表3银杏酮酯滴丸对缺血丙灌大鼠心肌组织MDA含量，SOD活力的影响(x±s，n＝6)剂量 指 标组别(mg·L-1) MDA(nmol/g) SOD(U/g)对照组77±38.4** 456±60.5*缺血再灌组206±64.9320±35.4给药组1 10 109±36.2368±81.8给药组2 20 92±21.9** 444±86.9**与缺血再灌组比较*P＜0.05**P＜0.013.结论银杏酮酯滴丸对离体心脏缺血再灌注有保护作用。
IV.银杏酮酯滴丸对小鼠和大鼠脑缺血的保护作用1实验材料1.1药品与试剂 银杏酮酯滴丸，每丸200mg，含银杏酮酯40mg(银杏总黄酮≥17.6mg，银杏内酯≥2.4mg)，河南大学药物研究所提供，批号20010901。尼莫地平，山东新华制药厂提供；氯化三苯基四氮唑(2，3，5 triphenyltetrazoliumchloride，TTC)，北京化学制药厂生产，蒸馏水配制，避光低温贮存备用；其余均为市售分析纯试剂。
1.2仪器CY-2型测氧仪，上海华光仪器仪表厂产品；PYX DHS隔水式恒温培养箱，上海市跃进医疗器械一厂产品；TE II型Olympus Tokyo实体显微镜，OlympusOptical Co.ctd产品。
1.3动物昆明种小鼠，Wistar大鼠，均购自河南医学实验动物中心2实验方法2.1小鼠常压密闭缺氧实验取体重18～22g，♀♂各半小鼠50只，随机分为5组(如表1所示)。灌胃给药8d，末次药后30min测定。将小鼠置于150ml广口瓶内，内盛适量钠石灰，瓶口接橡皮塞与CY-2型测氧仪相连。测定每分钟瓶内的氧含量O2％(耗氧速度)及小鼠存活时间。
2.2小鼠急性脑缺血实验取体重18～22g，♂小鼠120只，随机分为6组(如表2所示)。灌胃给药8d，末次药后30min，乙醚麻醉，分离左右两侧颈总动脉(带迷走神经，BCCA-VNL)，心端用线结扎，头端用动脉夹夹住，然后在中间将颈总动脉剪断，记录动物的死亡时间，超过2h死亡者，其死亡时间记为120min。
2.3大鼠局灶性脑缺血实验取体重280～320g，♂大鼠，随机分为6组(如表3所示)。灌胃给药7d，d8行MCAO术，按文献所示方法及图谱进行，即在左眼外眦到左外耳连线的中点切开皮肤，分离肌束，在颧骨和鳞状骨前联合前内2mm处钻孔开颅，电凝位于嗅束内约2mm至大脑大静脉间的一段大脑中动脉，缝合伤口，注意使术后动物保温。于术后6、24h采用盲法评分，然后断头取脑，去除嗅球、小脑及低位脑干，将剩余部分沿矢中缝一分为二，取手术同侧大脑半球，将其切为五片，于TTC染液中，37℃孵育30min，正常组织呈玫瑰红色，梗塞组织呈白色。在实体显微镜下计数8个面的缺血面积所占总面积的百分比。计数完毕，制备病理切片，HE染色，光镜下对各组切片进行组织学对比观察。
2.4统计学处理 实验结果采用x±s表示，统计差异的显著性时，计数资料用x2检验，计量资料用t检验。
3实验结果3.1对小鼠密闭缺氧耐受力的影响结果显示，银杏酮酯滴丸各剂量对小鼠在密闭缺氧状态下的耗氧速度无明显影响，对小鼠的存活时间没有延长作用。
表1银杏酮酯滴丸和尼莫地平对小鼠耐缺氧及存活时间的影响(x±s，n＝10)组别剂量(mg/kg)体重(g) 存活时间(min)残余O2(％)溶媒组 - 21.5±1.6217.49±2.62 6.13±0.84尼莫地平组 10 21.3±0.7519.69±1.64*6.21±0.50银杏酮酯滴丸12 21.2±0.9817.45±0.79 6.18±0.65银杏酮酯滴丸36 21.1±1.0417.67±1.42 6.23±0.77银杏酮酯滴丸10821.1±0.7717.51±0.83 6.17±0.52与赋形剂组比较，*P＜0.053.2对急性脑缺血小鼠2h内死亡率死亡时间的影响结果见表2，与溶媒对照组比较，银杏酮酯滴丸可降低急性脑缺血小鼠120min内的死亡率，延长动物的死亡时间。
表2银杏酮酯滴丸对急性脑缺血小鼠的死亡率及存活时间的影响(x±s，n＝20)组别剂量(mg/kg) 死亡率(％) 存活时间(min)
空白对照- 9510.35±26.01溶媒对照- 9515.77±31.16银杏酮酯滴丸12 9513.18±28.31银杏酮酯滴丸36 9017.26±35.30银杏酮酯滴丸10865* 54.63±52.92**与溶媒对照组比较*P＜0.05**P＜0.013.3对大鼠局灶性脑缺血的影响3.3.1对大鼠行为障碍的影响大脑中动脉阻断后，所有动物出现不同程度的神经运动功能障碍，模型组尤为明显。主要表现为提尾悬空时右前肢内收、肩内旋，右前肢张力降低，严重者行走时向一侧环转。银杏酮酯滴丸各剂量均可使手术后6、24h时脑缺血大鼠的行为障碍有不同程度的改善，结果见表3。
3.3.2对大鼠脑梗塞面积的影响如表3所示，与溶媒对照组相比，银杏酮酯滴丸各剂量可缩小局灶性脑缺血大鼠的脑梗塞面积。
3.3.3对大鼠脑组织病理状态的影响脑病理切片显示，对照组大鼠缺血侧脑组织有严重损伤的坏死中心和轻中度损伤的缺血半影区，表现为大量神经元周围间隙扩大，有散在的暗染神经元，神经细胞出现不同程度的皱缩。各用药组大鼠有不同程度的减轻。
表3银杏酮酯滴丸对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞面积的影响(x±s)动物数组别剂量(mg/kg) 梗塞面积(％)减少率(％)(只)溶媒对照- 1023.2±1.9 -银杏酮酯滴丸128 20.3±3.7** 12.50银杏酮酯滴丸369 17.8±1.7** 23.28银杏酮酯滴丸108 1016.7±1.9** 28.02Nim 2 1020.4±0.4** 12.07注*P＜0.05**P＜0.014结论银杏酮酯滴丸具有抗脑缺血作用。
V.银杏酮酯滴丸对生理机能的影响1对大鼠软脑膜和肠系膜微循环的影响选用健康SD大鼠10只用于微动脉口径、10只用于毛细血管开放数、30只用于软脑膜微动脉血液流态实验。银杏酮酯滴丸用生理盐水(NS)分别配成银杏酮酯量为50ug/ml(低浓度)、100ug/ml(中浓度)、200ug/ml(高浓度)三种不同的浓度，滴在大鼠软脑膜和肠系膜上，并以去甲肾上腺素(NE)为对照。在OLYMPUS万能研究显微镜下观察，用PANSONLC牌WV-CL320/G摄象头摄象，彩色视机显示，分别观察测定银杏酮酯滴丸对大鼠微动脉口径、毛细血管开放数、微动脉血管流态的影响。
1.1对微动脉口径的影响(见表1)表1银杏酮酯滴丸对微动脉口径的影响(x±SD)时间 软脑膜微动脉口 肠系膜微动脉ACSF(min) 径(um) 口径(um)药前对照 27±3 30±5 29±3滴EN后 1019±5 16±6 21±6滴低浓度1 23±4**17±6 25±5**银杏酮酯3 35±5**20±7 39±5**滴丸后5 26±4*20±7 32±5*5026±3*23±5 30±4*100 27±3*28±5*29±3*200 27±3*30±5*29±3*滴中浓度1 25±4**27±5**银杏酮酯3 41±2**43±3**滴丸后5 31±3**43±4**5029±3*32±3*100 28±3*30±3*200 28±3*29±3*滴高浓度1 24±4**26±4**银杏酮酯3 36±5**39±5**滴丸后5 28±3*31±4*5028±3*30±3*
100 27±3*29±3*200 27±3*29±3*注*P＜0.05，**P＜0.01表1所示，(1)软脑膜滴NE10min后与再滴三种浓度的EGB相比，低高两种浓度在1、3min，中浓度在1、3、5min时有非常显著性差异(P＜0.01)；低高浓度在5、10、20、30min，中浓度在10、20、30min时有显著性差异(P＜0.05)。(2)软脑膜滴人工脑脊液(ACSF)与滴三种不同浓度的银杏酮酯滴丸相比，发现三种浓度均在20、30min时有显著性差异(P＜0.05)。上述结果表明银杏酮酯滴丸能对抗NE引起的微循环障碍，使大鼠软脑膜和肠系膜微动脉口径显著扩张。
1.2银杏酮酯滴丸对大鼠毛细血管开放数的影响(见表2)。
表2银杏酮酯滴丸对毛细血管开放数的影响(x±SD)软脑膜毛细血管肠系膜毛细血管组别全开放数 开放％ 全开放数 开放％药前对照 6±2 60 60±1 60滴NE 0 0 0 0滴低浓度银杏酮酯** 8±1 80 9±1**90滴丸滴NE 2±2 20 2±2 20滴中浓度银杏酮酯** 10±1 100 10±1**100滴丸滴NE 3±1 30 3±2 30滴高浓度银杏酮酯** 10±1 100 10±1**100滴丸注**P＜0.01表2表明，(1)软脑膜毛细血管滴注NE后与再滴注三种不同浓度的银杏酮酯滴丸相比，毛细血管开放数均有非常显著性的差异(P＜0.01)。(2)肠系膜毛细血管实验也得到相同的结果(P＜0.01)。说明银杏酮酯滴丸能使软脑膜和肠系膜毛细血管开放数量显著增加，使组织内的血液供应得到有效地改善。
1.3对大鼠软脑膜微动脉血管流态的影响(见表3)。
表3银杏酮酯滴丸对软脑膜微动脉血管流态的影响(x±SD)动物数血流停止组别三级评分 恢复正常(只) 时间(min)
对照组 85.89±0.757.57±4.721柱滴低浓度银杏酮73.93±1.73* 2.87±4.24* 3*酯滴丸柱滴中浓度银杏酮81.89±1.80** 1.53±3.13** 7**酯滴丸柱滴高浓度银杏酮72.77±1.91** 1.79±2.52** 7**酯滴丸注*P＜0.05，**P＜0.01表3说明，(1)在微循环障碍的流态三级评定实验中，低浓度组有显著性差异(P＜0.05)，中、高浓度组有非常显著性差异(P＜0.01)。(2)在血流停止时间和血流态恢复另二项实验中其结果与流态三级评定相同。说明在事先使用NE障碍液使微动脉血流减慢的情况下银杏酮酯滴丸能使其血流速度加快，血流停止时间缩短，恢复正常状态的动脉条数增多。
银杏酮酯滴丸对大鼠软脑膜和肠系膜微循环影响研究提示银杏酮酯滴丸能有效对抗NE引起的微循环障碍，使微动脉口径显著扩张，毛细血管开放数增加，微动脉血流度加快。
2对血液系统的影响选用SD大鼠30只，随机分为对照组、实验1组和2组共3组，实验1组每天每只动物以体重10.8mg/Kg、2组36mg/Kg的银杏酮酯滴丸灌胃，对照组则灌蒸馏水，三组同时灌胃10d后采尾血，立即作红细胞总数(RBC)、血红蛋白含量(Hb)、RBC直径、白细胞总数(WBC)和分类，以及血浆总蛋白(SR)、白蛋白(A)、球蛋白(G)等方面的检测。
2.1对大鼠RBC和Hb的影响(见表4)表4银杏酮酯滴丸对大鼠RBC和Hb的影响(x±SD)组别 RBC(百万/mm3) Hb(g/100ml血)单细胞Hb(mg)对照组 8.6±1 15±1 15±2试验组1 8.8±2*** 16.5±1* 17±1.5*试验组2 10.9±1*19.5±1* 19±1.5**注*P＜0.05，**P＜0.01，***P＞0.05表4显示，实验1组对RBC总数虽没有显著性影响(P＞0.05)，但对Hb总量和单细胞Hb的含量却有显著性影响(P＜0.05)。实验2组对RBC总数有显著性影响(P＜0.05)，对Hb总量和单细胞Hb的含量有非常显著性影响(P＜0.01)。
2.2对大鼠RBC直径的影响(见表5)。
表5银杏酮酯滴丸对大鼠RBC直径的影响(x±SD)组别测量细胞个数RBC直径(μ)对照组 60 6.5±0.3试验组1 60 8.0±0.6*试验组2 60 8.8±0.2**注*P＜0.05，**P＜0.01表5说明，实验1组能使RBC直径明显增加(P＜0.05)，实验2组比实验1组效果更好(P＜0.01)。
2.3对大鼠WBC总数和分类的影响(见表6)。
表6银杏酮酯滴丸对大鼠WBC总数和分类的影响(x±SD)项目对照组 试验1组 试验2组WBC数(千/mm2) 14.5±515.6±4*16.7±3**嗜中性WBC 3.5±1 3.5±2* 3.6±2***嗜酸性WBC 0.3±0.1 0.3±0.1*** 0.35±0.1***嗜碱性WBC 0.15±0.01 0.2±0.01***0.2±0.02***淋巴细胞10.4±311.2±2*12.2±1**单核细胞0.35±0.1 0.36±0.05*** 0.36±0.1***注*P＜0.05，**P＜0.01，***P＞0.05从表6中看出，两个实验组对嗜中性、嗜酸性、嗜碱性WBC和单核细胞虽有影响，但没有统计学意义(P＞0.05)，实验1组对WBC总数和淋巴细胞数有显著性差异(P＜0.05)，实验2组有非常显著性差异(P＜0.01)2.4对大鼠SP、A、G的影响(见表7)。
表7银杏酮酯滴丸对大鼠SP、A、G的影响(x±SD)g/100ml组别 SP A GA/G对照组 7.3±0.4 3.1±0.53.9±0.6 0.79试验组1 8.4±0.2* 3.6±0.4* 4.6±1* 0.78试验组2 10.6±0.1**4.5±0.2** 5.9±1** 0.76注*P＜0.05，**P＜0.01表7表明，实验1组对SP、A、G均有显著性影响(P＜0.05)，实验2组有非常显著性影响(P＜0.01)，从A/G比值来看，实验组与对照组没有多大差异。
以上结果显示银杏酮酯滴丸能显著改善血液循环。
权利要求
1.一种银杏酮酯滴丸，其特征在于它是按下述方法制成的银杏酮酯1-6份 PEG-6000 1-25份将银杏酮酯过筛，按上述比例称取银杏酮酯细粉和PEG-6000，取PEG-6000置于50-150℃水浴中加热熔化，熔化后，在90℃以下加入银杏酮酯细粉，边加边搅拌，搅拌时间为5分钟-5小时，使其充分混匀，再在70-90℃保温条件下滴入冷凝液中，滴制成丸。
2.根据权利要求1所述的银杏酮酯滴丸，其特征在于银杏酮酯中的总黄酮≥44％，总内酯＞6％。
3根据权利要求1所述的银杏酮酯滴丸，其特征在于银杏酮酯与PEG-6000的配比为1∶4。
4.根据权利要求1所述的银杏酮酯滴丸，其特征在于银杏酮酯与PEG-6000的配比为1∶8。
5.根据权利要求1所述的银杏酮酯滴丸，其特征在于银杏酮酯与PEG-6000的配比为1∶15。
6.根据权利要求1所述的银杏酮酯滴丸，其特征在于银杏酮酯与PEG-6000的配比为1∶20。
7.根据权利要求1所述的银杏酮酯滴丸，其特征在于水浴温度为90-110℃。
8.根据权利要求1所述的银杏酮酯滴丸，其特征在于搅拌时间为30分钟-2小时。
9.根据权利要求1所述的银杏酮酯滴丸，其特征在于搅拌时间为1小时。
10.根据权利要求1所述的银杏酮酯滴丸，其特征在于冷凝液为10-25℃液体石蜡。
全文摘要
本发明涉及一种新的银杏酮酯滴丸制剂，该制剂是采用先进的固体分散技术制备而成，产品中总黄酮≥44％、银杏总内酯≥6％，它具有有扩展脑血管，促进脑血液循环，增强脑血流量，提高大脑新陈代谢活力，增强记忆力等作用。无论是产品质量、还是疗效，都较现有的剂型更为提高，具有速效、使用方便、有效成分含量高、服用量少等优点。
文档编号A61P9/00GK1552319SQ0313648
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月5日 优先权日2003年6月5日
发明者许启太, 周修春, 李钦, 杜钢军 申请人:许启太, 周修春