专利名称：五步蛇毒溶解纤维蛋白(原)No.2基因及其应用的制作方法
专利说明五步蛇毒溶解纤维蛋白(原)No.2基因及其应用 本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及尖吻蝮蛇(五步蛇毒)溶解纤维蛋白(原)No.2基因、含有该基因的载体、利用该载体进行基因工程化的宿主细胞以及将该基因用于制备溶解纤维蛋白(原)的药物，以对抗血栓形成所引起的栓塞性疾病。血管内血栓形成所引起的栓塞性疾病，尤其是心肌梗塞及脑中风，为目前世界上对人类健康危害最大的疾患，其发病率及病死率均居各病之首。在我国，随着大部分传染性疾病被控制、人们生活水平的显著提高、人群寿命的普遍延长和人口结构老龄化的发展，心、脑血管血栓病的发病率在各种疾病中已上升至第一位和第二位，每年发病300万人以上。并且有理由预期，此类疾病的发病率今后仍会进一步增高。
目前，栓塞性疾病的治疗主要依靠抗血小板药(如阿斯匹林)、抗凝血药(如肝素)和纤溶酶原激活药。从原理上说，阿斯匹林和肝素均是抑制凝血机制，使血液失凝而起到预防血栓形成及血栓扩大的作用，对已经存在的血栓则无效，不能作为治疗尤其是急救使用。纤溶酶原激活物为目前临床常用的治疗血栓病的药物，包括链激酶、尿激酶和组织型纤溶酶原激活物(tPA)。它们共同的机制是将内源性的无活性纤溶酶原激活为纤溶酶，后者水解血栓中的纤维蛋白而溶栓。因此，这类药物的共同特点是，其溶纤作用是间接的，起效较慢，且作用较弱，尤其对较大的血栓更是如此。而在心、脑血管发生栓塞的情况下，心肌与神经元在血流被切断后，缺氧数分钟即发生死亡。由于其间接溶栓的作用原理，还使得上述三种药物有对血栓选择性差、易引起出血等副作用。此外，链激酶还会发生过敏反应，tPA价格昂贵而限制了其广泛的应用。
尤其需要着重指出的是，现在使用的溶栓药，即使联合应用也有约有25％的患者无效。此外约5-30％的患者使用现有的溶栓药后发生“血管再闭塞”。而且此种再闭塞对继续使用溶栓药无效。
综上所述，现有的溶栓药不能完全满足临床的使用要求，迫切需要发展效能更高、疗效更加专一迅速的溶栓药物。
国外有关蛇毒的研究报道Agkistrodon contortrix蛇毒含有直接作用的纤溶酶，Crotalus atrox(western diamondback rattlesnake)蛇毒也含有纤维蛋白(原)水解酶，但不激活纤溶酶原，在大鼠静脉血栓模型静脉给药，用造影技术显示有溶栓作用。用组织学的方法检查未发现有肾、肝、心、肺组织坏死和出血的反应。
在我国临床上使用的蛇毒制品如去纤酶、抗栓酶，其机理如凝血酶一样，是将血浆的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，降低血浆的粘度，以求达到抗栓作用。其疗效与机制根本不能与溶栓药相比拟。
我国独有的五步蛇毒(Agkistrodon acutus venom)中含有直接溶解纤维蛋白的成分，并且具强烈的生物活性。用柱层析方法分离纯化法，从15个组份中得到几种具有溶纤作用的蛋白质。其中组份II(纤溶因子)具有极高应用价值的生物特性(1)直接溶栓用热板法破坏纤溶酶原后，纤溶因子仍能溶解纤维蛋白；(2)作用快速在体外实验中，纤溶因子作用比尿激酶快一倍；(3)效能高纤溶因子的生物活性比尿激酶更强(130μg相当于尿激酶450u)；(4)副作用低尽管未经纯化的五步蛇毒具有明显的出血作用，但纤溶因子在500μg/ml浓度下，亦未见出血反应。上述这些特点，强烈支持来自五步蛇毒中的纤溶因子可能成为新一代的治疗血栓性疾病的药物。
但是，自然来源的五步蛇毒，其成分与生物活性都存在着地区性、季节性变异，实际上难于取得稳定的临床疗效；此外，由于粗制品蛇毒中成份复杂，虽经纯化处理，仍难获得真正单一的化学成份，使临床应用隐含某些毒副作用；自然蛇毒产量有限，成本较高，市场占有能力低；其分子结构及结构与活性的关系，用蛋白质技术依然不能阐明。因此，解决上述问题，对真正确立纤溶因子的临床应用的科学基础无疑是必不可少的。
酵母不需要特殊的培养基就能迅速生长和大规模发酵；酵母的DNA较简单并且克隆筛选方便；酵母是真菌生物具有较大肠杆菌完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰，如可以糖基化，能形成正确的二硫键等等，已有蛇毒蛋白在酵母表达成功的先例。本课题以五步蛇毒纤溶因子FII的抗体作探针，从五步蛇毒腺cDNA文库中筛选出FII的基因，克隆到酵母表达载体PPIC9K，转化酵母细胞，实现五步蛇毒纤溶因子FII在酵母中的高效表达，用层析法纯化重组五步蛇毒纤溶因子FII并测定其溶解纤维蛋白的活性。本研究获得大量基因工程制备的五步蛇毒纤溶因子FII，为后续1类新药的药效学研究及评价奠定了基础。
蛇毒的研究曾经对生物医学的发展起过关键的作用，如从蛇毒中分离DNA内切酶，极大地推动过分子生物学的研究，从银环蛇毒中发现毒素，为神经递质受体的纯化起了决定性的作用。本发明用基因工程制备的五步蛇毒纤溶因子FII，与现在临床应用的多种蛇毒生化制剂相比，可以克服生物活性的地区差异和化学不均一性，提高疗效和产量，成为具有巨大市场价值并具有自主知识产权的临床新药。五步蛇毒纤溶因子FII可以直接溶解纤维蛋白，在有效纤溶剂量下未见出血反应。粗制品蛇毒成份复杂，难以纯化为单一成份；蛇毒产量有限，不利于大规模生产，应用基因工程技术表达纤溶因子可解决上述问题。本发明从五步蛇粗毒中分离纤溶因子FII；完成纤溶因子FII基因的筛选、克隆；在酵母细胞中表达纤溶因子FII；纯化表达产物并测定纤溶活性。
方法采用离子交换层析和凝胶过滤从五步蛇毒中分离天然五步蛇毒纤溶因了FII，用纤维蛋白原、纤维蛋白作底物测定其活性，通过SDS-PAGE观察其在纤维蛋白原的作用位点；制备多克隆抗体、单克隆抗体及五步蛇毒腺cDNA文库，用抗体作探针从文库中筛选纤溶因子FII基因，并用酶切连接等方法将其克隆入酵母表达质粒PPIC9K中；通过转化及筛选得到高表达酵母菌株；用离子交换层析和疏水层析纯化重组五步蛇毒纤溶因子FII，SDS-PAGE检测纯度，纤维蛋白平板法测定其纤溶性；通过SDS-PAGE观察其对IgG和白蛋白的作用；用狗肺血栓模型测定其体内纤溶活性。
结果通过三次层析从粗毒中纯化了纤溶因子FII，SDS-PAGE显示为单一条带，分子量为25,500。五步蛇毒纤溶因子FII降解纤维蛋白原的Aα、Bβ链，对γ链几乎没有降解作用；可以剂量依赖地溶解纤维蛋白。成功制备了多克隆抗体、单克隆抗体及五步蛇毒腺cDNA文库，从文库中筛选到一个纤溶因子FII基因，构建了重组质粒PPIC9K-FII。转化酵母细胞后，PCR证实重组质粒被整合到酵母染色体上。以降解纤维蛋白原活性为指标，筛选到一高表达菌株，在表达第3天活性达到高峰。通过两次层析纯化的重组五步蛇毒纤溶因子FII在SDS-PAGE呈单一区带，对纤维蛋白有较强的溶解作用，对IgG和白蛋白无降解作用。对右下肺动脉血栓溶解很好，给药1小时后再通率平均为83.3％。结论在酵母中高效表达了五步蛇毒纤溶因子FII，重组纤溶因子FII有较高的纤溶活性。
天然五步蛇毒分离的溶纤活性因子FII，产量较低，质量不稳定。本发明用基因工程酵母系统表达的溶纤因子，活性高，产量大，质量稳定，成本低。在整体动物血栓模型，溶栓效果良好，出血反应少。强烈地提示其可成为新型的强效的溶栓药，社会效益和经济效益巨大。
图1五步蛇毒的DEAE-SephadexA-50离子交换层析；图2组分II的Sephadex G-75凝胶过滤柱层析；图3用Sephadex G-75对组分II的重层析；图4用SDS-PAGE对组分II进行分子量定量；
图5SDS-PAGE中蛋白标记物的标准曲线；图6用SDS-PAGE分离的纤维蛋白原水解产物；图7组分II的纤维蛋白活性；图8五步蛇毒腺的全部RNA的甲醛琼脂糖电泳；图9五步蛇毒的CDMA文库结构；图10抗体筛选五步蛇毒CDMA文库中组分II的阳性结果；图11九个阳性克隆的插入DNA片段的序列；图12组分II的ORF DNA序列的推导的氨基酸序列；图13在大肠杆菌中表达的组分II融合蛋白的SDS-PAGE分析；图14在酵母中构建组分II目标DNA的表达载体的两个步骤；图15重组质粒pPIC9K-FII的双重限制；图16用SDS-PAGE分析培养上清液的纤维蛋白活性；图17培养上清液的DEAE-Sepharose离子交换层析；图18培养上清液的Buty-Toyopearl层析；图19用SDS-PAGE对重组组分II纯度的分析；图20重组组分II的直接纤维蛋白活性；图21用SDS-PAGE分析重组组分II对IgG和白蛋白的效果；图22重组组分II对狗右肺下动脉血栓模型的溶栓效应。一、五步蛇毒纤溶因子FII的分离1.DEAE-Sephadex A-50离子交换层析方法DEAE-Sephadex A-50离子交换凝胶在0.05M PH8.0的醋酸铵缓冲液中反复漂洗并在25℃浸泡约24小时后装柱(凝胶柱直径2.6cm、高100cm)。待流出液pH值接近8.0时平衡完成，3g五步蛇毒粗毒溶于10ml 0.05M PH8.0的醋酸铵缓冲液中，1500rpm 15分钟离心去沉渣后上柱。用0.05M PH8.0的醋酸铵缓冲液和1M PH5.0的醋酸铵缓冲液各750ml作直线梯度洗脱，洗脱液收集速度为4tube/h，3ml/tube。在280nm波长下测定光吸收值。测定各峰纤溶活性，具有纤溶活性的组分用mini透析脱盐、浓缩后，真空冷冻干燥机冻干备用。
纤溶活性测定参照Astrup和Mullerti方法，用纤维蛋白平板法检测纤溶活性。取0.2％小牛纤维蛋白原溶液20ml于直径为9.5cm的培养皿中，培养皿水平放置，加入80μl的凝血酶(100U/ml)，混合摇动均匀放置形成平板凝块。加入待测样品20μl于平板的表面，每一样品加三点，37℃保温12小时后，以溶解平板的面积表示纤溶活力。
结果五步蛇毒粗毒经DEAE-Sephadex A-50离子交换层析得到10个蛋白峰(见图1)，其中第2峰(FII)具有较高的纤溶活性，用纤维蛋白平板测得的纤溶活性为60.23±16.47mm2/μg。
2.Sephadex G-75凝胶层析方法Sephadex G-75凝胶用0.05M PH8.0的醋酸铵缓冲液反复漂洗并在25℃浸泡约24小时后装柱(凝胶柱直径1.1cm、高100cm)。平衡完成后，将DEAE-Sephadex A-50离子交换层析得到的纤溶成分85mg溶于2ml 0.05M PH8.0的醋酸铵缓冲液中，上柱，用0.05M PH8.0的醋酸铵缓冲液洗脱，洗脱液在280nm波长下测定光吸收值，按前述方法测定活性后，收集需要活性蛋白峰。
结果进一步经Sephadex G-75凝胶过滤层析，得到2个蛋白峰((见图2)，其中第一峰有较高的纤溶活性，其纤溶活性为87.51±24.95mm2/μg。
3.Sephadex G-75凝胶再次层析方法将第一次Sephadex G-75凝胶过滤得到的纤溶成分60mg按方法2再次层析。
结果再次用Sephadex G-75凝胶过滤层析得到一个蛋白峰(见图3)，其纤溶活性为90.49±12.41mm2/μg。
二、五步蛇毒纤溶因子FII的纯度及活性测定1.五步蛇毒纤溶因子FII的纯度检测方法采用SDS-PAGE垂直平板式电泳，分离胶浓度12％，PH8.8，浓缩胶浓度4％，PH6.8，电极缓冲液采用Tris-甘氨酸，电压200V，电泳时间为45分钟。电泳后用20％的三氯乙酸固定，考马斯亮兰R250染色，45％甲醇、7％的乙酸脱色。五步蛇毒纤溶因子FII(1mg/ml)20μl上样。分子量标准采用MBP-β-galactosidase(175,000)，MBP-paramyosin(83,000)，Glutamic dehydrogenase(62,000)，Aldolase(47,500)，Triosephosphate isomerase(32,500)，β-LactoglobulinA(25,000)，Lysozyme(16,500)。
结果经SDS-PAGE得到一条区带(见图4)，通过标准蛋白质的相对迁移率Rf(X)对分子量对数1gMW作回归曲线(见图5)，得方程1gMW＝-1.55X+5.51，r＝0.95，由此方程计算得五步蛇毒纤溶因子FII的分子量为25,550。
2.五步蛇毒纤溶因子FII溶解纤维蛋白原活性测定方法取0.2％的牛纤维蛋白原溶液75μl加于Ependoff管中，再加入五步蛇毒纤溶因子FII(2mg/ml)25ull在37℃保温。保温1h时间后加电泳蛋白质样品处理液50μl，取20μl做SDS-PAGE。以人纤溶酶(0.05U/ml)25μl作阳性对照。
结果牛纤维蛋白原与FII作用后的SDS-PAGE结果(见图6)。FII对纤维蛋白原的Aα链、Bβ链有水解作用，γ链几乎没有水解，产生的降解片段主要为45,000Da，而纤溶酶对纤维蛋白原的Aα链、Bβ链、γ链均有水解作用，产生的降解片段分子量为47,000Da、44,000Da和23,000Da，表明FII与纤溶酶均能降解纤维蛋白原，但作用位点不同。
3.五步蛇毒纤溶因子FII溶解纤维蛋白活性测定方法取0.2％的牛纤维蛋自原20ml于直径为9.5cm的培养皿中，培养皿水平放置，加入凝血酶(100U/ml)80μl，混合摇动均匀放置形成的纤维蛋白平板凝块后，加入待测样品20μl于平板的表面，每一样品加三点。37℃保温12小时后，以溶解平板的面积表示纤溶活力。
结果纤维蛋白平板法测定0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml四个浓度的五步蛇毒纤溶因子FII纤维蛋白溶解活性，以500u/ml的尿激酶和生理盐水分别作阳性和阴性对照。不同浓度五步蛇毒纤溶因子FII的纤维蛋白溶解活力(见表1)，表明五步蛇毒纤溶因子FII可以剂量依赖性地溶解纤维蛋白(见图7)。
表1.组分II的纤维蛋白活性.(n＝3，mean±SD)Concentration Lysed area(mg/ml) (mm2)0.25 31.33±3.400.5 60.00±3.271 105.00±4.082 137.67±5.31三、抗五步蛇毒纤溶因子FII抗体的制备1.兔抗五步蛇毒纤溶因子FII抗血清的制备方法(1)动物免疫 3mg/ml的五步蛇毒纤溶因子FII 1ml与1ml完全弗氏佐剂充分混合乳化后，兔背部皮下多点注射，每周加强免疫一次，共免疫4周。
(2)抗血清制备 已免疫家兔用3％戊巴比妥钠麻醉后，颈动脉插管取血，在室温下凝固后，离心收上清，放于4℃使血清析出。
(3)ELISA测定抗体效价 分别取0.1mg/ml的五步蛇毒纤溶因子FII(溶于pH9.5，NaHCO3/Na2CO3缓冲液)100μl于酶标板各孔中，4℃过夜，包被酶标板。次日，去掉孔中的液体，用PBST(0.05％Tween-20)洗两次。用封闭液[1×PBS，1％BSA(bovine serum albumin)]37℃封闭1h，去除封闭液加入2×系列稀释的兔抗血清(一抗，用1×PBS，1％BSA稀释)，37℃孵育1h，用PBST洗涤酶标板3次，加入羊抗兔HRP-IgG(二抗，1∶1000稀释)，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次后，每孔分别加入底物液A、B各一滴，据颜色确定抗血清的效价。
结果用纯化的五步蛇毒五步蛇毒纤溶因子FII作为抗原免疫1、2号两只家兔，在免疫4周后，制备抗血清，用ELISA法测定家兔的抗五步蛇毒纤溶因子FII血清抗体效价。结果显示两只家兔抗五步蛇毒类凝血酶的血清抗体效价均为1∶20,000。
2.五步蛇毒纤溶因子FII单克隆抗体的制备方法(1)免疫与细胞融合及克隆筛选 将五步蛇毒纤溶因子FII(1mg/ml)与等体积完全弗氏佐剂充分混合乳化后，给予7周龄的Balb/C小鼠皮下注射，每次注射0.2ml。2周免疫1次，共免疫3次。融合前3d以0.2ml五步蛇毒纤溶因子FII(1mg/ml)尾静脉注射。取免疫小鼠脾细胞制备细胞悬液与鼠SP2/10骨髓瘤细胞按10∶1比例混合，在＝50％PEG(u 3700)作用下融合后，分别接种在5块96孔细胞培养板，置于＝5％CO2培养箱培养。第1天至第4天用含＝15％胎牛血清的HAT选择培养基，第4天至第10天改用的HT培养基。第10天后改用含＝10％胎牛血清的RPMI-1640。
(2)按前述方法用ELISA测定抗体效价结果通过2次融合筛选到20株抗纤溶因子FII细胞株，其中两株特异性高(命名为C1、C4)，用IgG分类试剂盒检测表明两株杂交瘤分泌的单克隆抗体均为IgGI，两株单克隆抗体高效价。
四、五步蛇毒腺表达型cDNA文库的构建1.标本及总RNA的提取方法(1)将五步蛇断头处死，立即取毒腺，取出后放入Eppendorf管，立即用干冰速冻。
(2)用Promega公司试剂盒提取总RNA。称取双侧毒腺约1.7g，匀浆后加入20ml变性溶液，再匀浆20秒，加入2M乙酸钠2ml充分混匀，再加入1ml酚-氯仿-异丙醇混匀，振荡10秒，冰浴90秒，离心(4℃，12,000rpm，20min)，将上清移至50ml的离心管中，加等体积异丙醇，混匀在-30℃放置20min，离心(4℃，12,000rpm，15min)沉淀RNA。弃上清，沉淀用75％冰冷的乙醇洗涤，离心去上清后，真空干燥，用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水溶解，测定RNA的含量及纯度。
结果本实验用一步酚法提取总RNA426μg，OD260/OD280的比值为20。经甲醛琼脂糖凝胶电泳(见图8)显示，18S和28S两条rRNA带清晰，且28S的荧光强度约为18S的二倍，表明提取的总DNA保持了较好的分子完整性。
2.RNA的分离纯化方法Oligo(dT)纤维柱用层析加样缓冲液充分洗涤，然后将溶解在DEPC水中的RNA(3mg)于65℃保温5min，冰浴速降至室温。加等体积的上样缓冲液后上柱，用加样缓冲液洗3次，然后用洗脱缓冲液洗脱mRNA。在260nm波长下测定mRNA的光吸收值，计算纯化的mRNA的量。
结果将总RNA经过Oligo(dT)纤维素亲和层析柱分离得到mRNA的量为10μg。
3.cDNA文库的构建方法(按照Promega公司cDNA合成试剂盒说明，流程图(见图9)(1)cDNA第一链的合成。
(2)cDNA第二链的合成。
(3)在双链cDNA的末端连接Not I、Sal I接头。
(4)双链cDNA的连接和转化 含有Not I、Sal I接头的双链cDNA与线性化载体pSport I 1μg用T4连接酶在16℃连接过夜。连接产物10μl加入50μl感受态大肠杆菌DH5α中，依次4℃，30min；42℃，120s；4℃，5min；37℃，10min；37℃摇动培养1h。取2μl分别稀释10、100、1000倍，涂布于含氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂板上，37℃倒置培养12h至单菌落形成，计数菌斑并计算cDNA文库的滴度，文库液-80℃保存。
结果将文库菌液稀释后涂板计数菌落，计算出文库菌液的滴度为5×107pfu/ml。
五、五步蛇毒纤溶因子FII基因的获得1.抗体筛选cDNA文库方法(1)取文库菌液适当稀释后，取100μl，均匀涂布于含氨苄青霉素50μg/ml的LB培养板上，37℃倒置培养12-16h至菌落长至针尖大小。
(2)将用IPTG(10mmol/ml)溶液浸透并晾干的NC膜(硝酸纤维素膜)贴在长满菌落的LB培养板，用针头在3个不对称的位置上作好标记，揭下NC膜置于琼脂糖板上(有菌落的一面朝上)，置37℃再培养6-8h，原LB培养板于4℃保存。
(3)取出NC膜，用氯仿固定30min后，置于封闭液(4μg/ml溶菌酶、1μg/ml DNA酶、1％BSA)中轻摇30min，随后用PBST洗膜3次(每次15ml，5min)，在10ml兔抗血清稀释液中(1×PBS，1％BSA，一抗稀释比1∶1000)轻摇NC膜3h，用PBST洗膜3次(每次15ml，5min)，NC膜与10ml羊抗兔HRP-IgG(二抗，1∶1000稀释)轻摇3h，再洗膜3次。
(4)NC膜在DAB显色液中轻摇30min，用蒸馏水漂洗，观察。阳性克隆为棕色，对照原LB培养板，找出阳性菌落。
(5)将多克隆阳性克隆分别涂板，用单抗再次筛选、方法同前。
结果用多克隆抗体(兔抗血清)以直径为9cm平板约含5×103个菌落的密度进行筛选，共筛选了约20万个菌落，获得15个初筛阳性克隆，每一克隆再复筛一次，仍呈阳性反应的克隆共有11个。(阳性反应克隆在NC膜上呈现棕色斑点，见图10)。
将上述11个免疫血清筛选好的阳性克隆分别涂板，用单克隆抗体再次筛选，有9个与C1、C4两株单抗均起阳性反应。
2.抽提质粒cDNA序列测定方法按照QIAGEN公司的质粒提取试剂盒说明书进行。挑取阳性单菌落，于5ml LB培养基中37℃振荡培养24h。
(1)取1.5ml过夜培养菌，离心30s(4℃，12000rpm)，回收细菌。
(2)弃上清，沉淀用250μl溶液P1重悬，剧烈振荡，直到看不见块状细菌。
(3)加入250μl溶液P2，快速颠倒离心管5次。
(4)加入350μl溶液N3，立即将管倒置，颠倒5次，使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀。
(5)离心10min(4℃，12000rpm)，可见白沉淀。
(6)吸取上清液移入QIA离心柱中。离心30-60s，丢弃离心液。
(7)加入0.5ml溶液PB，离心30-60s，丢弃离心液。
(8)加入0.75ml溶液PE，离心30-60s，丢弃离心液。
(9)空离心1min。
(10)加50μl溶液EB或H2O，静置1min，离心1min。
抽提的质粒，以T7和SP6作测序引物，采用Sanger双脱氧末端终止法测定插入片段的序列。
结果分别挑取上述9个阳性单菌落，于含氨苄青霉素的LB培养基中过夜振荡培养后，取1.5ml抽提质粒。用质粒多克隆位点两端的通用引物T7、SP6做引物，进行PCR反应，9个阳性克隆全部扩增出特异条带。
采用Sanger双脱氧末端终止法，将上述9个阳性克隆插入cDNA片断全部测序，结果(见图11)。
3.序列的同源性分析方法通过互联网进入NCBI(The National Center of BiotechnologyInformation)网站，运用BLASTn和BLASTp程序进行核苷酸和推导可能蛋白质的同源性分析。确定含有五步蛇毒纤溶因子FII基因的FII质粒。
结果把得到的9个cDNA序列在NCBI-BlasTn和BLASTP数据库中进行同源性检索，发现这几个序列大多属于SVMPs家族(氨基酸序列同源性最高可达85％)，而其中的FII-2和和FII-4在序列上更为保守，属于与SVMPs家族相关的ADAM家族。功能实验表明FII-4具有溶纤性大，出血性小特点，故而在得到的9个cDNA序列中，优先对FII-2(将含有该插入序列的质粒定为FII质粒，该序列以下即将其称为FII基因)进行蛋白表达。其可能的氨基酸序列(见图12)。
六、五步蛇毒纤溶因子FII基因在大肠杆菌中的表达方法取0.2ml过夜菌(经过抽提含FII质粒的菌落)加入20ml含氨苄的SOB培养基中，37℃振摇3小时至OD600＝0.5左右，加入IPTG终浓度为1μm，振摇4小时，1500rpm，离心20min，去上清，沉淀加0.5ml水及0.5ml SDS上样缓冲液，100℃水浴5min，10,000rpm离心，取上清20μl上样作SDS-PAGE。
结果经过IPTG诱导后的含FII质粒的大肠杆菌裂解物，在SDS-PAGE图谱上存在一大小约为40KD的条带，在未诱导及空的大肠杆菌没有此条带(见图13)。结果提示FII基因可以以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达。
七、五步蛇毒纤溶因子FII基因克隆方法(见流程14)1.PCR扩增FII基因用两步PCR法将α信号的序列引入目的基因的5’端，同时引入限制酶切位点。
引物15’AGA GAG GCT GAA GCT AAT CTT ACT CCT GAA C3’引物25’CT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT AAT C3’反向引物引物35’GAG CGG CCG CCT CAC GCC TCC AAA AGT TC3’步骤
(1)第一轮引物1为正向，引物3为反向，FII质粒为模板 (2)第二轮为引物2为正向，引物3为反向以第一轮PCR产物为模板，反应条件与第一轮相同。
2.重组质粒PPIC9K-FII构建(目的基因克隆到PPIC9中)第二轮PCR产物，经1％琼脂糖电泳后，切胶回收目的片段。将回收的目的片段及质粒PPIC9分别用Xho I、Not I酶切，电泳、回收，然后在T4连接体系中，16℃连接12小时，转化感受菌Top 10F，涂布含氨苄的LB培养板，挑取菌落，抽提质粒，酶切鉴定，将含有目的片段的质粒纯化。
3.重组表达质粒PPIC9K-FII构建(目的基因克隆到PPIC9K中)用Sac I和Not I双酶切带有目的片段的质粒PPIC9及质粒PPIC9K，然后连接，转化，挑取阳性克隆，鉴定，抽提大量PPIC9K-FII质粒。
结果先以引物1、引物3为扩增引物，FII质粒为模板进行PCR反应，再以引物2，引物3作扩增引物，前述PCR产物为模板进行PCR反应，获得一大小约为700bp的与五步蛇毒纤溶因子FII的基因大小一致产物。将产物回收后与质粒PPIC-9分别用XhoI、NotI双酶切，然后连接构建重组质粒PPIC9-FII，经双酶切反应鉴定。
Sac I、Not I双酶切重组质粒 PPIC9-FII，将切下较小片段亚克隆入同样用Sac I、Not I双酶切的PPIC9K质粒中，建立重组酵母表达质粒PPIC9K-FII。经双酶切反应鉴定，有大小为700bp为的产物，与理论值一致(见图15)。用Sanger双脱氧末端终止法进行测序，结果证明重组质粒PPIC9K-FII中含有五步蛇毒纤溶因子FII的DNA序列。
八、五步蛇毒纤溶因子FII在酵母表达系统中的表达1.酵母细胞的转化及筛选方法将提取的PPIC9K-FII质粒50ug用Sac I酶切线性化，用酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解，-30℃冻存。酵母感受态的制备，采用3％聚乙二醇。将线性化的质粒，加鲑鱼精DNA混匀，加入酵母感受细胞内，均匀涂布在两块RD平板上，30℃倒置平96小时，将RD板上的菌株用蒸馏水洗下，涂布在含不同浓度G418(0.5、1、2、3、4mg/ml的YPD平板上，倒置平板30℃培养，低浓度G418平板从第四天开始有菌落，第6天挑取3mg/ml G418平板上菌落，抽提DNA，PCR鉴定。
结果提取PPIC9K-FII质粒，用Sac I酶切线性化，纯化后用PEG法转化感受态酵母细胞。转化物涂布于含G418的YPD板上后，低浓度(0.5mg/ml)板第四天开始有菌落长出。第六天挑取3mg/ml G418平板6个菌落。
2.高表达菌株的筛选及FII的大量表达方法挑取6株将经PCR证实有目的基因的酵母菌株，分别接种在10ml的MD培养基中，30℃振摇过夜、离心、沉沉加入BMMY培养基，30℃振摇，每天补1％的甲醇，每天取样，样品与纤维蛋白原37℃反应后，做SDS-PAGE，观察纤维蛋白原的降解活性。第3天取样品的其中3个管冻存。
取冻存菌一支，加入100ml MD培养基中，30℃振摇过夜，然后扩大至2个5升大瓶，各2升，30℃振摇24小时加入发酵缸100升，BMMY培养基30℃，24小时加1％甲醇，每天补加至1％，发酵96小时，离心取上清，超滤浓缩至2升。
结果将有FII基因的酵母菌6株培养后，每天取样各1份，将各样品上清与纤维蛋白原37℃保温1h后，做SDS-PAGE。其中第1，2和3号菌株在培养第3天所取样品上清即对纤维蛋白原有水解作用(见图16)，以天然五蛇毒纤溶酶FII作阳性对照)，对纤维蛋白原的水解方式及水解后产生的主要片段与天然纤溶因子FII相同。结果提示此三株酵母菌株可以高效分泌表达纤溶因子FII。
经过甲醇诱导后，在发酵96小时收集表达上清，获得大量表达的FII。
九、重组五步蛇毒纤溶因子FII的纯化及活性测定1.DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析方法(1)超滤浓缩将上清经Millipore超滤浓缩，浓缩至2L时，加2倍体积50mM NH4Ac超滤。
(2)DEAE-Sepharose FF用上样缓冲液(50mM NH4AC PH8.0)平衡柱后，超滤浓缩后50倍的样品上柱体积，然后用上样缓冲液至基线，加0.1M NH4ACPH6.5洗杂质，然后用含0.2M NH4AC PH5.2的洗脱液洗脱目的蛋白。
结果FII经过大量的表达后，收集表达上清，超浓缩50倍后的样品200ml上DEAE-sepharose柱，经过洗脱后得到5个蛋白峰(见图17)，0.2M NH4Ac pH5.2的洗脱峰有较高的纤溶活性。
2.疏水层析(Buty-Toyopearl)方法将过离子交换后的样品加2M NaCl上Buty-Toyopearl，用4倍体积的含1M NaCl，20mM PBS液洗杂质，达到基线，然后用0.1M NaCl，20mM PBS液洗杂质蛋白，最后用2mM PBS液洗结合目的蛋白。
结果将活性峰浓缩后，进一步经Buty-Toyopearl疏水层析，得到3个蛋峰(见图18)，其中第3峰具有较高纤溶活性。将第3峰收集、脱盐、干燥即得重组五步蛇毒纤溶因子FII。
3.重组五步蛇毒纤溶因子FII的纯度检测方法采用SDS-PAGE，具体操作同前。
结果经SDS-PAGE可见纯化后的重组五步蛇毒纤溶因子FII为单一区带(见图19)。
4.重组五步蛇毒纤溶因子FII的直接纤维蛋白溶解活性测定方法采用加热纤维蛋白平板法，将制备好的纤维蛋白平板在85℃加热30分钟，冷却到室温。分别在加热纤维蛋白平板表面加入重组五步蛇毒纤溶因子FII 2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，天然FII 0.5mg/ml，尿激酶5000IU/ml及生理盐水。37℃保温12小时后，以溶解平板的面积表示纤溶活力。
结果加热纤维蛋白平板法测定重组五步蛇毒纤溶因子FII的直接纤维蛋白溶解活性，结果显示，重组五步蛇毒纤溶因子FII依量地溶解纤维蛋白，且活性较天然FII强(重组五步蛇毒纤溶因子FII 0.5mg/ml产生的溶圈面积为50mm2，而天然FII 0.5mg/ml产生的溶圈面积为40mm2。见图20，表2)。在加热纤维蛋白到85℃已将其中的纤溶酶原灭活，所以FII可以直接溶解纤维蛋白而不依赖纤溶酶原的激活。
表2 重组组分II的直接纤维蛋白活性Concentration Lysed area(mg/ml) (mm2)2 1471 1100.5 500.25280.125 14FII 0.5 405.重组五步蛇毒纤溶因子FII对人IgG和白蛋白的作用方法取10mg/ml的人IgG溶液10μl于Ependoff管中，再加入重组五步蛇毒纤溶因子FII(0.5mg/ml)10μl在37℃保温。保温24h后加电泳蛋白质样品处理液10μl，取20μl做SDS-PAGE。以同样浓度的人白蛋白代替IgG重复该实验。
结果人IgG、白蛋白与重组五步蛇毒纤溶因子FII作用后的SDS-PAGE结果(见图21)。人IgG与重组五步蛇毒纤溶因子FII作用24h后，其重链有一定的水解，轻链仍保持完整。人白蛋白与重组五步蛇毒纤溶因子FII作用24h后，肽链仍保持完整，提示重组五步蛇毒纤溶因子FII对人白蛋白没有水解作用。
十、重组五步蛇毒纤溶因子FII对狗肺动脉血栓的作用方法参照Nowk素的肺动脉血栓模型进行。实验前取Beagle狗血15ml。体外凝固2小时后作为实验用的血栓。将Beagle狗随机分两组，一组为给药组、另一组为生理盐水组，每组6只。用戊巴比妥钠30mg％，1ml/kg。将狗麻醉后分离股静脉，把S＝6.0Fcobra或Humterhead导管插入股静脉，经下腹静脉、右心房、右心室、肺动脉干，选择性进入右下肺动脉。然后将15ml的狗血栓经导管注入右下肺动脉，人工形成右下肺动脉血栓。用数字减影肺动脉造影方法记录右下肺动脉血栓栓塞的变化。当右下肺动脉血栓经过2小时后，开始iv给药，重组五步蛇毒纤溶因子FII剂量为0.24mg/kg。对照组给生理盐水1ml/kg。给药前、给药后15、30、60、90、120min，分别用数字减影肺动脉造影方法记录右下肺动脉血栓复通有效率。以肺动脉复通率来评价FII的溶栓作用。
结果给予重组五步蛇毒纤溶因子FII 0.24mg/kg组，右下肺动脉血栓溶解很好(见图22)，给药1小时后再通率平均为83.3％(见表3)。而生理盐水组，右下肺动脉血栓变化很少，给生理盐水后1小时再通率平均为0.6％。
表3 重组组分II对狗右肺下动脉血栓模型的溶栓效应Recovery rate of pulmonary arteryBeagle dog(number) Time after injection(％)31h ＞9021h ＞801- ＞706NS 0.6
五步蛇毒溶解纤维蛋白(原)No.2基因及其应用<110>中山大学<120>五步蛇毒溶解纤维蛋白(原)No.2基因及其应用<160>1<210>1<211>702bp<212>DNA<213>尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus snake)<220>
<221>CDS<222>(1)...(702)<400>1aaaagagagg ctgaagctaa tcgtactcct gaacaacaaa tctatgaccc ctacaaatac 60gttgagactg tctttgttgt ggacaaagca atggtcacaa aatacaatgg cgatttagat 120aagataaaaa caagaatgta cgaagctgcc aacaatatga atgagatgta cagatatatg 180ttttttcgtg tagtaatggt tggcctaata atttggaccg aagaagataa gattaccgtg 240aagccagatg tggattatac tttgaacgca tttgcagaat ggagaaaaac atatttgctg 300gctgagaaaa aacatgataa tgctcagtta atcacgggca ttgacttcag aggaagcatt 360ataggatacg cttacattgg cagcatgtgc cacccgaagc gttctgtagg aattattcag 420gattatagcc caataaatct tgtgcttgcc gttataatgg cccatgagat gggtcacaat 480ctgggcattc accatgacga cggttactgt tattgcggtg gttacccatg cattatgggt 540ccctcgataa gccctgaacc ttccaaattt ttcagcaatt gtagttatat ccaatgttgg 600gactttatta tgaatcacaa cccagaatgc attgacaatg aacccttggg aacagatatt 660atttcacctc cactttgtgg aaatgaactt ttggaggcgt ga 70权利要求
1.一种分离的多核苷酸(No.2基因)，它包括以下的其中一组(A)、一种具有与以下序列的多核苷酸5’-aaaagagaggctgaagctaatcgtactcctgaacaacaaatctatgacccctacaaatacgttgagactgtctttgttgtggacaaagcaatggtcacaaaatacaatggcgatttagataagataaaaacaagaatgtacgaagctgccaacaatatgaatgagatgtacagatatatgttttttcgtgtagtaatggttggcctaataatttggaccgaagaagataagattaccgtgaagccagatgtggattatactttgaacgcatttgcagaatggagaaaaacatatttgctggctgagaaaaaacatgataatgctcagttaatcacgggcattgacttcagaggaagcattataggatacgcttacattggcagcatgtgccacccgaagcgttctgtaggaattattcaggattatagcccaataaatcttgtgcttgccgttataatggcccatgagatgggtcacaatctgggcattcaccatgacgacggttactgttattgcggtggttacccatgcattatgggtccctcgataagccctgaaccttccaaatttttcagcaattgtagttatatccaatgttgggactttattatgaatcacaacccagaatgcattgacaatgaacccttgggaacagatattatttcacctccactttgtggaaatgaacttttggaggcgtga-3’(702bp)；(B)、一种与(A)的多核苷酸至少有80％同源性的多核苷酸；(C)、(A)或(B)的多核苷酸的片段。
2.权利要求1中的多核苷酸，其特征在于该多核苷酸是DNA。
3.一种含有权利要求2的DNA的载体。
4.一种用权利要求3的载体基因工程化的宿主细胞。
5.用于溶解纤维蛋白(原)以对抗血栓形成所引起的栓塞性疾病的药物组合物，其中包含权利要求1或2的多核苷酸作为活性成分。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及尖吻蝮蛇(五步蛇毒)溶解纤维蛋白(原)No.2基因、含有该基因的载体、利用该载体进行基因工程化的宿主细胞以及将该基因用于制备溶解纤维蛋白(原)的药物，以对抗血栓形成所引起的栓塞性疾病。从五步蛇粗毒中分离纤溶因子FII；完成纤溶因子FII基因的筛选、克隆；在酵母细胞中表达纤溶因子FII；纯化表达产物并测定纤溶活性。本发明用基因工程酵母系统表达的溶纤因子，活性高，产量大，质量稳定，成本低，可成为新型的强效的溶栓药，社会效益和经济效益巨大。
文档编号A61K38/17GK1584029SQ0314021
公开日2005年2月23日 申请日期2003年8月20日 优先权日2003年8月20日
发明者颜光美, 陈家树, 邱鹏新, 单鸿 申请人:中山大学